SOGGETTI, MATERIALI E METODI

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II CAPITOLO

SOGGETTI, MATERIALI E METODI

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2.1 SOGGETTI

Il presente studio è stato condotto su 35 cani, di cui 25 femmine e 10 maschi di età compresa tra i 9 mesi e i 15 anni (54,37± 40,96 mesi), appartenenti a razze diverse e di taglie diverse, come specificato nelle tabelle 5, 6, 7, 8.

Tabella 5: L’età del cane.

Età del cane Totale

Fino a 10 mesi 8,5% (n=3)

Da 10 mesi a 3 anni 42,8% (n=15)

Da 3 a 6 anni 22,8% (n=8)

Da 6 a 12 anni 20% (n=7)

Oltre i 12 anni 5,7% (n=2)

Tabella 6: Il sesso del cane.

sesso del cane Totale

Maschio intero 22,8% (n=8)

Maschio castrato 5,7% (n=2)

Femmina sterilizzata 31,4% (n=11)

Femmina intera 40% (n=14)

Tabella 7: La razza del cane.

Razza Totale Razza Totale

Meticcio 34,3% (n=12) Border collie 2,8% (n=1) Golden retriver 11,4% (n=4) Boxer 2,8% (n=1) Cocker spaniel 8,6% (n=3) Shar pei 2,8% (n=1) Labrador retriver 2,8% (n=1) Hovawart 2,8% (n=1) Flat coated retriver 2,8% (n=1) Bull terrier 2,8% (n=1) Bovaro del bernese 2,8% (n=1) Cao de agua 2,8% (n=1) Jack russel terrier 2,8% (n=1) Pastore belga 2,8% (n=1) Pinscher 2,8% (n=1) Rottweiler 2,8% (n=1) Bichon frisè 2,8% (n=1) Bolognese 2,8% (n=1) Barboncino 2,8% (n=1)

Tabella 8: La taglia del cane.

Taglia Totale

Piccola (≤10Kg) 17,1% (n=6)

Media ( 34,2% (n=12)

Grande ( 25 Kg) 48,6% (n=17)

Per quanto riguarda l’abitudine dei soggetti che hanno partecipato allo studio di ascoltare musica insieme al proprietario, il 20% del campione non ne ascolta mai, il 5,7% ne ascolta fino a 5 minuti solo nei giorni festivi, il 5,7% ne ascolta 5 minuti al

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giorno sia nei giorni festivi che in quelli lavorativi ed il restante 31,4% ne ascolta dai 15 minuti a più di 1 ora sia nei giorni lavorativi che in quelli festivi (vedi tabella 9).

Tabella 9: L’abitudine del cane ad ascoltare musica insieme al proprietario. Giorni lavorativi Giorni festivi

Mai 25,7% (n=9) 20% (n=7) Fino a 5 minuti 5,7% (n=2) 5,7% (n=2) 5-15 minuti 14,3% (n=5) 14,3% (n=5) 15-30 minuti 14,3% (n=5) 11,4% (n=4) 30-60 minuti 28,6% (n=10) 17,1% (n=6) Otre 1 ora 11,4% (n=4) 31,4% (n=11)

La maggior parte dei cani sottoposti allo studio sono abituati a rimanere da soli (vedi tabella 10), e quando questo accade non mostrano segni particolari di ansia quali la distruzione di mobili e/o oggetti, urinare e/o defecare in casa, ululare e/o abbaiare (vedi tabella 11).

Tabella 10: L’abitudine a stare da solo del cane. Totale

Abituati a stare da soli 94,3% (n=33) Non abituati a stare da soli 5,7% (n=2) Tabella 11:Caniche mostrano segni di ansia se lasciati soli.

Totale Non mostrano segni di ansia 60% (n=21) Mostrano segni di ansia 40% (n=14)

2.2 MATERIALI

LOCALI:

Il Dipartimento di Scienze Fisiologiche dell’università di Pisa ha messo a disposizione 4 stanze con le stesse caratteristiche dimensionali (4mx5m) in cui poter svolgere lo studio. I locali utilizzati sono stati denominati: biblioteca, anti-consultorio, sala treadmill, consultorio.

