Introduzione
Il sebo è una matrice complessa di origine animale costituita da una gamma di famiglie di composti lipidici, tra i quali:
1. gli esteri del glicerolo (mono-, di- e tri-gliceridi degli acidi grassi), 2. le cere e i loro esteri,
3. alcuni idrocarburi (come lo squalene), 4. gli acidi grassi liberi,
5. gli steroli liberi e i loro esteri, etc. (fig. 1).
1) Gli esteri del glicerolo sono la componente più abbondante presente nel sebo umano. Rappresentano circa il 40 % della componente lipidica prodotta dal follicolo sebaceo, e sono costituiti principalmente da trigliceridi (ca. il 90 %), in misura minore da digliceridi e monogliceridi. Gli esteri del glicerolo costituiscono una forma di accumulo degli acidi grassi prodotti dalle cellule sebacee, in seguito alla biosintesi ed alla loro eventuale modificazione
strutturale (allungamento della catena, formazione di doppi legami, ramificazione). Uno dei trigliceridi più abbondanti nel sebo è l’1,2,3-trioleil-glicerolo o trioleina (fig. 2).
2) Le cere sono la seconda classe lipidica maggiormente espressa nel sebo umano. Chimicamente, sono alcoli alifatici ad alto peso molecolare (C > 10), generalmente presenti in forma lineare; si ritrovano sia in forma libera che in forma esterificata. Le cere sono specifiche nella biochimica della pelle poiché sono un costituente prodotto unicamente dal follicolo sebaceo, e quindi presente esclusivamente nel sebo. Inoltre, possono essere considerate un marcatore della velocità di produzione sebacea del follicolo. Nella fig. 3 è riprodotto l’oleil-oleato, una delle cere più abbondanti nel sebo.
Fig. 2: struttura della trioleina , un trigliceride p resente nel sebo umano
3) Per quanto riguarda gli idrocarburi a lunga catena, lo squalene è l’idrocarburo di gran lunga più espresso nel sebo, e costituisce circa il 15 % del totale. E’ un idrocarburo poliinsaturo coniugato a struttura lineare formato da 30 atomi di carbonio (fig. 4). Lo squalene è un composto molto diffuso in natura, sia nel mondo animale che vegetale, poiché costituisce il precursore biochimico del lanosterolo e rappresenta, quindi, un intermedio chiave nella biosintesi degli steroidi.
4) Gli acidi grassi liberi costituiscono una percentuale contenuta tra i componenti del sebo rispetto agli esterificati (ca. il 15-20 %), ma rivestono ruoli importanti dal punto di vista fisiologico. Sono presenti principalmente come strutture lineari, con un numero di atomi di carbonio compreso tra 4 e 22.. Alcuni acidi grassi presenti sia in forma libera che esterificata sono costituenti specifici del sebo, in particolare l’acido sapienico (C16:1Δ6) e l’acido sebaleico (C18:2Δ6,9), ed è stata proposto un loro coinvolgimento nella patogenesi di stati infiammatori cellulo-mediati come nelle fasi preliminari della patologia acneica (fig. 4).
Inoltre, gli acidi grassi con catena più corta sono responsabili dell’odore della pelle e dell’azione irritante e pro-infiammatoria, come riscontrata nell’acne patologica.
Scopo del lavoro
Lo studio delle matrici lipidiche risulta ancora in fase di sviluppo per le sue applicazioni nella clinica umana.
Lo scopo del lavoro è stato quello di mettere a punto delle metodiche per la determinazione quali-quantitativa della composizione di una matrice lipidica. A tale proposito, una delle matrici per cui la ricerca non ha ancora chiarito molti aspetti è il sebo, sia dal punto di vista fisiologico sia in correlazione a stati patologici.
Infatti, i pochi dati presenti in letteratura sono riferiti ad una disanima di massima sulla descrizione della composizione ma non sui rapporti quantitativi dei componenti. Tutti gli autori hanno affrontato lo studio di tale matrice focalizzando su tre punti principali: campionamento, estrazione ed analisi.
Introduzione ai metodi analitici cromatografici per l’analisi del sebo umano
Le classi di composti presenti nel sebo (esteri del glicerolo, acidi grassi liberi, cere, steroli, idrocarburi) possiedono caratteristiche diverse, in termini di polarità e solubilità. Pertanto, risulta difficile individuare metodiche analitiche che permettano la loro determinazione simultanea. Tuttavia, è possibile ottenere la determinazione simultanea delle diverse famiglie chimiche, ma non dei loro componenti, attraverso specifiche procedure di campionamento. Diversi autori hanno riportato la determinazione simultanea di più classi di lipidi nel sebo tramite differenti tecniche analitiche come TLC, HPLC, GC, NMR e CE; inoltre, ognuna di queste risulta più performante in relazione alle caratteristiche chimiche delle singole famiglie.
Dalla letteratura risulta che l’utilizzo della cromatografia su strato sottile (“Thin Layer Chromatography” o TLC), confrontata con metodiche più sensibili ed efficienti quali la GC e l’HPLC, non richiede particolari passaggi di pre-trattamento del campione.
In letteratura sono presenti diverse applicazioni della tecnica TLC all’analisi di campioni di sebo così come di altre matrici lipidiche di origine naturale (oli, alimenti, etc). Ad esempio, sono state sviluppate applicazioni della TLC in modalità analitica con cui poter identificare tutte le maggiori classi di composti documentate e presenti nel sebo (squalene, colesterolo e suoi esteri, mono-, di- e tri-gliceridi, acidi grassi e alcooli liberi, altri steroli e loro esteri, etc.): alcune sono costituite da più corse cromatografiche in serie,1-7 altre da un solo passaggio.8,9 E’ importante sottolineare come la tecnica TLC risulti particolarmente comoda quando l’esigenza analitica principale è quella di analizzare un alto numero di campioni contemporaneamente, soprattutto se esclusivamente di tipo qualitativo o semiquantitativo, rendendone possibile un confronto diretto e visivo. Questo può risultare utile al fine di stabilire, in prima istanza, la composizione percentuale del sebo nei diversi soggetti (ad es., individui con patolog ie vs. individui di controllo) e di quantificare la variabilità percentuale interna tra “famiglie” di composti.
Infine, va ricordato che l’analisi TLC applicata in modalità preparativa consente la separazione ed l’isolamento delle singole famiglie, per una successiva analisi cromatografica più
specifica tramite HPLC, GC, etc…6,7 In modalità analitica, invece, è possibile effettuare anche la determinazione semi-quantitativa tramite l’uso del fotodensitometro UV-Vis-FL1,2,5,6,8. Questo strumento consente di mettere in relazione la densità ottica rivelata da un raggio incidente sulla lastrina con la quantità di composto corrispondente, e quindi fornire un dato quantitativo all’analisi su TLC.
