Cromatografia ed Elettroforesi

Cromatografia ed Elettroforesi

Prof.ssa Flavia Frabetti

Esplorando le proteine

Un passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitano di conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la

PURIFICAZIONE della proteina di interesse

Tre metodi chiave: cromatografia elettroforesi

ultracentrifugazione

CROMATOGRAFIA

• metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa

• può essere analitica o preparativa

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema cromatografico

fase stazionaria impaccata in un letto cromatografico fase mobile

sistema di distribuzione della fase mobile sistema di rilevazione

• di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici

• il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili.

I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE:

dimensione e forma carica

volatilità solubilità

affinità di legame per molecole specifiche la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile

dalla diversa interazione degli stessi con la fase stazionaria

interazione forte ritardo maggiore interazione scarsa ritardo minimo

tempi di eluizione >

tempi di eluizione <

Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionare alla quale ha aderito per una specifica affinità

Lessico scientifico

Fase = componente del sistema caratterizzato da una uniforme composizione chimica e proprietà fisiche (densità, struttura cristallina, ecc.)

miscela

fase

stazionariafase mobile rilevatore

Si inietta una miscela da analizzare su una colonna I componenti avanzano a diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovvero la fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscita verrà registrato dal rilevatore

Tipologie dei sistemi cromatografici

forma del letto cromatografico

natura delle fasi mobile o stazionaria

metodo di separazione

Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna

Tipologia-classificazione

raccolta dei componenti aggiunta

solvente caricamento

campione colonna

contenente la fase stazionaria Cromatografia

su CARTA Cromatografia

su STRATO SOTTILE

Metodo di separazione Tipologia-classificazione

1) cromatografia di partizione o ripartizione

• separazione sulla base della solubilità di molecole piccole

• ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matrice solida inerte + fase mobile organica non polare

• cromatografia a fase inversa (vedi HPLC)

matrice inerte di supporto

fase stazionaria liquida

flusso della fase mobile

molecole non polari che si sciolgono nella fase

stazionaria

molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna

Metodo di separazione 2) cromatografia per gel permeazione (o esclusione molecolare)

• separazione sulla base della dimensione

• fase stazionaria = granuli porosi di un polimero insolubile ma molto idratato

flusso della fase mobile fase stazionaria gel

microporoso

molecole piccole che hanno

accesso all’intera matrice molecole medie che hanno accesso solo ai pori più larghi

molecole grandi che sono totalmente escluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna

Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico

• separazione sulla base della carica

• fase stazionaria = colonne con resine:

cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppure

cariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa)

flusso della fase mobile

cationi (+) del campione che vengono trattenuti dalla

colonna

+

+ +

_

_ _

_

_ _

_

_ _

+ +

- -

- - -

fase stazionaria resina a scambio cationico

Separazione di aa in una colonna a scambio cationico

Asp Ser Lys

Colonna a scambio cationico

Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità

• separazione sulla base ad una affinità chimica di legame

• fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzato un ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando

flusso della fase mobile fase stazionaria:

matrice solida di supporto tratto spaziatore ligando

tutti gli altri soluti vengono eluiti

molecola complementare legata da interazioni specifiche

al ligando

Tipologia-classificazione

Natura delle fasi mobile o stazionaria

fase stazionaria: solido/gel o liquido fase mobile: liquido o gas

liquida solida

Cromatografia a Scambio ionico (IEC)

liquida solida

Cromatografia su strato sottile (TLC)

liquida solida

Cromatografia liquida (LC)

gas Solida o

liquida Gascromatografia

Fase mobile Fase

stazionaria

Tipo es.

Tipologia-classificazione

Natura delle fasi mobile o stazionaria

cromatografia liquida-liquida:

HPLC cromatografia ad alta performance

o cromatografia liquida ad alta pressione

esempi:

cromatografia gas -liquida:

gas-cromatografia

fase stazionaria: solido/gel o liquido fase mobile: liquido o gas

carrier gas

pompa ^colonna

rilevatore

Fase stazionaria solida

Esempio di un cromatogramma

Deve avere una buona risoluzione

inizio

t’_R2

t’_R1 Δt t_M

picco di un soluto

non trattenuto t_R = tempo di ritenzione

t

= tempo di ritardo della fase mobile t’

= t

-t

Δt = distanza tra i 2 picchi

RISOLUZIONE R= Δt W_b1+W_b2

2 se R = 1.5 separazione completa

W_b1 W_b2

ELETTORFORESI

• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico

matrice di gel cella elettroforetica

alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante) tamponi salini

si possono studiare sia gli

acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine

Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consente la separazione

può essere fatto di polimeri agarosio o poliacrilamide

Gel di agarosio:

pesare l’agarosio

misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer

versare il gel nella vaschetta allestita Gel di acrilamide:

miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*

Come si forma il gel?

Gel di acrilamide

• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine

• di solito in sistemi verticali

• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri

taglia molecolare del peptide concentrazione di acrilamide

conformazione della molecola (denaturata o meno) voltaggio

pozzetti con i campioni

campione

anodo catodo

supporto di plastica

tampone

tampone PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema verticale

SDS = detergente (sodio-dodecil-solfato) carico

-

Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE

proteina tetramerica proteina monomerica bollitura

bollitura

peptidi connessi da ponti disolfuro

peptidi separati DENATURAZIONE DELLE PROTEINE

SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico) BME = β- mercaptoetanolo (riducente)

Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton)

8 200 - 25

10 100 - 15

12.5 70 - 10

15 60 - 6

20 40 - 4

Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine

Dal Chieffi

riquadro 2.2 pag:44-48

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE SU GEL o ISOELECTROFOCUSING

punto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica netta di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui La proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica

pH acido pH basico

I fase:

sep. x carica

II fase: separazione dimensionale

Rivelazione della separazione elettroforetica:

• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela (es. con comassie blue o silver-stain)

• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche

1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi

2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

consente di riconoscere una specifica proteina di interesse

consta di diverse fasi schematizzabili in:

a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi

consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il turn-over proteico. L’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo ³⁵S

a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa

trasferimento delle proteine

proteina di interesse

carta imbevuta di tampone

carta imbevuta di tampone

b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) - fasi procedurali

anticorpi I legano l’antigene

anticorpi II legano gli anticorpi I la membrana viene saturata da

proteine inerti

sviluppo della colorazione enzimatica

Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton)

8 200 - 25

10 100 - 15

12.5 70 - 10

15 60 - 6

20 40 - 4

Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine)

Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine