24
Capitolo 3
Materiali e Metodi
3.1 Materiali per gli studi funzionali
Linee cellulari
Nel modello sperimentale sono state utilizzate cellule di adenocarcinoma polmonare umano A549 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MA, USA), che crescono in adesione e possiedono morfologia epiteliale. Il tempo di duplicazione della linea cellulare è di circa 22 ore.
25
Per la valutazione della funzionalità del molecular beacon (MB) sono state utilizzate cellule di melanoma cutaneo umano A375 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MA, USA) che crescono adese alla superficie della fiasca, assumendo un aspetto allungato. La linea cellulare è caratterizzata da un tempo di duplicazione di circa 30 ore.
Figura 14 Morfologia delle cellule A375 a bassa (destra) e alta (sinistra) densità di crescita
Inoltre, per la valutazione del MB sono stati utilizzati, come controllo, monociti umani isolati da buffy coat, per centrifugazione in gradiente di densità di campioni di sangue.
RPMI 1640
Il Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640 Medium, Sigma Aldrich, Milano, Italy) è un terreno per il mantenimento in coltura di cellule in adesione, contenente sodio bicarbonato, proteine, L-glutamina, avente pH 7-7.6.
26 DMEM
Il Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è un terreno di coltura contenente glucosio, vitamine, aminoacidi e l’indicatore di pH rosso fenolo.
FBS
Il Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è il componente fondamentale per la crescita e la duplicazione in vitro delle cellule, in quanto ricco di nutrienti, fattori di crescita e di adesione, ormoni, proteine di trasporto (es. albumina).
PBS
Il Phosfate Saline Buffer (PBS, Lonza, Basilea, Switzerland) è una soluzione salina acquosa contenente cloruro di sodio, fosfato di sodio e cloruro di potassio. Il tampone serve a mantenere il pH costante, isotonico e non tossico per le cellule. E’ utilizzato per effettuare i lavaggi delle colture cellulari allo scopo di eliminare i detriti cellulari.
Tripsina/EDTA
La soluzione di Tripsina e EDTA (Try/EDTA, Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è utilizzata per staccare le cellule adese alla fiasca. L’EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) è un agente chelante che forma complessi stabili con il magnesio e il calcio indispensabili per l’adesione, mentre la tripsina è un enzima proteolitico in grado di degradare le proteine della matrice che mantengono le cellule in adesione.
27 Penicillina/Streptomicina
La Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è una miscela di due antibiotici che viene addizionata al mezzo di coltura per evitare contaminazioni.
WST-1
Il Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche, Mannheim, Germany) è un un sale di tetrazolio, di colore rosso pallido, che viene trasformato dagli enzimi mitocondriali di cellule vitali in sale di formazano, solubile e di colore rosso intenso. Si tratta di un saggio colorimetrico che, valutando l’attività enzimatica mitocondriale, fornisce un indice di vitalità cellulare.
Nanoparticelle di PMMA
Le nanoparticelle di PMMA utilizzate hanno dimensione di 57nm. Sono state sintetizzate dall’ Istituto per la sintesi organica e la fotoreattività del CNR di
Bologna, per polimerizzazione in emulsione. Sono costituite da un nucleo
polimerico di Polimetimetacrilato (PMMA) circondato da un “involucro” cationico portante gruppi amminici (-NH2) e ammonici quaternari (-NR4+). Le componenti cationiche presenti sulla superficie particellare hanno come controione, rispettivamente, il cloruro alla concentrazione di 208mol/g e il bromuro alla concentrazione di 498mol/g. Durante la sintesi i nanocostrutti, indicati con la sigla QTAM-02 e QTAM-03, sono stati funzionalizzati con fluoroforo Fluoresceina (FITC) in diverse quantità (le QTAM-03 hanno maggiore quantità di fluoroforo). La soluzione madre di NP-FITC utilizzata in tutte le valutazioni ha una concentrazione di 12.1mg/mL in acqua MilliQ.
28
Figura 15 Rappresentazione schematica di nanoparticelle QTAM-02 e QTAM-03
Molecular Beacon
Il molecular beacon (Twin Helix, Milano, Italy) specifico per l’mRNA della survivina utilizzato nello studio presenta la seguente sequenza:
5'-ATTO647N-CGACGGAGAAAGGGCTGCCACG/thiol-(C6)-dT/CG-BBQ-3'.
La coppia fluoroforo/quencher scelta è costituita dal fluoroforo Atto647N e dal quencher Blackberry650. Il fluoroforo Atto647N viene eccitato a 645 nm ed emette a 669 nm.