VIDEO:

Le sessioni sono state riprese da due video camere JVC Everio Disck Camcoder (JVC® GZ-MG 130E ), così da poter analizzare i vari comportamenti esibiti dai soggetti. Durante ogni sessione la musica è stata riprodotta, a volume costante, da un computer portatile Sony Vaio VPCEB4B4E.

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BRANI MUSICALI:

 Sessione Classica

Consiste nell’ascolto da parte del cane del brano di musica classica di J. S. Bach “ Glenn Gould - Goldberg Variations” per i 5 minuti in cui il soggetto è lasciato solo.

 Sessione Heavy metal

Consiste nell’ascolto da parte del cane del brano Heavy metal dei Metallica “Whiskey In The Jar”.

 Sessione “sua”

Consiste nell’ascolto da parte del cane della canzone scelta dal proprietario. Di seguito troviamo una tabella che riassume i vari brani musicali scelti dai proprietari e gli stili musicali ai quali essi appartengono.

Tab. n° 12

Nome Brano scelto Genere Caos Taake_-Hordalands

Doedskvad Part_I

Heavymetal

Carlotta Bob Marley & The Wailers Don’t rock my boat

Reggae

Elany Edward Maya Ft Vika Jigulina - Stereo Love

Dance

Fiona Lamb of god – Black Label

Metal

Fischia Beach Boys - Surfin' USA Pop

Ira Alborosie - Gal Dem Reggae

Mia Juan Magan – Mariah Dance Latino

Otto Beach Boys - Surfin' USA Pop

Paride Alborosie - Gal Dem Reggae

Raja Cristina d’Avena-Heidi Cartoni

Scott Blood_Sugar - Pendulum

Sofia Queen - Don't Stop Me Now

Rock

Tosca Billie Holiday- The Man I Love

Jazz

Walaway Meg- Succhio luce Pop

Yamara Mads Langer - You are not alone

Pop

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Oscar Ivano Fossati – Buontempo

Pop

Kyra Mark Knopfler – Poscard from Paraguay

Blues

Pluto Bob Marley – Three little birds

Reggae

Axel Twisted Sister – I wanna rock

Heavy-metal

Lilla Renato Zero – Spiagge Pop

Shiva Dusty springfield – Son of a preacher man

Pop

Zoe Passenger - Let her go Pop

Flora Malika ayane – La prima cosa bella

Pop

Anakin Einaudi – Mattino Strumentale

Dolly Einaudi – Mattino Strumentale

Nana Jovanotti – Ti porto via con me

Pop

Zara Bobo Rondelli – Haway da shangai

Pop

Lizzy Beethoven – Sonata al chiaro di luna

Classica

Trilly Jovanotti – A te Pop

Lola Beethoven – Sonata al chiaro di luna

Classica

Elga Beethoven – Sonata al chiaro di luna

Classica

Dub Black sabbath - Paranoid Hard rock

Davi Tre allegri ragazzi morti – Il mondo prima

Rock

 Sessione in silenzio

sessione di controllo, in cui il cane veniva lasciato nella stanza in silenzio.

QUESTIONARIO:

Ai proprietari sono stati sottoposti dei questionari recanti 20 domande aventi lo scopo di inquadrare in modo più preciso il carattere, le abitudini e le peculiarità di ognuno

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dei cani partecipanti al progetto, con attenzione particolare alla loro sensibilità nei confronti di eventi potenzialmente stressanti e all’abitudine o meno di essere sottoposti a stimolazione sonora.

1)

2) Età: ____________________

3)

4) Il cane proviene da:

5) Il cane è stato abituato a rimanere solo?

Si no

6) Il cane quando viene lasciato solo mostra segni di ansia?

Si no

7) Se si quali?

 Distrugge i mobili e/o ciò che è alla sua portata  Urina e defeca in casa

 Ulula e abbaia  Altro…..

8) Avete adottato qualche strategia per ridurre questo disagio?

Si no

9) Se si quali?

 Giochi di attivazione mentale (kong…)  Lasciare accesa la televisione o radio  Altro….



10) Il cane presenta una patologia comportamentale di ansia da separazione?

(7)

11) È stata diagnosticata da un Veterinario Comportamentalista?

Si no

12) Prende eventuali medicinali per ridurre la patologia?

Si no

13) In media, per quanto tempo al giorno il cane ascolta la musica insieme al proprietario?

Giorni lavorativi Giorni festivi Mai Fino a 5 minuti 5-16 minuti 15-30 minuti 30-60 minuti Otre 1 ora

14) Che tipo di musica ascolta?

