Influenza dell'interazione tra smalti cosmetico e medicato sulla permeazione transungueale di farmaci antimicotici

Dipartimento di Farmacia

Corso di Laurea Magistrale a Ciclo Unico in

Farmacia

Tesi di Laurea

Influenza dell’interazione tra smalti cosmetico e medicato

sulla permeazione transungueale di farmaci antimicotici

Relatori: Candidato:

Prof.ssa Daniela Monti Alice Ghelardi

Dott.ssa Silvia Tampucci

RIASSUNTO

Il presente lavoro di tesi ha avuto come scopo la valutazione della permeazione in vitro di ciclopirox dopo applicazione della lacca medicata su una lamina di zoccolo bovino trattata con uno o più strati di smalto cosmetico.

Il ciclopirox è un potente antifungino utilizzato per il trattamento topico

dell’onicomicosi, un’infezione molto comune che colpisce le unghie e ne causa ispessimento, scolorimento e talvolta onicolisi. L’aspetto estetico dell’unghia infetta può avere delle conseguenze importanti sulla qualità della vita dei pazienti, andando ad avere un impatto negativo sull’autostima e sulle relazioni sociali. Durante questo periodo i pazienti tendono a mascherare l’unghia con l’applicazione di smalto

cosmetico, soprattutto le donne.

Per questo problema negli ultimi anni c’è stata la necessità di valutare l’influenza dell’interazione tra smalto cosmetico e medicato sulla permeazione transungueale di farmaci antimicotici. Fino ad ora, sono stati testati farmaci come tavaborolo,

eficonazolo e amorolfina. Il nostro studio ha preso in esame il ciclopirox contenuto all’interno della formulazione idrofila. Il lavoro si è articolato in diverse fasi. In una prima fase sono state eseguite prove di applicazione di smalto cosmetico sulle lamine di bovino cercando un protocollo standard che permettesse l’applicazione di una quantità fissa e uniforme di smalto.

Sono stati sottoposti allo studio differenti smalti cosmetici utilizzando differenti condizioni operative. In dettaglio, sono stati presi in considerazione 3 set di diverso spessore di lamine ungueali e sono stati applicati uno e due coat di smalto cosmetico andandone a verificare la variazione di spessore. In base a questi studi preliminari è stato scelto lo smalto cosmetico Dior Vernis Rouge 999 ed è stato visto che

l’applicazione di un coat o di due coat incideva notevolmente sullo spessore della lamina ungueale e sembrava esistere una relazione tra lo spessore delle lamine iniziale e l’applicazione di 1 coat o 2 coat di smalto cosmetico. In questa fase è stata valutata anche la resistenza del colore dello smalto cosmetico dopo singola

applicazione di lacca medicata idrofila a base di ciclopirox. Sono state testate più strategie per ridurne la perdita di colore e quella vincente è risultata la combinazione smalto cosmetico + top, sia nel caso della lamina ungueale trattata con 1 solo coat che con 2 coat.

In una fase successiva, è stata valutata la permeazione transungueale di ciclopirox dopo applicazione della lacca sulla lamina ungueale trattata con smalto cosmetico. La permeazione transugueale di ciclopirox sia in termini di flusso che di quantità permeata al termine dell’esperimento non appariva significativamente influenzata dalla presenza di un solo strato di smalto cosmetico. In presenza di due strati di smalto, invece, è stata notata una riduzione di permeazione di circa 4 volte. Inoltre l’applicazione giornaliera della lacca medicata non ha portato ad una alterazione del colore, mantenendo l’unghia in una condizione ottimale anche dal punto di vista estetico.

INDICE

I.

Introduzione………..………...1

1. Anatomia dell’unghia……….…..2

1.1. Struttura dell’unghia……….….2

1.2. Crescita e ricrescita della lamina ungueale………..6

1.3. Composizione chimica dell’unghia……….…6

2. L’onicomicosi……….……….…..8

2.1 Classificazione dell’onicomicosi ……….…...8

3. Trattamento dell’onicomicosi……….………....11

3.1. Terapia sistemica………..12

4. La terapia topica ungueale……….……….13

4.1. Permeazione transungueale ..………..…..14

4.1.1 Unghia umana e fattori che influenzano la permeazione transunguale………...…14

4.1.2 Membrane ottenute da zoccolo bovino come modello sperimentale di unghia umana……….16

4.2 Formulazioni ad applicazione topica ungueale……….17

4.2.1 Farmaci e prodotti commerciali utilizzati nella terapia topica………19

II.

Parte Sperimentale………...23

1. Scopo della tesi………23

2. Materiali………..24

2.1 Ciclopirox………..…..24

2.2 Smalto Dior Vernis (999 Rouge) e smalto Essie (Forever Yummy)………25

2.3 Nail base & top coat (Rimmel London) e smalto trasparente Kiko

(nail lacquer)………...25

3. Metodi……….….26

3.1 Studi preliminari per la preparazione della lamina ungueale bovina con smalto cosmetico………....26

3.1.1 Modello di tessuto ……….…...26

3.1.2 Applicazione di smalto cosmetico su lamine ungueale bovine: messa a punto di una tecnica standardizzata …………..……..26

3.1.3 Risultati………..………27

3.1.4 Strategie per evitare l’alterazione di colore dello smalto cosmetico dopo applicazione di lacca ungueale idrofila………28

3.2 Valutazione della permeazione transungueale di ciclopirox attraverso la lamina ungueale bovina trattata con smalto cosmetico…………..…….29

3.2.1 Studio di permeazione in vitro: condizioni operative ………….29

3.2.2 Determinazione quantitativa di ciclopirox……….31

3.2.3 Analisi dei dati………..31

3.2.4 Risultati………..32

4. Bibliografia……….….33

5. Tabelle………..38

1

I. INTRODUZIONE

L’unghia umana è simile agli artigli e agli zoccoli degli altri mammiferi. Si è evoluta parallelamente all’abilità manuale dell’uomo e la sua funzione principale è quella di proteggere la sommità delle dita delle mani e dei piedi dai traumi; allo stesso tempo partecipa alla sensibilità fine del tatto e permette semplici attività come il raccoglimento e la manipolazione degli oggetti.

La lamina ungueale è la parte più visibile dell’apparato dell’unghia: consiste in uno strato di cellule morte altamente cheratinizzate in stretto contatto tra loro ed è molto variabile tra gli individui: le lamine possono infatti essere piccole, grandi, larghe, strette, dure, lisce, ruvide, sottili ecc.

I disturbi dell’unghia vanno da condizioni relativamente innocue, come per esempio la pigmentazione dei grandi fumatori, a stati dolorosi e debilitanti in cui l’unghia può andare incontro a distrofia, ipertrofia, infiammazione, infezione. Tali condizioni interessano la sfera fisica, sociale e psicologica del paziente e possono influenzare la qualità della vita. Molti disturbi sono notoriamente difficili da curare e necessitano di lunghi tempi di trattamento e la ricaduta è comune.

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1. ANATOMIA DELL’UNGHIA

1.1 Struttura dell’unghia

Figura 1- Vista dorsale (A) e sagittale (B) del complesso ungueale

Le unghie umane sono lamine cornee disposte sulla superficie dorsale delle falangi terminali delle dita di mani e piedi; ricoprono una superficie cutanea, denominata letto ungueale, e sono circondate, sui lati e nella porzione prossimale, da una piega cutanea denominata vallo ungueale, distinto in plica ungueale prossimale e in plica ungueale laterale (Fig.1).

L’estremità prossimale della lamina ungueale (radice dell’unghia) rimane sotto la plica prossimale e rappresenta circa un quarto della lunghezza totale della lamina ungueale. In prossimità della radice, l’unghia ha un colore biancastro; questa regione, denominata lunula, ha la forma di mezzaluna ed è la porzione anteriore visibile della matrice ungueale (parte germinativa dell’unghia); il colore biancastro dipende dal tipo di cellule che la compongono (cellule paracheratosiche) le quali hanno la proprietà di riflettere la luce. E’ visibile soprattutto nel pollice, mentre nelle altre dita è spesso assente o talvolta ricoperta dalla cuticola.

La parte visibile della lamina ungueale è semitrasparente e permette di distinguere il colore del sottostante tessuto connettivo, ricco di vasi sanguigni.

Nella porzione distale del corpo dell’unghia si distingue la banda onicodermica (stretta banda trasversale, chiara, ambrata, traslucida, il cui spessore varia da 0.1 a 1mm) che corrisponde alla giunzione letto ungueale-iponichio ed è dovuta ad un ispessimento dell’epitelio ungueale. A questo livello la lamina si stacca dal letto ungueale a costituire il

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bordo libero dell’unghia che cresce in lunghezza e può consumarsi gradatamente o essere asportato.