29 Figura 17 Range di quenching del Blackberry650
Come controllo è stata utilizzata una sequenza oligodeossinucleotidica inversa a quella del MB (reverse molecular beacon, revMB):
5'-ATTO647N-GC/thiol-(C6)-dT/GCACCGTCGGGAAAGAGGCAGC-BBQ-3' .
Per la valutazione dell’avvenuta trasfezione dei monociti, è stata inoltre utilizzata una sonda fluorescente (sondaMB) con la stessa sequenza del MB ma senza il
quencher, in grado, quindi, di emettere di per sé fluorescenza senza legarsi a nessun
target specifico. La sequenza della sondaMB è:
5'-ATTO647N-CGACGGAGAAAGGGCTGCCACG/thiol-(C6)-dT/CG
Il MB, il revMB e la sondaMB sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti alla concentrazione 100nM.
Lipofectamina
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Milano, Italy) è un agente trasfettante in grado di veicolare acidi nucleici all’interno delle cellule. E’ un liposoma cationico che complessa il DNA o l’RNA carichi negativamente e permette di superare le repulsioni elettrostatiche delle membrane cellulari, diffondendo in esse grazie alla porzione lipidica presente nella struttura.
30 OptiMEM
L’Opti-MEM (Invitrogen, Milano, Italy) è il mezzo ideale indicato per le tecniche di trasfezione. Contiene HEPES (acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico), bicarbonato di sodio, ipoxantina, timidina, piruvato di sodio, L-glutammina e fattori di crescita.
Cisplatino
Il Cisplatino (Cis-Pt, Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è un farmaco antineoplastico appartenente alla classe degli agenti metallanti. E’ in grado di interferire con tutte le fasi del ciclo cellulare legandosi a residui guaninici del DNA attraverso la formazione di legami crociati tra filamenti complementari.
31
3.2 Materiali per gli studi di microscopia
Vybrant® DiI Cell-Labeling Solution
Il colorante lipofilo utilizzato per marcare le membrane cellulari di cellule vitali è il
Vibrant DiI cell-labeling solution fornito da Life technologies (Carlsbad, California,
U.S.). Una volta incorporato nel doppio strato fosfolipidico di membrana e opportunamente eccitato, si osserva una fluorescenza rosso-arancio. Viene eccitato a 549 nm ed emette a 565 nm.
Figura 19 Spettro di eccitazione e di emissione del Vybrant DiI
Hoechst® 33342
L’Hoechst 33342 (Life technologies, Carlsbad, California, U.S.) è un colorante in grado di marcare i nuclei di cellule vitali in blu. Viene eccitato a 350nm ed emette a 461nm.
32
Figura 20 Spettro di eccitazione e di emissione dell’ Hoechst
3.3 Materiali per gli studi di biologia molecolare
Primer
I primer utilizzati per amplificare le sequenze dei geni per i target oggetto del nostro studio sono stati scelti facendo riferimento a sequenze presenti in letteratura e verificate su “Primer-Blast” (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), un programma disponibile sul sito http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, che permette di valutare se la coppia di primer è specifica solo per la sequenza di interesse o se amplifica prodotti genici indesiderati.
I primer sono stati forniti dalla Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) e le loro sequenze sono riportate nella tabella 3.
La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stata scelta come controllo positivo di espressione poiché, in qualità di proteina codificata da un gene housekeeping, è presenti in tutti i tessuti. La rilevazione dello specifico prodotto di PCR, attraverso l’osservazione della specifica banda elettroforetica su gel d’agarosio, è prova di una corretta esecuzione del protocollo di retrotrascrizione dell’RNA.
33 Tabella 3 Sequenze dei primer utilizzati
Kit e reagenti
Per l’estrazione dell’RNA totale dalle cellule è stato utilizzato RNeasy MiniKit (Qiagen, Milano, Italy). Il kit è costituito da: RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes da 1.5 e 2mL, reagenti RNase-Free (beta-mercaptoetanolo), acqua RNase-Free e buffer (buffer RLT, buffer RW1, buffer RPE). Durante l’estrazione per poter mantenere la vetreria e gli oggetti metallici utilizzati esenti da RNAsi è stata adoperata la soluzione decontaminante RNaseZAP fornita da Ambion (Austin, USA).
La digestione del DNA genomico è stata realizzata con RNase Free DNase Set (Qiagen, Milano, Italy) contenente buffer RDD e soluzione DNase I stock.
Per la retrotrascrizione il kit utilizzato è stato il QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Milano, Italy), composto da gDNA Wipeout Buffer 7x, Quantiscript® Reverse Transcriptase, Quantiscript RT Buffer 5x, RT Primer Mix, acqua RNase-Free.
Le reazioni di PCR sono state effettuate usando HotStarTaq® PCR (Qiagen, Milano, Italy). Il kit è composto da: PCR Buffer 10x, HotStarTaq Master Mix ed acqua RNase-Free.
