I recettori P2Y sono classificati nei sottotipi P2Y

Introduzione

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1.1 RECETTORI PURINERGICI E RECETTORI LEUCOTRIENICI.

1.1.1 RECETTORI PURINERGICI P2.

I recettori purinergici P2 sono recettori di membrana attivati da nucleotidi, quali ATP, ADP, UDP-glucosio/galattosio, e sono implicati nella regolazione di molti fenomeni fisiologici e patologici. Tali recettori sono stati coinvolti nella patogenesi di diverse malattie umane tra cui processi infiammatori, immunitari e condizioni ischemiche (Fredholm et al., 2001). La famiglia dei recettori P2 comprende i recettori P2Y e P2X.

I recettori P2Y sono classificati nei sottotipi P2Y

e sono recettori accoppiati a proteine G, mentre i recettori P2X comprendono P2X

e sono recettori a canale.

Entrambi sono sensibili a ATP, ma solo la sottofamiglia P2Y è sensibile anche a ADP, UDP, UTP e UDP-glucosio (Tabella 1).

I recettori P2Y sono specifici recettori di membrana composti da un numero variabile di amminoacidi che va da 328 a 379, e una massa che varia a seconda dello stato di glicosilazione da 41 a 53 KDa. Essi presentano la tipica struttura a 7 α-eliche transmembrana dei recettori accoppiati a proteine G, con la breve estremità N- terminale nello spazio extracellulare e l’estremità C-terminale nella parte citosolica.

Tuttavia, differiscono dalle altre famiglie di GPCR per una notevole diversità nella sequenza dei residui amminoacidici.

Presentano un’ampia distribuzione tissutale: infatti, sono stati riscontrati in cellule epiteliociti, endoteliociti, cellule muscolari striate e lisce, neuroni, fibroblasti, linfociti T attivati, monoliti e macrofagi

Tabella 1: Classificazione schematica dei recettori purinergici.

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Attualmente sono stati clonati 8 sottotipi recettoriali, definiti P2Y

, P2Y

, P2Y

, P2Y

, P2Y

, P2Y

, P2Y

e P2Y

, i quali vengono suddivisi, in base al loro agonista endogeno, in:

 P2Y

, P2Y

e P2Y

che rispondono principalmente a ATP e ADP;

 P2Y

e P2Y

che rispondono a UDP e UTP;

 P2Y

e P2Y

che rispondono sia a nucleotidi uracilici che adenilici;

 P2Y

che risponde a UDP-glucosio e UDP-galattosio.

Strutturalmente e filogeneticamente i recettori P2Y sono molto diversi tra loro e possono essere suddivisi in due gruppi:

 P2Y

, P2Y

, P2Y

, P2Y

e P2Y

, accoppiati a proteine G

, quindi sono in grado di attivare la fosfolipasi C;

 P2Y

, P2Y

e P2Y

, accoppiati a proteine G

, quindi inibiscono la produzione di cAMP (Tabella 2).

SOTTOTIPO RECETTORIALE

TIPO DI RECETTORE

AGONISTA PREFERENZIALE

DISTRIBUZIONE TISSUTALE

P2Y1 Gq ATP e DP Piastrine, cuore, tessuto connettivo,

sistema immunitario e tessuto nervoso.

P2Y2 Gq ATP,ADP,UDP ,UTP, UDP-

glucosio e UDP-galattosio

Cellule muscolari lisce ed endotelio vascolare.

P2Y4 Gq UDP e UTP Placenta.

P2Y6 Gq UDP e UTP Polmone, aorta, milza, placenta,

timo e cervello.

P2Y11 Gq ATP,ADP,UDP e UTP Milza, intestino, miocardio, cellule dendritiche e macrofagi.

P2Y12 Gi ATP e ADP Piastrine, linfociti e in livelli minori

nel cervello.

P2Y13 Gi ATP e ADP Milza e cervello prevalentemente

ma anche linfonodi e midollo osseo.