La lamina ungueale è curva e ciò gli consente di essere incorporata nelle pliche ai margini prossimali e laterali, fornendo un forte attaccamento e rendendo il bordo libero uno strumento utile. Questa caratteristica è più marcata nelle dita delle mani rispetto a quella dei piedi.

La superficie superiore è relativamente liscia e brillante; con un numero variabile di creste che cambiano con l'età. Nell'infanzia, ci sono spesso creste parzialmente oblique corte denominate spina di pesce(fig. 2).Con l'età, queste scompaiono e le creste longitudinali diventano più comuni.

Figura 2- Creste longitudinali nel bambino.

La lamina ungueale è divisa in tre strati: dorsale, intermedio e ventrale come rappresentato

in Fig 3.

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Lo strato superficiale o dorsale della lamina è costituito da piccole cellule cheratinizzate le cui membrane plasmatiche sono unite le une alle altre tramite giunzioni strette o tight junction (zonula occludente), regioni specializzate di contatto intercellulare dove i foglietti esterni delle membrane di cellule adiacenti si fondono. La stabilità della giunzione sembra mantenuta da proteine intrinseche di membrana capaci di interagire col citoscheletro (Monesi et al., 2012).

La zona intermedia della lamina ungueale è costituita da cellule poliedriche la cui membrana plasmatica si interpenetra con le cellule vicine. Non sono presenti giunzioni occludenti, ma desmosomi puntiformi che rappresentano zone isolate di contatto in grado di mantenere le membrane cellulari adiacenti parallele e separate da uno spazio di circa 12-25nm. Le cellule, sotto la membrana, in corrispondenza del desmosoma, contengono un disco di materiale denso e fibroso detto placca, ed alcuni filamenti di cheratina detti tonofilamenti, che si inseriscono direttamente in ciascuna placca. I filamenti di cheratina si estendono all’interno della cellula formando cosi un’impalcatura citoplasmatica e costituiscono, insieme con un altro tipo di fibra intercellulare che connette le due metà del desmosoma, parte di una trama fibrosa che si estende attraverso l’intero strato ungueale e conferisce al tessuto la caratteristica rigidità (Avers et al.,1992).

Lo strato ventrale è formato da uno o due strati cellulari con qualche traccia di nucleo. Questo strato non è caratterizzato nell’ultrastruttura, se non da una vacuolizzazione estensiva delle cellule epiteliali (Proserpio et al.,1991).

In corrispondenza della parte prossimale del vallo ungueale è presente un’espansione dello strato corneo epiteliale, chiamata eponichio, formazione che deriva dalla plica ungueale prossimale e dalle pliche laterali ed è quindi costituita da un epitelio simile a quello della cute dorsale del dito, da cui si differenzia solo perché più sottile, privo di peli e con poche ghiandole sudoripare. La stessa area presenta inoltre la cuticola vera e propria che deriva dalla parte ventrale della plica ungueale prossimale ed è caratterizzata da un epitelio ancora più sottile di quello dell’eponichio, che non presenta creste epidermiche, papille dermiche o annessi.

Nei punti in cui le pliche ungueale laterali si spingono all’interno dei solchi ungueali laterali, l’epidermide perde lo strato corneo e continua, sotto il corpo dell’unghia, formando il letto ungueale. In questa sede il derma è fuso con la membrana fibro-elastica che avvolge la falange: l’epidermide consiste di uno strato basale e di uno strato spinoso, mentre l’unghia

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sostituisce lo strato corneo. Sotto l’estremità libera dell’unghia, in corrispondenza dell’iponichio, riappare nuovamente lo strato corneo.

Figura 4- Vista sagittale del complesso ungueale.

La matrice è costituita da un tessuto epidermico altamente rigenerativo che ha origine da

un’invaginazione dell’epidermide della regione dorsale delle dita e si estende sino alla porzione distale della lunula; è posizionata dietro al letto ungueale e dà origine all’unghia propriamente detta. La matrice quindi può essere considerata l’origine dell’unghia e in caso di trauma chirurgico e accidentale, una volta che si è verificato un danno della matrice, è difficile riparare in modo efficace (David de Berker et al.,2013). È divisa in più porzioni in alcuni casi chiamate matrice prossimale e matrice distale, in altri, matrice dorsale, intermedia e del letto (Proserpio et al.,1991).

La matrice ha la stessa struttura istologica dell’epitelio superficiale cutaneo e comprende: strato basale, strato intermedio e strato corneo. Contiene inoltre melanociti, cellule di Langerhans e cellule di Merkel.

Le cellule di Langeranhans si trovano in posizione basale e superficiale, contengono tipici granuli e svolgono una funzione immunitaria.

Le cellule di Merkel costituiscono dei recettori sensoriali, sono molto rare e sono state osservate solo nella matrice ventrale dell’alluce.

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1.2 Crescita e ricrescita della lamina ungueale

L’unghia è prodotta dalla matrice ungueale in maniera continua e uniforme, diversamente da quanto accade per i capelli.

La velocità di ricrescita dipende dal turnover cellulare ed è molto variabile fra gli individui: in media si valutano 3 mm mensili nelle unghie delle mani e 1 mm in quelle dei piedi. La normale crescita delle unghie delle mani si completa in circa 6 mesi, mentre quella dei piedi ha una durata di circa 18 mesi.

Lo sviluppo dell’unghia è più rapido nel genere maschile, nella mano dominante (destra per i soggetti destrimani e sinistra per i mancini), in condizioni climatiche temperate, nel periodo di gestazione, nei soggetti affetti da onicofagia, onicolisi e psoriasi. Il tasso di crescita è inferiore negli anziani, in soggetti affetti da infezioni acute e in terapia con farmaci antimicotici (Murdan et al., 2002).

1.3

Composizione chimica dell’unghia

La composizione chimica dell’unghia umana differisce significativamente dagli altri corpi membranosi. Il costituente principale è rappresentato dalla cheratina, una scleroproteina contenente alte percentuali di solfuri. L’intera porzione cheratinica può essere distinta in una frazione “povera di solfuri” e una frazione amorfa, “ricca di solfuri”. La prima è costituita da proteine fibrose in cui tutta la catena polipeptidica presenta un tipo di struttura secondaria ad alfa-elica destrogira nella quale compaiono spesso sequenze periodiche di aminoacidi. Più catene polipeptidiche si uniscono a formare una struttura più complessa, una superelica levogira detta “protofibrilla” che è stabilizzata dalla presenza di ponti disolfuro tra le catene. La porzione ad alfa-elica costituisce circa il 33-55% dell’intera cheratina. Ogni filamento ha un diametro compreso tra 7 e 10 nm e diversi μm di lunghezza. Le protofibrille sono associate ad una matrice amorfa costituita da proteine aventi una struttura globulare ricca di legami a idrogeno; questi legami catalizzano il legame delle proteine globulari tra loro e con le protofibrille.

Le analisi biochimiche hanno dimostrato che le unghie ed i capelli dell’uomo contengono gli stessi tipi di filamenti di cheratina, che non sono però presenti nell’epidermide cutanea (Baswan et al., 2017) perciò l’unghia viene generalmente considerata più simile ai capelli che alla cute. Tuttavia, Lynch et al. (1986) ed Heid et al. (1988) hanno scoperto all’interno

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delle cellule ungueali l’esistenza di una percentuale pari al 10% di cheratina tipica delle cellule dell’epidermide. Studi seguiti da Kitarahara et al. (1993) hanno permesso di accertare che nella matrice ungueale si sviluppano cheratinociti analoghi a quelli della pelle e dei capelli: i cheratinociti analoghi a quelli della pelle sono stati localizzati principalmente nella matrice dorsale e intermedia, mentre quelli analoghi a quelli dei capelli prevalentemente in quelli del letto. Nella matrice ungueale sono inoltre presenti delle cellule non ancora differenziate che esprimono entrambi i tipi di cheratina.