 Radio  Pop music  Rock  Jazz  Reggae music  Altro…

15) Il cane mostra particolari paure verso i rumori?

(8)

16) Se si quali?

 Fuochi d’artificio  Tuoni

 Rumori di oggetti che cadono  Rumori improvvisi

 Altro……

17) Come reagisce?

 Scappa

 Abbaia e ringhia

 Si ritrae dallo stimolo che lo spaventa, ma se questo non scompare ridirige verso altro  Altro…

18) Durante il condizionamento alla calma con la canzone il cane ha mostrato di essere:

 Rilassato  Agitato  Indifferente  Altro…

19) Dopo l’avvenuto condizionamento, ha riproposto la canzone scelta in una situazione stressante e ha

notato che il cane fosse più tranquillo del solito? Si no

20) Se si quali comportamenti ha rilevato:

 Il cane si sdraiava  Il cane sbavava

 Il cane si addormentava  Altro…

CORTISOLO SALIVARE:

Per raccogliere la saliva sono state utilizzate le Salivette®, fatte masticare ai cani per circa un minuto dal proprietario e centrifugate successivamente a 3000 giri/minuto per 15 minuti. Il campione così ottenuto è stato trasferito in provette eppendorf (Eppendorf Tubes®) identificate con il nome del cane, il numero della seduta e la successione del prelievo (se prima o dopo il test) e refrigerato e congelato a -20°C entro 6 ore dal prelievo, come suggerito da Cronin e colleghi (2003). Il risultato finale è stato ottenuto con l’utilizzo del Kit ELISA per cortisolo salivare (Salimetrics® LLC, PA, USA) e relativa lettura con spettrofotometro.

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La presente ricerca si proponeva di valutare, tramite la determinazione di parametri fisiologici e comportamentali, l’effetto calmante di uno stimolo sonoro (un brano musicale di qualsiasi genere, scelto liberamente dal proprietario) con il quale il cane era stato condizionato, per un periodo di 20 giorni, in ambito domestico ed in situazioni di quiete, per verificarne la capacità di tranquillizzare l’animale sottoposto a situazioni stressanti (come l’introduzione in un ambiente sconosciuto).

Il protocollo prevede che, trascorsi 4 giorni dalla fine del periodo di condizionamento, ogni cane sia sottoposto a 4 sedute individuali, a distanza di 4 giorni l’una dall’altra, ciascuna di una durata di 5 minuti e ogni volta in una stanza diversa, sconosciuta all’animale, durante le quali i comportamenti e lo stato emotivo del cane sono stati filmati. Quattro minuti prima del test e undici minuti dopo la sospensione del brano musicale, sono stati effettuati i prelievi della saliva con Salivette® per la determinazione dei livelli di cortisolo salivare. Durante ciascuna delle 4 sessioni del test, ad ogni animale, è stato sottoposto, in ordine assolutamente casuale, il brano scelto dal proprietario, un brano di musica classica, un brano heavy-metal e una seduta in silenzio. Lo studio è stato condotto in due diverse fasi, suddividendo i 35 cani che vi hanno partecipato, in 2 gruppi. Il primo gruppo, composto da 17 soggetti, tra cui 6 maschi e 11 femmine di diverse razze ed età. In questa prima fase di studio non è stato possibile prelevare la saliva per la determinazione del cortisolo salivare. Nel secondo gruppo, composto da 18 soggetti (14 femmine e 4 maschi), è stato possibile determinare il cortisolo salivare su 10 soggetti.

PROTOCOLLO:

Le 4 sessioni di ascolto presso il Dipartimento di Scienze Fisiologiche dell’università di Pisa sono state gestite come descritto in seguito:

 All’arrivo i cani vengono condotti dai loro proprietari in un luogo tranquillo dove si procede al prelievo di un campione di saliva tramite un tampone di cotone (SALIVETTE®).

 Trascorsi 4-5 minuti, durante i quali il cane resta in compagnia del proprietario all’esterno della struttura del dipartimento, l’operatore prende in consegna l’animale e lo conduce all’interno del dipartimento e, nello specifico, nella stanza scelta per la prova di ascolto.

