INDICE
1. Introduzione
2. Linfomi Cutanei: aspetti clinici e istologici •Definizione
•Classificazione
•Linfomi cutanei a cellule B •Linfomi cutanei a Cellule T
•Micosi fungoide
•Il CTCL non MF a cellule CD30+
•Il CTCL non MF a cellule CD30-
3. Tecnica della citometria a flusso nella diagnosi delle lesioni cutanee linfoproliferative
•Cenni storici
•Principi CFM
4. Materiali e metodi • Casistica
• Raccolta dei campioni cutanei
• Biopsie cutanee tipo punch(<0,6 cm) • Biopsie cutanee incisionali (>0,6 cm)
• Processazione dei campioni cutanei
• Marcatura con gli anticorpi monoclonali
5.Risultati citofluorimetrici
• Analisi dei casi clinici: istologia e pannelli immunofenotipici • Statistica
6.Discussione
• Osservazione Casistica
TESI
1.
Introduzione
I linfomi cutanei (LC) sono malattie linfoproliferative che insorgono
primitivamente sulla cute. Pur essendo tumori a bassa incidenza, inferiore
1/100.000 Ab/anno, tra i linfomi extranodali sono al secondo posto dopo i
linfomi gastrici (1). I LC costituiscono ancora oggi un problema
diagnostico difficile. Fino a 10 anni fa venivano classificati come malattie
linfonodali con immancabili riflessi prognostico-terapeutici. Solo con le
prime classificazioni come la EORT (1) nel 1997 seguita poi dalla
WHO-EORT (2-5) si sono chiariti alcuni aspetti classificativi e terminologici.
Le nuove classificazioni tengono conto delle variabilità delle lesioni
cutanee, fornendo per ciascuna patologia pannelli immunologici e
caratteristiche biomolecolari. L’inquadramento clinico di queste lesioni si
basa su una diagnosi di tipo integrato, avvalendosi oltre l’esame
morfologico, di varie tecniche ancillari tra cui l’immunoistochimica, la
citometria a flusso, la citogenetica e la biologia molecolare. Lo scopo di
questa tesi è valutare l’utilità dell’analisi citofluorimetrica nella diagnosi
2.
Linfomi Cutanei: aspetti clinici e istologici
•
Definizione
I LC sono neoplasie caratterizzate dallo sviluppo clonale di una
popolazione di linfociti primitivamente nella cute (1). Il concetto di linfoma
organo-specifico, accettato per altri organi ed apparati va quindi esteso
anche alla cute. I linfociti B si trovano raramente in una cute normale,
mentre i linfociti T si trovano anche in condizioni fisiologiche (6).
Ritroviamo una proliferazione linfocitaria anche in numerosi processi
infiammatori, di solito polimorfa con aspetti clinici diversi. Tale
polimorfismo si riscontra anche in lesioni neoplastiche che mostrano di
solito una quota di elementi reattivi con una morfologia molto varia.
Quindi la definizione di linfoma primitivo della cute si basa pertanto sulla
correlazione tra caratteri clinico-evolutivi, istologici, immunologici e
molecolari. I LC sono caratterizzati da una proliferazione monoclonale di
cellule linfoidi a primitiva insorgenza cutanea che deve essere distinta sia
dalle lesioni secondarie a partenza extracutanea che dai cosiddetti
pseudolinfomi che sono disordini linfoproliferativi di natura
iperplastico-reattiva. La diagnosi differenziale tra queste lesioni può essere molto
difficile per la grande varietà di aspetti clinici e di quadri istologici a volte
•
Classificazione
Secondo la classificazione WHO/EORT (5) si distinguono innanzitutto due
grandi famiglie di LC: quelle a cellule con fenotipo B e quelle con elementi
a fenotipo T.
•
Linfomi cutanei a cellule B
La clinica tipica dei CBCL è costituita da placche, papule o noduli con
alone eritematoso e/o cianotico, spesso a superficie mammellonata,
raramente ulcerate. Fin dalle fasi iniziali le lesioni sono rappresentate da
noduli o placche modestamente infiltrate spesso accompagnate da lesioni
più piccole che possono evolvere fino a raggiungere tumefazioni di grandi
dimensioni, fino oltre 15 cm di diametro. La distribuzione è tronco,
testa/collo ed in misura minore gli arti (7). L’incidenza nei due sessi non
mostra differenze sostanziali, con età media intorno ai 60 anni. Le lesioni
benigne spesso presentano caratteri clinici completamente sovrapponibili.
Istologicamente i CBCL sono caratterizzati da un ampio spettro di aspetti
istologici legati al tempo di insorgenza, alle dimensioni, e alla velocità di
crescita delle lesioni. In molti casi accanto alla componente neoplastica la
lesione presenta ampia commistione di cellule linfoidi reattive. Il
comportamento biologico spesso non aggressivo e la risposta alla terapia
frustrante. La classificazione ora accettata (2) distingue 3 grandi gruppi di
CBCL:
Linfomi della zona marginale caratterizzati da cellule di
dimensioni medie e piccole con piccolo nucleolo e citoplasma
relativamente ampio;
Linfomi centro follicolari caratterizzati dalla presenza di
centrociti e centroblasti, con modelli di crescita di tipo
follicolare e/o diffuso:
Linfomi B diffusi a grandi cellule con la variante “leg type”,
caratterizzati dalla presenza di cellule grandi tipo centroblasti
o immunoblasti.
Sono presenti inoltre varianti rare come una forma cutanea di
T-Cell B cell rich una forma intravascolare e una forma
blastica a cellule NK.