P2Y14 Gi UDP-glucosio e UDP-

galattosio

Placenta, tessuto adiposo, stomaco e intestino, bassi livelli anche in cervello, milza, polmone e cuore.

Tabella 2: Classificazione dei sottotipi recettoriali P2Y.

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1.1.2 RECETTORI LEUCOTRIENICI.

I recettori leucotrienici, denominati anche CysLTR, sono dei GPCR che innescano il pathway di molecole eicosanoidi dette cisteinil leucotrieni, LTD

LTC

e LTE

(definiti così perché ritrovati per la prima volta nei leucociti). Questi ultimi sono mediatori lipidici dell’infiammazione, provenienti dal metabolismo dell’acido arachidonico, attraverso la via della 5-lipossigenasi (Figura 1), che vanno a interagire e attivare i due recettori cisteinil leucotrieni accoppiati a proteine G

, Cys-LT

e Cys- LT

.

 Recettore CysLT

: è espresso in maggior misura a livello della milza, macrofagi, muscoli e vie respiratorie. Risponde secondo l’ordine di affinità a LTD

> LTC

> LTE

ed è sensibile agli antagonisti tradizionali Montelukast, Zafirlukast e Pranlukast.

 recettore CysLT

: è maggiormente espresso a livello del cuore, surrene, placenta, milza, leucociti e cervello. Riconosce i propri ligandi endogeni secondo l’ordine di affinità LTC

=LTD

>LTE

e non è sensibile a Montelukast, Zafirlukast e Pranlukast.

Figura 1: Cascata dell’acido arachidonico.

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Questi recettori sono principalmente coinvolti nei fenomeni di asma bronchiale,

disordini cardiovascolari e interferiscono nella risposta infiammatoria

accumulandosi nei siti d’infiammazione.

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1.2 IL RECETTORE GPR17.

Il recettore GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G, clonato e caratterizzato per la prima volta da Raport e collaboratori (Raport et al., 1996) al fine di individuare nuovi recettori per le chemochine. Da un punto di vista filogenetico il recettore si trova in una posizione intermedia tra i recettori P2Y e CysLTs, in particolar modo tra P2Y

e CysLT

e CysLT

(Figura 2).

Infatti, GPR17 possiede la medesima via di trasduzione di tali recettori legata all’attivazione di proteine G

e G

, quindi all’inibizione dell’enzima dell’adenilato ciclasi, con conseguente riduzione di cAMP, e l’attivazione dell’enzima fosfolipasi C con successivo rilascio di Ca

dai depositi intracellulari (Ciana et al., 2006).

1.2.1 STRUTTURA DEL RECETTORE GPR17.

Il recettore GPR17 presenta la tipica struttura dei recettori GPCR (Figura 3), organizzata in:

 7 domini transmembrana (TM1-TM7);

 8 eliche anfipatiche (H8);

 La regione ammino–terminale extracellulare;

 La regione carbossi–terminale nel citoplasma;

 3 loop ad elica extracellulari e 3 loop ad elica intracellulari.

Figura 2: Relazione filogenetica tra GPR17 e i recettori P2Y e CysLTs.

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Il recettore è presente in due isoforme: una corta (GPR17-S), di 339 amminoacidi, e una lunga (GPR17-L) di 367 amminoacidi, caratterizzata dalla presenza di una coda di amminoacidi che si aggiunge alla parte N-terminale. Il GPR17-L è stato identificato esclusivamente a livello celebrale, suggerendo un suo ruolo specifico nel sistema nervoso (Pugliese et al., 2009).

