4. BIOLOGIA CELLULARE
4.1. Animali
Nel corso degli esperimenti, per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali murine (mMSCs), ho utilizzato topi Wild Type (WT) e topi transgenici Kit/GFP, appartenenti al ceppo BDF1, in cui la sequenza codificante della GFP è stata posta sotto il controllo degli elementi regolatori di Kit (costrutto 3) (Cairns et al., 2003), includendo un frammento di 4,5 Kb del primo introne e tutti i siti HS identificati (HS2-HS6). I topi Kit/GFP sono stati forniti dal laboratorio del Dott. Sergio Ottolenghi del Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze dell’Università di Milano Bicocca.
I topi Kit/GFP sono stati genotipizzati attraverso una PCR usando la coppia di primers: Senso 5’-ACATGAAGCAGCACGACTTC-3’
Antisenso 5’-TTGTGGCGGATCTTGAAGTT-3’
4.2. Isolamento ed espansione di cellule staminali mesenchimali
murine (mMSCs)
I topi utilizzati per l’isolamento delle mMSCs sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale, e il midollo osseo è stato prelevato dalle tibie e dai femori facendo passare del mezzo di coltura attraverso la cavità midollare mediante una siringa (0,8x40mm). Il midollo è stato recuperato in 2ml di MesenCult® completo e la sospensione resa omogenea facendola passare attraverso l’ago di una siringa (0,8x40mm).
Il MesenCult® completo (StemCell Technologies) è un terreno minimo privo di citochine, specifico per la crescita delle mMSCs. Viene preparato aggiungendo al “MesenCult® MSC Basal Medium” il “Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements”, in rapporto 1:5, contenente il 10% di siero bovino e il 10% di siero di cavallo, oltre ad altri nutrienti.
Le cellule, dopo la risospensione, sono state contate con il colorante vitale Trypan Blue (Biowest). Le cellule vengono quindi piastrate con una densità di 1x107 cellule/cm2. Le cellule sono state
piastrate in 10 ml di MesenCult® completo in flask T-25 cm2 e incubate a 37°C in atmosfera
umidificata con 5% di CO2. Il mezzo deve essere cambiato per metà ogni settimana e le cellule
devono essere tripsinizzate e piastrate in nuove flask di espansione una volta raggiunto il 70-80% di confluenza. Il protocollo di espansione delle cellule in aderenza prevede un lavaggio in PBS 1X, dopo la rimozione del mezzo vecchio, e alcuni minuti di incubazione a 37°C con Tripsina 0,25% EDTA in PBS (Biowest). La tripsina è un’enzima che facilita il distacco delle cellule dalla flask e rompe i legami tra le cellule. La reazione è poi bloccata con un volume di siero doppio rispetto a quello usato per la tripsinizzazione, che permette la neutralizzazione dell’enzima. La sospensione cellulare può così essere recuperata e centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti. Dopo la centrifuga si elimina il sovranatante e il pellet viene risospeso in un adeguato volume di mezzo. Le cellule possono essere nuovamente piastrate mediante diluizioni opportune o congelate.
Nel corso dei nostri esperimenti la densità cui abbiamo piastrato le cellule nella fase di espansione è stata di 2,5x104 cellule/cm2. Questi passaggi sono necessari sia per espandere le mMSCs in uno
stato indifferenziato che per purificarle rimuovendo la componente ematopoietica presente nel midollo. Infatti le MSCs crescono in adesione mentre le cellule ematopoietiche crescono in sospensione. Inoltre il terreno povero di citochine e i ripetuti passaggi in coltura sono necessari anche per eliminare la componente macrofagica che cresce in adesione alla plastica come le MSCs ma che, al contrario ha bisogno di specifiche citochine.
4.3. Congelamento e scongelamento cellule
Le cellule sono state congelate in MesenCult® con il 30% di supplementi in presenza del crioconservante DMSO (dimetilsulfossido) al 10%, in un volume finale di 1,5 ml e ad una
concentrazione finale di circa 1x106 cellule/vial. Grazie all’azione protettrice del DMSO le cellule
possono essere conservate in azoto liquido dopo averle tenute qualche giorno a -80°C.
Le cellule vengono scongelate a 37°C per accelerare il processo ed evitare possibili danni dovuti alla tossicità del DMSO. La sospensione cellulare viene immediatamente trasferita in una provetta contenente il mezzo, e poi centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti. Il sovranatante deve essere aspirato velocemente, per eliminare il prima possibile il DMSO, e il pellet risospeso in terreno completo. Le cellule dopo essere state risospese sono poste nuovamente in coltura nelle opportune condizioni.