I linfomi B a grandi cellule si distinguono perché colpiscono di solito
soggetti più anziani e si presentano spesso come noduli rossastri o bluastri,
in rapida crescita, multipli, frequentemente ulcerati, che pongono una
diagnosi differenziale con una malattia metastatica. Le altre varianti
presentano sovente aspetto sovrapponibile fra loro (8) e con le lesioni
•
Linfomi cutanei a Cellule T
Il termine Linfoma Cutaneo a cellule T (CTCL) è stato introdotto da
Edelson nel 1974 (9) per indicare un gruppo di malattie linfoproliferative
caratterizzate da interessamento cutaneo costituito da cellule a morfologia
cerebriforme, a fenotipo CD4+, con un grado di epidermotropismo delle
cellule neoplastiche correlato al loro livello di maturità. Queste lesioni , in
fase iniziale, sono localizzate mentre in una fase finale mostrano un
aspetto disseminato, con sviluppo di cloni cellulari a rapida crescita e
comportamento aggressivo, correlata ad una prognosi infausta. La storia
naturale e la prognosi dei CTCL risultano considerevolmente variabili in
relazione alle caratteristiche clinico-patologiche, immunofenotipiche e
genotipiche che caratterizzano la malattia all’esordio. Su questa base è stata
proposta la classificazione (2) dei CTCL in 3 principali sottogruppi:
la Micosi Fungoide
CTCL non Micosi Fungoide a cellule CD30+
CTCL non Micosi Fungoide a cellule CD30-
•
Micosi Fungoide
La Micosi Fungoide (MF) è un linfoma primitivo della cute, caratterizzato
dalla proliferazione di T linfociti di piccola e media taglia con nucleo
cerebri forme (10-14). L’indagine genetica mostra nella maggior parte dei
malattia è caratterizzata da un decorso prolungato nel tempo, anche
decenni, con lenta progressione dalla fase di chiazza -placca a quella di
tumore. Lo stadio di chiazza è caratterizzato dalla comparsa di macchie
eritematose, finemente desquamate, a margini netti, di dimensioni variabili,
talora atrofiche o pecilodermiche (rilievi papulosi nel contesto di una
chiazza atrofica), localizzate al tronco, alla regione glutea, alla radice degli
arti, alla faccia volare degli avambracci. Le chiazze, a volte, assumono una
colorazione giallastra di aspetto xanthomatoso. Nelle fasi iniziali possono
mostrare pattern digitato. In questa fase, che può durare molti anni o
decenni, l’aspetto istologico può risultare scarsamente specifico tanto da
affermare che la diagnosi di MF in fase iniziale è virtualmente impossibile
sulla base del solo dato istologico. La diagnosi istologica si basa sulla
presenza di linfociti con nucleo irregolare, talora circondato da alone
chiaro, isolati o in piccoli aggregati, disposti nel derma superficiale che
presenta variabile edema e fibrosi e con degenerazione vacuolare alla
giunzione dermo-epidermica. Lo stadio in placca è caratterizzato dalla
presenza di placche infiltrate, desquamate, di colore rossastro, localizzate al
tronco, natiche e cosce. E’ possibile assistere ad una evoluzione
eritrodermica della malattia con formazione di eritema e desquamazione
che coinvolge quasi totalmente alla superficie cutanea. Spesso si ha
interessamento del volto, ipercheratosi palmo-plantare e frequente
osserva un tipico infiltrato a banda di cellule cerebriformi (CD3+, CD4+,
CD8-) nel derma superficiale, con spiccato epidermotropismo e
formazione, seppur raramente, dei tipici microascessi di Pautrier. Lo stadio
nodulo-tumorale rappresenta la fase finale della storia naturale della MF ed
è caratterizzato dalla comparsa, di noduli, spesso multipli e frequentemente
ulcerati; istologicamente sono costituiti da un denso infiltrato dermico, a
tutto spessore, di grandi cellule cerebriformi o blastiche, senza evidenza di
epidermotropismo. In questa fase possono essere interessate aree inusuali
quali le mucose orali e genitali (15-20). Questo stadio è sempre associato
ad una prognosi infausta. La MF si presenta anche in diverse varianti con
un incidenza più o meno variegata da rara a rarissima come:
MF pediatrica
MF follicolare
MF associata a mucinosi follicolare
MF granulomatosa
Reticulosi pagetoide localizzata,
Sindrome di Sézary
Classicamente considerata la variante leucemica della MF, la Sindrome di
Sézary (SS) è contraddistinta clinicamente dalla triade eritrodermia,
linfoadenopatia generalizzata e presenza di caratteristici linfociti T atipici
circolante e nei linfonodi, con prognosi complessivamente sfavorevole
(20-23).
•
CTCL non Micosi Fungoide a cellule CD30+
Il CTCL non MF a cellule CD30+ costituisce un ampio spettro di malattie
linfoproliferative cutanee caratterizzate dal reperto nella biopsia di grandi
cellule atipiche CD30+ in numero e distribuzione variabile e clinicamente
da possibile e frequente regressione spontanea delle lesioni e decorso
cronico.
Caratteristiche cliniche sono:
esordio clinico con placche e/o noduli, con distribuzione
loco-regionale;
possibile storia clinica di regressione spontanea delle lesioni;
ottima e rapida risposta alla radioterapia;
prognosi favorevole (90% di sopravvivenza ai 5 anni)
nonostante le recidive frequenti;
istologia con infiltrato dermico o dermo-ipodermico diffuso
composto in prevalenza di grandi
cellule anaplastiche o pleomorfe, immunoblastiche esprimenti
l’antigene CD30+.
L’estremo dello spettro è rappresentato dalla papulosi linfomatoide (PL),
eziologia rimane sconosciuta. Nel 10-20% dei casi la PL precede, è
concomitante o segue altri tipi di linfoma, il che raccomanda il follow-up di
questi pazienti (5). Sono usualmente colpiti giovani adulti anche se sono
stati riportati casi in età pediatrica o nell’anziano. Clinicamente è
caratterizzata dall’eruzione cronico-subentrante di lesioni papulo-nodulari,
di colore bruno-rossastro, ad evoluzione ulcero-necrotica e regressione
spontanea senza esiti in qualche settimana, con localizzazione al tronco e
alle estremità prossimali. Il quadro istologico è caratterizzato più spesso da
un infiltrato dermico superficiale e medio con tipica disposizione a V, con
grandi cellule atipiche CD30+ sparse nel contesto di un abbondante
infiltrato infiammatorio linfo-istiocitario e granulocitario. La prognosi è
ottima con sopravvivenza a 5 anni del 100%. Il linfoma anaplastico a
grandi cellule è un linfoma cutaneo a cellule T CD30+, caratterizzato da
una buona prognosi e risposta alla terapia. Sono colpiti adulti di entrambi i
sessi anche se sono stati osservati casi in età pediatrica. Clinicamente si
presenta come lesioni, spesso ulcerate, bruno-rossastre localizzate al tronco
ed arti, singole o multiple. La completa regressione è stata osservata in
qualche caso anche se è più frequente una risoluzione parziale. E’ possibile
la presenza di noduli satelliti attorno al tumore primitivo, quadro che
simula la papulosi linfomatoide. Raramente sono state trovate cellule
•
CTCL non Micosi Fungoide a cellule CD30-
Il CTCL non MF a cellule CD30- è caratterizzato (24) da presentazione
clinica con noduli e/o placche più spesso multipli e da un quadro istologico
con infiltrato dermico diffuso a grandi cellule pleomorfe, con prognosi
infausta. E’ stato recentemente descritto un gruppo di CTCL non MF
CD30- caratterizzato da decorso meno aggressivo e caratterizzato
istologicamente da cellule pleomorfe di piccola-media taglia. E’
attualmente oggetto di valutazione la possibile importanza biologica e
clinico-prognostica di altri markers, come l’espressione dell’antigene CD8
3.
Tecnica della citometria a flusso nella diagnosi delle
lesioni cutanee linfoproliferative
La diagnosi dei disordini linfoproliferativi cutanei rappresenta una delle
aree della dermatopatologia più complessa e soggetta a cambiamenti.
L’introduzione di tecniche di immunoistochimica e di biologia molecolare
ha reso più agevole la distinzione tra un processo linfoide reattivo e
neoplastico, nonostante in alcuni casi sia difficile formulare una diagnosi di
certezza. In particolare, vedremo l’applicazione della citometria a flusso
(CFM) nella diagnosi dei disordini linfoproliferativi. La CFM, una tecnica
di analisi cellulare in uso nei laboratori di onco-ematologia e patologia
clinica, rappresenta un’applicazione relativamente recente nella diagnosi
dei linfomi cutanei (28-31). Essa costituisce uno strumento indispensabile
nel definire con estrema accuratezza l’immunofenotipo delle lesioni
linfoproliferative (32-38). La tecnica ha potuto contribuire al
raggiungimento di una diagnosi corretta, indispensabile per l’impostazione
di una terapia adeguata.
