52 Capitolo 4
Risultati e discussione
4.1 Profili di espressione ottenuti con RT-PCR per i canali al potassio voltaggio attivati hERG1 e hEag1
L’estrazione dell’RNA totale dalle cellule è stata eseguita secondo la procedura descritta nella sezione “Materiali e Metodi”. I campioni di RNA ottenuti sono stati analizzati mediante spettrofotometro NanoDrop. I risultati dell’analisi hanno mostrato un rapporto A260/A280 compreso tra
1,8 e 2,0 per tutti i campioni, indice di un buon grado di purezza dell’RNA estratto. Per quanto riguarda la stima della concentrazione, i valori sono espressi come rapporto μg/μl e rientrano nei range indicati nel manuale del kit fornito da Qiagen.
Successivamente all’analisi quali-quantitativa, l’RNA è stato valutato tramite elettroforesi, al fine di verificarne l’integrità.
L’RNA totale (1μg) è stato poi retrotrascritto, per poter ottenere cDNA da utilizzare nelle reazioni di PCR.
Per verificare l’efficacia dell’esecuzione del protocollo di retrotrascrizione, è stata eseguita una PCR iniziale con primer specifici per la GAPDH. Il gene della GAPDH è un gene costitutivo, definito anche housekeeping, in quanto, codificando per proteine fondamentali per la vita della cellula, è sempre presente ed espresso in misura simile nei diversi organi e tessuti di un organismo. Le condizioni di PCR per l’amplificazione con primer relativi alla GAPDH sono state perciò ottimizzate in modo da ottenere una sola banda elettroforetica delle
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dimensioni molecolari attese (vedi Tabella 3) ed evitare la formazione di amplificati aspecifici. Nei diversi campioni, le bande relative alla GAPDH hanno esibito una stessa intensità, come è ragionevole aspettarsi dallo studio di espressione di un gene costitutivo.
Figura 17. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi alla GAPDH su cellule A375
Una volta verificata la corretta esecuzione del protocollo di retrotrascrizione, è stato possibile procedere con l’indagine dell’eventuale espressione dei geni per i canali al potassio voltaggio attivati hERG1 e hEag1.
Nella sezione “Materiali e Metodi”, la Tabella 3 indica i protocolli utilizzati per le PCR eseguite e la lunghezza degli amplificati attesi. L’espressione dei due sottotipi di canali al potassio hERG1 e hEag1 è stata indagata utilizzando, in entrambi i casi, un protocollo di amplificazione che prevede l’impiego di un gradiente di temperatura per
L 100pb GAPDH
300
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la ricerca della T di annealing ottimale per le coppie di primer scelti. Per quanto riguarda hERG1 sono state saggiate otto temperature: tutte le T di annealing hanno dato la banda attesa, priva di aspecifico e la T migliore è risultata essere 66°C (fig.17).
Anche per il canale hEag1 sono state testate 8 temperature che hanno dato la banda attesa con simile intensità: quella più intensa è risultata essere corrispondente alla temperatura di 57,4°C. Per il sottotipo hEag1 sono state individuate due varianti: la variante1 di 556pb e la variante2 di 474 pb. Entrambe le varianti sono espresse sulla linea cellulare di melanoma A375, con una maggiore espressione della variante2 rispetto alla varaiante1 che risulta debolmente espressa (fig.18).
hERG1 229pb
hERG1 Ladder 100pb
Figura18. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relative al canale hERG1 su cellule A375
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hEag1 variante1 556pb
hEag1 variante2 474pb
Ladder 100pb hEag1
Figura19. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi al canale hEag1 su cellule A375
E’ stata valutata anche l’espressione dei due canali al potassio voltaggio attivati hERG1 e hEag1 su cellule HaCaT, cheratinociti umani immortalizzati non tumorali (fig.19).
hERG1 hEag1 (229pb) (var1 : 556pb var2 : 474pb) hERG1 229pb Ladder 100pb
Figura20. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi ai canali hERG1
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I risultati ottenuti sui cheratinociti evidenziano la sola espressione del sottotipo di canale hERG1. L’assenza di espressione dell’mRNA per il sottotipo hEag1 è stata confermata anche dopo riamplificazione.