Il gel per la corsa elettroforetica è stato ottenuto utilizzando agarosio all’1% e tampone TBE 0.5x contenente acido borico 0.9M, EDTA 0.01M, Tris 1M. Il bromuro di etidio è stato aggiunto alla soluzione. Il Ladder 100pb e blu di bromofenolo-xilene sono stati forniti da Bio-Rad (Hercules, USA)
34
3.4 Materiali per elettroforesi
Agarosio
L’agarosio (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una sostanza gelatinosa isolata dalle alghe. È un polimero lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici. L’agarosio è uno zucchero solubile in acqua alla temperatura di ebollizione, mentre diventa solido man mano che si raffredda, formando un gel grazie alla realizzazione di una matrice tridimensionale attraverso legami a idrogeno tra le catene lineari. Il gel di agarosio è largamente utilizzato per la separazione elettroforetica di frammenti di DNA.
TBE
Il TBE (Tris/Borate/EDTA, Sigma-Aldrich, Milano, Italy), è una soluzione tampone contenente Tris base, acido borico e EDTA. E’ utilizzato durante l’elettroforesi, poiché è un ottimo tampone per il mantenimento delle condizioni basiche che rendono il DNA deprotonato e solubile in acqua. L’EDTA è un chelante di cationi bivalenti, tra cui il magnesio, che è un co-fattore necessario per molti enzimi, come ad esempio le nucleasi. Il ruolo dell’EDTA è pertanto quello di proteggere gli acidi nucleici dalla degradazione enzimatica, ma, poiché il magnesio è anche un co-fattore per molti enzimi che modificano il DNA, come gli enzimi di restrizione e DNA polimerasi, la sua concentrazione nel TBE è generalmente bassa (tipicamente circa 1mM).
35 Bromuro di etidio
Il bromuro di etidio (Sigma-Aldrich, Milano, Italy) è una molecola intercalante di acidi nucleici (DNA e RNA) comunemente utilizzata in tecniche di biologia molecolare come l'elettroforesi in gel d’agarosio. Quando è esposto ai raggi ultravioletti è in grado di emettere fluorescenza che si intensifica di quasi 20 volte se intercalato nel DNA. Inserendo dunque nel gel il bromuro di etidio, è possibile evidenziare lo stato della migrazione del DNA all'interno del gel.
Blu di bromofenolo-xilene cianolo
Il blu di bromofenolo-xilene cianolo (BioRad, USA) è il tracciante colorato utilizzato per monitorare il processo di migrazione nell'ambito dell'elettroforesi su gel di agarosio.
3.5 Metodi utilizzati negli studi funzionali
3.5.1 Scongelamento della linea cellulare
Il criotubo contenente le cellule viene posto in bagnomaria a 37°C e agitato con movimenti rotatori continui. Una volta avvenuto lo scongelamento, si preleva tutto il contenuto del vial e lo si introduce in un falcon da 15mL sterile. Si aggiungono goccia a goccia 5-6mL di mezzo di coltura completo, precedentemente preriscaldato a 37°C, agitando continuamente la provetta. Si rende omogenea la soluzione e si centrifuga a 1100 rpm, per 5 minuti a temperatura ambiente. Una volta eliminato il sovranatante, si risospende il pellet in 4-5mL di mezzo completo e le cellule vengono seminate in una fiasca T75 (Starstedt, Verona, Italy) a cui sono stati precedentemente aggiunti 10-12mL di mezzo di coltura completo. Infine, la fiasca viene posta nell’incubatore a 37°C, in atmosfera controllata al 5% di CO2.
36
3.5.2 Mantenimento in coltura
Le fiasche T75 in cui sono seminate le cellule, vengono tenute all’interno dell’incubatore, in ambiente umidificato a 37°C di temperatura, 95% di O2 e 5% di CO2. Giornalmente le cellule sono state osservate al microscopio ottico per valutare la loro crescita e duplicazione. Il mezzo di coltura consumato è stato sostituito con mezzo fresco. Una volta raggiunto circa l’80% di confluenza, si può procedere con il loro distacco e la semina in una nuova fiasca per evitare la crescita in multistrato. Si aspira il mezzo e si procede con un lavaggio con 5-6mL di PBS per eliminare i detriti cellulari. Si rimuove il tampone e si aggiungono 1mL di PBS e 1mL di Try/EDTA (rapporto 1:1), si ripone la fiasca nell’incubatore per circa 30 secondi in modo da attivare la tripsina e favorire il distacco delle cellule dalla superficie della fiasca. Dopo aver verificato al microscopio il distacco delle cellule, si neutralizza la Try/EDTA aggiungendo 5mL di mezzo di coltura completo fresco. A questo punto si preleva il contenuto della fiasca, lo si pone in un falcon da 15mL e si procede con centrifugazione per 5 minuti a 1100 rpm, a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, si aspira il surnatante senza muovere il pellet cellulare che viene poi risospeso nell’opportuna quantità di mezzo di coltura completo. Le cellule possono essere riseminate in una nuova fiasca per il mantenimento in coltura, oppure possono essere congelate.