2) Sono stati sviluppati alcuni metodi per cromatografia in fase gassosa (GC)4,6,7 o in fase liquida (HPLC)9-13 per il riconoscimento di molti costituenti lipidici appartenenti a diverse famiglie. Le procedure descritte implicano fasi di preparazione del campione talvolta complesse.
Aitzetmuller e collaboratori hanno descritto l’analisi dei lipidi presenti in campioni di sebo tramite HPLC in fase diretta e detector “moving-wire”, un rivelatore simile al FID della GC. Per la determinazione dei composti appartenenti alle diverse famiglie chimiche, i campioni sono stati analizzati tal quali. Per quanto riguarda la determinazione degli acidi grassi liberi, questi sono stati determinati come esteri metilici (“FAME”) dopo metilazione con diazometano. La separazione cromatografica avviene su colonna in gel di silice LiChrosorb SI 60 (granulometria 5 e 10 μm) tramite eluizione in gradiente con una fase mobile ternaria miscela carbonio tetracloruro-isoottano (34:66, A), miscela cloroformio-diossano-n-esano (40:11:49, B) e miscela cloroformio-metanolo-etere diisopropilico (34:36:30, C), a potere eluotropico crescente.
L’analisi HPLC così descritta permette il riconoscimento di diversi componenti, quali: squalene, esteri delle cere, esteri metilici degli acidi grassi, trigliceridi, 1,3-digliceridi, 1,2-digliceridi, colesterolo e monogliceridi, in un tempo di analisi totale di 30 min. La metodica consente il riconoscimento delle principali famiglie di composti lipidici presenti, ma non di singoli costituenti.
3) E’ stata recentemente riportata la valutazione quantitativa dei componenti lipidici del sebo di uomo e di criceto (colesterolo, squalene, steroli esterificati, esteri delle cere e trigliceridi) tramite risonanza magnetica nucleare (NMR)14. I campioni di sebo umano sono stati ottenuti tramite applicazione del supporto solido adesivo Sebu-tape per 30 s, su varie parti del viso e della testa, e successivamente estratti con cicloesano deuterato, in vial chiusa in agitazione per 15 min. La soluzione ottenuta è stata analizzata direttamente tramite una strumentazione NMR a 600 MHz dotata di “cryo-probe” dedicato (H1-NMR). Nella regione compresa tra 3.8 e 5.5 ppm dello spettro ottenuto compaiono i segnali relativi a esteri delle cere, trigliceridi, esteri del colesterolo e squalene, e la metodica esibisce una buona correlazione tra quantità analizzate ed area dei picchi ottenuti. Le analisi sono state condotte, in parallelo, anche su un sistema HPLC dotato di rivelatore ELSD (“evaporative light-scattering detection”). Gli autori discutono come quest’ultimo approccio, nonostante la buona sensibilità, sia carente in selettività e linearità, rendendo difficile una validazione per l’applicazione clinica, mentre l’analisi NMR ha mostrato un range dinamico lineare molto ampio per tutti i composti considerati, e permette la determinazione simultanea dei composti considerati.
La letteratura prodotta negli ultimi venti anni riguardante l’analisi di matrici lipidiche prodotte dalla pelle ha fornito indicazioni sulle diverse fasi della procedura analitica (campionamento, estrazione ed analisi). In particolare, risulta evidente come la modalità di campionamento sia un punto “nodale”. Infatti, una non adeguata procedura da una parte può aumentare ulteriormente la complessità del campione prelevato, determinando un effetto-matrice che può avere effetto significativo sulla specificità e la sensibilità della successiva determinazione; dall’altra, può permettere il prelievo selettivo di alcune piuttosto che dell’intero pattern di componenti, semplificando le procedure di estrazione e purificazione, e diminuire l’effetto matrice, aumentando la sensibilità analitica.
CAMPIONAMENTO
Il prelievo di sebo dalla pelle può essere effettuato secondo diverse modalità, in base a quanto riportato dalla letteratura:
tramite estrazione diretta con solvente dalla superficie cutanea, utilizzando aliquote di solventi applicati con una spugna10 o per mezzo provetta in agitazione2;
tramite l’applicazione di supporti adesivi4,5,8,9,11.
L’estrazione diretta con solvente viene effettuata tramite tamponamento della cute con supporti solidi (ad es. spugne o batuffoli di cotone); successivamente viene effettuata un estrazione con solventi organici o miscele. La miscela di estrazione viene concentrata a piccolo volume e sottoposta all’analisi. Nonostante costituisca un approccio efficace e veloce, esso espone direttamente la cute ai solventi organici, e risulta difficilmente standardizzabile per consentire un’analisi quantitativa.
Il campionamento con supporti solidi, oltre alla maggiore compliance del paziente e la facilità nelle manovre coinvolte, permette di evitare l’esposizione della cute ai solventi e la variabilità associata alla manualità (intervento umano);e consente di avere una riproducibilità metodologica maggiore.
Esistono vari tipi di supporti adesivi, costituiti da diversi materiali. Tra questi ritroviamo carta assorbente di origine naturale,11 cerotto adesivo a nastro Leukoflex®4,8, strips in cianoacrilato a formazione estemporanea5 e cerotto adesivo dedicato “Sebu-tape®”9,14. Quest’ultimo tipo viene impiegato in clinica dermatologica per la valutazione ottica del numero di follicoli e del loro grado di produzione sebacea. La peculiarità sta nel fatto che non viene asportato lo strato corneo, e risulta essere così selettivo per “l’estrazione” dei lipidi cutane i. senza asportare lo strato corneo ed i componenti distribuiti al suo interno (a differenza del Leukoflex® che, in caso di applicazioni ripetute, è in grado di asportare anche lo strato corneo7), e risulta esser quindi uno strumento interessante per l’analisi selettiva della produzione di lipidi cutanei dalle sole ghiandole sebacee.
ESTRAZIONE
Dopo i campionamenti effettuati con supporti solidi segue una fase estrattiva con solvente. La scelta di un unico solvente o di una miscela avviene in relazione alla successiva determinazione analitica. Generalmente, i solventi utilizzati sono di tipo organico a basso peso molecolare (esano, cloroformio, metanolo, etanolo). L’estrazione può essere singola o multipla, e gli estratti ottenuti vengono riuniti e concentrati a piccolo volume, sotto corrente di N2.