Le unghie umane contengono inoltre una discreta quantità di amminoacidi: ritroviamo una grossa quantità di acido glutammico, glicina, cisteina, arginina, acido aspartico, serina e leucina. La presenza di ponti disolfuro, dovuti all’alto contenuto di cisteina, conferisce alla struttura cheratinica un eccezionale stabilità chimica e fisica. Ai ponti disolfuro si aggiungono legami secondari che includono forze di Van der Waals, legami a idrogeno e forze di Coulomb; queste ultime si generano a causa della presenza di gruppi amminici carichi positivamente e gruppi carbossilici caricati negativamente. Per quanto riguarda la componente lipidica, essa rappresenta meno del 5% del contenuto totale ed esiste sotto forma di fosfolipidi, di colesterolo (per la maggior parte), di acidi grassi saturi, di acidi grassi insaturi e di idrocarburi. La componente lipidica è importante per l’elasticità della lamina e per la coesione intercellulare.

Le unghie umane contengono inoltre grandi quantità di oligoelementi soprattutto S e N, mentre ridotta è la quantità di Ca, Mg, Na, K, Fe, Cu e Zn (Vellar, 1970) e di vitamine, in particolare vitamina A, C, E, H e vitamine del gruppo B. Inizialmente il calcio era ritenuto responsabile della durezza della lamina dorsale dell’unghia (Jarret, 1966). Attualmente si ritiene che questa caratteristica sia dovuta alla presenza dei legami disolfuro. Nell’unghia del pollice sono state ritrovate tracce di Cr, Se, Au, Hg, Ag e Co (Kanabrocki et al., 1979). Gli oligoelementi e le vitamine costituiscono le sostanze più importanti per una corretta crescita ungueale. La cheratina, una proteina fibrosa elicoidale, è il componente principale delle lamine ungueali umane.

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2. L’ONICOMICOSI

L’onicomicosi è una delle infezioni ungueali più frequenti e colpisce soprattutto le unghie dei piedi. Riguarda circa il 4-9% della popolazione mondiale (Sigurgeirsson et al.,2014). Può essere causata da dermatofiti, muffe non dermatofitiche (NDMs) e lieviti (Candida spp). Approssimativamente il 90% delle infezioni da onicomicosi sono causate da dermatofiti (Trichophyton, Microsporum, and Epidermophton) e tra questi i ceppi più comuni sono Trichophyton rubrum and Trichophyton Interdigitale. Si stima che le infezioni ungueali da onicomicosi aumenteranno con l’intensificarsi di fattori predisponenti quali diabete, obesità, immunodepressione, fumo ed età. Infatti, nelle persone ultrasessantenni l’incidenza di onicomicosi è alta, corrispondente a circa il 40%. In un recente studio su pazienti con età superiore ai 65 anni, si è infatti osservato che le infezioni fungine sono la terza malattia più comune dermatologica. I bambini sono meno suscettibili in quanto le loro unghie crescono più velocemente, sono meno probabili i traumi cumulativi e la loro superficie ungueale è ridotta rispetto a quella degli adulti. Ulteriori fattori di rischio per l’insorgenza dell’infezione sono costituiti dalla genetica, la scarsa cura delle unghie e scarpe inadatte. I cambiamenti nell'aspetto delle unghie sono in genere i primi segni e sintomi di onicomicosi. Questi, possono variare a seconda della gravità dell’infezione e dal tempo di mancato trattamento. Il principale sintomo è l’alterazione cromatica dell’unghia chiamata discromia: l’unghia tende a cambiare il proprio colore sfumando da bianco a giallino. Può presentare delle macchie di diverso colore come il marrone, il verde e anche il nero. La superficie dell’unghia appare inoltre ispessita (ipercheratosi) e fragile. Può capitare, a volte, di percepire dolore e cattivo odore. Nei casi più gravi e trascurati, l’unghia può anche arrivare a staccarsi dal proprio letto ungueale (onicolisi). L’infezione fungina può portare il paziente ad una difficoltà nello

svolgere attività della vita quotidiana e talvolta, può compromettere le interazioni sociali (Gupta et al., 2019).

2.1

Classificazione dell’onicomicosi

Clinicamente, in base alle modalità di invasione dell’apparato ungueale da parte delle ife fungine, si distinguono diverse varietà di onicomicosi, che vengono qua di seguito

descritte:

• Onicomicosi subungueale distale(DLSO): rappresenta la forma di onicomicosi più

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invade l’unghia e il letto ungueale penetrando nei margini distali o laterali. Come mostrato in Figura 5, questa patologia è caratterizzata dall’accumulo di cheratina gialla tra la lamina ungueale e il letto ungueale (ipercheratosi subungueale), il distacco dell’unghia dal letto ungueale (onicolisi) e l’infezione cutanea intorno all’unghia (paronichia) (Yau et al., 2018).

Figura 5. Onicomicosi subungueale distale (Piraccini et al., 2015).

• Onicomicosi bianca superficiale (WSO): interessa generalmente le unghie dei piedi e rappresenta il 10% dei casi di onicomicosi. Questa patologia è causata da funghi che invadono direttamente gli strati superficiali della lamina ungueale e formano delle “isole” bianche opache distinte sulla superficie dell’unghia, che si diffondono gradualmente sull’intera unghia, facendola diventare morbida e friabile (Fig. 6) (Yau et al., 2018).

Figura 6. Onicomicosi bianca superficiale (Tosti et al., 2018).

• Onicomicosi subungueale prossimale (PSO): è una delle forme maggiormente

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dell’unghia a partire dalla piega ungueale prossimale e invadono la porzione prossimale della lamina nei suoi strati più profondi Clinicamente, l’unghia colpita presenta un’area di colore biancastro a livello della lunula che di solito include paronichia (infezione del tessuto periungueale) come mostrato in Fig.7. (Amen et al.,2014).

Figura 7. Onicomicosi subungueale prossimale.

• Onicomicosi endonica (EO): è una forma molta rara e si presenta con caratteristiche

macchie biancastre lattiginose, ma senza ipercheratosi e onicolisi del letto ungueale (Yau et al.,2018). Infatti, le ife fungine invadono direttamente la superficie dal margine distale avanzando verso quello prossimale e infettando le porzioni profonde della lamina ungueale. Questa patologia si differenzia dall’onicomicosi subungueale con origine prossimale in quanto quest’ultima tende a progredire distalmente (Tosti et al.,2017).

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• Onicomicosi distrofica totale (TDO): L’onicomicosi distrofica totale è la forma più avanzata di onicomicosi e colpisce la lamina ungueale, il letto ungueale e la matrice ungueale, causando una grave distrofia ungueale. Può esserci gonfiore cronico alla falange distale con l’unghia interessata che appare ispessita, di colore giallo-marrone e gravemente deformata come appare in Fig. 9 (Yau et al., 2018).

.

Figura 9. Onicomicosi distrofica totale (Piraccini et al., 2015).

3.

TRATTAMENTO DELL’ONICOMICOSI

Gli obiettivi della terapia per l’onicomicosi sono eliminare l’organismo fungino infettante e ripristinare l’unghia al suo stato fisiologico. Questo processo può richiedere del tempo vista la lenta crescita delle unghie che prevede un allungamento che va da 2 a 3 mm al mese per le unghie delle mani e 1-2 mm al mese per quelle dei piedi (Lipner et al.,2019).

La valutazione dell’efficacia del trattamento segue specifici endpoints, definiti come:

• Cura micologica: si ottiene in caso di colture negative e analisi microscopica con KOH negativa. L’esame microscopico con KOH permette di dimostrare rapidamente la presenza del micete, anche in caso di ife poco vitali. Viene prelevata una parte del materiale ungueale e posta su un vetrino, incubata per 1-4 ore in una soluzione di KOH al 20% e osservata al microscopio, a piccolo e medio ingrandimento. L’esame colturale permette l’isolamento del micete e viene effettuato su agar di destrosio di Sabouraud. Lo sviluppo di dermatofiti e muffe richiede tempi d’incubazione molto lunghi, talvolta anche di 3-4 settimane. L’isolamento in coltura di un dermatofita è ritenuto di per sé sufficiente per convalidare la diagnosi di onicomicosi, mentre quando il micete isolato è un lievito o una muffa, l’esame colturale deve essere ripetuto almeno due volte, con materiale ungueale fresco, per escludere che il reperto ottenuto dalla prima coltura

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possa essere legato ad una semplice contaminazione ambientale. Questo metodo ha un tasso di falsi negativi del 35% (Gupta et al., 2017).

