4. Risultati e conclusioni

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4. Risultati e conclusioni

L’esposizione di cardiomioblasti della linea cellulare H9c2, a 16 ore

sotto flusso di diazocarb (miscela al 95% di N2 e 5% di O2) a 37°C, in

mezzo contenente basse concentrazioni di glucosio e deprivato del siero fetale bovino, seguita da 2 ore di riperfusione ottenuta ripristinando sia le condizioni normossiche che il mezzo di coltura, ha rappresentato il risultato di un lungo processo di ottimizzazione e sviluppo di un modello sperimentale affidabile e ripetibile di danno da ischemia-riperfusione su cellule.

In tutte le sperimentazioni effettuate è sempre stata osservata una significativa, ma comunque sempre relativamente contenuta, diminuzione della vitalità delle cellule sottoposte a procedura anossica. Infatti i livelli riscontrati di danno da ischemia-riperfusione si sono sempre aggirati intorno a valori compresi tra un 55-70% di vitalità cellulare residua, valori particolarmente vantaggiosi per le finalità dello studio.

Valutando in più set sperimentali diverse tipologie di farmaci anti-ischemici dovevamo contare su un livello affidabile e riproducibile di insulto. D’altra parte non potevamo consentire un livello di danno da ischemia-riperfusione eccessivamente elevato, perché in condizioni

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così drastiche di impatto dell’insulto anossico/ischemico sarebbe stato improbabile poter apprezzare e quantificare un effetto farmacologico anti-ischemico.

In particolare, per i set sperimentali eseguiti per la valutazione della nuova serie originale di benzopirani spirociclici, l’esposizione di cellule H9c2 a condizioni di anossia/riperfusione, ha causato una significativa riduzione della vitalità cellulare, che è stata attestata al 63±2% (vedi veicolo, Grafico 1).

Con troll o no n is che mic o Veico lo _M Diazossido 100 M  F 163 10 M  F 278 10 M  F 279 10 M  F 276 10 M  F 246 10 M  F 247 10 M  F 245 10 M  MM 107 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 632 1036 993 923

*

_*

*

*

*

*

*

*

* = significatività rispetto a Veicolo

V ita lit à ce llu la re %

Grafico.1 Effetti protettivi del diazossido e della nuova serie di benzopirani

spirociclici di natura morfolonica, morfolinica e ossazolidinica, su cellule H9c2 sottoposte ad insulto anossico.

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Il diazossido, è stato selezionato come attivatore di riferimento dei canali KATP, in particolare dei mito-KATP, con apprezzabile selettività

rispetto agli altri KATP attivatori disponibili quali: cromakalim,

pinacidil, nicorandil ecc.

Il pre-trattamento delle cellule H9c2 con diazossido alla concentrazione di 100µM, ha significativamente e vistosamente preservato le cellule stesse dal conseguente danno da anossia-riperfusione. Infatti la vitalità cellulare delle cellule H9c2 trattate con diazossido è risultata pari a 103±6% (vedi Grafico 1).

Il derivato spiromorfolonico F 163 somministrato ad una concentrazione di 10µM, cioè dieci volte inferiore rispetto al farmaco di riferimento, ha comunque prodotto effetti qualitativamente e quantitativamente equivalenti al diazossido stesso. Le cellule H9c2 trattate con lo spiromorfolone e conseguente insulto da ischemia-riperfusione, hanno mantenuto alti livelli di vitalità cellulare che si è attestata sul valore di 99±3% (vedi F 163, Grafico 1).

Date le interessanti proprietà anti-ischemiche mostrate da F 163, questo derivato è stato preso come modello per apportare variazioni strutturali finalizzate all’ulteriore incremento delle proprietà farmacodinamiche; in particolare, tra queste, una riguarda il restringimento dello spirociclo a 6 termini all’omologo inferiore

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(ossazolidinone) (vedi Figura 28), l’altra, invece, riguarda lo spostamento del carbonile ammidico in posizione extraciclica e rimozione del raggruppamento acetilico nel gruppo benzilico (composto MM 107).

Fig.28 Modificazioni strutturali apportate alla molecola F 163.

Il composto MM 107, rappresentativo del secondo approccio di modifica strutturale, si è rivelato completamente inefficace e ciò sembra indicare l’importanza di un ossigeno carbonilico su uno degli atomi di carbonio dello spirociclo (vedi MM 107, Grafico 1).