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 Introdotto l’animale nella stanza, si procede sganciando il guinzaglio, in modo che l’animale resti libero mentre l’operatore aziona la videocamera e la

riproduzione audio del brano scelto per la seduta.

 A questo punto l’operatore esce dalla stanza portando con sé il guinzaglio.

 Si lascia il cane da solo per 5 minuti.

 Allo scadere dei 5 minuti l’operatore rientra , ferma la ripresa video e la riproduzione audio, e rimane con l’animale per 11minuti.

 Trascorsi gli 11 minuti si procede con un nuovo prelievo di saliva previa tampone con SALIVETTE®.

Il cane viene quindi rimesso al guinzaglio e condotto fuori dalla stanza e dal dipartimento, dove lo attendono i proprietari.

L’intervallo dalla fine del condizionamento all’ascolto del brano stesso è stato di 4 giorni. Lo stesso intervallo di tempo doveva trascorrere tra una sessione e l’altra, anche se questo non è stato sempre possibile sia per altri impegni dei proprietari che per la disponibilità delle stanze.

Tab. n° 13

Cane Sessione Musica Stanza

Caos

1° Heavy metal Consultorio

2° Sua Camera A

3° Silenzio Biblioteca

4° Classica Anti-consultorio

Carlotta

1° Silenzio Camera A

2° Heavy metal Anti-consultorio

3° Classica Portineria

4° Sua Biblioteca

Elany

3° Classica Camera A

4° Sua Consultorio

Fiona

1° Sua Consultorio

2° Heavy metal Camera A

Fischia 1° Sua Camera A

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3° Classica Portineria

Ira

1° Classica Consultorio

2° Sua Anti-consultorio

3° Heavy metal Biblioteca

Laila

Mia

1° Sua Camera A

Otto

1° Sua Camera A

2° Classica Biblioteca

3° Heavy metal Portineria

4° Silenzio Anti-consultorio

Paride

1° Silenzio Consultorio

Rajha

1° Sua Biblioteca

3° Silenzio Consultorio 4° Classica Camera A Scott 1° Sua Biblioteca 2° Silenzio Anti-consultorio 3° Classica Consultorio

Sophia

1° Sua Biblioteca

3° Classica Camera A

Tosca

1° Sua Biblioteca

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Wala Way

4° Sua Camera A

Yamara

2° Silenzio Camera A 3° Sua Consutorio 4° Classica Biblioteca Zippo 1° Sua Biblioteca 2° Classica Anti-consultorio

3° Haevy metal Consutorio

Oscar

1° Sua Consultorio

3° Haevy metal Treadmill

Kyra

3° Sua Biblioteca

4° Silenzio Treadmill

Pluto

Lilla

2° Heavy metal Treadmill

3° Silenzio Bilblioteca 4° Sua Anti-consultorio Trilly 1° Classica Anti-consultorio 2° Silenzio Consultorio 3° Sua Treadmill

Elga

1° Sua Biblioteca

2° Classica Treadmill

3° Heavy metal Consutorio

(13)

Lola

1° Sua Biblioteca

3° Heavy metal Consutorio

Anakin

2° Sua Consultorio

3° Haevy metal Anti- consultorio

Dolly

2° Sua Consultorio

Dub

1° Heavy metal Anti- consultorio

4° Sua Consultorio

Davi

1° Heavy metal Anti- consultorio

2° Silenzio Treadmill 3° Classica Biblioteca 4° Sua Consultorio Zoe 1° Classica Treadmill 2° Sua Consultorio

3° Haevy metal Anti- consutorio

4° Silenzio Boblioteca

Shiva

1° Sua Consultorio

Flora

1° Sua Consultorio

Axel

4° Sua Treadmill

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2° Sua Anti- consultorio

Zara

2° Sua Anti- consultorio

Lizzy

1° Classica Anti- consultorio

2° Silenzio Consultorio

3° Sua Treadmill

ANALISI DEI FILMATI E ETOGRAMMA:

Le osservazioni comportamentali sono state effettuate sulla base di un etogramma compilato preventivamente considerando quei comportamenti ritenuti rilevanti per determinare lo stato emotivo del cane in quella specifica situazione.

Le valutazioni sono state redatte attingendo alla letteratura disponibile ed adattando le definizioni alle contingenze del presente studio. In base ai comportamenti considerati, essi sono stati raggruppati in categorie riportate in tabella 6.