• Cura clinica: si ottiene quando l’unghia risulta pulita al 100%; nei casi di onicomicosi più grave non è possibile ottenerla;

• Cura completa: quando i due end-point precedenti sono stati raggiunti (cura micologica + cura clinica) (Gupta et al., 2016)

Attualmente per la cura dell’onicomicosi esistono diverse modalità di trattamento. Nel caso di lieve e moderata onicomicosi si consiglia la terapia topica, mentre per le infezioni più gravi si usano trattamenti con somministrazione di antifungini per via orale. La combinazione delle due terapie (topica e orale) può aumentare l’efficacia e migliorare i risultati nei pazienti, probabilmente grazie ad un effetto sinergico, limitando l’effetto della resistenza fungina Gupta et al. (2016) hanno riassunto gli studi che combinano farmaco orali e / o topici per onicomicosi, mettendo in evidenza che la combinazione delle due terapie (anche se non sempre) è più efficace della monoterapia. Nella maggior parte degli studi sono stati associati farmaci per via orale (terbinafina o itraconazolo) con attivi somministrati per via topica (amorolfina o ciclopirox). La scelta della giusta terapia viene fatta tenendo conto, oltre che della gravità, anche della localizzazione e del tipo di infezione.

3.1 La terapia sistemica

La terapia sistemica è raccomandata nei casi più gravi di onicomicosi. Questa terapia viene sconsigliata nei casi in cui i pazienti stiano già assumendo altri farmaci contemporaneamente, come ad esempio gli anziani, gli immunodepressi, i pazienti in dialisi e i pazienti sottoposti a trapianti di organi. Può dare infatti interazioni farmacologiche, aumento del rischio di epatotossicità e insufficienza cardiaca congestizia (Lipner et al.,2019).

Gli antifungini orali raggiungono livelli antimicotici nel flusso sanguigno che superano di molto la minima concentrazione inibitoria (MIC). (Queller et al., 2015).

Attualmente la cura di 12 settimane (dosaggio continuo) con terbinafina è considerata lo standard per il trattamento dell’onicomicosi. Tuttavia, alcuni studi suggeriscono che la completa guarigione si ottiene solo nel 38% dei casi per le unghie dei piedi dopo 36 settimane dal trattamento. (Kawa et al.,2019).

La terbinafina è un allilammina ed esercita la sua attività antifungina inibendo la squalene epossidasi. Ha un ampio spettro di attività contro dermatofiti e in minima parte contro

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Candida spp e NMD. Tra gli effetti avversi più comuni legati alla terapia con questo farmaco abbiamo mal di testa, sintomi gastrointestinali ed eruzioni cutanee, i quali, però, raramente richiedono la sospensione della terapia (Kawa et al., 2019).

Un’altra molecola approvata per il trattamento di tipo sistemico è l’itraconazolo: un triazolo che blocca la crescita di nuovi funghi andando ad inibire la lanosterolo 14-alfa-demetilasi. Ha uno spettro d’azione più ampio rispetto alla terbinafina con maggiore efficacia contro dermatofiti, NDM e Candida spp. Il dosaggio approvato è di 200 mg due volte al giorno per una settimana seguito da un periodo di 3 settimane senza trattamento. Questo ciclo deve essere ripetuto per 3 volte nel caso di infezioni alle unghie dei piedi. Il tasso di guarigione completo è del 14%. Gli effetti avversi sono paragonabili a quelli della terbinafina (Lipner et al.,2019).

4. LA TERAPIA TOPICA UNGUEALE

La terapia topica è un trattamento auspicabile per le malattie dell’unghia come l’onicomicosi e la psoriasi ungueale, in quanto evita gli effetti avversi associati alla terapia sistemica, permette la penetrazione e l’accumulo di farmaco direttamente nella lamina ungueale dove il prodotto viene applicato, migliorando, inoltre, la compliance del paziente.

Gli antimicotici sistemici invece raggiungono il sito dell’infezione attraverso il letto ungueale e la matrice distribuendosi in tutta l’unghia. Elevate dosi devono essere somministrate per via sistemica per ottenere una concentrazione di farmaco attiva a livello ungueale con effetti collaterali notevolmente ridotti con la terapia topica.

L’efficacia della terapia topica però è limitata dall’alta resistenza della struttura cheratinizzata dell’unghia alla permeazione degli agenti attivi. La ricerca nel corso dell'ultimo decennio è stata focalizzata sull’aumento della permeabilità ungueale mediante l’uso di promotori di permeazione o di metodi fisici (ionoforesi, elettroporazione, microaghi) per ridurre temporaneamente le proprietà di barriera dell’unghia. Inoltre, la messa a punto di appropriate formulazioni è la chiave per portare concentrazioni terapeutiche di farmaco nel letto dell’unghia attraverso la lamina ungueale riducendo gli effetti collaterali di tipo sistemico.

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4.1

Permeazione transungueale

4.1.1 Unghia umana e fattori che influenzano la permeazione

transungueale

In virtù della sua composizione chimica, la lamina ungueale forma un’effettiva barriera alla penetrazione dei farmaci per cui la penetrazione dei principi attivi nell’unghia e la diffusione al suo interno sono estremamente basse se confrontate con quelle di altre membrane biologiche. Tuttavia, la lamina ungueale, nonostante la sua natura cheratinica altamente compatta, non è una struttura del tutto impermeabile; essa infatti rammollisce per assorbimento di acqua aumentando la sua permeabilità. Tale proprietà può essere sfruttata per fini terapeutici: l’applicazione topica di farmaci, direttamente sulla lamina ungueale, permette di trattare le patologie dell’unghia e del suo letto in modo più efficace e, soprattutto di evitare gli effetti collaterali associati alla terapia sistemica. La permeabilità della lamina ungueale, tuttavia, si rivela spesso troppo bassa per garantire un flusso di farmaco sufficiente a determinare l’effetto terapeutico auspicato; per questo motivo, negli ultimi 30 anni sono stati fatti molti studi che hanno dimostrato che la permeazione dei farmaci attraverso la lamina ungueale è influenzata dalle proprietà dell’unghia (spessore, idratazione), dalle proprietà chimico-fisiche del permeante, dalle caratteristiche della formulazione (pH, concentrazione del farmaco, presenza di promotori di permeazione) e dall’ interazione tra permeante e cheratina.

I fattori che influenzano la permeazione transungueale e quindi l’efficacia di una formulazione topica possono essere riassunti nel seguente schema (Fig. 10):

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Figura 10. Fattori che influenzano la permeazione ungueale.

La quantità di farmaco disponibile per la diffusione può essere notevolmente influenzata da processi di cristallizzazione quando il solvente volatile, etanolo principalmente, evapora rapidamente dopo l’applicazione.

Le proprietà e le condizioni dell’unghia possono giocare un ruolo di controllo importante, influenzato dai componenti della formulazione. L’unghia idratata sembra comportarsi più come un idrogel che come una membrana lipofila: prodotti di natura idrofila sono più affini all’unghia, la quale risulta più permeabile alla forma dissociata di composti ionici e di veicoli acquosi che sono quindi da preferire per promuovere la permeazione dei farmaci attraverso e nell’unghia.

Numerosi studi hanno dimostrato che il flusso di un permeante, attraverso la matrice cheratinica ungueale, è governato dalla legge di Fick:

dM/dt= -D A (dC/dx)

dove dM è la quantità di soluto che diffonde nel tempo dt, attraverso una superfice A, sotto l’influenza di un gradiente di concentrazione dC/dx; D è il coefficiente di diffusione.

Se ne deduce facilmente che l’entità della permeazione di una molecola attraverso la lamina ungueale è inversamente proporzionale al suo spessore e alle dimensioni molecolari del permeante: tanto più alto è il suo PM, infatti, tanto più difficilmente le molecole diffondono attraverso il reticolo cheratinico e tanto minore risulta la permeazione.

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Un altro parametro che influenza l’entità della permeazione è l’idratazione. L’unghia infatti si rigonfia in seguito ad idratazione, la distanza tra le fibre di cheratina aumenta, ed i pori aumentano le loro dimensioni facilitando la diffusione del permeante. In definitiva l’unghia idratata diventa meno selettiva al variare del peso molecolare del farmaco.

È ritenuto importante anche il rapporto idrofilità/lipofilicità. Il carattere idrofilo/lipofilo di una molecola può essere espresso ricorrendo al suo coefficiente di ripartizione n-ottanolo-acqua (LogPO/A) cioè al rapporto delle solubilità di una sostanza in questi due solventi.

Le indagini sull'influenza della lipofilicità sulla permeazione sono state ostacolate dal fatto che l'aumento della lipofilicità è direttamente proporzionale a un crescente peso molecolare. Sebbene l’influenza della lipofilicità sulla permeabilità dell’unghia sia meno rilevante dell'effetto che esercita la dimensione molecolare, non dovrebbe essere comunque trascurata (Elsayed et al., 2015).