Nell’ambito della serie di composti spiro-ossazolidinonici, un solo derivato, F 278, si è rivelato efficace. Infatti, le cellule trattate con questo composto hanno mostrato, in seguito al danno da

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Interessante notare, che nell’ambito di questa serie il composto F 278 rappresenta il più stretto analogo strutturale di F 163.

Ai fini di svolgere un’indagine farmacodinamica più accurata e di individuare il meccanismo d’azione responsabile delle attività protettive di tali composti riscontrate nel modello sperimentale, è stato usato l’acido 5-idrossidecanoico (5-HD), bloccante selettivo dei

canali KATP, in particolare di quelli mitocondriali (vedi Grafico 2).

Con trol lo n on is chem ico Veic olo M Dia zoss ido 100 M  M+ Dia zoss ido 100  5HD 100 M  F 16 3 10 M  M+ F 1 63 1 0  5HD 100 M  F 27 8 10 M  M+ F 2 78 1 0  5HD 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 675 787 483 § § § § § § §§§=p<0,001 §§=p<0,01 § =p<0,05

§= significatività rispetto alla sostanza

senza bloccante Vi ta li tà c e ll u la re %

Grafico.2 Effetti del bloccante selettivo dei canali mito-KATP, 5-HD, su diazossido, F 163 ed F 278.

Gli effetti protettivi del diazossido, come atteso e riportato in letteratura (Calderone et al., 2010), sono stati completamente aboliti

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dal 5-HD (vitalità cellulare 67±5%) a conferma dell’implicazione dei

canali mito-KATP negli effetti del diazossido.

Analogamente il bloccante ha esercitato significative attività antagoniste nei confronti degli effetti anti-ischemici prodotti da F 163 e F 278 (vitalità cellulare 78±7% e 48±3%, rispettivamente) (vedi Grafico 2).

Tale evidenza sperimentale rappresenta dunque una chiara indicazione dell’implicazione dei canali mito-KATP degli effetti prodotti dai due derivati benzopiranici spirociclici e suggerisce inoltre, che tale chemotipo possa costituire un’interessante prototipo di una nuova classe di farmaci anti-ischemici.

Il metodo sperimentale sviluppato è stato quindi impiegato per la valutazione di altri composti anti-ischemici sintetici descritti in letteratura come agonisti selettivi del recettore β estrogenico (Minutolo et al., 2008; Minutolo et al., 2009).

In linea con i risultati di binding che indicavano questi composti come attivi a concentrazioni nanomolari, i derivati TM 33, TM 34, TM 18, TM 20, FS 95, sono stati inizialmente testati alla concentrazione di 10nM, in cellule H9c2 sottoposte ad insulto anossico. In queste condizioni sperimentali, solo il derivato TM 18 ha mostrato una modesta ma significativa attività protettiva ed in particolare tale

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derivato ha incrementato i livelli di vitalità cellulare dal valore di 70±3%, registrato in condizioni di controllo, al valore di 84±3% (TM 18) (vedi Grafico 3). Con trol lo n on is chemi co Vei colo TM -33 10 n M TM-3 4 10 nM TM -18 10 n M TM -20 10 n M FS-9 5 10 nM 0 20 40 60 80 100

_*

*= significatività rispetto a Veicolo

* = p<0,05 V it a li tà c e ll u la re %

Grafico.3 Effetti della serie di composti TM, alla concentrazione di 10nM, sulla

vitalità cellulare di cellule H9c2 sottoposte ad anossia-riperfusione.

Lo studio è proseguito incrementando le concentrazioni delle molecole esaminate a 1µM. A tali livelli di concentrazione, il composto TM 18 ha mostrato aumentati effetti protettivi; in particolare, la vitalità cellulare che in condizioni di controllo in questo

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set sperimentale si era testata al 57±3%, è stata considerevolmente incrementata dal TM 18 fino ad un valore di 90±4% (vedi Grafico 4).

Con trol lo n on is chemi co Vei colo M TM -33 1 M  TM -34 1 M  TM -18 1 M  TM -20 1 M  FS-9 5 1 0 20 40 60 80 100

*

*

*

*= significatività rispetto a Veicolo

V it a li ta c e ll u la re %

*

Grafico.4 Effetti della serie di composti TM, alla concentrazione di 1µM, sulla

vitalità cellulare di cellule sottoposte ad insulto anossico.

