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1.1. RECETTORI PURINERGICI E RECETTORI LEUCOTRIENICI 2

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Academic year: 2021

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INDICE

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1. INTRODUZIONE

1.1. RECETTORI PURINERGICI E RECETTORI LEUCOTRIENICI 2

1.1.1. Recettori purinergici P2 2

1.1.2. Recettori leucotrienici CysLTR 4

1.2. RECETTORE GPR17 5

1.2.1. Struttura del recettore GPR17 5

1.2.2. Ligandi per il recettore GPR17 6

1.3. DISTRIBUZIONE E RUOLO FISIOPATOLOGICO DEL RECETTORE GPR17 9 1.3.1. Modello di ischemia: GPR17 è coinvolto sia nel danno

che nella riparazione cerebrale 9

1.3.2. Lesioni traumatiche al midollo spinale (SCI) 10

1.3.3. Ruolo del GPR17 nello sviluppo di precursori degli oligodendrociti 11 1.4. MECCANISMI MOLECOLARI CHE REGOLANO LE RISPOSTE

DEI RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G 14

1.4.1. Desensitizzazione recettoriale 14

1.4.2. Ruolo delle β–arrestine nella terminazione e nella trasduzione

del segnale dei recettori accoppiati a proteine G 16

1.5. RUOLO DELLE ERK NELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE

DEI RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G 18

1.6. DESENSITIZZAZIONE DEL RECETTORE GPR17 20

SCOPO DEL LAVORO DI TESI 22

(2)

2. MATERIALI E METODI

2.1. COLTURE CELLULARI 1321N1 24

2.2. VALUTAZIONE DELL’ASSOCIAZIONE DELLE β-ARRESTINE CON GPR17 24 2.2.1. Preparazione di lisati cellulari di cellule 1321N1 hGPR17 24

2.2.2. Dosaggio proteico di Folin 25

2.2.3. Immunoprecipitazione del recettore GPR17 26

2.2.4. Western Blot su immunoprecipitati di cellule 1321N1 hGPR17 28 2.3. VALUTAZIONE DELLA FOSFORILAZIONE DELLE ERK 1/2

MEDIATA DA AGONISTI DEL GPR17 31

2.3.1. Valutazione del contributo del pathway proteina G

i

-dipendente alla fosforilazione delle ERK 1/2 mediata da agonisti del GPR17 34 2.3.2. Valutazione del contributo del pathway β-arrestina-dipendente

alla fosforilazione delle ERK 1/2 mediata da agonisti del GPR17 34 2.3.2.1. Spingimento delle β–arrestine 1 e 2 tramite Small Interfering RNA (siRNA) 35 2.3.2.2. Tecnica di estrazione del mRNA e retrotrascrizione in cDNA 36

2.3.2.3. Tecnica di amplificazione genica: PCR 38

2.4. VALUTAZIONE DELLA TRASLOCAZIONE DELLE ERK FOSFORILATE

DAL CITOPLASMA AL NUCLEO 43

2.5. VALUTAZIONE DELLA FOSFORILAZIONE DELLE CREB

MEDIATA DA AGONISTI DEL GPR17 44

2.6. ANALISI DEI DATI 46

3. RISULTATI E DISCUSSIONE 48

3.1. ASSOCIAZIONE DELLE β-ARRESTINE CON GPR17 51

3.2. FOSFORILAZIONE DELLE ERK 1/2 MEDIATA DA AGONISTI DEL GPR17 52

3.2.1. Cinetica di attivazione delle ERK 1/2 dopo attivazione del GPR17 52

(3)

3.2.2. Contributo del pathway proteina G

i

-dipendente alla fosforilazione

delle ERK 1/2 mediata da agonisti del GPR17 53

3.2.3. Contributo del pathway β–arrestina-dipendente alla fosforilazione

delle ERK 1/2 mediata da agonisti del GPR17 55

3.2.3.1. Spingimento delle β–arrestine 1 e 2 tramite Small Interfering RNA (siRNA) 55 3.2.3.2. Fosforilazione delle ERK 1/2 in cellule β–arrestina-knock down 56 3.3. TRASLOCAZIONE DELLE ERK FOSFORILATE DAL CITOPLASMA AL NUCLEO 58 3.4. FOSFORILAZIONE DELLE CREB MEDIATA DA AGONISTI DEL GPR17 60

3.5. CONCLUSIONI 61

BIBLIOGRAFIA 63

Riferimenti

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