3.5.3 Congelamento cellulare
Per il congelamento è necessario preparare un mezzo opportuno per la linea cellulare di interesse, costituito da:
- RPMI 1640 o DMEM non ricostituito 60% - FBS 50%
- DMSO 10%
37
La procedura di congelamento prevede una prima fase di distacco delle cellule e centrifugazione come nel normale protocollo per il mantenimento in coltura. Dopo la centrifugazione, viene aspirato il surnatante e il pellet, indipendentemente dalle sue dimensioni, è stato risospeso in 1.8mL di mezzo di congelamento. Tutta la sospensione viene trasferita in un criovial, il quale viene inizialmente conservato nel congelatore a -80°C. Dopo 24 ore si procede con il trasferimento del criotubo nel dewar di azoto liquido, a -170°C. La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante perché congelamenti troppo rapidi portano alla formazione di cristalli di ghiaccio all’interno delle cellule che, al momento dello scongelamento, provocano lisi della membrana plasmatica.
3.5.4 Trasfezione con lipofectamina
Il giorno precedente alla trasfezione, le cellule sono state seminate in numero adeguato a seconda del supporto utilizzato in mezzo di coltura completo, come indicato nella tabella 4.
Tabella 4 Supporti e diluizioni per la trasfezione con lipofectamina
Trascorse 24 ore, tempo necessario per far aderire le cellule alla superficie del supporto, si è proceduto alla trasfezione del MB, del revMB o della sondaMB. In una eppendorf sono state diluite in mezzo Opti-MEM le sequenze oligodeossinucleotidiche, mentre in un’altra è stata diluita la lipofectamina in mezzo
38
Opti-MEM (Tab.4). Entrambe le soluzioni sono state mescolate delicatamente e lasciate incubare per 5 minuti. Trascorso tale tempo, le soluzioni sono state unite e lasciate incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Prima di procedere con l’aggiunta dei complessi di trasfezione, è stato aspirato il mezzo di coltura dalle cellule e aggiunto mezzo di coltura DMEM completo fresco, in volume appropriato, come riportato nella tabella.4. Infine, le cellule sono state trasfettate addizionando i complessi di trasfezione goccia a goccia. Per gli studi di vitalità, le cellule sono state incubate a 37°C per 6 ore, dopodiché il mezzo è stato sostituito con nuovo mezzo di coltura DMEM completo per 24 e 48 ore. Per gli studi di dinamica in vivo tramite microscopia confocale, i campioni sono stati incubati con i complessi di trasfezione per 6 ore a 37°C.
39
3.5.5 Saggi di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio colorimetrico WST-1 che valuta l’attività enzimatica mitocondriale, indice di vitalità cellulare.
La bioriduzione del sale di tetrazolio WST-1 in sale di formazano, necessita di NADH prodotto dalle cellule vitali, pertanto la quantità di formazano che si forma è proporzionale al numero di cellule metabolicamente attive.
Essendo una reazione colorimetrica, se le cellule sono vitali, si ha il viraggio di colore dal rosso pallido al rosso intenso, fig. 22.
Figura 22 Riduzione del reagente WST-1 a sale di formazano
La valutazione della vitalità cellulare è stata effettuata mediante lettura allo spettrofotometro Infinite M-200 (NanoQuant, Tecan, Männedorf, Switzerland) alla lunghezza d’onda di 450nm.
I valori di assorbanza, indici di vitalità cellulare, sono espressi come percentuale di vitalità delle cellule trattate vs i controlli non trattati, ovvero trattati con il solvente in cui è disciolto il composto da testare.
I dati ottenuti da tre esperimenti indipendenti, in cui ogni concentrazione è stata testata in triplicato, sono stati elaborati con il software GraphPad (San Diego, CA, USA).