•
Cenni storici
La CFM permette di ottenere informazioni quantitative riguardo a
composizione, struttura e funzione delle cellule. Introdotta nel 1970 la
CFM ha ricevuto ampi consensi in campo onco-ematologico dove la sua
applicazione è considerata necessaria e irrinunciabile nella formulazione di
offre il vantaggio dell’efficienza coniugato ad un alto grado di sensibilità
(39-42). La metodica è rapida, misura alcune decine di migliaia di cellule
in pochi secondi. Inoltre, l’approccio statistico delle misure risulta
estremamente affidabile per la ricostruzione dell’intera popolazione
cellulare. Ulteriore peculiarità della CFM è quella di fornire una misura
simultanea di più parametri che possono, anche a posteriori, essere
elaborate in mutua relazione. In definitiva la CFM facilita:
la distinzione tra condizione benigna e neoplastica;
la diagnosi e la caratterizzazione di linfomi e leucemie;
la determinazione della malattia minima residua nei pazienti con
leucemie acute o disordini linfoproliferativi cronici. In alcuni casi
fornisce anche informazioni prognostiche.
•
Principi della CFM
La CFM include alcuni principi di base riassunti nel seguente schema
(Fig.1). La parte centrale del CFM è rappresentata dalla “ cella di flusso” o
flow chamber , uno speciale capillare realizzato solitamente con quarzo
sintetico dove un apparato idropneumatico dedicato consente di ottenere un
effetto caratteristico conosciuto come “focalizzazione idrodinamica”. Le
cellule in sospensione vengono forzate a fluire al centro del capillare
stesso, idealmente contenute in una “cella di flusso ” in moto laminare di
flusso esse intersecano uno o più fasci di luce a laser generando una serie di
segnali di luce diffusa e/o di fluorescenza che vengono raccolti da una serie
di sensori (fotomoltiplicatori) dislocati lungo il percorso ottico del laser. La
sorgente di luce consiste in un fascio laser in grado di fornire un’adeguata
eccitazione delle molecole di fluorocromo legate alle cellule da analizzare.
Le sorgenti di luce universalmente impiegate sono il laser con emissione a
488 nm. La colorazione delle cellule rappresenta un passaggio importante
nell’analisi citofluorimetrica. Va comunque sottolineato che lo strumento è
in grado di ottenere misure anche su particelle o cellule non colorate. Infatti
in tutti i citometri sono presenti due sensori che misurano la luce diffusa
dalla particella a diversi angoli rispetto alla luce laser incidente: il sensore
per il forward scatter (FSC) e il sensore per il side scatter (SSC). (Il FSC è
un fotodiodo posto lungo il percorso del raggio laser che raccoglie
principalmente l’intensità dei raggi difratti, che sono stati deflessi dai bordi
dell’oggetto senza attraversarlo. Questo sensore quindi misura la
dimensione della cellula (Fig.3). Un fotomoltiplicatore posto
ortogonalmente rispetto al precedente raccoglie principalmente l’intensità
dei raggi difratti (e riflessi) che hanno attraversato l’interno dell’oggetto ed
quindi proporzionale alla complessità interna della cellula ovvero alla sua
granulosità (SSC) (Fig. 4) La luce che incide su una cellula oltre che ad
essere diffusa può anche essere assorbita; in questo caso l’energia assorbita
nuova emissione luminosa (fluorescenza). Le cellule vengono rese
“fluorescenti” attraverso la marcatura con anticorpi monoclonali legati a
fluorocromi. Al momento dell’interazione tra cellule e luce di eccitazione si
producono i diversi segnali che devono essere rilevati e fornire così le
misure di interesse. In un citometro tipo con sorgente di eccitazione laser si
possono ottenere simultaneamente quattro o cinque segnali, due di luce
diffusa (FSC e SSC) e due o più fluorescenze. I rilevatori di fluorescenza
sono quasi universalmente ottenuti con l’impiego di fotomoltiplicatori che
hanno la funzione di registrazione dei segnali (Fig.5). I segnali passano
successivamente ad un dispositivo di conversione analogico-digitale e i
risultati delle misure vengono presentati come istogrammi di distribuzione
bidimensionali (citogrammi) in cui la densità dei punti è proporzionale al
numero degli eventi che hanno per coordinate i valori delle grandezze
misurate. Analisi successiva con la realizzazione del gating consente di
definire, in un citogramma, una regione di interesse (gate) per selezionare
popolazioni di cellule biologicamente rilevanti senza ricorrere ai metodi di
separazione fisica. La regione viene tracciata utilizzando i parametri di FSC
e SSC che consentono una buona discriminazione tra linfociti, monociti,
Figura 1: Diagramma di flusso
Figura 2-3-4-5: Illustrazioni delle fasi della camera di
fotomoltiplicatori per determinare dimensioni e caratteristiche delle cellule. Diagramma di flusso delle funzioni di base della citofluorimetr
Illustrazioni delle fasi della camera di rilevamento e disposizione dei fotomoltiplicatori per determinare dimensioni e caratteristiche delle cellule.
PMT
Dichroic Filters
Bandpass Filters Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry
1 Flow cell
funzioni di base della citofluorimetria.
rilevamento e disposizione dei fotomoltiplicatori per determinare dimensioni e caratteristiche delle cellule.
PMT PMT PMT
Bandpass Filters Example Channel Layout for
based Flow Cytometry
Laser
2 3 4
4.
Materiali e Metodi
•
Casistica
La nostra casistica consta di 53 biopsie cutanee con sospetta diagnosi di
linfoma cutaneo pervenuti al laboratorio di Citometria a Flusso
dell’Anatomia Patologica del S.Chiara di Trento nel periodo compreso tra
il giugno 2015 e il luglio 2016. Ogni paziente è stato sottoposto a due
prelievi bioptici. Il primo prelievo pervenuto a fresco dalla Dermatologia
del S. Chiara, è stato utilizzato per eseguire l’esame citofluorimetrico. Il
secondo campione pervenuto in formalina, è stato processato con le
metodiche di routine.
•
Raccolta dei campioni cutanei
I campioni sottoposti ad analisi citofluorimetrica per la tipizzazione
linfocitaria, sono biopsie cutanee tipo punch o incisionali. Il campione
pervenuto in soluzione fisiologica o in tampone salino (PBS pH 7.2 – 7.4),
deve essere rapidamente lavorato cercando di evitare sbalzi termici; inoltre
il tempo massimo di conservazione a temperatura ambiente non deve
superare le 4 ore. Le modalità di trattamento del campione sono distinte in
•
Biopsie cutanee tipo punch
Le biopsie inferiori ai 0.6 cm vengono
piccoli (Fig. 6), poi poste in una soluzione composta da collagenasi IV
all’1% in RPMI + CaCl
protocolli riportati in letteratura (
disaggregazione meccanica.
passaggi tecnici effettuati sui campioni di linfonodo.