4.4. Saggio delle colonie CFU-F
Il saggio delle CFU-F è una delle modalità d’identificazione delle MSCs in quanto queste cellule una volta messe in coltura a bassa densità sono caratterizzate dalla capacità di formare colonie di tipo fibroblastoide, dopo circa 10 giorni, ognuna delle quale originatesi per divisione di uno stesso progenitore mesenchimale. Il saggio viene effettuato nelle 6-well plate, con due diverse concentrazioni di cellule, 5x105 e 1x106 cellule per pozzetto. Dopo essersi formate, le colonie
vengono colorate con Giemsa al 5%. La colorazione prevede due lavaggi in PBS 1X e una fissazione in metanolo per 5 minuti a RT, passati i quali il fissativo viene aspirato e le colonie incubate con il Giemsa per 5 minuti. Seguono dei lavaggi con acqua e, dopo averle fatte asciugare, la conta delle colonie.
4.5. Differenziazione osteogenica di mMSCs
Per la differenziazione osteogenica le cellule sono state piastrate a una densità di 2,5x104
cellule/cm2 e una volta raggiunto il 70-80% di confluenza sono state incubate con agenti
Il protocollo di differenziazione osteogenica utilizzato prevede l’aggiunta, al mezzo di coltura degli agenti inducenti: acido ascorbico 0,5 mM Aldrich), dexametasone 1μM (Sigma-Aldrich), β-glicerofosfato 10mM (Sigma-Aldrich). L’acido ascorbico contribuisce a ridurre il potenziale proliferativo delle cellule a favore del loro differenziamento, il dexametasone è l’agente chimico che svolge l’azione inducente vera e propria, il β-glicerofosfato rappresenta la fonte di fosfati necessari alla mineralizzazione della matrice. Il mezzo con le sostanze inducenti è stato cambiato ogni 3-4 giorni. Le cellule sono state raccolte al tempo zero (cellule proliferanti, indifferenziate, utilizzate come controllo), ai giorni 3, 7, 14 e 21 di trattamento. Dalle cellule così raccolte è stato estratto l’RNA per lo studio di espressione genica.
4.6. Differenziazione adipogenica di mMSCs
Per la differenziazione adipogenica le cellule sono state piastrate ad una densità di 2,5x104
cellule/cm2. Sono state espanse fino ad un 70-80% di confluenza in presenza di MesenCult®
completo. Successivamente sono state esposte ad agenti inducenti, disciolti ad opportune concentrazione nel mezzo di coltura dopo aver abbassato anche la concentrazione dei supplementi, in modo da limitare la proliferazione e spingere le cellule verso un destino differenziativo. Il protocollo per la differenziazione adipogenica prevede l’incubazione per un tempo di 3 giorni con il mezzo di induzione costituito da Isobutilmetilxantina 0,5 mM (Sigma-Aldrich), Indometacina 0,2 mM (Sigma-Aldrich), Dexametasone 1 µM (Sigma-Aldrich) e Insulina 0,01 M (Sigma-Aldrich). Successivamente, le cellule vengono coltivate con un mezzo di mantenimento in cui viene aggiunta solo l’Insulina nel mezzo di coltura. Il mezzo di mantenimento così costituito viene cambiato ogni 3-4 giorni per il resto della differenziazione. Le cellule vengono raccolte in un pellet, utilizzato poi per le analisi molecolari, a diversi giorni del trattamento: al giorno zero, corrispondente ad uno stadio indifferenziato usato come controllo, e ai giorni 3, 7, 14.
4.7. Colorazione citochimica mediante Alizarin Red S
Con il procedere della differenziazione le cellule cambiano morfologia e si assiste alla formazione di noduli di mineralizzazione che possono essere evidenziati dalla colorazione con Alizarin Red S (Sigma-Aldrich), un colorante che si lega alla matrice sintetizzata e secreta dagli osteoblasti maturi grazie alla sua affinità con i cristalli di fosfato di calcio. La soluzione di Alizarin utilizzata per la colorazione è all’1% e portata a pH 4.0-4.2, mediante NaOH 1N. La soluzione così preparata può essere conservata, al buio e a RT, per 3 mesi. Il protocollo di colorazione utilizzato prevede, dopo l’eliminazione del mezzo di coltura, un lavaggio in PBS 1X e la fissazione con formalina al 10% per 40 minuti a RT. Quando le cellule sono fissate, si elimina la formalina, si fa un lavaggio in PBS 1X e si aggiunge il colorante che va lasciato agire per circa 10 minuti al buio a RT. Seguono dei lavaggi in acqua e poi in PBS 1X per rimuovere l’Alizarin in eccesso. A questo punto la colorazione è pronta per essere osservata al microscopio e fotografata.