40
- Saggio di vitalità cellulare su cellule A549 trattate con NP
Dopo aver staccato le cellule con Try/EDTA e aver effettuato la conta con la camera di Burker, in una piastra multiwell da 96 pozzetti sono state seminate 5000 cellule A549 per pozzetto in mezzo di coltura RPMI 1640 completo (10% FBS, 1% P/S). Dopo 24 ore dalla semina, il mezzo di coltura è stato rimosso e sostituito con mezzo RPMI 1640 non ricostituito, per evitare il sequestro delle NP da parte delle proteine sieriche. E’ stato quindi effettuato il trattamento con le soluzioni delle nanoparticelle QTAM-02 e QTAM-03, testate entrambe nel range di concentrazione 0.5-50µg/mL. Le concentrazioni delle soluzioni delle nanoparticelle da testare sono state ottenute diluendo 1:10 le rispettive soluzioni madre direttamente nei pozzetti della piastra, dopo sonicazione in bagno ad ultrasuoni per circa 3 minuti. Dopo 60’ e 180’ di esposizione alle NP, sono stati aggiunti, in ogni pozzetto, 10µL di reagente WST-1 per 100µL di soluzione e le cellule sono state incubate a 37°C per 1 ora. Infine, è stata effettuata la lettura allo spettrofotometro a 450nm e i dati ottenuti sono stati elaborati come sopra indicato.
- Saggio di vitalità cellulare su cellule A375 trattate con MB e revMB
In piastre multiwell da 96 pozzetti sono state seminate 5000 cellule A375 in mezzo di coltura DMEM completo (10% FBS, 1% P/S). Dopo 24 ore, le cellule sono state trasfettate con MB o revMB 100nM, come descritto nel paragrafo 3.5.4, e incubate a 37°C per 24 e 48 ore. Le cellule trasfettate con revMB rappresentano il campione controllo. Al termine dei tempi di trattamento, in ogni pozzetto sono stati aggiunti 10µL di reagente WST-1, le cellule sono state incubate per 1 ora a 37°C ed è stata effettuata la lettura allo spettrofotometro a 450nm.
41
- Saggio di vitalità cellulare su cellule A375 trattate con MB/Cis-Pt e revMB/Cis-Pt
Con il medesimo procedimento, descritto nel paragrafo precedente, è stata valutata la vitalità cellulare di cellule A375, trasfettate con MB o revMB 100nM e successivamente trattate per 48 ore con Cis-Pt 3µM, concentrazione tale da dare un’inibizione della vitalità cellulare di circa il 20% (dati non mostrati).
Dopo il trattamento, è stato aggiunto WST-1, le cellule sono state incubate per un’ora a 37°C ed effettuata la lettura allo spettrofotometro.
3.6 Metodi utilizzati negli studi di biologia molecolare
3.6.1 Estrazione dell’RNA totale
L’RNA totale è stato estratto in condizioni e con materiali RNase-Free (RF) per limitare la degradazione dell’RNA da parte dell’enzima RNase. Per questo motivo, l’etanolo utilizzato nella procedura viene addizionato di DEPC (dietilpirocarbonato) in rapporto 1: 1000 rispetto al volume totale. La soluzione è stata poi lasciata sotto cappa per una notte, quindi autoclavata per almeno 20 minuti. Le altre soluzioni necessarie all’estrazione sono state fornite direttamente RNase-Free.
Il protocollo di estrazione, per cellule in adesione, si articola nelle seguenti fasi : 1. Distacco delle cellule mediante tripsinizzazione e successiva centrifugazione per 5 minuti a 1100 rpm.
2. Eliminazione del sovranatante e risospensione del pellet in mezzo di coltura completo, in volume variabile a seconda delle dimensioni dello stesso.
3. Conta delle cellule e successiva centrifugazione a 1100 rpm per 5 minuti.
4. Eliminazione del sovranatante e aggiunta di 1mL di PBS e ulteriore centrifugazione (1100 rpm per 3 minuti).
42
5. Eliminazione del sovranatante e risospensione del pellet in 1ml di PBS, quindi centrifugazione (1100 rpm per 3 minuti).
6. Aspirazione del sovranatante e aggiunta di Buffer RLT ricostituito (10µl di beta-mercaptoetanolo per 1mL di Buffer RLT non ricostituito), per lisi delle cellule. Il volume di RLT da utilizzare per la lisi dipende dal numero di cellule del campione, secondo la proporzione fornita dal kit e riportata di seguito.
7. Agitazione della provetta con il buffer, in modo da lisare il pellet. Alla lisi cellulare corrisponde un aumento della viscosità della soluzione: per evitare la formazione di grumi e filamenti, si utilizza una bacchetta di vetro in modo da omogeneizzare quanto più possibile il contenuto del lisato.
8. Trasferimento del lisato in una eppendorf, aggiunta di un volume di etanolo RF 70%, pari a quello di Buffer RLT utilizzato, in agitazione continua per evitare la formazione di due fasi.
9. Caricamento di una quantità massima di 700µl del lisato cellulare per ogni spin column, quindi inserimento della colonna in un collection tube da 2mL e centrifugazione per 1 minuto a velocità maggiore di 10000 rpm.