•
Biopsie cutanee incisionali
Le biopsie superiori ai 0.6 cm
meccanica mediante una procedura manuale.
capsula Petri e bagnato con pochi mL di PBS viene disaggregato
manualmente e avvalendosi di un bisturi monouso, viene effett
procedura di scraping cellulare del tessuto. Successivament
cellulare (Fig.7) vien
µm.
Figura 6 e 7: Disgregazione dei diversi Punch cutanei con tecnica di sminuzzamento e di
iopsie cutanee tipo punch(<0,6 cm)
inferiori ai 0.6 cm vengono prima sminuzzate in
poi poste in una soluzione composta da collagenasi IV
all’1% in RPMI + CaCl2 0,1% per 2-4 ore a 37 °C (Fig.34) seguendo
protocolli riportati in letteratura (44). Successivamente viene effettuata una
disaggregazione meccanica. Le procedure successive riproducono i
passaggi tecnici effettuati sui campioni di linfonodo.
Biopsie cutanee incisionali (>0,6 cm)
superiori ai 0.6 cm (Fig.6) sono sottoposte a disaggregazione
meccanica mediante una procedura manuale. Il campione posto in una
capsula Petri e bagnato con pochi mL di PBS viene disaggregato
manualmente e avvalendosi di un bisturi monouso, viene effett
procedura di scraping cellulare del tessuto. Successivament
viene filtrata utilizzando filtri monouso con pori da 100
Disgregazione dei diversi Punch cutanei con tecnica di sminuzzamento e di
prima sminuzzate in frammenti più
poi poste in una soluzione composta da collagenasi IV
Fig.34) seguendo i
Successivamente viene effettuata una
Le procedure successive riproducono i
a disaggregazione
Il campione posto in una
capsula Petri e bagnato con pochi mL di PBS viene disaggregato
manualmente e avvalendosi di un bisturi monouso, viene effettuata la
procedura di scraping cellulare del tessuto. Successivamente la sospensione
so con pori da 100
•
Processazione delle biopsie cutanee
Ottenuta la sospensione di cellule (Fig.8), si eseguono le seguenti
procedure di pre-analisi che consistono in:
Separazione su gradiente Test di vitalità cellulare Concentrazione cellulare
La prima consiste in una separazione su gradiente di densità, utilizzata allo
scopo di eliminare dal campione in esame i linfociti danneggiati e le
emazie che potrebbero assorbire passivamente gli anticorpi monoclonali e
inficiare l’analisi citofluorimetrica. Si utilizza un composto di sodio
metrizoato e un polisaccaride (Lymphoprep) sul quale è poi stratificato la
sospensione cellulare (Fig.9). Dopo centrifugazione, le cellule
mononucleate formano una banda distinta all’interfaccia tra il campione e il
medium, mentre i linfociti morti, eritrociti e granulociti maturi rimangono
sul fondo della provetta. Le cellule sono aspirate da questa interfaccia
usando una pipetta Pasteur di vetro, senza rimuovere lo strato superiore. La
sospensione di cellule prelevate all’interfaccia viene sottoposta al test di
vitalità cellulare, procedura che consiste nella colorazione delle cellule con
Trypan Blue. Lo scopo è verificare sia la morfologia, sia la vitalità
cellulare. Le cellule con membrana danneggiata sono permeabili al
colorante, mentre le cellule vive sono impermeabili. In una provetta di
cellulare da analizzare. La conta delle cellule viene poi effettuata
utilizzando vetrini contacellule
quali si inserisce una quantità pari a 30
vetrino. Osservando al microscopio si possono distinguere le cellule vitali
trasparenti e le cellule
se ha una vitalità cellulare superiore al
vitalità tende ad essere più bassa nei tumori aggressivi, composti di cellule
grandi, rispetto a tumori di basso grado, composti da cellule di piccole
dimensioni. Le cellule neoplastiche grandi sono più fragili e quindi più
suscettibili ad essere danneggiate e perse nelle fasi di lavaggio e di
centrifugazione, durante la processazione del materiale.
prima di procedere alla marcatura, è la concentr
sospensione cellulare deve avere
elementi cellulari / mL, questo determinerà anche il numero di marcature
da fare successivamente.
Figura 8 e 9: Filtrazione e raccolta della sospensione cellulare s
cellulare da analizzare. La conta delle cellule viene poi effettuata
utilizzando vetrini contacellule appositi (Fast – Read 102, Vizaplastik), nei
quali si inserisce una quantità pari a 30 µl lasciandola
. Osservando al microscopio si possono distinguere le cellule vitali
le cellule morte colorate in blu, un campione ri
se ha una vitalità cellulare superiore al 75%. Come regola la cellularità e la
vitalità tende ad essere più bassa nei tumori aggressivi, composti di cellule
grandi, rispetto a tumori di basso grado, composti da cellule di piccole
ni. Le cellule neoplastiche grandi sono più fragili e quindi più
suscettibili ad essere danneggiate e perse nelle fasi di lavaggio e di
centrifugazione, durante la processazione del materiale.
prima di procedere alla marcatura, è la concentrazione cellulare. La
sospensione cellulare deve avere una concentrazione, tra il
elementi cellulari / mL, questo determinerà anche il numero di marcature
da fare successivamente.
raccolta della sospensione cellulare su gradiente di Ficoll.
cellulare da analizzare. La conta delle cellule viene poi effettuata
Read 102, Vizaplastik), nei
l lasciandola diffondere sul
. Osservando al microscopio si possono distinguere le cellule vitali
risulta accettabile
75%. Come regola la cellularità e la
vitalità tende ad essere più bassa nei tumori aggressivi, composti di cellule
grandi, rispetto a tumori di basso grado, composti da cellule di piccole
ni. Le cellule neoplastiche grandi sono più fragili e quindi più
suscettibili ad essere danneggiate e perse nelle fasi di lavaggio e di
centrifugazione, durante la processazione del materiale. La fase ultima
azione cellulare. La
tra il 5–10 x 106
elementi cellulari / mL, questo determinerà anche il numero di marcature
•
Marcatura con gli anticorpi monoclonali
La sospensione di cellule viene marcata con anticorpi monoclonali,
utilizzando una tecnica di immunofluorescenza diretta. Il campione viene
distribuito in più tubi, circa 100 µl di sospensione cellulare.