4.8. Colorazione citochimica Oil Red
Gli adipociti che si formano in seguito all’induzione adipogenica mostrano un fenotipo facilmente riconoscibile, grazie alla presenza delle gocce lipidiche nel citoplasma. Il colorante Oil Red (Sigma-Aldrich) mette in evidenza la presenza dei vacuoli lipidici. Per effettuare la colorazione è necessario fare una Working Solution, costituita da tre parti di Stock Solution (Oil Red 0,4%) e due di PBS 1X. Una volta filtrata attraverso un filtro 45 µm, le cellule vengono lavate dal mezzo di coltura con il PBS1X e incubate per 40 minuti con formalina al 10%. Dopo aver fissato le cellule e eliminato la formalina viene fatto un lavaggio in PBS 1X e messo l’Oil Red. Questo colorante va lasciato agire al buio per 15 minuti a RT. Seguono dei lavaggi in acqua e poi in PBS1X per eliminare i residui del colorante. Le piastre sono così pronte per essere osservate al microscopio e fotografate.
4.9. Raccolta delle cellule per l’estrazione dell’RNA
Le cellule possono essere conservate come pellet di cellule da cui estrarre DNA, RNA o proteine. Dopo la tripsinizzazione, le cellule vengono raccolte in falcon, centrifugate; il pellet viene sottoposto a tre successivi lavaggi in PBS 1X. I primi due vengono fatti con 5 ml di PBS 1X e la sospensione sottoposta a centrifughe di 7 minuti a 1000 RPM; l’ultimo viene fatto con 1 ml di PBS1X e la sospensione viene trasferita in eppendorf e centrifugata a 4°C per 10 minuti a 4500 RPM. Dopo l’ultima centrifuga si elimina il sovranatante e si conserva il pellet a -80°C. Nel corso dei nostri esperimenti abbiamo raccolto sia pellet di cellule allo stato indifferenziato a vari passaggi che a vari time points durante la differenziazione osteogenica e adipogenica.
4.10. Microscopia
I topi transgenici Kit/GFP, in cui il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) è posto sotto il controllo trascrizionale di regioni di regolazione di Kit permettono di monitorare l’attività del transgene attraverso l’analisi della fluorescenza. Ho monitorato la fluorescenza nelle CFU-F, in cellule mantenute in uno stato indifferenziato e indotte a differenziare in senso osteogenico o adipogenico. In particolare durante la differenziazione adipogenica ho monitorato le cellule al microscopio a fluorescenza (Zeiss OBSERVER.Z1, AxioCam MRc5) ogni due ore fino al terzo giorno del trattamento, a 7 giorni e 14 giorni di trattamento, a differenziazione ultimata.
5. BIOLOGIA MOLECOLARE
5.1 Estrazione dell’RNA totale dalle MSCs
L’estrazione dell’RNA totale dalle cellule è stata fatta utilizzando RNeasy® Plus Micro Kit (Qiagen). Questo kit permette di estrarre l’RNA totale da pellet con un numero di cellule minore di 5x105. Le cellule sono inizialmente lisate e omogeneizzate mediante incubazione con un buffer
contenente grandi quantità di ioni caotropici, la guanidina isotiocinato, che protegge l’RNA dalla degradazione creando le condizioni necessarie alla sua estrazione, e il β-mercaptoetanolo, un agente denaturante che facilita la rottura delle membrane e la denaturazione delle proteine. Nel complesso questo buffer di lisi ha la funzione di inattivare l’RNAsi e garantire l’isolamento di RNA intatto, non degradato. Il lisato è poi passato attraverso una gDNA Eliminator Spin Column, che in combinazione con un buffer ad alta concentrazione di sali, permette un’efficiente eliminazione del DNA genomico. La soluzione recuperata è poi aggiunta ad etanolo al 70% RNAsi-free (RF) che permette l’appropriata condizione di legame dell’RNA ad una membrana di silicio presente nell’RNeasy MinElute Spin Column. Segue il lavaggio della membrana con un buffer capace di rimuove metaboliti, sali e detriti cellulari mentre l’RNA permane associato alla membrana. Infine, l’RNA purificato è eluito con un piccolo volume di H20 RF. La concentrazione di RNA recuperata è
stata stimata mediante la lettura spettrofotometrica con il Nanodrop (ND-1000, Celbio) che oltre a fornirci informazioni sulla quantità dell’RNA ci fornisce informazioni anche sulla qualità (stimando i rapporti RNA/proteine e RNA/DNA). L’RNA può essere conservato a -80°C per diversi mesi. L’RNA così estratto è stato utilizzato per la retrotrasrizione del cDNA utilizzato poi per lo studio di espressione genica.