I dettagli sull’estrazione di ciascuna famiglia di composti dalla matrice iniziale, quando specificati in letteratura, verranno descritti nella sezione successiva “ANALISI”.
ANALISI
Per quanto riguardale metodiche analitiche, sono stati descritti diversi approcci basati fondamentalmente su HPLC e GC. In particolare, a seconda della classe di composti di interesse, vengono riportate metodiche diverse, e, a queste, sono direttamente correlati specifici approcci estrattivi.
Determinazione simultanea di diverse classi di lipidi
L’estrazione del contenuto lipidico totale della pelle dal Leukoflex® è stato ottenuto con miscela etile acetato/metanolo (20:80)4 e dallo strip in cianoacrilato con miscela n-esano/etanolo (95:5)5;diversamente, è possibile l’estrazione diretta dei diversi lipidi dalla pelle con spugna imbevuta di esano10 e con miscela esano/acetone (2:1) applicata tramite provetta a contatto diretto con la cute.2
Grosso rilievo per una determinazione qualitativa di composti lipidici è dato dall’analisi su TLC. Questa metodica viene ampiamente utilizzata per screening preliminari su estratti vegetali (ad es. olii) o di origine animale (ad es. secrezioni sebacee). Analogamente, anche per il sebo umano sono presenti in letteratura riferimenti analitici riguardanti la TLC, attraverso l’utilizzo di lastrine in fase diretta (TLC e HPTLC in gel di silice 60). Alcune metodiche prevedono sviluppi ripetuti con miscele eluenti diverse, altre una singola corsa cromatografica, e i composti vengono rivelati con reattivi spray non specifici (acido solforico al 50 %, acido
fosfomolibdico etanolico, p-anisaldeide etanolica), che forniscono colorazioni con le diverse classi di sostanze presenti sulla lastra a fine analisi.
In particolare, diversi autori citano la metodica descritta per la prima volta da Downing nel 1968 per l’analisi di lipidi neutri in miscele sintetiche di riferimento; oltre alla determinazione qualitativa della composizione del campione, l’introduzione di uno standard interno e l’uso del fotodensitometro permettono di ottenere dati semi-quantitativi per i composti quali: colesterolo, acido oleico, trioleina, cetile palmitato, colesteril oleato, squalene. Tale metodica prevede l’uso di lastrine in gel di silice su supporto di vetro ed uno sviluppo multiplo di tre corse cromatografiche in serie, con tre diverse miscele eluenti a polarità crescente: esano 100%, benzene 100% ed esano-etere etilico-acido acetico (70:30:1). In successive varianti proposte per l’analisi dei lipidi della superficie cutanea, lo sviluppo con benzene viene sostituito da un passaggio con una miscela di esano-etere etilico 90:10 (Weissmann et al.) o toluene 100 % (Pappas et al.). La metodica descritta da Downing è stata successivamente applicata, senza variazioni, da Nordstrom e colleghi per la caratterizzazione di esteri delle cere, trigliceridi e acidi grassi liberi nell’apparato follicolare umano6. Nel lavoro di Weissmann, le lastrine vengono fatte correre per 20 cm nelle prime due corse, 14 cm nella terza; i composti vengono rivelati con acido solforico 50 %. Tale metodica consente di individuare la presenza delle principali classi di lipidi presenti nel sebo, come gli acidi grassi liberi e gli esteri delle cere, ed il riconoscimento di alcuni composti in particolare, come lo squalene.
Determinazione Degli Acidi Grassi Liberi (“Free Fatty Acid” o FFA)
Gli acidi grassi liberi (a. miristico, palmitico, stearico, oleico, palmitoleico, linoleico, linolenico, arachidonico, margarico), dopo campionamento con carta adsorbente dedicata di tipo commerciale (in fibra di canapa 100 %, Max Factor©), vengono estratti con una miscela etanolo-acetonitrile (20:80). L’analisi viene effettuata tramite HPLC in fase inversa (C18, 250 x 4.6 mm, 5 μm) nella loro forma nativa, accoppiata ad un rivelatore elettrochimico)11.
Alcuni autori hanno riportato l’analisi degli acidi sapienico, oleico, palmitoleico, palmitico e stearico attraverso la trasformazione nel relativo estere p-bromo-fenacilico e rivelazione tramite detector UV (λ = 250 nm)10.
Nelle condizioni cromatografiche adottate, non è possibile ottenere una separazione completa delle coppie di isomeri geometrici, quali gli acidi sapienico e palmitoleico (ovvero C16:1Δ6 e C16:1Δ9) oppure petroselinico e oleico (ovvero C18:1Δ6 e C18:1Δ9).
Per la determinazione degli acidi grassi liberi è stata utilizzata anche la gascromatografia (GC) dopo trasformazione nei relativi esteri metilici (“FAME”). Nordstrom e collaboratori hanno riportato questo approccio nell’analisi degli acidi grassi liberi ed esterificati (in forma di trigliceridi) estratti dall’apparato follicolare umano, utilizzando una colonna capillare e la rivelazione tramite spettrometria di massa (MS)6. I derivati esterei ottenuti vengono successivamente trasformati nelle relative pirrolididi e ri-analizzati in GC-MS, allo scopo di determinare la posizione dei doppi legami negli acidi grassi mono- e poli-insaturi, e distinguere gli isomeri geometrici tra loro. Tra gli acidi grassi liberi, i composti saturi (50.6 %) prevalgono sugli insaturi (32.8 %) e sugli acidi portanti catene ramificate (16.6 %); i componenti saturi predominano anche nella frazione dei trigliceridi (86.3 %) rispetto agli insaturi (10.8 %) e ai ramificati (3.0 %). Nello stesso lavoro vengono determinati anche gli esteri delle cere presenti nel campione.
Squalene e Lanosterolo
Dalla letteratura, lo squalene risulta essere un componente abbondante nel sebo. Le relative determinazioni sono state effettuate principalmente da studi su altre matrici naturali (ad es. alghe, cellule di grano, etc.). Infatti, sono state utilizzate tecniche sofisticate per la loro singola determinazione.
Lo squalene è stato determinato, insieme ai relativi monoidroperossidi isomeri ottenuti dopo fotoossidazione del campione, mediante analisi HPLC in fase inversa C18 (Luna 250 x 4.6 mm, granulometria 5 um) e detector UV (210 nm)9. Nello stesso lavoro, lo squalene viene purificato dai relativi monoperossidi tramite HPTLC in fase diretta (gel di silice) con miscela eluente costituita da benzene-etile acetato (93:7).