1.2.2 LIGANDI PER IL RECETTORE GPR17.

Il recettore GPR17 è stato identificato come un recettore GPCR dualistico, cioè responsivo a due famiglie di agonisti non correlate tra loro, i nucleotidi uridinici (UDP, UDP-glucosio) e cisteinil-leucotrieni (LTD

, LTC

, LTE

)

In linea con questa caratteristica, l’attività del recettore viene antagonizzata sia da antagonisti specifici per i recettori P2Y come il Cangrelor, selettivo per i recettori P2Y

, che da Montelukast e Pranlukast, antagonisti caratteristici per i recettori CysLT

(Ciana et al., 2006; Daniele et al., 2011; Lecca et al., 2008).

Anche l’analogo non idrolizzabile dell’ATP (ATPγS) agisce da antagonista sul GPR17, come dimostrato dalla sua capacità di inibire l’attivazione del recettore indotta da UDP-glucosio o LTD

(Pugliese et al., 2008) (Tabella 3).

Mediante saggi d’immunoprecipitazione è stato dimostrato che tale recettore è accoppiato prevalentemente con proteine G

e in misura minore con proteine G

(Pugliese et al., 2008).

Figura 3: Rappresentazione strutturale del recettore GPR17.

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Sono state riscontrate inoltre, delle differenze funzionali tra le due isoforme GPR17-S e GPR17-L: l’isoforma lunga è poco attivata dai nucleutidi uracilici, mentre l’isoforma GPR17-S è attivata da UDP e UDP-glucosio con potenza simile a quella dei recettori nucleotidici P2Y

e P2Y

(Pugliese et al., 2008).

Tuttavia ad oggi la farmacologia del recettore è oggetto di discussione poiché recentemente un altro gruppo di ricerca (Benned-Jensen T and Rosenkilde MM, 2010) ha confermato che UDP-glucosio, UDP-galattosio e UDP attivano l’isoforma GPR17-S umana, con valori di EC

nell’ordine del micromolare, simili a quelli riportati precedentemente (Ciana et al., 2006). Tuttavia gli stessi autori non rilevano che il GPR17 sia attivato, internalizzato o legato dai ligandi leucotrienici. In contrapposizione, Maekawa e collaboratori suppongono che il recettore GPR17 possa legarsi a CysLT

, regolando negativamente la sua funzione (Maekawa A et al., 2010).

COMPOSTI STRUTTURA FARMACOLOGIA E

AFFINITÀ VERSO GPR17

UDP

Agonista

EC

= 1.14 µM (h); 4.6 µM (r); 55 nM (m)

UDP-glucosio

Agonista

EC

= 12 µM (h); 530 nM (r); 88 nM (m)

UDP-galattosio

Agonista

EC

= 1 µM (h); - (r); 68

nM (m)

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Cangrelor

Antagonista IC

= 0.7 nM (h); 22 pM (r); 1.2 nM (m)

MRS 2179

Antagonista IC

= 508 nM; 0.18 pM (r); n.d. (m)

ATP

Antagonista IC

= 3.1 µM vs UDP- glucose; 209.8 vs LTD

(h); n.d. (r, m)

LTC

Agonista EC

= 0.33 nM (h); 65 nM(r); 0.74 nMM (m)

LTD

Agonista EC

= 7.2 nM (h); 5.9 nM (r); 0.63 nM (m)

LTE

Agonista

EC

= n.d. (h, r); 0.31

nM (m)

10

Montelukast

Antagonista IC

= 60 nM; 196 nM (r), 61 nM (m)

Pranlukast

Antagonista IC

= 10.5 nM (h);

31 nM (r); n.d. (m)

Tabella 3:Strutture dei ligandi del GPR17 (umano, h, ratto, r, murino, m), attività farmacologica e affinità per il recettore.

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1.3 DISTRIBUZIONE E RUOLO FISIOPATOLOGICO DEL RECETTORE GPR17.