5.2 Eliminazione del DNA genomico
Prima di procedere con la retrotrascrizione la soluzione contenente l’RNA è stata trattata con DNAsi al fine di eliminare possibili residui di DNA genomico rimasti in soluzione. Questa reazione è stata realizzata utilizzando i reagenti contenuti nello stesso kit della Qiagen che abbiamo utilizzato per la retrotrascrizione: “QuantiTech® Reverse Transcription Kit”. Per ognuno degli stadi considerati sono stati digeriti 500 ng di RNA in una miscela di reazione contenente gDNA Wipeout Buffer 7X e H2O RF per portare ad un volume finale di 14μl. La miscela è stata incubata per 10
minuti a 42°C e subito dopo messa in ghiaccio. I campioni di RNA così trattati possono essere direttamente utilizzati per la reazione di retrotrascrizione.
5.3 Retrotrascrizione dell’RNA: sintesi del DNA complementare
(cDNA)
La retrotrascrizione dell’RNA a cDNA è stata effettuata con il kit della Qiagen “QuantiTech® Reverse Transcription Kit”. In ogni reazione sono stati retrotrascritti 500 ng di RNA. Dopo l’eliminazione del DNA genomico, i campioni di RNA sono pronti per la retrotrascrizione realizzata utilizzando una miscela di reazione costituita dalla Quantiscript Reverse Transcriptase, dal Quantiscript RT Buffer e dalla RT Primer Mix. La Quantiscript Reverse Transcriptase è data dall’insieme di due enzimi, la Retrotrasrittasi e un enzima inibitore dell’RNAsi. Si tratta di un enzima ricombinante eterodimerico espresso in E. coli costituito dall’Omniscript® e dalla Sensiscript® Reverese Transcriptase. Il Quantiscript RT Buffer è un buffer ottimizzato per le retrotrascrizione con la Quantiscript Reverse Transcriptase e contenente dNTP necessari per la sintesi del cDNA. L’RT Primer Mix è una miscela acquosa di primers oligo-dT, che specificatamente interagiscono con la coda poli-A al 3’ del messaggero, e primers random che garantiscono una corretta retrotrascrizione anche delle regioni al 5’. La miscela di retrotrascrizione
viene aggiunta alla soluzione contenente l’RNA ed incubata per 30 minuti a 42°C e poi a 95°C per 3 minuti per inattivare la reazione. Una parte del cDNA ottenuto viene conservato a -80°C, una parte viene diluito 1:10 e utilizzato per gli studi di espressione genica mediante Real-Time qPCR.
5.4 Real-Time qPCR
Il cDNA così sintetizzato è stato utilizzato per fare un’analisi quantitativa relativa dell’espressione dei geni d’interesse mediante esperimenti di Real-Time qPCR. Le reazioni sono state condotte sfruttando la chimica del SYBR Green, una molecola fluorescente non specifca che si intercala nella doppia elica del DNA legandosi al solco minore. La fluorescenza emessa è proporzionale alla quantità di molecole di DNA a doppia elica presenti e di conseguenza alle quantità iniziali di trascritto. E’ così possibile seguire in tempo reale l’amplificazione dei prodotti di PCR e quantificarli rispetto ad un gene housekeeping, nel nostro caso l’Hprt (Hypoxanthine guanine
phosphoribosyl transferase) utilizzato come controllo endogeno per la normalizzazione.
Per le reazione è stato utilizzato lo strumento Rotor Gene 3000 (Corbett) con il kit Quantitech SYBR Green PCR Master Mix della Qiagen. Il kit consiste in una Master Mix che contiene già tutti i reagenti necessari per l’amplificazione: HotStart Taq DNA Polymerase, SYBR Green PCR Buffer, SYBR Green I, dNTP. Le reazioni di Real-Time condotte ci hanno permesso di fare un’analisi di espressione mediante una quantificazione relativa rispetto al gene housekeeping.