Lo squalene, dopo purificazione tramite cromatografia contro-corrente ad altà velocità (“High-Speed Counter-Current Chromatography” o HSCCC) è stato determinato tramite HPLC in fase inversa C18 (150 x 3.9 mm, 5 μm), fase mobile acetonitrile 100% e detezione UV a 205 nm15. Le analisi indicano, per la procedura di purificazione, un recupero pari al 95 %. Gli stessi autori hanno determinato lo squalene in campioni naturali e commerciali (olio di oliva, estratto lipidico di alghe, squalene in capsule commerciali)16 attraverso la stessa metodica, ottenendo limiti di rilevabilità (LOD) pari a 40 ppb, con linearità (R2 = 0.9999) nell’intervallo 0.1-40 ppm.
Sviluppo del metodo analitico su TLC – Determinazione delle famiglie di
composti nel sebo
Il primo approccio in questo studio è stato quello di determinare tre famiglie di composti presenti nel sebo, utilizzando come standard di riferimento alcuni componenti. Per la famiglia degli acidi grassi, sono stati scelti gli acidi sapienico, sebaleico, palmitico, palmitoleico e stearico; per quanto riguarda gli idrocarburi è stato selezionato lo squalene, mentre per gli steroli è stato selezionato il lanosterolo.
Nelle fasi preliminari dello studio, è stato effettuata l’estrazione con solvente di un campione di olio di oliva adsorbito su Sebu-tape, così da poter valutare l’efficienza e la selettività di una procedura di estrazione di una matrice lipidica complessa basata sull’utilizzo di tale supporto; parallelamente, è stato valutato il comportamento dei composti standard e degli estratti ottenuti in diverse condizioni cromatografiche su TLC. E’ stato considerato l’olio di oliva come matrice di riferimento in quanto rappresenta una matrice lipidica complessa assimilabile al sebo umano.
Nelle fasi preliminari di sviluppo del metodo cromatografico su strato sottile, le condizioni cromatografiche descritte da Weissmann e da Pappas sono state riprodotte, utilizzando esano-etere dietilico 90:10 o toluene 100 % per effettuare il secondo sviluppo della lastra cromatografica. Le lastrine sono state sviluppate con diversi reattivi spray, e la sensibilità dimostrata dalla successiva lettura al fotodensitometro è stata valutata nei diversi casi e con diverse impostazioni strumentali.
Tecnicamente, sono stati estratti con solvente un aliquota di olio di oliva (10 ul; 1), il supporto tal quale (2) e 10 l di olio di oliva (3) adsorbiti sul supporto; la miscela estraente è stata esano-etanolo 2:1 (4.0 ml, 10’). Successivamente, gli estratti sono stati portati a secco singolarmente in corrente d’azoto e ripreso con 200 l di cloroformio-metanolo (1:2). Gli estratti così ottenuti sono stati depositati su TLC, e fatte sviluppare secondo le condizioni di Weissmann in taniche apposite presaturate; la rivelazione dei composti è avvenuta sia con
p-anisaldeide che con acido fosfomolibdico. Si nota come il supporto rilascia alcuni composti che risultano essere interferenti con la matrice oggetto di analisi (olio di oliva). Nell’estratto 2 si nota la presenza di diverse macchie con valore di Rf analoghi a quelle presenti negli altri due estratti, pertanto, l’utilizzo di tale supporto con la procedura indicata produce campioni non privi di interferenze e non risulta adatto allo scopo. Inoltre, la rivelazione con p-anisaldeide produce colorazioni blu-rosa una separazione maggior numero di macchie e con definizione migliore rispetto all’acido fosfomolibdico (fig. 5).
La ricerca è proseguita nella sperimentazione di altri supporti, reattivi spray e fa si stazionarie (TLC) con diversi adsorbenti e supporti, nonché miscele eluenti. Inoltre, viste le buone indicazioni iniziali ottenute con la matrice lipidica di riferimento (olio), nella sperimentazione è iniziata la valutazione della matrice lipidica umana (sebo). Sono stati analizzati due diversi campioni di sebo utilizzando la seguente procedura. Il campionamento di sebo umano è stato effettuato con tamponamento con cotone idrofilo (in triplicate); i campioni sono stati estratti con esano-etanolo 2:1 (1 x 6 ml) in agitazione per 15 min, centrifugati (3000 rpm, 5 min), portati a secco in corrente d’azoto e ridisciolti in 200 l di cloroformio-metanolo (2:1). Nello stesso modo è stato preparato un estratto di riferimento del cotone da solo; i campioni depositati sulla lastrina sono stati sviluppati secondo la procedura messa a punto da Weissmann. L’analisi TLC mostra in entrambi i campioni di sebo una s erie numerosa di macchie con Rf compreso tra 0.0 e 0.75 ed una macchia con Rf = 0,90. Anche in questo caso, il bianco di riferimento mostra che il supporto rilascia una serie di macchie (Rf compreso tra 0.0 e 0.50), che risulta più evidente con p-anisaldeide piuttosto che con acido solforico (fig. 6 e 7).
L’utilizzo della p-anisaldeide fornisce una serie di colorazioni più variegata rispetto all’acido solforico, dal blu al viola e al rosa, e con una sensibilità leggermente maggiore (fig. 7).
Visti i risultati, l’attenzione è stata rivolta allo studio degli effetti di alcune miscele eluenti, al fine di ottenere informazioni sulla migrazione dei componenti della matrice in funzione della polarità dell’eluente stesso. Per questo, sono state effettuate eluizioni con esano 100 %, esano-etere (90:10) ed esano-etere-acido acetico (70:30:1). I dati ottenuti da questi esperimenti indicano come la presenza di acido acetico in una miscela di media polarità comporta una apprezzabile separazione dei componenti della matrice (fig. 8-10).
Secondo i dati raccolti dai vari esperimenti condotti attraverso la variazi one delle condizioni sperimentali esaminate, lo sviluppo della metodica è proseguito con l’analisi della matrice e dei singoli composti di riferimento (standard) e del fotodensitometro, per ottenere dati semi-quantitativi. A tale scopo sono state utilizzate lastrine di vetro HPTLC. Gli standard sono stati depositati (soluzioni 1000 ppm, 2 ul) insieme agli estratti di sebo da cotone (2 ul) e successivamente eluiti con uno sviluppo multiplo a tre corse in serie con le seguenti fasi mobili:
n-esano 100 % (1), toluene 100 % (2) e una miscela n-esano-etere acido acetico (70:30:1, 3). Lo
sviluppo a tre corse così strutturato cstituisce le condizioni separative migliori ottenute dai vari esperimenti precedenti. Al fine di ottenere dei cromatogrammi con una buona risoluzione, le lastrine sono state rivelate con diversi reattivi spray: H2SO4 50 %, p-anisaldeide, rame acetato e potassio permanganato (fig. 11 e 12).