Inoltre alla concentrazione di 1µM, anche i derivati TM 33 e TM 34, hanno prodotto significativi effetti protettivi portando a livelli di vitalità cellulare conseguenti a danno da insulto anossico al 71±7% e 86±3%, rispettivamente (vedi Grafico 4).

L’efficacia a questo livello di concentrazione ha quindi indotto a incrementare ulteriormente questo parametro fino al valore di 100µM.

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A tali livelli di concentrazione solamente il composto TM 34 ha mantenuto un’attività protettiva (vitalità cellulare in condizioni di controllo = 68±5%, vitalità cellulare in presenza di TM 34=101±1%) (vedi Grafico 5). Con trol lo n on is chemi co Vei colo M TM -33 100 M  TM -34 100 M  TM -18 100 M  TM -20 100 M  FS-9 5 10 0 0 50 100 150

*

*

*

*

*

*

*= significatività rispetto a Veicolo

V it a li tà c e ll u la re %

Grafico.5Effetti della serie di composti TM, alla concentrazione di 100µM, sulla vitalità cellulare di cellule sottoposte ad anossia-riperfusione.

Il composto TM 20 già risultato inerte alle due concentrazioni precedenti, anche a queste condizioni di elevata concentrazione non ha prodotto nessun tipo di effetto.

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Significativa, invece, la riduzione della vitalità cellulare a livelli addirittura inferiori rispetto al controllo indotta da FS 95 (vitalità cellulare 26±2%), inefficace alle concentrazioni più basse, nonché da TM 33 e TM 18, (vitalità cellulare 19±4% e 50±8%, rispettivamente) composti che a più basse concentrazioni erano protettivi. E’ ragionevole ipotizzare che tale profilo farmacologico possa riflettere una possibile tossicità esplicata da elevate concentrazioni TM 33, TM 18, FS 95 a livello delle cellule H9c2. A supporto di tale ipotesi è interessante osservare che i tre derivati esibiscono una comune caratteristica strutturale, in particolare la presenza di un gruppo fenolico libero in posizione 4 del sostituente fenilico.

I risultati sperimentali ottenuti con questi derivati non consentono allo stato attuale di stabilire una possibile correlazione tra il profilo di attività selettiva reciprocamente riscontrabile su recettori estrogenici e gli effetti riscontrati in questo studio su cellule H9c2.

Infine, particolarmente interessante appare il dato che è emerso dalla valutazione delle potenziali attività protettive esercitate da NaHS

utilizzato come agente “mimetico” del composto endogeno H2S.

In particolare la somministrazione del sale alla concentrazione di 100µM, concentrazione in grado di liberare, in modo pressoché istantaneo, a condizioni di pH fisiologico e temperatura di 37°C,

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concentrazioni di H2S stimabili in circa 10-30µM, ha portato ad una pressoché totale protezione delle cellule H9c2 esposte ad anossia-riperfusione. In particolare il dato di vitalità cellulare che in condizioni di controllo è risultato pari a 67±4% è stato portato al valore di 101±1% dall’NaHS 100µM.

Concentrazioni inferiori di NaHS, in particolare 30µM e 10µM non hanno invece determinato effetti rilevanti (vitalità cellulare 62±2% e 55±2%, rispettivamente) (vedi Grafico 6).

Cont rollo n on is chemico Ve icolo M NaHS 100 M  NaHS 30 M  NaHS 10 0 50 100 150

*

*

*

* = significatività rispetto a Veicolo

*** =p<0,001 ** =p<0,01 * =p<0,05 V ita lit à ce llu la re %

Grafico.6 Effetti di NaHS alle concentrazioni di 100-30-10µM sulla vitalità

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Al fine di correlare gli effetti protettivi indotti da NaHS 100µM con la

possibile attivazione dei canali mito-KATP, anche in questo caso è stato

utilizzato il 5-HD. Con trol lo n on is chemi co Vei colo M NaH S 1 00 M  M+5 -HD 100  NaH S 1 00 0 50 100 150 § § § 802

§§§=p<0,001 §= significatività rispetto alla sostanza

senza bloccante V it a li tà c e ll u la re %

Grafico.7 Effetti antagonizzanti del bloccante 5-HD 100µM sull’azione protettiva

di NaHS 100µM.

Come evidente nel Grafico 7, il bloccante mito-KATP ha marcatamente

antagonizzato gli effetti protettivi del bisolfuro inorganico, vitalità

cellulare (80±2%), confermando che i canali mito-KATP giocano un