Per studiare in dettaglio il ruolo fisiopatologico e la distribuzione tissutale del recettore GPR17, è stato preso in considerazione il GPR17 di topo, poiché è la specie filogeneticamente più vicina all’uomo. Attraverso analisi PCR è stato evidenziato che il recettore è maggiormente espresso a livello del cervello, cuore, rene e muscolo scheletrico, organi principalmente coinvolti nel danno ischemico e nel trauma, mentre è poco espresso nei polmoni e nel fegato (Ciana et al., 2006). A livello del sistema nervoso, GPR17 si ritrova altamente espresso nell’area subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali (VL) e nel nucleo dentato (Lecca et al., 2008). In condizioni fisiologiche nelle pareti VL GPR17 è molto espresso nelle cellule ependimali e si ritrova segregato in un sottoinsieme di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) nel parenchima cerebrale, disperso sia nella materia grigia che nella materia bianca.

Non è stata ritrovata alcuna co-localizzazione del recettore con il marker delle cellule oligodendrogliali mature (APC) e ciò indica che l’espressione di tale GPCR è limitata esclusivamente agli stati precoci della differenziazione degli oligodendrociti, riducendosi quando queste cellule arrivano a maturazione. Un comportamento analogo è stato riscontrato anche a livello del midollo spinale (Ceruti et al., 2009;

Chen et al., 2009), in cui il recettore GPR17 è espresso da neuroni e oligodendrociti a diversi fasi di maturazione e da cellule ependimali, ma mai dagli astrociti.

1.3.1 MODELLO DI ISCHEMIA: GPR17 È COINVOLTO SIA NEL DANNO CHE NELLA RIPARAZIONE CEREBRALE.

Nel modello di occlusione monolaterale dell’Arteria cerebrale Media di ratto e topo (MCAo), sono stati evidenziati dei cambiamenti sostanziali del recettore a livello spazio-temporale, a partire dal luogo dell’insulto ischemico (Ciana et al., 2006):

GPR17 sembra giocare diversi ruoli a seconda delle specifiche fasi di sviluppo del danno, di rimodellamento e di riparazione.

A 24 ore dall’insulto ischemico, vi è una up-regulation di GPR17 nelle cellule

neuronali che si trovano nel “core” della lesione, con la co-espressione del marker di

stress heat shock protein 70 (HSP70).

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L’inibizione in vivo di GPR17 con agenti farmacologici o attraverso approccio biotecnologico riduce fortemente la progressione del danno ischemico, suggerendo che GPR17, nel cervello lesionato, contribuisce realmente all’evoluzione e allo sviluppo del danno (Lecca et al., 2008).

A 48 ore dall’insulto, il recettore GPR17 non è più presente nei neuroni dell’area lesionata, suggerendo che tali cellule siano realmente andate incontro a morte, ma lo si ritrova molto espresso ai confini del “core” ischemico, in cellule di microglia e macrofagi, che, in condizioni fisiologiche, non esprimono il recettore. Queste cellule si vanno a infiltrare nella zona ischemica, inducendo fagocitosi e rimodellamento del tessuto danneggiato.

A 72 ore dall’insulto ischemico, si ha un aumento marcato del numero di cellule proliferanti. Due principali tipi di cellule sono state ritrovate nell’area ischemica: le prime si osservano principalmente ai confini della lesione e sono macrofagi e cellule della microglia attivate; le seconde sono i progenitori oligodendrogliali GPR17

, proliferano nell'area che circonda il “core” della lesione, facendo supporre un inizio di re-mielinizzazione (Lecca et al., 2008). Quindi dopo le prime fasi di ischemia, i segnali generati dai neuroni danneggiati diffondono nelle regioni adiacenti al “core”

ischemico, innescando i processi riparativi (Ciana et al., 2006).

1.3.2 LESIONI TRAUMATICHE AL MIDOLLO SPINALE (SCI).

Studi recenti (Ceruti et al., 2009) hanno riportato che una lesione del midollo spinale (SCI) provocata per compressione acuta, causa un’aumentata espressione di GPR17, determinando l’attivazione delle vie di morte cellulare dei neuroni e oligodendrociti.