Essendo le cellule HaCaT cheratinociti, questo non ci permette di indicare la sovraespressione dei canali in studio come un marker della cellula tumorale rispetto alla corrispondente sana. Tuttavia, la mancanza di espressione del canale Eag1 nelle cellule epidermiche non tumorali può, invece, suggerire la possibilità di una buona selettività
farmacologica di modulatori di questo canale a livello cutaneo. Questi dati sono in linea con quanto riportato in letteratura dove si
evidenzia una iperespressione di questi canali su cellule tumorali rispetto alle cellule sane.
I profili di espressione dei canali al potassio voltaggio attivati hERG1 e hEag1 derivanti dalle PCR condotte su cDNA di cellule A375 e HaCaT, sono riassunti in tabella 4.
Linea cellulare hERG1 (229pb) hEag1 (var.1-556pb, var.2-474pb)
A375 + +
HaCaT ± _
Tabella5. Profilo di espressione ottenuto mediante RT-PCR qualitativa con primer relativi ai canali al potassio hERG1 e hEag1 sulle linee cellulari umane di melanoma cutaneo A375 e cheratinociti HaCaT. Simboli: + : espresso - : non espresso ± : debolmente espresso
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4.2 Valutazione dell’azione di CisPt e Temozolomide sulla vitalità delle cellule di melanoma cutaneo umano A375
CisPt e Temozolomide sono stati testati in quanto usati come farmaci di riferimento in chemioterapia nel melanoma cutaneo [Azzabi A. et al., 2005]. Il CisPt, farmaco alchilante, è stato testato in un range di concentrazioni 0,1-100μM, mentre la Temozolomide (derivato del farmaco Dacarbazina) in un range di concentrazioni più ampio tra 10 e 400µM; entrambi i composti sono stati trattati per 48 ore di esposizione sulla linea cellulare di melanoma cutaneo umano A375. I risultati hanno mostrato che entrambi i composti sono in grado di ridurre la vitalità cellulare in modo concentrazione-dipendente (fig. 21-22), evidenziando una maggiore attività del CisPt (IC50~4,32µM) rispetto alla Temozolomide (IC50~250,86).
Figura 21. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con CisPt ( 0,1-100 μM), dopo 48h di esposizione, 1% FBS. WST-1 Cis-Pt A375 48h 1% FBS -8 -7 -6 -5 -4 0 20 40 60 80 100 120 140 IC50 = 4.320,04M n=3 log M CisPt % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
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Figura 22. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con Temozolomide ( 0,1-400 μM), dopo 48h di esposizione, 1% di FBS.
L’inibizione della vitalità cellulare indotta da CisPt e lo scarso effetto della Temozolomide sono in accordo con quanto riportato in letteratura dove sono presenti studi effettuati su linee cellulari di melanoma cutaneo A375, SKmel28 e DX3 [Reuland S.N. et al., 2011; Azzabi A. et al., 2005]. La Temozolomide è un profarmaco inattivo che subisce una rapida idrolisi enzimatica a pH fisiologico, per dare il metabolita MTIC (5-(3-methyltriazen-1-yl) imidazole-4-carboxamide) che viene ulteriormente degradato a metabolita attivo citotossico AIC (4-Amino-5-imidazole-carboxamide). Si ipotizza che il metabolita MTIC eserciti la sua attività antitumorale alchilando le posizioni O6 e N7 dell’amminoacido Guanina in DNA e RNA [NingaraJ S.N. et al., 2009]. Dati in letteratura evidenziano una resistenza alla Temozolomide, in
WST-1 Temozolomide A375 48h 1% FBS -6 -5 -4 -3 0 20 40 60 80 100 120 140 n=3 IC50=250,860,86M log M Temozolomide % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
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diverse linee cellulari di melanoma cutaneo [Guida M. et al., 2010], in accordo con quanto osservato nel nostro modello sperimentale. Tale resistenza sembra essere dovuta all’elevata presenza dell’enzima di riparazione del DNA MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase), deputato alla rimozione di gruppi alchilici da filamenti alchilati di DNA [Guida M. et al., 2010]. L’attivittà di agenti alchilanti, come la Temozolomide, dipende dalla loro capacità di formare addotti con il DNA e l’attività antineoplastica di questo farmaco è limitata dalla resistenza cellulare indotta dall’enzima MGMT [Guida M. et al., 2010]. Pertanto elevati livelli di MGMT possono essere responsabili della resistenza riscontrata con la Temozolomide. E’ stato anche riportato che l’inattivazione dell’enzima di riparazione MGMT attraverso O(6)-benzylguanine sensibilizza tutte le cellule di melanoma alla Temozolomide [Reuland N.S. et al., 2011]. Maggiore è l’espressione di tale enzima e più rapida è la riparazione ai danni del DNA [Kim C. et al., 2010; Guida M., et al., 2010].