Il rapporto idrofilicità/lipofilicità del farmaco è influenzato inoltre dal suo grado di dissociazione: farmaci che presentano deboli proprietà acide o basiche possono, in base al pH del veicolo, essere presenti in forma dissociata (ioni) o indissociata e le interazioni elettrostatiche che si vengono a creare tra le cariche delle molecole ionizzate di permeante e le cariche delle proteine dell’unghia (cheratina) possono promuovere o ridurre la permeazione transungueale. La ionizzazione può infatti portare ad un aumento della solubilità della molecola in acqua, ma ridurne la permeabilità attraverso l’unghia (Elsayed et al.,2015).

4.1.2 Membrane ottenute da zoccolo bovino come modello sperimentale

di unghia umana

Le unghie umane sono substrati difficilmente reperibili quindi si è reso necessario individuare un modello alternativo idoneo, che fosse in possesso di caratteristiche strutturali e di permeabilità analoghe a quelle dell’unghia umana. Mertin e Lippold, nel corso degli studi nel 1997, dopo aver scrupolosamente valutato gli effetti di numerosi parametri sulla permeazione attraverso le due barriere, proposero le membrane bovine quale modello alternativo alle unghie umane per gli studi di permeazione in vitro. Il modello animale, infatti, dimostrava di possedere caratteristiche analoghe a quello umano: si tratta in entrambi i casi di membrane cheratiniche che si comportano, nei confronti dei permeanti, come geli idrofili, anche se l’unghia bovina possiede una permeabilità 30 volte superiore ed una minore selettività nei confronti dei permeanti voluminosi. Per gli autori tuttavia, queste differenze

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non inficerebbero la validità del modello e consentirebbero esperimenti più brevi e l’acquisizione di risultati in tempi ragionevoli. Le lamine ungueali bovine presentano una rete cheratinica meno densa che, quando immersa in acqua, si rigonfia maggiormente. Questo con molta probabilità è causato da un contenuto in cisteina ed in ponti di solfuro significativamente più basso rispetto all’unghia umana. Abbiamo quindi una diversa mobilità del farmaco nelle due differenti strutture tridimensionali e quindi una differente permeabilità. In ogni caso, l’affinità di un penetrante per l’unghia umana e le lamine bovine, entrambi costituiti da cheratina, dovrebbe essere simile.

In tempi più recenti sono stati numerosi gli studi che hanno comprovato la validità della lamina ungueale bovina come modello di unghia umana. Monti et al (2011), in uno studio comparato tra lamine ungueali bovine e unghie umane infette, ne hanno confermato la validità determinando la permeazione transungueale di ciclopirox dopo applicazione sulla lamina ungueale bovina di una lacca idrofila: nonostante il flusso di ciclopirox attraverso le lamine ungueali bovine fosse circa 14 volte più alto rispetto a quello attraverso le unghie umane infette, le differenze sembravano dovute principalmente al maggiore spessore di queste ultime (4 volte più spesse) suggerendo una sostanziale equivalenza fra i due modelli.

4.2 Formulazioni ad applicazione topica ungueale

Le lacche ungueali rappresentano la formulazione topica di scelta rispetto alle tradizionali soluzioni o creme (difficoltà di applicazione, scarsa permanenza al sito di applicazione e facilità di essere eliminati) vista la maggiore permanenza della formulazione nel sito di azione, fattore ritenuto critico per ottenere il successo del trattamento. Il film è ottenuto utilizzando polimeri filmogeni ed ha la funzione di assicurare una maggiore adesione della formulazione con l’unghia, garantendo un continuo rilascio del farmaco per periodi più lunghi (Kataria et al., 2016). Alcuni esempi sono rappresentati dalle lacche viniliche o acriliche, le quali formano sulle unghie un film rigido e persistente che richiede una rimozione settimanale mediante l’utilizzo di solventi organici, a differenza delle lacche a base acquosa, le quali sono facilmente rimovibili con acqua ed applicabili nella zona periungueale dove la proliferazione dei funghi è favorita dalla presenza di ife fungine (Monti et al.,2010). La concentrazione del farmaco dopo l’applicazione diretta della lacca sull’unghia rimane ottimale. I solventi volatili che compongono il formulato evaporano creando il film, il quale agisce da deposito di farmaco permettendo il rilascio e la penetrazione/permeazione del principio attivo attraverso la lamina ungueale (Akhtar et al.,2016). Infatti, l’elevato gradiente

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di concentrazione ai due lati della barriera permette la diffusione del farmaco attraverso l’unghia, processo ulteriormente favorito dalla riduzione della perdita di acqua dalla superficie ungueale in seguito alla formazione del film che agisce come una pellicola e favorisce l’idratazione degli strati superiori della lamina ungueale, facilitando ulteriormente la diffusione dell’attivo. In Figura 10 sono riportati schematicamente i processi a cui è sottoposto il farmaco quando viene applicato sull’unghia attraverso una lacca.

Figura 10- Schema del meccanismo d’azione delle lacche ungueali

I principali componenti delle lacche ungueali sono ottimizzati per il rilascio del principio attivo, la stabilità, la facilità di trattamento (tempo per asciugare, trasparenza e assenza di lucidità) e si possono suddividere principalmente in agenti filmogeni, plastificanti, solventi (acetone, acetato di etile, etanolo ecc.). Gli agenti filmogeni possono essere di natura lipofila o idrofila. I primi sono impiegati nella preparazione di lacche ungueali ad applicazione settimanale o giornaliera per ottenere un film molto resistente agli insulti meccanici e al lavaggio; l’asportazione periodica del film, necessaria per effettuare le successive applicazioni, viene realizzata impiegando solventi organici o meccanicamente con l’ausilio di lame. I polimeri idrofili, invece, danno film asportabili mediante semplice lavaggio con acqua evitando l’insulto di solventi e lime sui tessuti compromessi dalla patologia; d’altra parte formulazioni di questo tipo devono necessariamente essere applicate notte-tempo e la somministrazione non può che essere giornaliera. Tra i lipofili, i più comunemente usati sono i copolimeri acrilici (Eudragit® _{e i copolimeri metilviniletere-acido malico (es. Gantrez}®_),

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tra gli idrofili, alcool polivinilico e polimeri di tipo polisaccaridico come i derivati del chitosano e il più rappresentato nelle lacche commerciali è l’idrossipropilchitosano. I plastificanti di uso comune sono esteri di acidi organici (acetiltributilcitrato, dibutil ftalato, isopropilmiristato) che hanno buone proprietà lubrificanti, emollienti e sono ottimi agenti di spargimento. Possono essere aggiunti umettanti come sorbitolo, e anche glicerolo, ossido di titanio, bismuto ossicloruro, ritardanti di sedimentazione, agenti chelanti, antiossidanti, silicati, sostanze aromatiche, agenti bagnanti, derivati lanolinici (Kataria et al., 2016).

Molti sono gli esempi commerciali di lacche ungueali soprattutto per il trattamento dell’onicomicosi. Possiamo ricordare tra le lacche ungueali lipofile Penlac (principio attivo: ciclopirox), Loceryl e Onilaq (principio attivo: Amorolfina) mentre tra quelle idrofile Neogermox (principio attivo: ciclopirox).

La ricerca è in continua attività nello sviluppo di nuovi carrier per la veicolazione di farmaci attraverso l’unghia. I farmaci antimicotici, ad esempio, sono stati veicolati in varie forme, anche nanostrutturate: ciclopirox in gel e nanoemulsioni gel, terbinafina in trasferosomi, liposomi ed etosomi, sertaconazolo in nanovescicole, itraconazolo in microemulsioni gel (Akhtar et al., 2016)

4.2.1 Farmaci e prodotti commerciali utilizzati nella terapia

topica

La terapia topica è raccomandata per le forme lievi e moderate di onicomicosi e nei casi in cui è sconsigliata la terapia orale. È spesso preferita in quanto gli effetti collaterali legati alla somministrazione sistemica sono ridotti così come le possibili interazioni farmacologiche. Questo tipo di approccio non è facilmente attuabile a causa della particolare composizione e struttura dell’unghia che riduce la permeabilità del farmaco attraverso la lamina ungueale. Tra i vari fattori che influenzano la penetrazione del farmaco abbiamo il peso molecolare, l’idrofilia, la formulazione (veicolo, pH, concentrazione farmaco, presenza di enhancers di diffusione) e le proprietà dell’unghia (spessore, idratazione, bassa permeabilità). Sono disponibili in commercio numerosi trattamenti topici in forma di smalti e soluzioni. I primi agenti antifungini commercializzati sotto forma di smalti ungueali sono stati quelli a base di amorolfina 5% (Loceryl®) e ciclopirox 8% (Penlac®).