Allo scopo di ottenere un analisi semi-quantitativa, è stato valutato l’utilizzo del densitometro per TLC, cercando di ottimizzare i parametri operativi della macchina sulle lastrine ottenute, in particolare:
la lunghezza d’onda del raggio incidente
l’applicazione di filtri di attenuazione del segnale in uscita, relativi al tipo di lastrina utilizzata (spessore, granulometria, presenza o meno del mezzo di contrasto fluorescente, etc.)
l’impostazione dei parametri di integrazione e scrittura del cromatogramma
Il densitometro è stato settato nel modo seguente. La scansione è avvenuta con oscillazione orizzontale di 9 o 12 mm sull’intera lunghezza della corsa, con il raggio incidente di dimensioni 1 x 1 mm. E’ stato visto che l’uso di “Auto Zero” in modalità ON migliora il profilo della linea di base, e l‘applicazione di un filtro di linearizzazione per materiale adsorbente in gel di silice migliora il rapporto segnale/rumore, mostrando picchi più alti rispetto alla linea di base. L’utilizzo ed il funzionamento di tali parametri deve essere verificato in base alla tipologia di lastrine e di reattivo spray utilizzati per l’analisi nel momento in cui questi vengono variati.
Nel range dello spettro UV, l’area dei picchi corrispondenti alle macchie sulla lastrina è stata tabulata in funzione della lunghezza d’onda del raggio incidente, e si è visto che la scansione intorno ai 250 nm mostra la maggiore sensibilità sui composti evidenziati con potassio permanganato (KMnO4), rame (II)-acetato (Cu-acetato) e acido solforico (H2SO4 50 %), mentre un valore intorno ai 365 nm si è rivelato il migliore dopo l’utilizzo della p-anisaldeide etanolica (fig. 11 e 12). Dall’analisi dei cromatogrammi ottenuti in seguito all’utilizzo dei vari reattivi spray, si evidenzia quanto segue. L’anisaldeide etanolica comporta una maggiore sensibilità e specificità per gli acidi grassi liberi, poiché il picco relativo presenta l’area relativa maggiore e la comparsa, sul profilo del picco, di segnali ascrivibili ai singoli componenti della famiglia considerata. Inoltre, essa costituisce il reattivo che dimostra la maggiore sensibilità verso gli esteri del glicerolo (soprattutto trigliceridi, i più abbondanti, fig. 12). Tuttavia, l’uso di
anisaldeide è accompagnato anche da una linea di base irregolare e scarsa sensibilità verso gli esteri degli steroli, che migrano poco al di sotto dello squalene e degli altri idrocarburi.
L’acido solforico produce macchie giallo-arancio e rosa; come per l’anisaldeide, il suo utilizzo produce segnali molto alti per le macchie presenti ma è accompagnato da una linea di base irregolare ed alcuni picchi non sono completamente risolti.
Con l’uso di una soluzione di rame acetato si ottiene un risultato simile, anche se leggermente meno pronunciato, per quanto riguarda la sensibilità e la specificità verso gli acidi grassi liberi. Inoltre, l’acetato di rame comporta un’alta sensibilità verso gli steroli esterificati e lo squalene ed un buon andamento della linea di base, con una risoluzione accettabile delle diverse famiglie di composti presenti nel campione. Va detto comunque che i trigliceridi mostrano una sensibilità piuttosto bassa rispetto agli altri reattivi spray.
Il potassio permanganato causa la comparsa di macchie rosso-bruno-violetto su fondo pressochè bianco, privo di colorazioni residue dovute all’interazione dello spray con i componenti dello strato di materiale adsorbente; questo fa sì che, tra i reattivi spray sperimentati, il potassio permanganato implica il miglior rapporto segnale/rumore osservato, che si traduce in un profilo della linea di base particolarmente regolare, con la comparsa di picchi ben separati e più simmetrici rispetto ai casi precedenti. Inoltre, offre un ottima sensibilità per i componenti sterolici, anche se risulta meno selettivo del rame e dell’anisaldeide per quanto riguarda i componenti degli acidi grassi liberi.
In sintesi, acido solforico e p-anisaldeide hanno fornito profili cromatografici meno soddisfacenti, mentre rame acetato e potassio permanganato hanno fornito i risultati migliori in termini di chiarezza del cromatogramma.
Dalle prove di eluizione, di rivelazione e di scansione al fotodensitometro in diverse condizioni, il seguente protocollo per l’analisi delle principali famiglie di composti lipidici presenti nel sebo umano è stato selezionato:
1. Fase stazionaria: lastrine HPTLC in gel di silice 60 F254 LiChrosphere (10 x 20 cm) su supporto di vetro
2. Fase mobile: sviluppo multiplo con tre eluizioni in serie
a. esano 100 % (fino a 13 cm) b. toluene 100 % (fino a 13 cm)
c. esano-etere dietilico-acido acetico 70:30:1 (fino a 9 cm)
3. Rivelazione: soluzioni di rame (II)-acetato (7,5 % p/v in 8 % H3PO4 aq.) o potassio permanganato (3 % p/v in H2SO4 conc.).
4. Fotodensitometro: lettura a 250 nm; dimensioni raggio incidente: 1 x 1 mm; AUTO ZERO: On.
Infine, l’efficienza separativa delle lastrine HPTLC contenenti materiale adsorbente costituito da particelle sferiche è stata verificata, rispetto alla separazione ottenute con lastrine con particelle irregolari. L’utilizzo di lastre con particelle di silice sferiche consente una migliore separazione degli steroli dagli acidi grassi liberi, come si può apprezzare dalla migrazione di lanosterolo e acido sapienico (Rf pari a 0.20 e 0.16, rispettivamente; fig. 13), ed una maggiore risoluzione e definizione delle macchie più vicine al fronte del solvente. Inoltre, nonostante una completa risoluzione non sia attualmente possibile, l’uso di particelle sferiche implica minore diffusione per le macchie relative all’acido sapienico e l’acido sebaleico.