Tabella 14: Etogramma del cane utilizzato ai fini della presente ricerca

Comportamenti Definizioni Riferimenti bibliografici

Eliminazione di feci e/o urina

Emissione di deiezioni Beerda et al., 1998, 1999; Casey, 2002; Tod et al., 2005

Ridotta attività Rimanere fermi, in piedi, sdraiati o seduti

Beerda et al., 1997, 1999; Gaines et al., 2003

Girare la testa Ruotare la testa rispetto all’osservatore

Schildler and van der Borg, 2004; Rooney et al., 2007

Salivazione Scialorrea Beerda et al., 1997;

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eccessiva and Granger, 2005 Pelo irto Alzare il pelo sulla schiena

e sulla coda

Beerda et al., 1999;

Tremori Contrazioni muscolari

simili a quelle provocate da freddo

Beerda et al., 1999; Dreschel and Granger, 2005; Tod et al., 2005; Rooney et al., 2009 Respiro frequente e

affannoso

Frequenza respiratoria aumentata e respiro con bocca aperta

Beerda et al., 1997, 1999; Hennessy et al., 1998; Casey, 2002; Schildler and van der Borg, 2004;

Dreschel and Granger, 2005; Rooney et al., 2009

Sollevamento di una zampa anteriore

Raccogliere la zampa sotto di sé e tenerla sollevata da terra

Beerda et al., 1997, 1998, 1999; Schildler and van der Borg, 2004; Rooney et al., 2007; Rooney et al., 2009 Girare in tondo Camminare in circolo o

seguendo un perimentro

Beerda et al., 1997, 1998, 1999; Casey, 2002; Schildler and van der Borg, 2004;Dreschel and Granger, 2005; Rooney et al., 2007; Hubrecht et al., 1992 Camminare

ossessivamente

Camminare senza un fine e senza meta Beerda et al., 1997, 1998; Casey, 2002; Rooney et al., 2007 Abbaiare ossessivamente Emettere abbaio frequentemente Beerda et al., 1998; Schildler and van der Borg, 2004; Tod et al.,

(16)

2005; Rooney et al., 2009

Leccamento di parti del corpo

Leccare o rosicchiare parti del corpo

Beerda et al., 1998, 1999; Rooney et al., 2007; Rooney et al., 2009

Farsi piccoli Assumere posizione seduto e rannicchiato

Beerda et al., 1997; Rooney at al., 2009

Orecchie basse Tenere le orecchie

all’indietro

Beerda et al., 1999

Coda fra le zampe Tenere la coda bassa tra le zampe posteriori senza scodinzolare

Kotrschal et al., 2009

Grattarsi Percuotere una zona del

corpo con zampa posteriore

Scuotersi Il cane si scrolla Beerda et al., 1999;

Cercare di

nascondersi

Sedersi o sdraiarsi sotto tavoli, sedie…

Lockwood, 1995

Cercare di scappare dalla sala

Tentativo di uscire dalla sala tramite porte, finestre o altre aperture.

Beerda et al., 1997;

Orientato alla porta

Fissare la porta, sia quando si trova vicino ad essa che quando è lontano.

Prato-Previde et al., 2003

Esplorazione Attività, dirette verso gli oggetti presenti nella stanza. Annusare ispezione visiva da lontano (fissando o scanning), ispezione visiva da vicino, leccare.

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Altre attività ripetitive

Tutte le attività non incluse nella lista comportamentale qui sopra, ma che sono manifestate più volte nell’intervallo di tempo

Beerda et al., 1997, 1999; Rooney et al., 2009

Grattare la porta

Il cane graffia con una o due zampe la porta.

Può essere considerato come tentativo di fuga. Se continuo può essere associato ad ansia

Beerda et al., 1999; Kotrschal et al., 2009

Tournis

Il cane gira su sé stesso. Possibile associazione a stress e restrizione ambientale Feaver et al., 1986; Gosling, 1998; Gosling & Bonnemburg, 1998 Leccarsi i baffi

Il cane passa la lingua su labbra e baffi; se frequente è associato ad ansia Feaver et al., 1986; Gosling, 1998; Gosling & Bonnemburg, 1998 Sonnecchiare Il cane è accucciato ed ha gli occhi socchiusi; associato a quiete

Feaver et al., 1986; Gosling, 1998; Gosling & Bonnemburg, 1998

Scodinzolare

il cane agita la coda in modo più o meno intenso.