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• Il ciclopirox è un derivato idrossipiridone ed esercita la sua attività antifungina chelando i cationi trivalenti, tra cui Fe 3+ _{e Al} 3+_{. Provoca l'inibizione degli enzimi}

metallo-dipendenti, in particolare i citocromi, le catalasi e le perossidasi che portano a un trasporto ridotto di ioni attraverso le membrane citoplasmatiche e una ridotta assunzione di nutrienti (Katarzyna Tabara et al.,2015). Ha un ampio spettro d’azione che comprende dermatofiti, Candida spp ed alcuni NDM (muffe non dermatofitiche). È stata inoltre dimostrata un’attività di queste molecole contro i batteri Gram + e Gram - (Lipner et al, 2019). In commercio è presente sia come smalto su base anidra (Penlac®), sia come smalto su base acquosa, contenente un agente filmante chiamato idrossipropil chitosano (HPCH) avente nome commerciale Onytec®. Monti et al. (2010, 2013) nei loro studi in vitro hanno dimostrato la maggiore efficacia di questa nuova formulazione a base acquosa nella penetrazione di ciclopirox attraverso le membrane di zoccolo bovino (modello accettato come rappresentativo delle unghie umane dei piedi) (Monti et al., 2011). Questa innovativa formulazione non richiede limatura delle unghie e può essere facilmente rimossa con acqua, migliorando notevolmente la compliance del paziente. L’HPCH è infatti in grado di formare una pellicola invisibile sulla superficie dell'unghia, che può prevenire l'invasione di funghi (Ghannoum et al., 2015). Inoltre, questo polimero consente alla formulazione di rimanere in contatto con la superficie dell'unghia per un tempo abbastanza lungo, permettendo così una penetrazione maggiore del ciclopirox all'interno e attraverso l'unghia (Monti et al., 2013). Per quanto riguarda invece l’applicazione di ciclopirox in presenza di polimeri insolubili in acqua (Penlac®), questo viene solitamente applicato sull'unghia pulita 3 volte a settimana durante il primo mese, due volte a settimana per il secondo mese ed infine una volta a settimana dal terzo mese in poi. L’aspetto negativo di queste formulazioni riguarda la rimozione settimanale con un solvente per unghie cosmetico. La formulazione idrofila, invece, deve essere applicata giornalmente perché rimovibile con acqua nella normale vita quotidiana ma gli studi clinici effettuati non hanno rilevato alcuna differenza statisticamente significativa nell’efficacia del farmaco. Una volta a settimana ciclopirox deve essere rimosso. In questo caso il ciclopirox viene applicato, una volta al giorno sull’unghia infetta e questa non deve essere lavata per almeno 6 ore. Per questo motivo è preferibile un’applicazione serale prima di coricarsi. Prurito e sensazione di bruciore locale sono tra gli effetti collaterali più comuni per entrambi i veicoli descritti, che si manifestano ad ogni modo con bassa frequenza (Schalka et al., 2012).

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• L'amorolfina è un derivato della morfolina con attività antifungina e fungistatica; inibisce la sintesi dell'ergosterolo su due livelli: inibendo la delta 14 reduttasi e la delta 7–8 isomerasi. Questo influisce sulla sintesi della membrana patogena e vede l’accumulo di steroli sferici non tipici nelle membrane citoplasmatiche fungine (Schalka et al., 2012). Monti et al. (2010, 2013, 2014) in vari studi hanno dimostrato la superiorità della formulazione Onytec® basata su HPCH contenente ciclopirox 8% rispetto al prodotto commerciale Loceryl® a base di amorolfina 5%, sia in termini di maggiore capacità di permeazione del farmaco attraverso l’unghia sia per l’efficacia nei confronti dei più comuni patogeni fungini.

• Efinaconazolo (Jublia®, 10% soluzione) è un farmaco triazolico attivo contro dermatofiti, muffe non dermatofitiche e lieviti. Agisce andando ad inibire la lanosterolo 14 α-demetilasi coinvolta nella biosintesi dell’ergosterolo. Ha una bassa affinità per la cheratina e questo le permette di penetrare facilmente la lamina ungueale. L’efinaconazolo, nonostante la bassa concentrazione minima efficace (MIC) e quindi la notevole potenza del farmaco, è dotato di una minor capacità di penetrazione in e attraverso la lamina ungueale rispetto al ciclopirox, infatti l’alta concentrazione solo a livello della parte più esterna della lamina ungueale potrebbe non essere sufficiente per la completa eradicazione dei patogeni, Nel caso di infezione da T. rubrum, l’attività antifungina sulla lamina ungueale sembra essere paragonabile a quella del ciclopirox (Monti et al., 2019).

Studi condotti su unghie di cadavere hanno dimostrato che la lacca ungueale contenenti efinaconazolo può essere usata anche in concomitanza con smalti cosmetici; infatti la penetrazione di efinaconazolo dopo applicazione di una soluzione ungueale al10% non era influenzata dall’applicazione di uno smalto cosmetico decorativo, mostrando concentrazioni molto simili a quelle viste in sua assenza (Kawa et al.,2019).

•

Il tavaborolo (Kerydin, 5% soluzione) è un antimicotico a base d’elemento boro. Agisce andando ad inibire un enzima fungino essenziale, la leucil-tRNA sintetasi, necessario per la sintesi proteica. La maggiore affinità per gli enzimi fungini permette al farmaco di essere selettivo contro l’agente patogeno senza interferire con la sintesi proteica dell’ospite. E’ efficace contro T.Rubrum e T. Mentagraphyes ed anche contro patogeni meno comuni come i lieviti. Dopo applicazione di questa formulazione, i livelli di farmaco nell’unghia rimangono alti anche dopo 3 mesi dal trattamento. Studi ex vivo su unghie di cadavere hanno mostrato un’alta penetrazione di tavaborolo rispetto a ciclopirox anche se il tavaborolo ha una MIC più elevata rispetto al ciclopirox nei confronti

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dei più comuni agenti patogeni. In dettaglio, è stato dimostrato che la quantità di soluzione di tavaborolo al 5% che penetra attraverso l’unghia di cadavere ex vivo è 250 volte più alta della soluzione di ciclopirox all'8% dopo 14 giorni di applicazione giornaliera (Jinna et al., 2015).

Diversi studi hanno valutato gli effetti dello smalto cosmetico sulla penetrazione di tavaborolo ed hanno osservato che la presenza di smalto non influisce negativamente sulla sua penetrazione. Nonostante la preoccupazione per il profilo di tossicità legato al boro, il tavaborolo sembra avere un ottimo profilo di sicurezza. Infatti, studi effettuati sui roditori hanno confermato che questo farmaco è possibile sull’uomo, senza alcun effetto di tipo canceroso (Kawa et al., 2019).

Attualmente sono in fase di studio altri trattamenti topici, quali: auriclosene, ME11,

luliconazolo. NCV 422 (auriclosene) è un agente antibatterico e antifungino ad ampio

spettro d’azione appartenente alla famiglia degli aganocidi. Gli attuali studi clinici si stanno concentrando sul trattamento di impetigine, congiuntivite e infezioni urinarie. Tuttavia, studi preclinici hanno valutato la sua efficacia nel trattamento dell’onicomicosi. ME11 è un composto fungicida, efficace contro dermatofiti. Non è ancora stata valutata la capacità antifungina di questo farmaco in presenza di cheratina (Kawa et al., 2019).

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II. PARTE SPERIMENTALE

1. SCOPO DELLA TESI

Lo scopo della presente tesi è stato valutare la permeazione in vitro di ciclopirox dopo applicazione della lacca medicata su una lamina di zoccolo bovino trattata con uno o più strati di smalto cosmetico.

Il ciclopirox è un potente antifungino utilizzato per il trattamento topico dell’onicomicosi, un’infezione molto comune che colpisce le unghie e ne causa ispessimento, scolorimento e talvolta onicolisi. L’aspetto estetico dell’unghia infetta può avere delle conseguenze importanti sulla qualità della vita dei pazienti, andando ad avere un impatto negativo sull’autostima e sulle relazioni sociali. Durante questo periodo i pazienti tendono a mascherare l’unghia con l’applicazione di smalto cosmetico, soprattutto le donne.