Sviluppo del metodo cromatografico GC-FID per la determinazione degli acidi grassi liberi
Come precedentemente descritto, dal punto di vista fisiologico il sebo riveste un azione molto importante nella protezione dall’aggressione degli agenti esterni. La quantità prodotta e la sua composizione sono funzione di fattori quali la stagionalità, l’alimentazione, i cicli ormonali, etc. Talvolta, in letteratura è stata verificata una correlazione con alcuni stati patologici quali l’ovario policistico e l’iperinsulinemia.
Inoltre, diversi autori hanno riportato un cambiamento della composizione degli acidi grassi del sebo, sia liberi che in forma di esteri del glicerolo, associato all’aumento della produzione sebacea e all’insorgenza dell’acne; in particolare, sono state osservate variazioni nel pattern degli acidi grassi C16 e C18 mono- e di-insaturi normalmente presenti.
E’ stata descritta una minore proporzione, nei soggetti patologici rispetto ai soggetti sani, di acido linoleico (C18:2Δ9,12), presente sia nella forma libera che esterificata, accompagnata dalla presenza di livelli elevati di un suo isomero geometrico, l’acido sebaleico (C18:2Δ5,8), un acido grasso presente unicamente nel sebo e non ritrovato in altri tessuti1,2 A questo composto è stato ascritto un potere pro-infiammatorio dovuto all’attività chemiotattica che esibisce verso i neutrofili3.
E’ stato proposto un ruolo importante anche per l’acido sapienico (C16:1Δ6), un altro acido grasso esclusivo del sebo umano, isomero geometrico dell’acido palmitoleico (C16:1Δ9), che subisce un aumento dei livelli sebacei durante la pubertà. E’ stato riscontrato che tale composto possiede attività antibatterica in vitro.
Altri composti di natura non acida, come lo squalene e gli esteri delle cere, sono componenti peculiari della matrice sebacea umana4, e l’aumento della loro produzione è stato messo in relazione con lo sviluppo dell’acne (ad es., tramite la generazione dei perossidi dello squalene)5.
Alla luce degli studi precedentemente descritti (studi TLC) e da quanto riportato in letteratura sul ruolo di alcuni acidi grassi sull’evoluzione dell’acne e la sua correlazione con stati patologici, la ricerca sulle applicazioni analitiche sulla matrice lipidica è proseguita nel tentativo di individuazione di una metodica sensibile e di facile applicazione per la determinazione di alcuni componenti. L’attenzione è stata focalizzata sui componenti quali alcuni acidi grassi
(sapienico, palmitico, palmitoleico, stearico, sebaleico) e lo squalene, in quanto, come visto prima, un ruolo sullo sviluppo dell’acne.
Il progetto di ricerca ha previsto una metodica di facile applicazione e sensibilità, per una determinazione quantitativa di questi composti attraverso un'unica analisi, per minimizzare le perdite di analiti e la formazione di prodotti di degradazione e trasformazione.
In letteratura, gli acidi grassi sono stati riportati studi per l’analisi GC-FID, GC-MS, HPLC-UV e HPLC-FL, dopo appropriata derivatizzazione.
Lucker e collaboratori6 hanno determinato gli acidi grassi presenti in campioni di tessuto cerebrale di diversa origine (tacchino, maiale, pecora) ed in campioni di carne di riferimento (muscolo di maiale, salsiccia) tramite analisi GC-MS dopo estrazione con solvente, purificazione SPE e trasformazione nei corrispondenti esteri metilici. La reazione di esterificazione è stata effettuata in HCl metanolico 1 N a 60°C per 12 h. Gli acidi grassi determinati sono C22:6, C24:1Δ9, C24:1Δ7, C24:0, C24-OH.
Gli acidi grassi presenti nel plasma e in omogenati di tessuti di topo sono stati determinati tramite analisi GC-FID dopo metilazione diretta del campione, senza una procedura di estrazione7. I campioni vengono trattati a caldo con NaOH metanolico 0.5 M (100°C per 15 min); dopo raffreddamento, gli acidi grassi vengono convertiti negli esteri metilici con BF3 in metanolo a caldo (100°C per 20 s), e successivamente estratti con isoottano prima di essere analizzati. Gli acidi grassi determinati sono saturi, monoinsaturi e polinsaturi con lunghezza compresa tra C16 e C22.
Per quanto riguarda le applicazioni in cromatografia liquida, Lu ed il suo gruppo di ricerca hanno effettuato la determinazione di acidi grassi saturi a lunga catena (C18:0, C20:0, C22:0, C23:0, C24:0, C26:0) da plasma addizionato di una miscela di standard, tramite HPLC a fase inversa e rivelazione in fluorescenza (FL)8. L’estrazione dei campioni è stata effettuata con n-eptano, e la derivatizzazione degli acidi grassi è avvenuta tramite aggiunta di una soluzione di 2-(2-naftossi)etil-2-(piperidino)etansulfonato (NOEPES) in toluene, ed agitazione per 1.5 h a 95°C.
Mehta e collaboratori hanno applicato la derivatizzazione con fenacil bromuro e p-bromo-fenacil bromuro alla determinazione di sei acidi grassi principali presenti nel plasma umano (C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 e C18:2), tramite analisi in HPLC a fase inversa con colonne C6 e C18 e rivelazione UV9. In seguito ad estrazione con solvente, effettuata secondo due diverse procedure di riferimento presenti in letteratura, i derivati fenacilici sono stati
preparati per aggiunta, al campione essiccato, di una soluzione di α-bromoacetofenone, acido acetico e trietilammina in acetone, e riscaldamento a 100°C per 20 min. I derivati bromo-fenacilici, invece, sono stati preparati per aggiunta al campione secco di una soluzione di p-bromo-fenacil bromuro, etere 18-crown-6 e KHCO3 in acetonitrile, e riscaldamento a 85°C per 45 min.
Nei processi di derivatizzazione risulta importante l’isolamento dell’analita dalla matrice e successivi passaggi che prevedono generalmente una fase di riscaldamento. Questo però comporta processi degradativi o di isomerizzazione (ad esempio, per gli acidi grassi insaturi o i composti poliinsaturi come lo squalene). Inoltre, la difficoltà di avere un analisi quantitativa del sebo risulta difficoltosa nella fase di campionamento, in quanto non esistono, in letteratura, tecniche che prevedono “il prelievo” per specifiche unità di superficie, che possono renderlo standardizzabile.
Alla luce di queste considerazioni, questo studio si è articolato attraverso la ricerca di una procedura analitica per la determinazione quantitativa e lo studio di una tecnica di campionamento ed estrazione dalla matrice compatibile con la determinazione strumentale.