Successivamente il campione è incubato al buio con 10 µl di anticorpo
monoclonale per circa 15 minuti a temperatura ambiente. In ciascuna
sessione di lavoro viene inclusa una provetta con il controllo isotipico che
funge da controllo negativo. Per il nostro studio abbiamo utilizzato diversi
anticorpi monoclonali, di varie aziende, Becton Dickinson, Dako, Partec,
ciascun anticorpo è coniugato con un fluorocromo come: isotiocianato di
fluoresceina (FITC), ficoeritrina (PE), proteina clorofilla piridina cianina 5
(PerCP-Cy5.5), ficoeritrina cianina 7 (PC7), alloficocianina (APC). Il
pannello di base comprende marcature con i seguenti anticorpi
monoclonali(Tab.1):CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP-
Cy5.5/CD5PC7/CD20APC;CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP-Cy5.5/CD45APC;κFITC/λPE/CD19PerCPCy5.5/CD20APC;CD4FITC/CD
26PE/CD3PerCPCy5.5;CD5FITC/CD10PE/CD19PerCP-Cy5.5/CD20APC;
CD3FITC/CD16+56PE; FMC7FITC/CD23PE/CD3PC7/CD20APC;CD19
ITC/CD200/CD5PC7/CD3APC. Successivamente all’incubazione ciascun
tubo è sottoposto ad un lavaggio con 2 ml di PBS, seguita da una
centrifugazione e una risospensione dei pellets con 1 ml di PBS. Il
(CyFLOW, PARTEC
eventi. Dopo lo step iniziale,
di approfondimento
(Fig.10) si rendono fondamentali per individuare le diverse entità
nosologiche della malattia, ad esempio ne
delezione totale del CD7 orienta verso una diagnosi di Micosi
Nel caso dei linfomi B, il pannello di approfondimento ha consentito di
effettuare una diagnosi precisa, ad esempio
cellule CD19+ orienta la diagnosi verso due entità nosologiche
linfocitico B e il linfoma mantellare; solo applicando approfondimenti
immunologici come l’uso FMC7 e il CD23 si riesce ad avere una diagnosi
precisa (45-53).
Figura 10: Algoritmo interpretativo dei Pannelli Anticorpali di diverse patologie.
PARTEC). Per ciascun tubo sono stati acquisiti almeno 5
Dopo lo step iniziale, in alcuni casi sono stati eseguiti dei pannelli
o (Tab.2 e Tab.3). I pannelli di approfondimento
si rendono fondamentali per individuare le diverse entità
nosologiche della malattia, ad esempio nell’ambito dei linfomi T,
delezione totale del CD7 orienta verso una diagnosi di Micosi
dei linfomi B, il pannello di approfondimento ha consentito di
effettuare una diagnosi precisa, ad esempio, l’espressione del CD5 sulle
orienta la diagnosi verso due entità nosologiche
B e il linfoma mantellare; solo applicando approfondimenti
immunologici come l’uso FMC7 e il CD23 si riesce ad avere una diagnosi
10: Algoritmo interpretativo dei Pannelli Anticorpali di diverse patologie.
sono stati acquisiti almeno 50.000
alcuni casi sono stati eseguiti dei pannelli
I pannelli di approfondimento
si rendono fondamentali per individuare le diverse entità
ll’ambito dei linfomi T, ove la
delezione totale del CD7 orienta verso una diagnosi di Micosi Fungoide.
dei linfomi B, il pannello di approfondimento ha consentito di
l’espressione del CD5 sulle
orienta la diagnosi verso due entità nosologiche:il linfoma
B e il linfoma mantellare; solo applicando approfondimenti
immunologici come l’uso FMC7 e il CD23 si riesce ad avere una diagnosi
Tabella 1: Pannello di screening dei Linfomi Cutanei
CD Utilità Clinica
CD45 FITC / CD14 PE Valutazione e scelta della finestra analitica
CD3 FITC / CD4 PE Quota linfocitaria T totale e T CD4+
CD3 FITC / CD8 PE Quota linfocitaria T totali e TCD8+
CD3 FITC / CD19 PE Quota linfocitaria T totali e B totali
CD3 FITC / CD16+56 PE Quota linfocitaria T totali e NK
CD20 FITC / CD5 PE
Quota linfocitaria B CD20+, T CD5+ e co-espressione
T su B (CD5+ / CD20+ in CLL,MCL)
CD7 FITC / CD2 PE
Linfociti T totali e NK
Anomalie di espressione della popolazione T
K FITC / L PE Restrizione clonale catene leggere
K FITC / CD19 PE Restrizione clonale catene leggere
Tabella 2: Pannello di approfondimento per la linea dei linfociti B
CD Utilità Clinica
CD5 / CD19 Espressione di CD5 sulle cellule B: CLL,MCL.
CD43 / CD23
LLC: CD43+ CD23+ MCL: CD43+ CD23-
FMC7 / CD10
FMC7: cellule B ; distingue linfomi CD5+ ( CLL -; MCL: spesso +; HCL +)
CD10 : cellule centro follicolari (FL,DLBCL,BL)
CD103 / CD22
CD103: positivo HCL e alcuni MZL
CD22: linea B ( l’intensità spesso differisce nei sottotipi di linfoma B: CLL/SLL dim )
CD138 / CD38 Plasmacellule: CD138+ CD38+ CD25 / CD19 HCL, CLL: CD25+ CD11c / CD19 HCL:CD11c+ SIgM / D / G / A o ICIgM / G / A
Valutazione della maturazione / differenziazione
Ki67 / CD20 Attività proliferativa linfoma B
Bcl2 / CD10/ CD20
Distingue neoplasie CD10+: FL+,BL- Variabile positività in DLBCL
Tabella 3: Pannello di approfondimento delle linee cellulari T/NK
CD Utilità Clinica
CD2 Linea T , NK
CD3 di superficie Linea T . Delezione o diminuzione di espressione
CD4 Classificazione delle neoplasie T mature
CD5 Linea T. Delezione o diminuzione di espressione
CD7 Linea T. Delezione o diminuzione di espressione
CD8 Classificazione delle neoplasie T mature
CD45 Neoplasie linfoidi mature
CD56 Indicatore di differenziazione NK
CD3 citoplasmatico Linea T; linfobalsti
CD10 Positivo in alcune neoplasie T mature ( AITCL )
CD16 Indicatore di differenziazione NK
CD26 Micosi fungoide/Sindrome di Sézary spesso CD26-
CD30
Marcatamente positivo in ALCL. Variabile positività in altre neoplasie T e NK mature.
Positivo in H.L.
CD57 Indicatore di differenziazione NK
TCR αβ TCR γδ
Classificazione delle neoplasie T mature
Può aiutare nell’identificazione di popolazioni ristrette
3.