Come visto nel caso del danno ischemico, 48 ore dopo la SCI, si ha la fase di proliferazione, migrazione e infiltrazione dei macrofagi, i quali puliscono la zona danneggiata e favoriscono la riparazione. Settantadue ore dopo l’insulto, le cellule ependimali GPR17

iniziano a proliferare ed esprimere la proteina gliofibrillare acida (GFAP), indicando il tentativo di iniziare un processo riparativo che però rimane solo parziale e nella maggior parte dei casi, non risolutivo (Ceruti et al., 2009).

L’inibizione in vivo del GPR17 con un oligonucleotide antisenso, ha dimostrato di

ridurre considerevolmente i danni indotti durante SCI, confermando il ruolo cruciale

di questo recettore nelle prime fasi dello sviluppo dei danni tessutali. GPR17 sembra,

13

perciò, rappresentare una risposta caratteristica del SNC a diversi tipi di danno:

infatti si mostra come un “sensore” che si attiva durante l’insulto cellulare, inducendo morte all'interno della lesione, ma promuovendo successivamente rimodellamento locale, ricostruzione e ripresa della funzione tissutale.

I cambiamenti di espressione spazio-temporale mostrati dal recettore potrebbero avere un’influenza importante nello sviluppo di nuovi approcci farmacologici:

antagonisti selettivi per GPR17 potrebbero rallentare, nella fase acuta del danno, l’evoluzione della lesione, mentre agonisti selettivi potrebbero agire come

“rimodellatori tissutali” nelle fasi successive al danno.

1.3.3 SVILUPPO DEL GPR17 DA CELLULE PROGENITRICI PRODUTTORI DI MIELINA.

A livello del SNC GPR17 è espresso sia nei neuroni che in un sottogruppo di progenitori di oligodendrociti parenchimali quiescenti, dispersi nella materia grigia e nella materia bianca. Questi ultimi sono cellule deputate alla produzione di mielina nel SNC e sono gli unici a esprimere costitutivamente il recettore GPR17 sia in vivo che in cultura primaria (Lecca et al., 2008). Si è anche dimostrato, nel corpo striato, la presenza di precursori immaturi di cellule GPR17

, all’interno di tratti mielinici che contengono cellule immature positive al fattore di regolazione dello sviluppo degli oligodendrociti, Oligo 2

. Queste cellule GPR17

possono quindi rappresentare una risorsa di pre-oligodendrociti in grado di trasformarsi in cellule mielinizzanti, quando è necessario, oppure possono giocare un ruolo nel controllo trofico locale della mielinizzazione (Lecca et al., 2008). La mielinizzazione è un processo essenziale per il normale funzionamento del sistema nervoso centrale (cervello e midollo spinale);

una sua alterazione porta a una degenerazione assonica e a una disabilità neurologica associata a malattie acquisite o ereditarie come la sclerosi multipla, definita anche sclerosi a placche (Pfeiffer et al., 1993).

La sclerosi multipla (SM) è una malattia cronica demielinizzante che colpisce il SNC in

più aree (da cui “multipla”). La perdita della mielina, cha riveste parte del corpo dei

neuroni, determina un’alterazione nella trasmissione degli impulsi nervosi,

bloccandoli o rallentandoli, portando così alla formazione di zone lesionate, che

prendono il nome di placche.

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In tali condizioni patologiche i precursori degli oligodendrociti sono presenti nelle lesioni, ma non riescono a differenziarsi a oligodendrociti maturi, poiché la fase di re- mielinizzazione è bloccata (Pfeiffer et al., 1993).

In condizioni d’insulto ischemico si è anche osservato che i precursori oligodendrociti GPR17

quiescenti, attivati dai mediatori infiammatori rilasciati nella lesione, iniziano a proliferare nel parenchima dell’area danneggiata, evidenziando che tale recettore può contribuire alla riparazione intrinseca nella rigenerazione post-ischemica (Lecca et al., 2008), e che, la differenziazione dei precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti maturi potrebbe ripopolare la zona lesa e favorire il rimodellamento tissutale.