Per questo problema negli ultimi anni c’è stata la necessità di valutare l’influenza dell’interazione tra smalto cosmetico e medicato sulla permeazione transungueale di farmaci antimicotici. Fino ad ora, sono stati testati farmaci come tavaborolo, eficonazolo e amorolfina. Il nostro studio ha preso in esame il ciclopirox contenuto all’interno della formulazione idrofila. Il lavoro si è articolato in diverse fasi. In una prima fase siamo andati ad eseguire prove di applicazione di smalto cosmetico sulle lamine di bovino cercando un protocollo standard che permettesse l’applicazione di una quantità fissa e uniforme di smalto. In una fase successiva, abbiamo valutato la permeazione transungueale di ciclopirox dopo applicazione della lacca sulla lamina ungueale trattata con smalto cosmetico. Infine, è stato valutato l’aspetto estetico dell’unghia in seguito ad una applicazione continuativa giornaliera di lacca medicata idrofila dal momento che la terapia antimicotica topica prevede un periodo di trattamento molto lungo.

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2. MATERIALI

•

Lacca ungueale idrofila a base di ciclopirox contenente alcol cetostearilico come agente plasticizzante e come solventi una miscela di etilacetato, etanolo (96%) ed acqua.

• Smalto Dior Vernis (999 Rouge) • Smalto Essie (Forever Yummy)

• Smalto trasparente Kiko (Nail lacquer) • Nail Base & Top coat (Rimmel London) Tutti i gli altri solventi sono di grado analitico.

2.1

Ciclopirox

Figura 11. Struttura chimica del Ciclopirox

Ciclopirox è un agente antifungino topico appartenente alla classe chimica degli idrossipirodoni, in particolare è 1-idrossipiridin-2 (1H) -one in cui gli idrogeni nelle posizioni 4 e 6 sono sostituiti dal gruppi metile e dal gruppo cicloesilico.

Ciclopirox è un antimicotico a largo spettro con effetto fungicida sui dermatofiti, lieviti e muffe non dermatofitiche. Ha attività anche contro molti batteri Gram-positivi e Gram-negativi e ha proprietà antinfiammatorie.

Ciclopirox esercita la sua azione legandosi e chelando cationi trivalenti, come Fe3 + e Al3 +, inibendo così la disponibilità di cofattori essenziali per gli enzimi metallo-dipendenti. Ciò può comportare una perdita di attività di questi enzimi che sono essenziali per il metabolismo

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cellulare, l'organizzazione della struttura della parete cellulare e altre funzioni cellulari cruciali come per esempio la degradazione dei perossidi all’interno della cellula fungina. Ciclopirox e il suo sale di olamina, sono disponibili in numerose formulazioni topiche, adatte all’applicazione sulla pelle e sulle unghie. Le forme farmaceutiche più studiate sono 1% ciclopiroxolamina crema e 8% ciclopirox lacca ungueale. La lacca ungueale è presente in due diversi veicoli: la prima generazione di lacche include una resina insolubile come agente filmante mentre la nuova generazione presenta idrossipropil chitosano, un amminopolisaccaride solubile in acqua.

2.2 Smalto Dior Vernis (999 Rouge) e smalto Essie (Forever yummy)

Lo smalto per unghie è una lacca sintetica che va distribuita su tutta la superficie della lamina ungueale per proteggere e/o colorare l’unghia. Lo smalto contiene una miscela di pigmenti inorganici (coloranti), un agente filmogeno che ricopre l’unghia di un film sottile, solventi, resine che insieme all’agente filmogeno rende lo smalto più aderente, i plastificanti, indicati per dare al film elasticità e flessibilità per prevenire la scheggiatura dello smalto, i gelificanti e gli addensanti per permettere ai pigmenti di rimanere in sospensione nella bottiglietta, i fotostabilizzanti per evitare l’alterazione del colore dello smalto all’esposizione dei raggi solari ed altri ingredienti come glicerina, cera d’api e lanolina con azione idratante, emolliente e nutriente.

In molti casi si ricorre all’utilizzo dello smalto cosmetico per coprire e correggere le imperfezioni dell’unghia dovute a patologie fungine e batteriche. In tal caso vengono scelti smalti dalla colorazione intensa e coprente in modo da rendere invisibile l’unghia malata. Nel nostro studio sono stati presi in esame due smalti di colorazione rossa: Dior Vernis (999 Rouge), e Essie (Forever Yummy). In tabella 1 è riportata la composizione qualitativa degli smalti in oggetto.

2.3 Nail base & top coat (Rimmel London) e smalto trasparente Kiko (nail

lacquer)

Nail base & top coat 5 in 1 è uno smalto che può essere utilizzato sia come base che come top coat. L’utilizzo come base implica un’applicazione precedente a quella dello smalto colorato in modo da rinforzare, proteggere e creare una base uniforme. Come top coat viene

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applicato dopo lo smalto colorato per fissare, intensificare la brillantezza e proteggere le unghie da graffi, scheggiature e desquamazione.

Lo smalto trasparente (Kiko) è proprio come qualsiasi altro smalto ma privo di pigmento. È vulnerabile a graffi, scheggiature e desquamazione. In tabella 2 è riassunta la relativa composizione qualitativa.

3. METODI

3.1 Studi preliminari per la preparazione della lamina ungueale

bovina con smalto cosmetico

3.1.1. Modello di tessuto

Zoccoli bovini sono stati prelevati da animali appena macellati: dopo averli liberati dai residui di tessuti cartilaginei e connettivi rimasti adesi, la convessità di ogni zoccolo è stata tagliata in modo da ottenere aree quadrate di 3.5-4 cm di lato. I frammenti così ottenuti al fine di renderli più malleabili sono stati idratati mediante immersione in acqua distillata per 24 ore; infine sono stati ridotti in lamine di diverso spessore: compreso tra 100 e 200 micron mediante l’uso di un criomicrotomo (2800 Frigocut E, Reichert-Jung

).

3.1.2 Applicazione di smalto cosmetico su lamine ungueali bovine:

messa a punto di una tecnica standardizzata

In questa fase del lavoro è stata valutata la strategia migliore per l’applicazione di smalto cosmetico sulle lamine ungueali bovine cercando un protocollo standard che mi permettesse l’applicazione di una quantità fissa di smalto e tale da ricoprire uniformemente l’unghia. Sono stati sottoposti allo studio in questa fase preliminare differenti smalti cosmetici utilizzando differenti condizioni operative. Il protocollo sperimentale prevedeva l’applicazione di 1 o 2 strati di smalto con la successiva verifica della variazione dello spessore dell’unghia. Successivamente, sopra lo smalto cosmetico veniva applicata la lacca medicata a base di ciclopirox e veniva eseguita una valutazione visiva per la verifica del mantenimento del colore, come indice di integrità dello strato di smalto cosmetico e conseguentemente delle proprietà di barriera. Lo studio è stato effettuato utilizzando lamine ungueali bovine appartenenti a 3 range di spessore: 60-90 micron, tra 90 e 170 micron e tra 180-300 micron.

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Le lamine ungueali bovine sono state idratate in acqua depurata per 24 ore in modo tale da rendere la membrana più malleabile e quindi da permettere l’applicazione uniforme dello smalto cosmetico. Prima dell’applicazione dello smalto, le unghie sono state asciugate con carta assorbente e ne è stato misurato lo spessore. Successivamente in un primo set di lamine (n=4) è stato applicato 1 strato di smalto cosmetico con l’ausilio di uno stampo di forma circolare corrispondente all’area della cella di diffusione verticale tipo Gummer utilizzata per gli studi di permeazione transungueale (Fig. 11). Lo smalto è stato lasciato asciugare all’aria per circa 10 minuti. Dopo ulteriore idratazione in acqua per 10-15 minuti (Fig.12) ne è stato misurato nuovamente lo spessore. Un secondo set di lamine (n=4) è stato trattato con un secondo strato di smalto (Fig. 13) valutandone lo spessore.

Infine, in entrambe le lamine ungueali è stata applicata la lacca medicata idrofila a base di ciclopirox ed è stata valutata la resistenza del colore dello smalto cosmetico dopo una singola applicazione e dopo applicazioni giornaliere per 5 giorni.

3.1.3. Risultati

Il primo approccio a questo lavoro è stato quello di applicare sulla lamina ungueale bovina 2 differenti smalti cosmetici: Dior Vernis Rouge 999 ed Essie Forever yummy. Rispetto allo smalto Essie Forever yummy, il prodotto Dior Vernis ha permesso una più facile ed uniforme distribuzione del film di smalto sul substrato con maggiore resistenza del colore quando più coat venivano applicati per cui gli studi successivi sono stati eseguiti utilizzando lo smalto cosmetico Dior.