10. Eliminazione dell’eluato.
11. Digestione del DNA genomico attraverso il kit RNase Free DNase Set:
- aggiunta di 350µl di Buffer RW1, centrifugazione per 15 secondi a velocità maggiore di 10000 rpm;
- aggiunta di 10µl di DNase ricostituita (550µl di acqua su DNase liofilizzata, da conservare poi a -20°C) a 70µl di Buffer RDD in una nuova eppendorf,
43
agitazione della soluzione, dopodiché prelievo degli 80µl e caricamento sulla spin column.
- lasciare agire per 15 minuti. Aggiunta di 350µl di Buffer RW1 e centrifugazione.
12. Eliminazione dell’eluato, aggiunta di 500µL di Buffer RPE e centrifugazione per 15 secondi a velocità maggiore di 10000 rpm.
13. Eliminazione dell’eluato, caricamento di altri 500µl di Buffer RPE e centrifugazione per 2 minuti a velocità maggiore di 10000 rpm.
14. Eliminazione del collection tube e ultima centrifugazione utilizzando un tubo nuovo da 2mL.
15. Senza aggiungere buffer, centrifugazione per 1 minuto a velocità maggiore di 10000 rpm.
16. Eliminazione del tubo collettore, utilizzo di un nuovo tubo da 1,5 ml ed aggiunta di 40µL di acqua RNase Free sulla membrana, lasciando idratare la membrana per qualche minuto.
17. Centrifugazione per 1 minuto a velocità maggiore di 10000 rpm.
18. L’eluato ottenuto contiene l’RNA, per cui eliminazione della colonna e alloggiamento del collection tube in ghiaccio.
Per determinare la concentrazione e la purezza dei campioni ottenuti sono state effettuate misurazioni spettrofotometriche nell’ultravioletto, a due lunghezze d’onda: 260 e 280nm. La stima della purezza del campione è data dal rapporto fra l’assorbanza a 260nm e quella a 280nm. Il valore ottenuto deve essere compreso tra 1.8 e 2: quanto più il valore si avvicina a 2, tanto maggiore è la purezza dell’RNA estratto. L’integrità dell’acido nucleico estratto è stata valutata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%, effettuata necessariamente con materiali RNase Free, 120V per 20 minuti.
44
3.6.2 Retrotrascrizione
La metodica consente di retrotrascrivere l’RNA in cDNA, utilizzato come stampo per la successiva reazione di amplificazione. La retrotrascrizione è stata effettuata seguendo la procedura descritta dal QuantiTect® Reverse Transcription Handbook, riportata di seguito:
1. Scongelamento dell’RNA e dei componenti del kit (gDNA Wipeout Buffer, QuantiScript Reverse Transcriptase, QuantiScript RT Buffer, RT Primer Mix, RNase Free Water) in ghiaccio. Centrifugazione breve e riposizionamento in ghiaccio.
2. Preparazione della reazione di eliminazione del DNA genomico: 2µL di gDNA Wipeout Buffer 7x, 1µg di RNA totale, RNase Free Water q.b. 14µL. Centrifugazione e posizionamento in ghiaccio.
3. Incubazione di 2 minuti a 42°C nel termociclizzatore e posizionamento immediato in ghiaccio.
4. Preparazione della Reverse Transcription Master Mix: 1µL di QuantiScript Reverse Transcriptase, 4µL di QuantiScript RT Buffer 5x, 1µL di RT Primer Mix. 5. Aggiunta dell’RNA totale privo di DNA genomico (14 µL), ottenuto al punto 3, alla Reverse Transcription Master Mix, per un volume totale di 20µL. Centrifugazione e posizionamento in ghiaccio.
6. Incubazione nel termociclizzatore con il protocollo specifico per la retrotrascrizione, che prevede: 30 minuti a 42°C, 3 minuti a 95°C per inattivare l’enzima QuantiScript Reverse Transcriptase.
Il cDNA ottenuto è stato poi utilizzato per le reazioni di PCR o conservato in congelatore a -20°C.
45
3.6.3 RT-PCR (Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction)
La procedura di PCR è stata eseguita utilizzando HotStarTaq Master Mix il cui protocollo di esecuzione è riportato di seguito:
1. Scongelamento delle soluzioni dei primer (25µM), quindi centrifugazione prima dell’uso.
2. Centrifugazione dell HotStarTaq Master Mix e prelevamento di 6.25µL da trasferire in una eppendorf da PCR.
3. Aggiunta di 0.2µL di primer Forward e di primer Reverse.
4. Alla mix ottenuta aggiunta di 3.85µL di acqua contenuta nel kit, quindi centrifugazione breve.
5. Aggiunta di 2µL di cDNA ottenuti tramite retrotrascrizione, quindi centrifugazione breve e trasferimento del campione nel termociclizzatore, impostando l’opportuno protocollo.
