1 Il contenuto di questa tesi di laurea è strettamente riservato, essendo presenti argomenti tutelati dalla legge come segreti. Pertanto tutti coloro che ne prendono conoscenza sono soggetti all’obbligo, sanzionato anche penalmente dagli articoli 325 e 623 del codice penale, di non divulgare e di non utilizzare le informazioni acquisite.
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Introduzione
L’Ingegneria Tessutale può essere definita come l’applicazione dei principi scientifici alla progettazione, costruzione, modificazione, crescita e mantenimento dei tessuti viventi, ed è un nuovo ramo della ricerca scientifica nato per superare i limiti intriseci delle terapie tradizionali basate sul trapianto degli organi (carenza di donatori e problemi di istocompatibilità) e sull’utilizzo di protesi (risposta infiammatoria e complessità del sistema biologico da sostituire).
La generazione di sostituti 3D in-vitro richiede non solo un modello biologico (una adeguata sorgente di cellule proliferanti, con una appropriata funzione biologica, un protocollo per la proliferazione cellulare che mantenga lo specifico fenotipo del tessuto), ma anche l’ulteriore sviluppo di nuove strategie di coltura che consentano di raggiungere densità cellulari più elevate di alcuni ordini di grandezza di quelle utilizzate nelle normali condizioni di coltura a due dimensioni (106 cellule/cm3). L’Ingegneria Tessutale perciò ha abbandonato i classici metodi di coltura cellulare, sviluppando nuove metodologie ed apparecchiature quali il bioreattore, un dispositivo sterile, termostatato e con adeguate concentrazioni di metaboliti e gas: grazie ad esso è possibile ricreare in-vitro un ambiente che simula le condizioni fisiologiche per la crescita dei tessuti bioartificiali, ma anche studiare in modo sistematico della risposta dei tessuti viventi ai vari stimoli chimico-fisici.
Ciascun organismo è costantemente soggetto sia a carichi meccanici esterni (es. la gravità e il movimento) sia a forze interne (es, la forza contrattile e le forze emodinamiche), generate principalmente (ma non solo) dalle cellule muscolari. Ciascuna cellula grazie al proprio citoscheletro ha la possibilità sia di sviluppare e che di sentire forze esterne che ne influenzano la morfologia, l’organizzazione del citoscheletro, la sopravvivenza, la differenziazione cellulare e l’espressione genica. Ciò diventa ancor più importante nel caso di cellule appartenenti a tessuti con un ruolo prettamente strutturale, quali quello muscolare, osseo e cartilagineo caratterizzati da sollecitazioni meccaniche di tipo ciclico la cui defezione porta a patologie gravemente invalidanti, come ad esempio la degenerazione della cartilagine articolare, o addirittura mortali, nel caso di problemi al tessuto cardiaco.
3 Proprio in tale ottica si colloca tale lavoro di tesi, che è imperniato sullo sviluppo di un bioreattore in grado di imporre stimoli meccanici controllati per riprodurre le condizioni di carico fisiologiche e/o patologiche a cui sono soggetti miociti, condrociti, osteociti e fibroblasti. La fase di progettazione della camera di coltura è stata preceduta da una modellizzazione sia in termini di analisi agli elementi finiti sia tramite lo sviluppo di un modello meccanico analitico, in modo da valutare l’effettiva rispondenza delle condizioni di sforzo all’interno del sistema col distretto fisiologico in esame. I modelli teorici realizzati si sono rivelati indispensabili al dimensionamento del dispositivo, in maniera tale da garantire caratteristiche similari a quelle presenti in-vivo in termini di sforzi, deformazioni e sovrappressioni localizzate. La rispondenza tra l’ambiente biologico e le condizioni sperimentali in-vitro così realizzate sono state utili anche in fase di convalida dei risultati degli esperimenti.
Il bioreattore, disegnato tramite l’ausilio di strumenti CAD, presenta le seguenti caratteristiche:
utilizzo di materiali biocompatibili, con costi contenuti, sterilizzabile e trasparente;
un ingombro contenuto in modo da non limitare l’attività di ricerca delle altre persone presenti nel laboratorio;
facilità montaggio ed utilizzo da parte di personale non qualificato;
conservazione della sterilità per lunghi periodi e quindi lunghi tempi sperimentali;
facilità di modulazione delle condizioni sperimentali;
volumi contenuti dei terreni di coltura in modo da ridurre i costi sperimentali e permettere una facile analisi, anche in tempo reale, dei metaboliti e cataboliti rilasciati dal tessuto in fase di sperimentazione.
Tutte le fasi che hanno portato dall’analisi del problema alla realizzazione di un tale dispositivo, nonché alla sua fase di validazione, sono riportate scrupolosamente in questo lavoro di tesi, che è stato suddiviso per semplicità di lettura in cinque capitoli. Nel primo capitolo vengono illustrati i principi ed i metodi dell’Ingegneria Tessutale, con particolare attenzione rivolta all’analisi critico-funzionale delle varie componenti di un bioreattore. Quindi, attraverso la descrizione della fisiologia dei tessuti cartilagineo, scheletrico e muscolare, vengono definiti i parametri di progetto di un bioreattore per l’imposizione di stimoli meccanici.
Il capitolo due è dedicato allo sviluppo di modelli fisico/matematici, sia analitici che numerici, per la descrizione dei flussi, degli sforzi e delle deformazioni che possono
4 essere imposti e modulati all’interno di una camera di trattamento cellulare attraverso il movimento di un attuatore. Il capitolo si chiude con il dimensionamento dell’attuatore stesso, ossia con la stima delle caratteristiche necessarie in termini di forza e velocità. Nel capitolo tre vengono descritte le caratteristiche elettromeccaniche del tipo di attuatore scelto e ne vengono introdotti i metodi di controllo che verranno implementati attraverso un dispositivo digitale programmabile.
Il quarto capitolo descrive tutte le problematiche di progettazione e le soluzioni adottate durante la realizzazione vera e propria del bioreattore, sviluppato in accordo con i modelli e gli schemi di controllo presentati nei capitoli due e tre, rispettivamente.
Infine, nel capitolo cinque vengono riportate le procedure e i risultati ottenuti durante le procedure di validazione del bioreattore per l’imposizione di stimoli meccanici. La metodologia validativa del sistema è stata incentrata su prove a vuoto, su prove senza attuazione e esperimenti di trazione ciclica di film polimerici su cui erano state coltivate cellule muscolari.