Risultati citofluorimetrici
L’analisi citofluorimetrica ha confermato e in alcuni casi ha reso possibile
la diagnosi istologica. Dei 53 casi esaminati, 34 sono stati classificati come
casi reattivi, con un normale rapporto CD4/CD8 (il cui intervallo è
compreso 2.2-6.1). I restanti 19 casi sono stati classificati come linfomi
cutanei, di questi 5 a fenotipo B (Tab.4) e 14 a fenotipo T (Tab.5). Nella
tabella 4 sono illustrate le anomalie immunofenotipiche che abbiamo
riscontrato. Attraverso l’utilizzo di parametri fisici (FSC/SSC) con un
parametro immunologico, come il CD19, siamo riusciti a discriminare le
popolazioni di piccole dimensioni (reattive) dalla popolazione
medio-grandi (neoplastiche), ciò ha reso possibile la diagnosi di due linfomi
follicolari, due linfomi a grandi cellule e la localizzazione cutanea di una
leucemia linfatica cronica. La tabella 5 illustra le anomalie
immunofenotipiche dei linfomi T; anche nell’ambito dei questi linfomi T i
parametri fisici (FSC/SSC) sono stati utilizzati per discriminare la
popolazione neoplastica da quella reattiva di accompagnamento. Tale
popolazione aberrante mostra una dimensione che varia da cellule piccole a
cellule medie per la maggior parte dei campioni. Abbiamo osservato,
costantemente,che nei linfomi T la presenza di una popolazione T reattiva
ci ha aiutato nella comparazione dell’espressione antigenica normale con
un’espressione aberrante. Su 14 casi a cui è stata fatta diagnosi di linfoma
sui parametri fisici (FSC/SSC) ed è emerso quanto segue segue: in 6 casi
l’espressione del CD3 è risultata diminuita (CD3 dim), in 5 casi
l’espressione del CD3 è risultata aumentata (CD3 bright), in 2 casi con il
CD3 era deleto e un unico caso in cui l’espressione di CD3 è normale. Nei
casi con CD3 dim abbiamo osservato due diverse popolazioni: una di
piccole cellule con espressione normale del CD3 e l’altra con cellule più
grandi ad espressione CD3dim. Di questi 6 casi 3 mostrano positività per
CD4+ e gli altri 3 positività per CD8+ . Nei casi CD3 bright abbiamo visto
due diverse popolazioni: 4 casi /CD8+ mentre solo un caso era
CD4-/CD8-. Nei due casi CD3-, il CD4 è risultato positivo, così come nel caso
CD3+ è risultato CD4+. Abbiamo poi osservato che la popolazione
neoplastica presenta un fenotipo T helper (CD4+) in 6 casi, un fenotipo
citotossico (CD8+) in 7 casi, mentre solo un caso risulta CD4-/CD8-.
L’analisi del CD26 e del TCR è stata effettuata solo in alcuni casi, a causa
della scarsa quota linfocitaria. Il CD7, ad esempio è risultato negativo in
Tabella 4: Anomalie immunofenotipiche Linfomi B FCS/SSC Cellule atipiche CD45 CD19 CD20 CD5 CD10 K L CD23 CD200 FMC7 Grandi 80 + + + - + + - - - + Medio-grandi 50 + +dim + - + - + - - + Piccole 60 + +dim + + - - + + + - Medio-grandi 60 + + + - - +(più) + - - + Medio-grandi 70 + +dim + - + - + - - +
+ :intensità normale dell’espressione dell’antigene
+ dim :diminuzione dell’intensità dell’espressione dell’antigene
+bright: alta intensità dell’espressione dell’antigene
Tabella 5: Anomalie immunofenotipiche Linfomi T FCS/SSC Cellule Atipiche CD45 CD2 CD3 CD4 CD8 CD5 CD7 CD16-56 Piccole 83 + + + + - - - - Piccole 40 + + +dim - + + - - Medie 30 + + +bright - - - - - Medie 40 + + +bright - + - Nd - Medie 62 + + - + - + - - Piccole 35 + + - + - + - - Medie 47 + + +dim + - nd Nd - Piccole 45 + + +bright - + - Nd - Medie 21 + + +dim - + nd Nd - Medie 42 + + +dim + - + - - Medie 30 + + +dim + - nd - - Medie 18 + + +bright - + + - - Medie 4 + + +bright - + - - - Medie 5 + + +dim - + + - -
+ :intensità normale dell’espressione dell’antigene
+ dim :diminuzione dell’intensità dell’espressione dell’antigene
+bright: alta intensità dell’espressione dell’antigene
•
Analisi
dei
casi
clinici:
istologia
e
pannelli
immunofenotipici
Per chiarire alcuni aspetti circa la complessità della diagnosi, illustriamo
alcuni casi clinici. In questi casi la semplice diagnosi istologia con il
supporto delle colorazioni immunoistochimiche orientano per una
determinata diagnosi mentre l’utilizzo dell’indagine citofluorimetrica
facilita la risoluzione de quesito diagnostico.
Micosi fuingoide
Il primo caso esaminato è stato diagnosticato come Micosi Fungoide;
caratterizzato da chiazze eritematose desquamanti a limiti netti,
irregolari con diversa tonalità e aspetto a carta geografica nella zona
del tronco (Fig. 11a). L’esame istologico (Fig.11b) individua un’
iperplasia psoriasiforme con infiltrato linfo-istiocitario superficiale.
L’esame immunoistochimico conferma l’espressione dei linfociti T
helper CD4+ (Fig.11c). I pannelli citofluorimetrici mostrano le
anomalie immunofenotipiche a carico dei linfociti T. I linfociti in
esame mostrano espansione della popolazione CD4+ (Fig.11d freccia
rossa; Fig. 11e), si osserva, inoltre, assenza di CD5 (Fig.11f) e di
CD7 (Fig.11g freccia rossa). Il rapporto T4/T8 è marcatamente
Nel secondo caso osservato è stata posta la diagnosi di Micosi
Fungoide, caratterizzata da papule eritematose cupoliformi
lievemente desquamanti raggruppate in chiazze (Fig.12a).
Istologicamente si osserva un’ epidermide con aspetto lichenoide con
acantosi epiteliale e infiltrato a banda. (Fig.12b). La quasi totalità
degli elementi dell'infiltrato esprime il CD4.(Fig.12c). I pannelli
citofluorimetrici evidenziano anomalie immunofenotipiche a carico
dei linfociti T. La popolazione in esame, costituita da elementi di
medio-piccole dimensioni ,è data da elementi T reattivi commisti ad
elementi neoplastici (Fig. 12d-e). I linfociti neoplastici mostrano
assenza di espressione a carico di CD3, ositività per CD4 (Fig. 12f-g
freccia rossa) ed assenza di CD8. Le cellule T reattive mostrano
Figura 11 Micosi Fungoide dei pannelli citofluorimetrici
11 Micosi Fungoide. Fig:11a -11c clinica ed immagine istologiche; dei pannelli citofluorimetrici
Figura 12 Micosi Fungoide corrispondenti; Fig:12d cellule neoplastiche
Micosi Fungoide. Fig:12a -12c cute con papule ed i d-12g analisi dei pannelli citofluorimetrici con positività
cute con papule ed immagine istologiche con positività per CD4 delle
Linfoma T
Il terzo caso esaminato è un linfoma T. Le immagini mostrano un
nodulo sottocutaneo che affiora in superficie con modesto eritema, a
bordi sfumati (Fig. 13a). Il nodulo dermo-ipodermico è costituito da
elementi linfoidi neoplastici. (Fig.13b) La quasi totalità degli
elementi linfoidi esprime il fenotipo T (Fig.13c). Osservando i
pannelli citofluorimetrici, alcuni linfociti T presentano anomalie
immunofenotipiche (rossi) rispetto ai linfociti T normali (blu).
I linfociti anormali cadono nella regione di dimensioni maggiori
FSC/SSC (Fig.13d) ed esprimono CD3 ad una intensità minore
rispetto ai linfociti T normali (Fig.13e-f). Si riscontra un’espansione
clonale a carico dei linfociti CD4+ (Fig.13g), negatività per CD8
(Fig.13h), negatività per CD7 (Fig.13i), positività per CD5 (Fig.13l).