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4.3 Canali hERG1: valutazione dell’azione di E-4031 sulla vitalità di cellule di melanoma cutaneo umano A375
Il composto E-4031 è stato saggiato sulle cellule di melanoma cutaneo umano A375 a concentrazioni comprese nell’intervallo 0,1-100 µM, per un tempo di esposizione di 48 ore.
I risultati ottenuti evidenziano un mancato effetto di riduzione della vitalità da parte del bloccante in esame (fig.23). Questo risultato non è in linea con quanto riportato nella maggior parte dei dati presenti in letteratura dove si evidenzia un effetto antiproliferativo del composto su varie linee tumorali come HL-60, SGC-7901, Colo205, MCF-7, MDA-MB-435S [Li H. et al., 2009; Roy J. et al., 2008; Kim H. et al., 2010].
Figura23. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375 dopo trattamento con E-4031 a concentrazioni comprese tra 0,1-100µM per 48 ore di esposizione, 1%FBS.
WST-1 E-4031 A375 48h exp 1% FBS
-9 -8 -7 -6 -5 -4 0 20 40 60 80 100 120 140 n=3 IC50=n.d. log M E-4031 % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
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Per il composto E-4031 alcuni autori hanno proposto un meccanismo d’azione che coinvolge il blocco del ciclo cellulare nella transizione dalla fase G1/S del ciclo cellulare con conseguente arresto della crescita [Li H. et al., 2007; Asher V. et al., 2011] e il blocco della migrazione delle cellule tumorali [Li H. et al., 2009], anche se non risulta ancora del tutto chiaro il meccanismo con cui questo composto interagisce con i canali hERG1.
Esistono dati in letteratura che associano mutazioni a livello dei residui di Isoleucina in posizione 647 ad una diminuzione dell’affinità di legame di E-4031 nei confronti del canale hERG1 [Ishii K. et al., 2002].
I nostri risultati riguardo ad una quasi assente riduzione della vitalità cellulare ad opera del composto E-4031, potrebbero essere quindi spiegati con una mutazione del canale hERG1 a livello di Isoleucina in posizione 647 (sostituzione di Phe o Trp) [Ishii K et al., 2002] o con una instabilità del composto utilizzato durante il trattamento di durata superiore alle 36 ore, in accordo con quanto riportato in letteratura [Roy J. et al., 2008].
I risultati ottenuti nel nostro modello sperimentale con il composto E-4031 non ci permettono di definire in modo chiaro il ruolo svolto dal canale hERG1 nella vitalità cellulare.
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4.4 Canali hERG1: valutazione dell’azione dell’apritore PD118057 sulla vitalità di cellule di melanoma cutaneo umano A375
Il composto PD118057 è stato testato su cellule A375 di melanoma cutaneo umano nell’intervallo di concentrazioni 0,01-100µM, a 48 ore di esposizione. I risultati ottenuti evidenziano una riduzione della vitalità cellulare ad opera di questo apritore hERG1 selettivo (IC50=23,24µM). Esistono pochi dati in letteratura riguardo a questo composto; Afrasiabi E. et al., 2009 ha indicato che il PD118057 non ha effetto sulla proliferazione di cellule di melanoma MDA-MB-435S, mentre sembra essere coinvolto nei processi di migrazione cellulare. Perry M. et al., 2009 indica invece una duplice azione di questo composto, sia pro-proliferativa quando agisce da apritore, sia anti-pro-proliferativa se si comporta da bloccante dei canali hERG1 [Perry M. et al., 2009].