Come schematizzato nella Figura 4, i precursori degli oligodendrociti mostrano una tipica morfologia bipolare, e non risultano positivi alla proteina GPR17 (benché sia presente il suo mRNA). L’espressione del recettore aumenta progressivamente durante lo sviluppo dei precursori a oligodendrociti (caratterizzati da morfologia più complessa e da alcuni processi di ramificazione emergenti dal corpo cellulare), fino ad arrivare a un massimo di espressione durante il terzo stadio, quando viene raggiunta la fase di pre-oligodendrociti immaturi (circa 6 giorni di differenziamento in vitro).

L’espressione del GPR17 è praticamente nulla allo stadio di oligodendrocita maturo, quando cioè le cellule hanno raggiunto la differenziazione terminale (Fumagalli et al., 2011).

Figura 4: Schema dell’espressione del recettore GPR17 in funzione della differenziazione dalle cellule precursori degli oligodendrociti a oligodendrociti maturi.

15

La presenza del recettore durante la maturazione degli OPC sembra dover rientrare in una finestra temporale precisa: la sua forzata espressione a livello dei pre- oligodendrociti comporta una diminuzione dei processi di maturazione e mielinizzazione, mentre il silenziamento del gene che esprime la proteina favorisce la maturazione degli OPC a cellule mielinizzanti. Una up-regulation del GPR17 è stata inoltre riscontrata a livello di lesioni demielinizzanti (Chen et al., 2009), avvalorando l’ipotesi di un coinvolgimento del recettore nella regolazione del processo di mielinizzazione, sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

È stato quindi supposto che, attraverso il legame con GPR17, i ligandi endogeni

potrebbero promuovere la desensitizzazione del recettore con successiva

internalizzazione e degradazione, e che questo evento potrebbe contribuire alla

perdita della attività fisiologica di GPR17 durante la maturazione degli OPC.

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1.4 MECCANISMI MOLECOLARI CHE REGOLANO LE RISPOSTE DEI RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G.

I molteplici eventi che accompagnano l’attivazione di un recettore di membrana hanno generalmente, in condizioni fisiologiche, un rapido andamento, a causa dei fenomeni di re-uptake e di degradazione enzimatica dell’agonista, in condizioni di prolungata stimolazione del recettore. Esistono anche, altri meccanismi adattivi di regolazione che controllano nel tempo la risposta dei recettori accoppiati alle proteine G. Questi fenomeni includono la desensitizzazione recettoriale, l’internalizzazione e la down-regulation.

1.4.1 DESENSITIZZAZIONE RECETTORIALE.

Con il termine di desensitizzazione si intende la scomparsa progressiva della risposta recettoriale in seguito a trattamento cronico con agonista, e quindi la perdita della capacità del recettore di accoppiarsi al sistema di trasduzione del segnale. La desensitizzazione, in base al meccanismo coinvolto, può essere di due tipi (Goodman L.S. & Gilman A et al., X ed):

 Omologa: quando la perdita di attività dell'agonista è mediata dall’attivazione agonista-dipendente del proprio recettore.

 Eterologa: quando l’attivazione prolungata del recettore va a indurre la desensitizzazione di un altro sistema recettoriale presente anch’esso sulla stessa membrana, che utilizza il medesimo meccanismo di trasduzione del segnale o gli stessi effettori.

I meccanismi responsabili del processo di desensitizzazione sono, in genere, fenomeni di fosforilazione del recettore su residui amminoacidici di serina e treonina e l’internalizzazione del complesso recettore-ligando.