La mix di reazione misura un volume finale di 12.5µL per campione.
Il protocollo di PCR messo a punto con termociclizzatore a gradiente di temperatura è risultato il seguente:
- 95°C per 15 minuti: attivazione della HotStarTaq DNA Polymerase mediante calore;
- 3 step ripetuti per un numero di 36 cicli
⋅ 95°C per 1 minuto: fase di denaturazione;
⋅ 59°C (temperatura di annealing) per 1 minuto;
⋅ 72°C per 1 minuto: fase di estensione; - 72°C per 10 minuti: fase di estensione finale
46 Tabella 5 Protocolli di PCR utilizzati
I campioni ottenuti sono stati utilizzati immediatamente per la corsa elettroforetica o conservati a -20°C.
3.6.4 Elettroforesi su gel di agarosio
L’integrità dell’RNA totale estratto e il risultato delle amplificazioni sono stati valutati mediante corsa elettroforetica sottomarina su gel di agarosio all’1%. Il gel è stato preparato con tampone TBE 0.5x, ottenuto per diluizione della soluzione madre TBE 10x la quale contiene: acido borico 0.9M, EDTA 0.01M e Tris 1M, a pH 8.4. Gli esperimenti sono stati effettuati in apparati orizzontali, con voltaggio costante di 90- 100V, usando TBE 0.5x come tampone di corsa.
Nelle corse elettroforetiche per la valutazione dell’integrità dell’RNA totale sono stati caricati 6µL di soluzione contenente: campione, acqua RF, 1µL di blu di bromofenolo-xilene. Tutto il materiale utilizzato deve essere RF per evitare la degradazione dell’RNA: l’apparato per elettroforesi è stato perciò trattato con RNase Zap prima di effettuare la corsa, mentre il tampone TBE 0.5x è stato preparato (con la stessa procedura descritta per l’etanolo) RNase Free il giorno prima di effettuare la corsa.
Nelle corse dei prodotti di PCR sono stati caricati in un pozzetto 6µL di Ladder 100pb, standard di pesi molecolari che consente il confronto con i frammenti da identificare, per la visualizzazione della lunghezza dell’amplificato di PCR e negli
47
altri pozzetti 6µL di soluzione contenente 1µL di blu di bromofenolo-xilene e 5µL di campione.
La presenza dell’acido nucleico, in entrambi i casi, è stata messa in evidenza su gel di agarosio tramite colorazione con bromuro di etidio e visualizzazione con transilluminatore (Euroclone, Milano, Italy), poiché il bromuro di etidio assorbe raggi UV (200-300nm) ed emette nel campo del visibile (400-700nm).
3.7 Metodi utilizzati negli studi di microscopia
3.7.1 Semina e trattamento di cellule A549 con le soluzioni di nanoparticelle QTAM-02 e QTAM-03 per la valutazione morfologica al microscopio ottico
In piastre multiwell da 96 pozzetti sono state seminate 5000 cellule A549 per pozzetto in 100µL di mezzo di coltura RPMI 1640 completo e incubate a 37°C per 24 ore. Trascorse le 24 ore, il mezzo di coltura è stato eliminato e le cellule sono state trattate con le soluzioni di nanoparticelle QTAM-02 o QTAM-03, alle diverse concentrazioni ottenute per diluizione 1:10, in mezzo di coltura RPMI non ricostituito, dalle rispettive soluzioni madre di nanoparticelle, precedentemente sonicate in bagno ad ultrasuoni per circa 3 minuti. Dopo il trattamento, le cellule sono state osservate al microscopio ottico, per apprezzare eventuali cambiamenti morfologici tempo e concentrazione dipendenti. Le osservazioni al microscopio ottico sono state eseguite prima del trattamento con le NP (t=0) e dopo 5’,10’, 30’, 60’ e 180’ dal trattamento.