Lo studio del TCR mostra diminuita espressione per TCR αβ delle
cellule neoplastiche rispetto le cellule normali (Fig.13m). L’indice di
proliferazione cellulare Ki67 delle cellule neopastiche (clone MIB-1)
è pari al 13,15% (Fig.13n). I linfociti normali T sono invece positivi
per CD3,CD4,CD5, CD7,CD8 e non mostrano alterazioni di
Figura 13 Linfoma T. Fig:
pannelli citofluorimetrici con popolazione neoplastica CD3dim/CD4+/CD5+
: 13a-13c nodulo ascellare e colorazioni immunoistologiche con popolazione neoplastica CD3dim/CD4+/CD5+
Linfoma B
Placca eritematosa con nodulo rosso intenso a superficie liscia
(Fig.14a). L’istologia mostra un infiltrato denso di cellule linfoidi nel
derma superficiale rispetto all’area sub-epiteliale (Fig14b). La
totalità degli elementi è positiva per CD20 (Fig.14c). I dot-plots
evidenziano una popolazione di linfociti di piccole-medie dimensioni
(Fig.14d). Utilizzando il gate immunologico SSC/CD45 (Fig.14e) si
identificano due popolazioni cellulari: una di linfociti T ed una
marcata quota di linfociti B con elementi CD19+ (Fig.14f). Lo
studio della clonalità di quest’ultima popolazione cellulare rivela la
presenza di elementi B normali policlonali, regione R3, (Fig.14g)
commisti ad elementi di dimensioni maggiori, regione R4,
(Fig.14g-h) che mostrano restrizione monoclonale Kappa a bassa intensità di
espressione. I linfociti T mostrano normale espressione di CD4 e
CD8 (Fig.14i) e di altri marcatori dei quali non sono mostrati i
Figura 14 Linfoma B. Fig: citofluorimetriche, in evidenza
:14a-14c nodulo rosso con istologia e IHC CD20+
in evidenza la regione R4 con cellule neoplastiche CD19+/monoclonali
20+; Fig:14d-14i analisi 19+/monoclonali K
Linfoma B diffuso a grandi cellule
Il quarto caso illustra un linfoma B diffuso a grandi cellule. Si
osserva un nodulo eritematoso cupoliforme (Fig.15a), con infiltrato
linfoide che interessa il derma risparmiando la zona
subepiteliale.(Fig.15b). Si identificano grandi cellule a nucleo ampio,
vescicoloso e chiaro (Fig.15c), mentre immunoistochimicamente una
positività per il CD79a (Fig.15d). I pannelli citofluorimetrici rivelano
due popolazioni cellulari una piccola e una grande, valutabile
attraverso i parametri fisici. I linfociti B esprimono una anormale
espressione di CD19 (Fig.15g) con espressione diminuita, ma sono
positive per CD20 e CD10 (Fig.15h-i) e mostrano una restrizione
monoclonale Lambda (Fig.15l ). I linfotici T, di dimensioni più
Figura 15 Linfoma B diffuso a grandi cellule Fig: 15e-15li analisi dei pannelli citofluorimetrici
15 Linfoma B diffuso a grandi cellule. Fig: 15a-15d clinica ed immagin 15li analisi dei pannelli citofluorimetrici
Linfoma follicolare
Si documenta la presenza di una placca a superficie mammellonata
di colorito roseo non ulcerata (Fig.16a). Le cellule identificate
ritrovate (Fig.16b) sono di medio-grandi dimensioni. I pannelli
citofluorimetrici mostrano una popolazione cellulare di medio-grandi
dimensioni (Fig.16c) con prevalenza dei linfociti B (Fig.16d-e) con
espressione di CD10 (Fig.16f) e restrizione monoclonale delle catene
leggere delle sIg fenotipo Lambda (Fig.16g). Le cellule B, nella
regione R2 (in verde) mostrano iper-espressione per BCL2 in
paragone al controllo interno rappresentato dai linfociti T, regione
R1 (in rosso) (Fig.16i-l). L’indice di proliferazione cellulare Ki67
Figura 16 Linfoma Follicolare
mostra una popolazione anomala CD20+/CD10+/monoclonale L/BCL2+ 16 Linfoma Follicolare. Fig: 16a e 16b clinica e sezione istologica; Fig: mostra una popolazione anomala CD20+/CD10+/monoclonale L/BCL2+
Linfoma Linfocitico B
Clinicamente si osserva un nodulo cupoliforme eritematoso a rapida
crescita (Fig.17a). Istologicamente si osserva un tessuto biancastro,
omogeneo, con positività al CD23 (Fig.17b). I pannelli
citofluorimetrici mostrano una popolazione cellulare di linfociti di
piccole dimensioni( Fig17d), mentre i linfociti B neoplastici sono
CD19+ e co-esprimono il CD5 (Fig17e) mentre la popolazione di T
normali, non esprime il CD5. Inoltre, si conferma la positività del
CD23, vista in immunoistochimica, e si osserva inoltre una
negatività per FMC7 (Fig17f), inoltre si osserva una restrizione
Figura 17 Linfoma L immunoistochimiche; 1
CD19+/CD5+/CD23+monocolanale K
Linfocitic di tipo B: 17a e 17c nodulo campionato e
17d-17h pannelli citofluorimetrici mostrano una popolazione neoplastica CD5+/CD23+monocolanale K, con co-espressione CD20+/CD5+
odulo campionato e immagini mostrano una popolazione neoplastica
•
Statistica
L’indagine statistica è stata eseguita valutando una serie di parametri e in
particolare abbiamo analizzato statisticamente: età, sesso, sede, modelli
istologici di distribuzione dell’infiltrato (Modelli istologici : Nodulare:1,
perivascolare:2, psoriasiforme:3, lichenoide.4, diffuso:5.), interessamento
dell’ epidermide e zona grenz, grandezza cellulare, fenotipo, risultati della
CFM. L’indagine ha rivelato che la percentuale di uomini- donne colpiti da
fenotipo T o B è pressoché identica (Tab.6). Si è rilevato, invece, una
differenza statisticamente significativa per quanto riguarda la sede. Le
lesioni a fenotipo B prediligono le sedi esposte del capo-collo, i linfomi T
sono localizzati soprattutto al tronco; gli arti sono colpiti in ugual misura da
linfomi T e B (Tab.7). I linfomi cutanei B hanno più frequentemente cellule
di dimensioni medio grandi, i CTCL di dimensioni medio piccole e la
differenza è statisticamente significativa. La CFM in rapporto alla diagnosi
istologica è risultata indicativa di neoplasia in 14 casi diagnosticati come
LC, contro i 5 della linea B, inoltre i Linfomi cutanei B presentano nella
Tabella 6 e 7: Analisi statistiche: osservazione della distribuzione dei Linfomi B e dei Linfomi T per genere e sede
4.