Il processo di fosforilazione può avvenire in due modi:

1. Fosforilazione a livello della terza ansa citoplasmatica mediata da protein-

chinasi A e C (PKA, PKC), in precedenza attivate dalla produzione di cAMP, e il

conseguente disaccoppiamento tra recettore e proteina G. Il recettore

desensitizzato viene quindi internalizzato e può essere degradato da enzimi

lisosomiali oppure può essere riciclato sulla membrana (risensitizzazione). Si

17

tratta di un esempio di desensitizzazione eterologa, poiché un qualsiasi altro sistema recettoriale in grado di stimolare la produzione di cAMP ha la potenzialità di indurre desensitizzazione del recettore.

2. Fosforilazione su specifici residui di serina e treonina a livello intracellulare da parte di chinasi specifiche dei recettori accoppiati a proteine G (GRK).

L’interazione agonista-recettore determina la dissociazione della proteina G trimerica, mentre il dimero βγ funziona da ancoraggio per le GRK, le quali, una volta legatesi ad esso, fosforilano il recettore su residui specifici, determinando un aumento di affinità del recettore stesso verso la proteina citoplasmatica β-arrestina. Quest’ultima, una volta traslocata sulla membrana, determina il distacco del recettore dalla proteina G. A questo punto il recettore può essere internalizzato in endosomi, attraverso vescicole rivestite di clatrina, e può seguire due destini: essere degradato da enzimi lisosomiali (down-regulation), oppure può essere riciclato sulla membrana. In quest’ultimo caso le pompe ATP-dipendenti, che mantengono costante il pH degli endosomi, vanno a de-fosforilare il recettore e lo distaccano dalla β- arrestina, consentendone così il riciclo su membrana (Figura 5).

Figura 5: Esempio di desensitizzazione, internalizzazione e degradazione di un recettore accoppiato a proteine G.

18

1.4.2 FAMIGLIA DELLE CHINASI SPECIFICHE PER RECETTORI ACCOPPIATI ALLE

PROTEINE G: GRK.

Le GRK, dall’acronimo inglese G protein-coupled receptor kinase, sono chinasi che interagiscono con i GPCR attivati da agonisti, promuovendo la fosforilazione recettoriale e dando inizio a una profonda riduzione della funzionalità del recettore, ovvero la sua desensitizzazione omologa (Métayé T. et al., 2005). La fosforilazione avviene principalmente su residui di serina e treonina a livello del terzo loop intracellulare e/o all’estremità C-terminale del recettore, aumentando l’affinità di questo verso la proteina citosolica β-arrestina, che a sua volta può: impedire l’interazione proteina G-recettore per ingombro sterico, oppure promuovere il processo endocitotico clatrina-dipende del recettore inattivo, con la sua successiva degradazione o riciclo su membrana (Sorriento et al., 2010).

Per il ruolo chiave che hanno le GRK nel processo di desensitizzazione dei GPCR e per i numerosi coinvolgimenti che hanno i recettori accoppiati a proteine G nelle funzioni vitali, è probabile che una alterazione nella regolazione dei GPCR GRK-mediata possa contribuire alla patogenesi di diverse malattie.

Tutte le GRK (60-80 KDa) possiedono una simile organizzazione strutturale:

 Un dominio N-terminale, moderatamente conservato, di circa 185 amminoacidi;

 Un dominio catalitico, altamente conservato, con circa 270 amminoacidi;

 Un dominio C-terminale, poco conservato, con 105-270 amminoacidi (Métayé T. et al., 2005).

Il dominio ammino-terminale è costituito da 25 residui amminoacidici unici per la

famiglia delle chinasi GRK, seguito da un dominio omologo (RH) regolatore del

segnale delle proteine G (RGS) e da un dominio serina/treonina protein kinasi (KD). Il

dominio N-terminale sembra mediare l’attivazione allosterica delle GRK in presenza

di recettori accoppiati a proteine G attivi. Il dominio carbossi-terminale contiene

invece elementi responsabili per il loro riconoscimento sulla membrana. Ad esempio

GRK

e

presentano una piccola sequenza C-terminale prenilata; GRK

e

contengono un dominio che interagisce con le subunità βγ delle proteine G; GRK

e

contengono dei siti di palmitolazione, mentre GRK

presenta elementi carichi

positivamente che legano i lipidi di membrana (Guervich E.V. et al., 2012).