48
3.7.2 Semina e trattamento di cellule A549 con soluzioni di nanoparticelle QTAM-02 e QTAM-03 per l’analisi al microscopio a fluorescenza e confocale
Per le valutazioni al microscopio a fluorescenza e confocale, le cellule A549 sono state seminate ad una confluenza di circa 15-20% in dischi µ-dish 35 mm high (Ibidi, Martinsried, Germany), in un volume totale di 2mL di mezzo di coltura completo RPMI 1640 e incubate per 24 ore a 37°C, per permetterne l’adesione e il raggiungimento della confluenza adeguata (≈30-40%) per l’esperimento. Trascorso tale tempo, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state trattate con la soluzione di nanoparticelle QTAM-02 o QTAM-03, alla concentrazione finale di 10µg/mL, fig. 23. Dopo un’incubazione di 10’, 30’, 60’ e 180’ a 37°C , sono stati effettuati tre lavaggi ciascuno con 800µL di PBS per rimuovere l’eccesso di NP e favorire quindi una migliore visualizzazione della fluorescenza con basso segnale di
background. Infine, è stato aggiunto 1mL di mezzo di coltura RPMI 1640 non
ricostituito ad ogni disco e si è proceduto con l’osservazione al microscopio.
Figura 23 Schema di preparazione dei campioni di cellule A549 per l’acquisizione delle immagini al microscopio a fluorescenza e confocale
49
Il microscopio a fluorescenza Olympus IX81 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan), è stato utilizzato nelle fasi preliminari dello studio, per la valutazione dell’intensità del segnale fluorescente emesso dai due tipi di nanoparticelle.
Per valutare la localizzazione delle NP nelle cellule A549, è stato utilizzato il microscopio confocale Radiance Plus (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, U.S.). Le relative immagini sono state acquisite utilizzando i seguenti parametri:
OBIETTIVO: 40X OLIO POTENZA LASER: 100% GUADAGNO FOTOMOLTIPLICATORE: 100% FILTRO DI EMISSIONE: 500 LP ZOOM: 3 IRIDE: 7
3.7.3 Marcatura della membrana plasmatica di cellule A549 con colorante Vybrant DiI
Dopo aver effettuato la semina delle cellule A549 in dischi µ-dish 35 mm high (Ibidi, Martinsried, Germany) e il successivo trattamento con la soluzione di nanoparticelle QTAM-03, alla concentrazione di 10µg/mL, come descritto nel paragrafo 3.7.2, si è proceduto alla marcatura della membrana plasmatica con colorante specifico Vybrant DiI.
Per ogni disco contenente le cellule è stato preparato 1mL di mezzo di coltura RPMI 1640 non ricostituito, in cui sono stati disciolti 5µL di soluzione madre di colorante. In seguito, i dischi sono stati incubati per 45 minuti a 37°C. Successivamente, dopo tre lavaggi con 800µL ciascuno di mezzo di coltura RPMI 1640 non ricostituito, è stato aggiunto ad ogni campione 1mL di mezzo non ricostituito e le cellule sono state osservate al microscopio confocale.
50
3.7.4 Marcatura dei nuclei di cellule A549 con colorante Hoechst
Per poter comprendere al meglio la localizzazione delle NP nelle cellule A549, è stato utilizzato il colorante dei nuclei Hoechst. La soluzione del colorante fornita ad una concentrazione di 10mg/mL, è stata utilizzata ad una concentrazione di 4µg/mL. Una volta preparato il colorante, si è proceduto aggiungendo 1mL di soluzione dello stesso ad ogni disco µ-dish 35 mm high (Ibidi, Martinsried, Germany) contenente le cellule precedentemente seminate, come descritto nel paragrafo 3.7.2. Le cellule sono state incubate per 20 minuti a 37°C e, al termine, dopo due lavaggi, ciascuno con 800µL di PBS, sono state trattate con la soluzione di nanoparticelle QTAM-03, alla concentrazione 10µg/mL. Dopo 1 ora di incubazione a 37°C, per ogni campione sono stati effettuati 3 lavaggi in PBS (800µL/each) , aggiunto 1mL di mezzo di coltura RPMI 1640 non ricostituito e si è proceduto con la visualizzazione al microscopio confocale.
3.7.5. Trattamento di cellule A375 con MB 100nM per la valutazione dell’internalizzazione e della specificità
In dischi µ-dish 35 mm high (Ibidi, Martinsried, Germany) sono state seminate 200000 cellule A375 in mezzo di coltura DMEM completo, trasfettate con MB 100nM, come descritto nel paragrafo 3.5.4, e visualizzate a 1, 3 e 6 ore di trasfezione al microscopio confocale. La stessa procedura è stata eseguita su monociti umani che, non esprimendo mRNA per survivina, rappresentano un campione di controllo negativo. I monociti sono stati trasfettati con MB o sonda MB 100nM.
Le immagini sono state acquisite al microscopio confocale Radiance Plus in DIC (Differential Interference Contrast) e in fluorescenza mediante l’utilizzo del laser 638 red diode e del fotomoltiplicatore Det 32 Ha660LP, obiettivo 60X olio e zoom 2.5.
51
Figura 24 Schema di preparazione dei campioni di cellule A375 e monociti per l’acquisizione delle immagini al microscopio confocale