E' una forma di comunicazione molto importante: esprime un atteggiamento amichevole se il movimento è morbido e ampio, esprime eccitazione se il movimento è rigido e intenso. Feaver et al., 1986; Gosling, 1998; Gosling & Bonnemburg, 1998

(18)

Leccarsi il naso/ naso che gocciola

In alcuni cani l’agitazione e lo stress provocano

aumento della produzione di muco

Nagel e v. Reinhardt, 2003

Sbadiglio

Il cane spalanca la bocca e inspira e espira aria;

frequentemente indica uno stato d’ansia. Feaver et al.,1986;Gosling, 1998; Gosling and Bonnemburg, 1998 In piedi

Il cane è in piedi con le quattro zampe che toccano il pavimento. Se prolungato può indicare stress.

Mills D.S. et al.,2006

Sdraiato

Il cane si stende per terra con il torace che poggia sul pavimento. Associato a quiete. Feaver et al.,1986;Gosling, 1998; Gosling and Bonnemburg, 1998 Movimento Qualsiasi andatura (passo, _{trotto, galoppo) non}

associata a esplorazione.

Mills D.S. et al.,2006

Seduto

Il cane si siede con il posteriore appoggiato a terra mentre le zampe

anteriori sono stese in modo che il torace non tocchi il pavimento. Suggerisce tranquillità. Feaver et al.,1986;Gosling, 1998; Gosling and Bonnemburg, 1998

Abbaiare Vocalizzazione tipica del

cane che si manifesta più o meno frequente a seconda della razza considerata, della sua personalità e della necessità; associata a stress e a richiesta di interazione sociale.

Natoli et al., 2001

Ululare Vocalizzazione tipica dei

lupi; se frequente indica nel

Feaver et al., 1986; Gosling, 1998; Gosling

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cane profonda sofferenza. & Bonnemburg, 1998

Guaire Suono prolungato, acuto,

normalmente associato con

la sofferenza, la

sottomissione, l’insicurezza e la paura.

Abrantes R., 2008

ANALISI DEI DATI COMPORTAMENTALI:

I filmati sono stati visionatiper creare un file di Microsoft Excel® contenente tutte le durate dei comportamenti osservati al fine di effettuare un’analisi statistica.

ANALISI DEL CORTISOLO SALIVARE:

1. PRELIEVO: i prelievi sono stati effettuati dai proprietari mediante l’utilizzo di Salivette®, 4-5 minuti prima di ogni seduta e 11 minuti dopo il termine, facendo masticare il tampone per circa 1 minuto. E’ stato poi chiesto ai proprietari di effettuare un ulteriore prelievo a casa, in condizioni tranquille per il cane, in modo da avere un campione di riferimento (basale). Per ogni soggetto che ha partecipato al test sono stati così ottenuti 9 campioni di saliva identificati (nome del cane, numero della seduta, successione del prelievo) e processati come segue.

2. CENTRIFUGAZIONE: le Salivette® sono state centrifugate a 3000 giri/minuto per 15 minuti, ottenendo il filtraggio della saliva attraverso il tampone di cotone e la sua collezione sul fondo della provetta.

3. TRASFERIMENTO E CONSERVAZIONE: i campioni di saliva ottenuti sono stati trasferiti tramite pipettatura in eppendorf tube®, identificati ulteriormente (nome del cane, seduta e successione del prelievo), per poi essere refrigerati e conservati a -20° fino alla processazione.

4. ANALISI DEL CORTISOLO: effettuata mediante Kit ELISA per cortisolo salivare (Salimetrics® LLC, PA, USA) e relativa lettura con spettrofotometro.

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PRINCIPIO DEL METODO: il cortisolo ( antigene) presente nel campione compete con l’antigene marcato con perossidasi di rafano (HRP) nei confronti dell’anticorpo anti-cortisolo adsorbito su micro piastra (fase solida). Dopo l’incubazione, la separazione libero-legato si ottiene mediante semplice lavaggio della fase solida. Successivamente l’enzima HRP presente nella frazione legata, catalizza la reazione tra il substrato (H2O2) ed il TMB Substate, sviluppando una colorazione blu che vira al giallo dopo l’aggiunta della Stop solution ( H2SO4). L’intensità del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla concentrazione del cortisolo presente nel campione.