Figura24. Riduzione della vitalità delle cellule A375 in seguito a trattamento con PD118057 (0,01-100µM), 48 ore di esposizione, 1%FBS. -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 20 40 60 80 100 120 140 IC50=23,244,68M n=2 WST-1 PD118057 A375 48h 1% FBS log M PD118057 % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
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L’attività di apritore sembra dipendere dall’interazione del PD118057 con un sito localizzato tra il segmento transmembrana S6 di una subunità α adiacente, mentre l’attività bloccante sembra dovuta all’interazione con siti di legame presenti nel segmento transmembrana S6, in particolare con il residuo F656 [Perry M. et al., 2009].
Questa osservazione riguardo la duplice azione del PD118057 sul canale hERG1 da parte di Perry M. et al., 2009, potrebbe sostenere il nostro dato che mostra una riduzione della vitalità cellulare ad opera di questo composto su cellule di melanoma cutaneo umano A375.
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4.5 Canali hEag1: valutazione dell’azione del bloccante selettivo Imipramina sulla vitalità delle cellule di melanoma cutaneo umano A375
L’Imipramina è stata testata nel range di concentrazioni 25-100 µM su cellule di melanoma cutaneo A375, per un tempo di esposizione pari a 48 ore. I nostri risultati hanno evidenziato un’azione inibitoria sulla vitalità cellulare (IC50=63,69µM), in accordo con quanto riportato in letteratura [Asher V. et al., 2011].
Figura25. Riduzione della vitalità cellulare di cellule di melanoma cutaneo A375 in seguito a trattamento con Imipramina (25-100 µM), dopo 48 ore di esposizione e 1%FBS.
WST-1 Imipramina A375 48h 1%FBS -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 20 40 60 80 100 120 140 IC50=63,690,99M n=2 log M Imipramine % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
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I risultati ottenuti nel nostro modello sperimentale sono in linea con quanto osservato su cellule di melanoma umano IGR1 [Gavrilova-Ruch O. et al., 2002]; l'azione di riduzione della vitalità delle cellule trattate con Imipramina fa ragionevolmente pensare ad un coinvolgimento dei canali hEag1 nel controllo della vitalità cellulare [Gavrilova-Ruch O. et al., 2002].
Da quanto emerge dalla letteratura l’Imipramina sembra agire nella sua forma protonata; il suo sito di legame si trova a livello della porzione intracellulare del canale al potassio hEag1 e questo sito risulta accessibile solo quando il canale si trova nella conformazione aperta [Garcìa-Ferreiro R. et al., 2004].
Per il legame dell’Imipramina al canale hEag1 sembrano essere importanti i residui aminoacidici presenti a livello del segmento transmembrana S6 e quelli localizzati all’estremità C-terminale delle eliche del poro antecedenti il filtro di selettività [ Garcìa-Ferreiro R. et al., 2004].
A conferma del coinvolgimento del canale hEag1 (e non hERG1) nel controllo della vitalità cellulare nel nostro modello sperimentale è il risultato ottenuto con il bloccante non selettivo hERG1/hEag1 Astemizolo [Asher V. et al., 2010] che inibisce la vitalità delle cellule A375 con IC50=9µM a 48 ore di esposizione. Questo dato è in accordo con la letteratura dove si evidenzia una riduzione della proliferazione in varie linee tumorali quali MCF-7 di cancro al seno [Asher V. et al., 2010; Borowiec A. et al., 2011].
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Figura26. Riduzione della vitalità di cellule di melanoma cutaneo umano A375 in seguito a trattamento con Astemizolo (0,1-100 µM), 48 ore di esposizione e 1% FBS.
-8 -7 -6 -5 -4 -3 0 20 40 60 80 100 120 140 n=3 IC50=9,00,41M WST-1 Astemizolo A375 48h 1% FBS log M ASTEMIZOLO % c el l vi ab ili ty v s co nt ro l