19

Sulla base delle somiglianze funzionali e delle analogie di sequenza, le GRK si classificano in tre sottofamiglie (Figura 6):

1. Sottofamiglia delle chinasi della Rodopsina, GRK

e GRK

;

2. Sottofamiglia delle chinasi dei recettori β-adrenergici, GRK

e GRK

; 3. Sottofamiglia delle GRK

GRK

GRK

GRK

.

L’espressione delle GRK è per lo più di tipo ubiquitario, fatta eccezione per GRK

che è presente esclusivamente nei testicoli e GRK

solo nella retina. A livello subcellulare le GRK si ritrovano, principalmente, in prossimità delle membrane plasmatiche, anche se ultimamente GRK

e GRK

sono state ritrovate anche a livello nucleare. In particolar modo si è visto che GRK

contiene delle sequenze che mediano sia la localizzazione nucleare che il legame con il DNA, suggerendo una sua partecipazione nella regolazione della trascrizione genetica (Sorriento et al.,2010).

GRK

: l’RNA messaggero di tale chinasi è molto espresso nel cuore umano, supportando una suo ruolo chiave nella regolazione delle funzioni cardiache. È presente, come precedentemente riportato, anche all’interno dei nuclei, ma anche a livello centrale, principalmente nelle membrane sinaptiche. La GRK

è coinvolta in molteplici patologie, come il carcinoma della tiroide, in cui si ha una significativa riduzione della sua espressione, con conseguente riduzione delle desensitizzazione del recettore della tireotropina (TSH). Si è anche visto un importante aumento della sua attività chinasica nella patologia della fibrosi cistica, con conseguente riduzione

Figura 6: Struttura dei domini delle GRK.

20

dell’espressione dei recettori β-adrenergici nelle vie aeree, i quali sembrano implicati

nella malattia (Métayé T. et al., 2005). La sua presenza a livello centrale fa sì che la

GRK

abbia anche un ruolo critico nelle funzioni cerebrali: ne è stata riscontrata

infatti, una sua disfunzione sia nella patologia dell’Alzheimer che del Parkinson

(Guervich E.V. et al., 2012).

21

1.5 DESENSITIZZAZIONE DEL RECETTORE GPR17.

È stato già dimostrato che, in cellule 1321N1 trasfettate con GPR17, sia gli agonisti cisteinici che purinergici inducono una desensitizzazione omologa del recettore in maniera tempo e concentrazione dipendente, con cinetiche paragonabili per entrambi le classi dei ligandi (Daniele et al., 2011). Dopo induzione della desensitizzazione e lavaggio delle cellule, la risposta del recettore viene recuperata con cinetiche tipiche di un GPCR (risensitizzazione), anche se è stata vista avvenire in maniera più lenta per UDP-glucosio rispetto a LTD

Inoltre, entrambi i ligandi inducono internalizzazione del recettore in modo tempo-dipendente: la percentuale di recettori internalizzati sembra più alta dopo trattamento con UDP-glucosio rispetto che con LTD

. Queste differenze potrebbero spiegare le diverse cinetiche di riciclo che si sono osservate dopo attivazione con i due diversi agonisti: LTD

induce un basso segnale di internalizzazione del recettore, determinando un più rapido riciclo di GPR17 sulle membrane plasmatiche e quindi un più rapido recupero della sua funzione.

Inoltre, in studi recenti è stata vista l’implicazione della GRK

nei processi di

fosforilazione e desensitizzazione del recettore GPR17 indotti dall’agonista

leucotrienico LTD

, mentre tale chinasi non sembra coinvolta nella regolazione della

risposta funzionale del recettore del sito purinergico, facendo supporre il

coinvolgimento di un’altra chinasi.