Discussione
La pelle è un organo bersaglio su cui convergono diversi e numerosissimi
stimoli sia esterni all’organismo che interni e reagisce ad essi secondo
modalità che possono essere diverse per lo stesso antigene e simili per
antigeni diversi. Questo si traduce in una miriade di quadri clinici diversi
per una stessa lesione e simili per lesioni diverse. E’ il caso dei LC in cui ci
troviamo di fronte a un numero impressionante di varianti cliniche di
linfoma ma anche un numero considerevole di simulatori, detti
pseudolinfomi. Fra questi ci sono inoltre lesioni considerate potenzialmente
maligne. Si parla di LC primitivi solo quando abbiamo escluso che si tratti
di lesioni secondarie alla cute a partenza da altre sedi (1); unica eccezione
la MF che si considera sempre primitiva e che ha un quadro clinico
abbastanza tipico. Anche in questo caso ci sono problematiche legate alla
diagnosi precoce a cui spesso si arriva dopo più biopsie. Clinicamente,
nelle forme iniziali, si può avere solo un rush cronico del tutto aspecifico
(9-10) o può simulare tutti i modelli istologici di dermatite (9-12). Spesso
non c’è alcun criterio specifico neppure clinico e la valutazione di tali
lesioni richiede grande attenzione. Ci sono molti casi di reperto sospetto
dove la sola istologia, soprattutto se si tratta di lesione nella forma iniziale,
mostra un elevato numero di falsi negativi (11). Altri studi hanno
dimostrato come la revisione dei casi porta spesso ad una riattribuzione
esistente tra la lesione maligna e quella benigna, in molti linfomi si osserva
un decorso indolente con successiva variazione dell’aspetto istologico;
spesso le biopsie sono piccole e rendono estremamente difficile la diagnosi
(Connors et Al.20). È emerso, inoltre, che di grande ausilio diagnostico è il
rapporto CD4/CD8. Il dato risulta utile solo quando è molto alto ma non è
mai patognomonico. Tali rapporti risultano alterati nel sangue di diversi
pazienti affetti da neoplasie maligne, come il melanoma cutaneo. Bisogna
ribadire che la presenza di monoclonalità non equivale sempre a neoplasia.
Inoltre la gran parte delle lesioni linfoproliferative B è costituita da linfomi
centrofollicolari e da linfomi della zona marginale che sono in diagnosi
differenziale con lesioni reattive piuttosto comuni come la linfoadenosi
benigna cutis. (22;25-27). L’aspetto clinico è spesso molto simile tra una
lesione neoplastica e una reattiva e l’andamento biologico, di solito molto
blando, non permette di dirimere con sicurezza. Alla luce di tutto queste
informazioni, grande svolta è quindi rappresentata dalla CFM (29). Molti
studi confermano che tale metodica non solo permette un’analisi sensibile
quantitativa e rapida relativa all’espressione delle molecole di superficie
delle cellule ma permette inoltre di avere informazioni circa la
•
Osservazione casistica
I linfomi B, nella nostra casistica sono essenzialmente linfomi
centrofollicolari e della zona marginale. Quasi tutti i linfomi B osservati
presentavano la zone di grenz ed inoltre la dimensione delle cellule variava
da medio-grandi a piccole in ugual proporzione. L ‘espressione del BCL2 è
risultato negativo in tutti i casi di linfoma primitivo, positivo in alcune
lesioni secondarie. La CFM ha evidenziato una restrizione clonale in tutti i
casi di linfoma B; nella quasi totalità dei casi si è evidenziata una
restrizione clonale delle catene Kappa eccetto in due casi in cui la catena
leggera espressa era Lambda. Continuando l’analisi della casistica è emerso
che la lesione più frequente risulta la MF. Nelle forme iniziali l’atipia
cellulare è molto lieve e sfumata; nella maggior parte dei casi abbiamo
notato solo ipercromasia e piccole indentature nucleari. La presenza di
cellule atipiche è segnalata comunque anche in molte dermatiti. Come
suggerito in letteratura abbiamo valutato anche la differenza di dimensioni
delle cellule nell’epidermide e nel derma e l’eventuale presenza di ascessi
di Pautrier, entrambi i dati non sono stati di aiuto nella diagnosi. La MF è
un LC a linfociti T helper CD4+ e le immunocolorazioni sono importanti
per la diagnosi. Nel valutare questo parametro bisogna ricordare che la
stragrande maggioranza delle dermatiti ha un infiltrato con prevalenza di
linfociti CD4+. Inoltre, in una popolazione linfoide neoplastica, c’è
di CD8. Quello che conta è il rapporto fra le due popolazioni. In un quadro
neoplastico questo deve essere almeno superiore a 4. Noi valutiamo il
rapporto CD4/CD8 con la CFM ed eseguiamo una misurazione sui
preparati istologici con doppia colorazione solo se non disponiamo di
materiale a fresco. La CFM ci ha permesso di separare i processi
neoplastici da quelli reattivi, tipici o atipici. Questo perchè la CFM dà
percentuali precise, numeri affidabili in quanto contati da uno strumento
che non risente di variazioni soggettive. La tecnica CFM in tutti i casi ha
fornito in modo veloce ed accurato il rapporto T4/T8 che nello studio dei
linfomi T variava tra 1.2 e 9. Le anomalie immunofenotipiche sono state la
diminuzione di espressione dell’intensità del CD3 o una sua totale
delezione. Abbiamo osservato alcuni casi di papulosi linfomatoide (PL) che
è una lesione linfoproliferativa T, a comportamento biologico benigno,
caratterizzata dalla presenza di cellule grandi, atipiche, che esprimono
monoclonalità in biologia molecolare e sono CD30+. Considerata una
lesione borderline da alcuni e francamente neoplastica da altri. Il quadro
istologico può invece essere sfumato con la sola presenza di alcune cellule
grandi CD30+, che peraltro possono essere presenti anche in corso di
dermatite. La citofluorimetria ha evidenziato un’espansione della
•
Conclusione
Tutte le tecniche ancillari in aiuto all’istologia sono veramente utili ai fini
diagnostici. Si è proposto perciò recentemente l’applicazione di uno
schema integrato clinico e morfologico (21). La diagnosi dei linfomi
cutanei, è tutt’oggi, una diagnosi complessa e nella maggior parte dei casi
la lesione cade in una zona grigia. Noi riteniamo che l’approccio migliore
sia quello di sfruttare tutti i mezzi a disposizione con una stretta
collaborazione clinico morfologico laboratoristica. Nello specifico la CFM
si è rilevata un valido strumento ai fini diagnostici. L’analisi
citofluorimetrica della cute non è molto applicata perché il procedimento è
complesso, occorre tempestività e manualità. Nel caso dei Linfomi cutanei
a fenotipo B, i pannelli citofluorimetrici orientano la diagnosi di per sé in
quanto sono indicativi di alcune lesioni poiché consentono di valutare la
restrizione clonale. Nei CTCL, la CFM ci ha permesso di valutare il
corretto rapporto CD4/CD8 e parallelamente le colorazioni IHC hanno
integrato e confermato i nostri dati. In molti casi, la CFM ha permesso di
identificare quote percentuali molto piccole di cellule atipiche non
rilevabili né a livello istologico né a livello immunoistochimico
consentendo al patologo di effettuare approfondimenti sul caso. Siamo
arrivati alla conclusione che spesso la diagnosi è un puzzle il cui disegno si
riconosce bene quanti più tasselli ci sono: la CFM è un tassello
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