REATTIVI E MATERIALI:

 Cortisol calibrators: forniti nel kit; necessari per determinare i punti di riferimento della curva di calibrazione; hanno le seguenti concentrazioni:

C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6

ng/ml 0 0.5 1 5 10 20 100

 Incubation buffer: phosphate buffer pH 7.4

 Conjugate: cortisolo coniugato con perossidasi di rafano (HRP)

 Coated microplate: anticorpo anti-cortisolo adsorbito alla micropiastra

 TMB substrate: perossido di idrogeno-TMB (0.26 g/l)

 Stop solution: acido solforico (0.15 mol/l)

 Acqua distillata

 Dispensatori automatici (P200)

 Campioni salivari PROCEDIMENTO:

- Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22°-28°C)

- Preparare il coniugato diluito con 10µl di Conjugate e 1 ml di Incubation Buffer

- Allestire sulla micropiastra 2 pozzetti per ogni punto della curva di calibrazione (C0-C6), 2 per ogni controllo, 2 per ogni campione e 1 per il Bianco. Operare in doppio consente di aumentare l’accuratezza dei risultati del test.

Reagente Calibratore Campioni Bianco

Calibratore C0-C6 25µl

Campioni 25µl

Coniugato diluito 200µl 200µl

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- Allontanare la miscela di reazione e lavare 2 volte, aggiungendo a ogni pozzetto 0.3 ml di acqua distillata.

- Aggiungere TMB Substate:

Calibratore Campioni Reagente

TMB Substrate 100µl 100µl 100µl

- Incubare 15 minuti a temperatura ambiente (22-28°C) al riparo dalla luce. - Aggiungere Stop solution:

Calibratore Campioni Reagente

Stop solution 100 100 100

- Agitare delicatamente la micropiastra

- Leggere l’assorbanza (E) a 450 nm contro il bianco entro 5 minuti. ANALISI STATISTICA:

Trattando il presente studio, dati di soggetti correlati statisticamente (dipendenti), sottoposti a trattamenti ripetuti nel tempo (4 sessioni del test), è stata condotta una analisi basata sulla statistica non parametrica, dato che i comportamenti osservati (dati) non hanno distribuzione normale o gaussiana. Tenendo in considerazione tali fattori, sono stati utilizzati il Test di Friedman e, sui risultati statisticamente significativi da esso derivati, il Test di Wilcoxon, tenendo conto del fattore di correzione di Bonferroni, dividendo i livelli di significatività per le possibili combinazioni.

TEST DI FRIEDMAN: test proposto da Milton Friedman nel 1937 (con l’articolo The use of ranks to avoid the assumptions of normality implicit in the analysis of variance pubblicato su Journal of the American Statistical Association Vol. 32, pp. 675-701). Come dice il titolo del suo articolo, l’uso dei ranghi da lui proposto permette di evitare le assunzioni di normalità, implicite nell’ANOVA. E’ l’alternativa non parametrica all'ANOVA a due criteri di classificazione o a blocchi randomizzati, quando non sono rispettate le condizioni di validità richieste dai test parametrici. E' uno dei test non parametrici più potenti e di uso più generale . Come tale è riportato in quasi tutte le librerie statistiche informatiche, anche quelle che limitano la presentazione di quelli non parametrici a pochi test. Il test di Friedman viene usato per comparare tra loro più di due campioni dipendenti, in termini di popolazione. Il confronto che viene fatto si basa sulla mediana della popolazione. È utilizzato per analizzare esperimenti nei quali ogni soggetto è sottoposto a un certo numero di trattamenti diversi. Si attribuisce un rango alle risposte di ciascun soggetto ai trattamenti. Se l’ipotesi che il trattamento non ha effetto è corretta, allora in ciascun soggetto i ranghi saranno distribuiti in modo casuale e le somme dei ranghi saranno analoghe per ogni gruppo sottoposto ai trattamenti.

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TEST DI WILCOXON: Sebbene spesso chiamato test di Mann-Whitney, l'equivalente non parametrico del test t di Student per dati appaiati è dovuto anch'esso a Wilcoxon. Rappresenta l'equivalente non parametrico del test t di Student per campioni indipendenti, e va utilizzato in luogo di questo quando i dati non siano distribuiti in modo gaussiano.