Pr quest’ultimo aspetto, avendo acquisito buona esperienza nello studio precedente, la fase di campionamento è stata condotta su supporti solidi adesivi (Sebu-tape).
Quest’ultimo, essendo un prodotto commerciale, consente una buona riproducibilità strumentale, in funzione della superficie e della capacità adsorbente.
Anche per quanto riguarda la fase estrattiva dal supporto, anche in questa fase le esperienze precedenti ci hanno portato all’ottimizzazione della fase, in funzione del tipo di solventi (esano-etanolo 2:1) e dei tempi di estrazione. Attraverso un’adeguata ricerca bibliografica, l’attenzione si è spostata sulla tecnica gascromatografica.
Per questo, si è cercato di mettere a punto una metodica analitica semplice e facilmente riproducibile, che permettesse la determinazione quali-quantitativa di alcuni composti prescelti. In particolare, la nostra attenzione si è rivolta alla determinazione di squalene, lanosterolo e alcuni acidi grassi liberi a catena lineare, sia di tipo saturo che insaturo, compresi tra C16 e C18 (acido sapienico, C16:1Δ6; a. palmitoleico, C16:1Δ9; a. sebaleico, C18:2Δ6,9; a. stearico, C18:0) e che includono coppie di isomeri geometrici (differenti per la posizione del doppio legame, come la coppia palmitoleico-sapienico). La metodica è stata utilizzata per
un’indagine su alcune modalità di campionamento, in particolare sull’utilizzo di alcuni supporti solidi ed alle relative procedure di estrazione con solvente, e successivamente applicata all’analisi di campioni di sebo di alcuni soggetti studiati.
Per la messa a punto del metodo, inizialmente è stato valutato il comportamento dei singoli analiti ed in miscela, con una metodica strumentale che prevede una isoterma nella porzione iniziale (tra 0 e 5 min., 180 °C) seguita da una rampa lineare (tra 5’ e 20’); temperatura dell’iniettore e del detector: 130 °C e 270 °C, rispettivamente); la durata totale dell’analisi è di 20 minuti (metodica ‘1’). Dopo diversi esperimenti, per ottenere i 6 analiti con Rt sufficientemente diversi, gli stessi sono stati analizzati in miscela. Nei cromatogrammi ottenuti, di cui ne viene riportato un esempio (fig. 14), si individuano 5 picchi; questo si deve alla coeluzione di acido sapienico e acido palmitoleico (picco a Rt = 5.8), come confermato dall’analisi degli standard singoli (fig. 15).
I composti a struttura lineare (acidi grassi e squalene) mostrano un fattore di ritenzione proporzionale al numero di carboni presenti, con i due composti C18 che seguono il picco dei due isomeri C16; tra i composti lineari caratterizzati dallo stesso numero di carboni, i composti saturi mostrano una ritenzione leggermente maggiore rispetto ai corrispondenti insaturi (ad es., l’acido sebaleico rispetto all’acido stearico). I risultati ottenuti sono coerenti con quanto riportato in letteratura sull’utilizzo di questa tipologia di colonne (Stewart, 1978).
Dopo diverse modifiche sperimentali, variando alcuni parametri classici della tecnica gascromatografica (temperatura dell’iniettore e del rivelatore, temperatura della colonna e durata della rampa), non si sono ottenute buone separazioni tra i due acidi isomeri.
La complessità esibita dal campione reale nell’intervallo considerato ci ha spinto a variare la metodica strumentale per ottenere una maggiore separazione degli analiti e dei componenti dei campioni di sebo, in modo da ridurre il più possibile i fenomeni di coeluzione dei composti e semplificare il profilo cromatografico, rendendo più facile il riconoscimento dei singoli composti. Inoltre, si è voluta verificare l’eventuale risoluzione dei composti isomeri.
Per fare questo, è stata adottata una rampa di temperatura della colonna che prevede l’andamento da 150 a 240 °C (tra x e y min.; temperatura dell’iniettore e del detector:….rispett.), con durata totale dell’analisi pari a 60 minuti (metodica ‘2’).
In queste condizioni, i segnali relativi ai 4 acidi grassi analizzati compaiono nell’intervallo tra 8 e 13 min., ovvero a tempi più lunghi rispetto all’analisi precedente ma conservand o lo stesso ordine di ritenzione (fig. 16). Purtroppo, anche in questo caso non è stato possibile ottenere la separazione degli isomeri geometrici rappresentati dalla coppia acido palmitoleico-acido sapienico: i composti coeluiscono con Rt pari a 8,6 minuti ca., come dimostrato dall’analisi degli standard singoli (fig. ).
Le analisi GC-FID sono state utili per la valutazione del supporto solido utilizzato nella messa a punto della fase di campionamento. Due diversi supporti adesivi (foglietto Pureness Oil-control® e film polimerico Sebutape®) e un campione di cotone commerciale sono stati utilizzati per effettuare un prelievo di sebo da soggetti sani. I campioni sono stati ottenuti con I supporti solidi tramite adesione sulla cute della regione frontale per 30 min, mentre il campionamento con cotone è avvenuto tamponando la cute con 3-4 batuffoli imbevuti di miscela esanosono stati estratti con una miscela n-esano-etanolo 2:1 (2 x 1.0 ml per I supporti
adesivi, 2 x 2.0 ml per il cotone) in agitazione per 15 min, centrifugati (3000 rpm, 5 min), portati a secco in corrente di azoto e ripresi con cloroformio-metanolo (2:1). La soluzione è stata trasferita in Eppendorf con inserto da centrifuga (capacità 200 μl), centrifugati (7000 rpm a 4 °C per 5 min.) e successivamente analizzati.
Con la stessa procedura sono stati ottenuti estratti di riferimento dei diversi supporti solidi.
I campioni di sebo ottenuti tramite l’applicazione del foglietto Pureness Oil-control® mostrano un pattern di picchi tra Rt = 0 min. e Rt ≅ 12 min., ed un picco significativo a Rt ≅ 22 min (fig. 17).
L’estratto di riferimento (“bianco”) del foglietto Pureness Oil-control® da solo mostra segnali molto piccoli ed in numero esiguo in quelle finestre cromatografiche (fig. 18), dimostrando di essere un supporto con interferenze trascurabili sul campione ed adatto al campionamento del sebo.
La sottrazione del cromatogramma del “bianco” dal cromatogramma del campione di sebo comporta una maggiore pulizia del profilo cromatografico, grazie anche ad un migliore andamento della linea di base, senza causare la scomparsa di picchi significativi o la variazione del loro Rt; questa affermazione è coerente con la precedente indicazione circa la “neutralità” analitica di questo supporto per il campionamento.