Come ben evidenziato in figura 13, il secondo strato di smalto portava alla copertura più uniforme dell’unghia e dava un aspetto più lucido al substrato. L’applicazione di un coat o di due coat incideva notevolmente sullo spessore della lamina ungueale e sembra esistere una relazione tra lo spessore delle lamine iniziale e l’applicazione di 1 coat o 2 coat di smalto cosmetico. Sono stati presi in considerazione 3 set di diverso spessore di lamine ungueali: 60-90 m, 90-170 m e 180-300 m. I dati relativi alla variazione di spessore (%) rispetto al controllo non trattato dopo applicazione di 1 coat e 2 coat di smalto cosmetico nei 3 gruppi di lamine sono riassunti in tab. 3. Nel caso di 1 coat, sembra che sia presente una maggiore incidenza dello smalto cosmetico sulla variazione dello spessore: 44.03 ± 6.66% per le lamine del gruppo 60-90 m e tra 24.31 ± 3.09% e 22.00 ± 1.76% per le lamine dei gruppi 90-180 m e 180-300 m, rispettivamente. Nel

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caso dei 2 coat, sembra non sussistere una differenza significativa nel comportamento dei 3 set di unghie rimanendo in un range di variazione tra 53.67 e 73.89 %.

Sulla lamina ungueale trattata con 1 o 2 coat di smalto cosmetico sono stati applicati 10 microlitri di lacca medicata ed è stata effettuata una valutazione visiva delle dell’unghia in termini di colore secondo le indicazioni riportate in tabella 4 attribuendo uno score (grado) ad ogni condizione. Come dimostrano i risultati di tale analisi riportati in tabella 5 e ancora più chiaramente la foto Fig. 14, i solventi presenti nella lacca medicata (in particolare etilacetato ed etanolo 96%) portano ad un’alterazione del colore dello smalto cosmetico, soprattutto quando l’applicazione dello smalto medicato avviene quotidianamente per più giorni. Questo fenomeno dovrebbe essere evitato in quanto la barriera non è integra e questo potrebbe inficiare gli ulteriori studi di permeazione transungueale.

3.1.4 Strategie per evitare

l’alterazione di colore dello smalto

cosmetico dopo applicazione di lacca ungueale idrofila

Al fine di ridurre la perdita di colore sono state seguite due strategie volte a schermare lo smalto cosmetico:

1) Il primo tentativo è stato quello di isolare lo smalto cosmetico utilizzando uno smalto per unghie trasparente. Dopo l’asciugatura dello smalto cosmetico sulla lamina ungueale bovina è stato applicato direttamente lo smalto trasparente con l’ausilio del pennellino in modo da ricoprire completamente e uniformemente la superficie. 2) Lo stesso procedimento è stato ripetuto utilizzando come copertura dello smalto

cosmetico un top coat.

In entrambi i casi è stata eseguita la misura dello spessore finale della lamina ungueale ed è stata valutata visivamente la resistenza del colore quando la lacca medicata era applicata sulla lamina trattata con smalto cosmetico + top e su smalto cosmetico colorato+ smalto cosmetico trasparente.

In base al grado di resistenza del colore la strategia vincente è risultata la combinazione smalto cosmetico + top sia nel caso della lamina ungueale trattata con 1 solo coat che con 2 coat. In Figura 15 è riportata la condizione di una lamina ungueale bovina trattata con 2 coat di smalto cosmetico + top coat dopo applicazioni ripetute di lacca medicata e rimozione del residuo con un batuffolo di cotone imbevuto d’acqua. L’influenza della

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presenza del top coat sulla variazione dello spessore dell’unghia è stata determinata su un set di unghie dello spessore 90-170 m, utilizzato successivamente per gli studi di permeazione transugueale. I risultati sono riportati in tab. 6. Si evidenzia un leggero aumento di spessore in seguito all’applicazione del top coat di circa 1.3 volte, indipendentemente dal tipo di trattamento.

3.2 Valutazione della permeazione transungueale di ciclopirox attraverso

la lamina ungueale bovina trattata con smalto cosmetico

3.2.1. Studio di permeazione in vitro: condizioni operative

Gli studi di permeazione sono stati eseguiti utilizzando lamine ungueali bovine trattate con 1 e 2 strati di smalto cosmetico Dior Vernis 999 Rouge ed in tutte le unghie è stato applicato anche uno strato di top coat, preferito rispetto allo smalto cosmetico trasparente, per evitare la perdita di colore dello smalto in seguito alla ripetuta applicazione di ciclopirox. Prima degli esperimenti le lamine già preparate con smalto cosmetico sono state idratate per 2 ore per ridurre la rigidità e dare loro una forma planare che ne facilitasse l’introduzione nell’apparato di perfusione. Dopo questo preliminare stadio di imbibizione, le unghie sono state asciugate con carta assorbente e ne è stato determinato lo spessore.

Gli studi di permeazione sono stati eseguiti con le celle di diffusione verticali tipo Gummer (Fig. 14-15) ed avevano una durata di 5 giorni (96 ore).

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Figura 14- Celle verticali di tipo Gummer

Figura 15- Struttura di una cella Gummer

La cella è costituita da un compartimento donatore e uno ricevente aventi un volume di 1.0 e 5.0 ml, rispettivamente. La lamina veniva interposta tra i due compartimenti e l’area disponibile per la permeazione era di 1.23 ± 0.99 cm². Nel compartimento donatore venivano introdotti 10 μl di lacca ungueale contenente ciclopirox e asciugato sottocorrente d’aria leggermente riscaldata per garantire l’evaporazione del solvente e la formazione di un film polimerico sulla membrana. L’applicazione della lacca medicata (10 μl) veniva ripetuta giornalmente per 5 giorni consecutivi previa rimozione dalla lamina ungueale del residuo della precedente applicazione con un batuffolo di cotone imbevuto d’acqua. Come riferimento è stata monitorata la permeazione transungueale del ciclopirox dalla lacca ungueale posta direttamente a contatto con la lamina ungueale bovina senza alcun strato

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interposto. Come fase ricevente, simulante i liquidi biologici, viene usato tampone fosfato isotonico (PBS, 66,7 mM, pH 7.4) contenente 0,003% p/v di sodio azide per prevenire la crescita batterica. La fase ricevente veniva agitata con agitatore magnetico a stella ad una velocità costante di 600 giri/min; la temperatura del sistema era mantenuta costante a 37°C mediante circolazione d’acqua termostatata nella doppia parete della cella. Ad intervalli di tempo regolari (ogni 6 ore) venivano effettuati prelievi della fase ricevente sostituendoli con egual volume di fase ricevente fresca per mantenere le condizioni di sink. La quantità di farmaco permeata veniva determinata mediante analisi HPLC. Tutti gli esperimenti venivano eseguiti in triplicato.

3.2.2. Determinazione quantitativa di ciclopirox

La determinazione quantitativa di CPX nei campioni è stata effettuata mediante metodica HPLC. L’apparecchiatura consisteva in un sistema Shimadzu (Shimadzu Corp., Kyoto, Giappone) LC-20AD con un rivelatore UV SPD-10A dotato di autocampionatore SIL-10AD VP e un sistema di integrazione computerizzata. La valvola di iniezione era un Rheodyne con capacità di 20 μl. È stato utilizzato un Phenomenex SynergiTM 4 μm Fusion-RP80Å, colonna LC 150 mm x 4,6 mm. La colonna è stata termostata a 60 ° C con un controller di temperatura (ThermasphereTM, Phenomenex). La fase mobile consisteva in una miscela di acetonitrile: acido fosforico 20 mM; metanolo (50:30:20); il flusso e la lunghezza d’onda di rilevamento erano rispettivamente di 1,0 ml / min e 302 nm. Il tempo di ritenzione è stato di 4 minuti. L’analisi quantitativa di CPX nei campioni di fase ricevente è stata eseguita per confronto con una retta di taratura esterna ottenuta diluendo con tampone fosfato

isotonico a pH= 7.4 una soluzione madre in metanolo rispetto alle corrispondenti aree di picco nei cromatogrammi HPLC. La curva di taratura risultava lineare (Y = 42268X - 9650, R²= 0,9993) nel range di concentrazione testato 0.34 — 6.80 μg/mL.

3.2.3. Analisi dei dati

I parametri ricavati dall’analisi della regressione lineare del profilo di permeazione allo stato stazionario sono:

• flusso allo stato stazionario (J), definito come g di ciclopirox che permeano il substrato nel tempo per unità di superficie