Utilizzando diluizioni 1:10 dei nostri cDNA le reazioni sono state assemblate in un volume finale di 15 μl nel modo seguente:
2 μl cDNA
7,5 μl SYBR Green 2X (1X finale) 0,9 μl primer F 5 μM (0,3 μM finale) 0,9 μl primer R 5 μM (0,3 μM finale)
3,7 μl H2O mQ
I primers utilizzati sono stati scelti mediante Beacon Desiger 5.0 e controllati con il software Primer3. L’utilizzo di questi programmi ci ha permesso di selezionare primers che non formano dimeri che altrimenti potrebbero creare degli artefatti durante la reazione di amplificazione. Laddove è stato possibile, i primers sono stati scelti a cavallo tra un esone e un introne, in modo da amplificare selettivamente solo il cDNA.
La qualità dei prodotti di reazione è stata verificata grazie all’analisi delle curve di dissociazione (curve di melting) fornite dallo strumento e che permettono di discriminare l’amplificato d’interesse dalla presenza di eventuali prodotti aspecifici o dimeri di primers.
La normalizzazione del gene d’interesse viene effettuta paragonando il ciclo soglia (CT) di
questo con quello dell’Hprt. Il ciclo soglia è il ciclo di PCR in corrispondenza del quale la fluorescenza emessa dal campione supera quella considerata come valore soglia, oltre il quale lo strumento comincia a registrare l’emissione. Ho fatto le PCR in doppio e per questo ho utilizzato come CT il valore medio dei cicli soglia ai vari stadi considerati. Questi sono stati
utilizzati per il calcolo del ΔCT del gene d’interesse e di quello di riferimento. Il ΔCT del gene
d’interesse (ΔCTtarget) è inteso come la differenza tra il ciclo soglia medio del controllo e quello
del campione relativo al gene d’interesse; il ΔCT del gene di riferimento (ΔCT ref) come la
differenza tra il ciclo soglia medio del controllo e quello del campione considerato relativo al gene di riferimento. Nei nostri esperimenti il controllo è sempre stato lo stadio 0 (cellule proliferanti indifferenziate) mentre i campioni sono i vari stadi della differenziazione.
Inoltre, con lo strumento che abbiamo utilizzato è possibile calcolare il tasso di amplificazione di ogni singola reazione, rendendo molto più preciso il calcolo della concentrazione relativa dell’mRNA. Quindi, considerando l’efficienza di amplificazione (E) del gene d’interesse (Etarget) e quella del gene di riferimento (Eref), è stato possibile il calcolo della concentrazione
relativa dell’mRNA del gene d’interesse in rapporto a quella di un gene di riferimento mediante la formula (Pfaffl, 2001):
Ctcontol sample ref sample contol Ct et t E E Ratio argPer ogni punto è stato possibile calcolare la deviazione standard e di conseguenza l’errore standard che viene utilizzato per identificare l’intervallo di valori entro il quale ricade il reale livello di mRNA del gene considerato.
Per ogni gene che ho deciso di studiare ho costruito una tabella con tutti i dati necessari per effettuare il calcolo dei livelli di espressione relativi dell’mRNA e per definire l’attendibilità statistica dei risultati mediante il test t di Student a due code per dati non appaiati con intervallo di confidenza del 95%.
PRIMER FORWARD
PRIMER REVERSE
Hprt 5’ GGCCAGACTTTGTTGGATTTG 3’ 5’ GGCCACAGGACTAGAACACC 3’
Runx2 5’ TGGCAAAGTGGAGATTGTTGGC 3’ 5’ AAGATGGTGATGGGCTTCCCG 3’
Alp 5’ TGAGCGACACGGACAAGA 3’ 5’ GGCCTGGTAGTTGTTGTGAG 3’
Pparγ 5’ CACAATGCCATCAGGTTTGG 3’ 5’ GCTGGTCGATATCACTGGAGATC 3’
C/Ebpα 5’ TGTGGCAGCACGAGACGTC 3’ 5’ AACTCGTCGTTGAAGGCGG 3’
Kit 5’TGGGAGCTCTTCTCCTTAGGAA 3’ 5’ TGCTCCGGGCTGACCAT 3’
GFP 5’ACATGAAGCAGCACGACTTC 3’ 5’ TTGTGGCGGATCTTGAAGTT 3’
HPRT 5’ AGCCAGACTTTGTTGGATTTG 3’ 5’ TACTAACCAGATGGCCACAGA 3’
RUNX2 5’CCCAGGCAGTTCCCAAGCATTTC 3’ 5’ GGTGGCAGGTAGGTGTGGTAGTG 3’
PPARγ 5’ AGGGCGATCTTGACAGGAAA 3’ 5’ TCTCCCATCATTAAGGAATTCATG 3’
C/EBPα 5’ AAGAAGTCGGTGGAACAGAACAG 3’ 5’ GCAGGCGGTCATTGTCACT 3’