Una considerazione simile può essere effettuata per l’estratto di riferimento ottenuto dal film polimerico Sebutape® ed un estratto di sebo dopo campionamento con lo stesso supporto (fig. 20 e 21).
Al contrario, il bianco di riferimento ottenuto da cotone in batuffoli commerciale presenta una serie di picchi interferenti nelle aree cromatografiche dove s ono presenti gli analiti (fig. 22). Pertanto, nelle nostre indagini preliminari condotte, il cotone in batufoli non è un supporto adatto per il campionamento del sebo rivolto alla successive analisi in GC -FID, a causa della presenza eccessiva di composti interferenti; da notare che questo aspetto, ovvero la complessità del campione reale ed il conseguente “effetto matrice” sull’analisi, non costituiscono una pregiudiziale negativa all’analisi degli stessi campioni tramite TLC o HPTLC.
Conclusioni
Il lavoro effettuato ha permesso di sviluppare una procedura estrattiva, basata su l’utilizzo di supporti solidi durante il campionamento, per l’analisi di campioni di sebo umano; inoltre, sono state individuate le condizioni per poter determinare da una parte, la composizione delle principali famiglie di composti presenti tramite l’uso della TLC e del fotodensitometro e, all’altra, la presenza di alcuni composti “marker” selezionati a priori tramite gascromatografia (GC-FID).
Oltre agli aspetti riguardanti strettamente l’analisi del campione, vale a dire la separazione dei composti e la loro identificazione quali-quantitativa, si è cercato di ottimizzare le fasi di campionamento ed estrazione del campione stesso, al fine di ottenere una metodica standardizzata e riproducibile. Le analisi TLC sono state effettuate su lastrine in fase diretta di due diverse tipologie, applicando le condizioni di due metodiche indicate in letteratura, e rivelate con vari reattivi spray. Le lastrine ottenute sono state successivamente scansionate al fotodensitometro, ed i parametri strumentali ottimizzati in funzione del reattivo spray utilizzato, al fine di individuare le condizioni migliori per una valutazione semi-quanititativa dei risultati ottenuti. In questo modo, è stato definito un protocollo analitico che permette la determinazione delle principali famiglie di composti presenti nel sebo.
Questo protocollo è stato integrato dallo sviluppo di una metodica gascromtografica per l’analisi quantitativa di squalene, lanosterolo e di alcuni acidi grassi presenti nel sebo. L’utilizzo di una colonna capillare polare ha permesso la separazione ed il riconoscimento di tutti i composti considerati senza la necessità di uno step di derivatizzazione pre-analisi, tuttavia non è stato possibile ottenere la risoluzione dei composti acidi isomeri (es. sapienic o e palmitoleico). La metodica sviluppata ha permesso di verificare l’efficienza e la selettività estrattiva di alcuni supporti solidi, adesivi e non, utilizzati per il campionamento del sebo dai soggetti.
SEBO – Materiali e metodi
ESTRAZIONE
Il sebo è stato raccolto dalla regione frontale del viso di tre volontari adulti giovani (2 maschi – 1 femmina, età sotto i 30 anni) caratterizzati da pelle in buona salute, priva di patologie. I campioni sono stati prelevati tramite l’applicazione di un film in grado di adsorbire la secrezione sebacea (fazzoletto di carta adsorbente Shiseido Pureness Oil-control®; cerotto in materiale polimerico Sebu-tape®) o per mezzo di batuffoli di cotone commerciale. Il film adsorbente (Shiseido Pureness Oil-control® - Sebu-tape®) è stato applicato con pressione costante su un lato della regione frontale e mantenuto come tale per 30’; nel cas o del Sebu-tape®, le alette laterali di colore nero sono state rimosse con un paio di forbici. L’altro lato della fronte è stato contestualmente strofinato con 3-4 piccoli batuffoli di cotone imbevuti di n-esano. Entrambi i campioni sono stati trasferiti in vials con tappo a vite ed estratti con n-esano-etanolo (2:1), per 15 min. sotto agitazione costante (2 x 2.0 ml per il cotone, 2 x 1.0 ml per i film adsorbenti). Gli estratti ottenuti sono stati portati a secco sotto flusso di azoto (N2) e ripresi con CHCl3-MeOH (2:1, 100 μl). Le soluzioni ottenute sono state sottomesse direttamente ad analisi HPTLC, mentre per l’analisi GC-FID (e GC-MS) la soluzione è stata trasferita in Eppendorf con inserto da centrifuga (capacità 200 μl), centrifugati (7000 rpm a 4 °C per 5 min.) e successivamente analizzati.
ANALISI CROMATOGRAFICA
Squalene (Sq), acido stearico (St), acido palmitoleico (P) e lanosterolo (L) sono stati forniti da Sigma-Aldrich, acido sapienico (Sa) e acido sebaleico (Sb) sono stati forniti da Lipidox; tutti sono stati utilizzati come sostanze di riferimento. Per le analisi HPTLC e GC, sono sta te preparate soluzioni standard di riferimento da 10 – 50 – 200 – 1000 ppm (CHCl3-MeOH 2:1).
Le analisi TLC sono state effettuate su lastrine TLC in gel di silice 60 con supporto in alluminio, su latrine HPTLC in gel di silice 60 con supporto in vetro (10 x 20 cm; Merck) e con lastrine LiChrosphere in gel di silice 60 F254 con supporto in vetro (10 x 20 cm; Merck).
Le lastrine sono state sviluppate con sviluppo multiplo sequenziale in tre passaggi, costituiti da:
cm. Dopo ciascuno sviluppo, il solvente è stato rimosso per evaporazione sotto cappa aspirante. Le separazioni finali sono state visualizzate con differenti reattivi spray: p-anisaldeide (soluzione etanolica 1 % v/v), rame (II)-acetato (7,5 % p/v in H3PO4 8 % acq.), H2SO4 50 % e KMnO4 (3 % p/v in H2SO4 conc.).
Le analisi GC-FID sono state effettuate su un sistema FocusGC (ThermoFinnigan) equipaggiato con colonna capillare (Restek RTX-5 MS; lunghezza 15 mt, diam. int. 0.25 mm) e detector FID. N2 è stato usato come gas carrier, con flusso di 1.0 ml/min e rapporto di splittaggio 1:12. La temperatura dell’iniettore e del detector erano 150 e 240 °C rispettivamente; la temperatura della colonna variava da 150 a 240°C, con durata totale dell’analisi 60 min.
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