3.1 CAMPIONI DI GLIOMA E TESSUTO CEREBRALE NORMALE.

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MATERIALI E METODI

3.1 CAMPIONI DI GLIOMA E TESSUTO CEREBRALE NORMALE.

Dieci campioni tumorali corrispondenti a glioblastomi (presumibilmente primari) sono stati ottenuti da pazienti operati al fine di rimuovere chirurgicamente un tumore cerebrale primario. Tre campioni di tessuto cerebrale normale sono stati ottenuti da pazienti sottoposti ad operazione per patologie non tumorali (come ad esempio traumi od ematomi spontanei) durante la quale, per ragioni terapeutiche, sono state asportate piccole porzioni di tessuto cerebrale.

I campioni sono stati raccolti previo consenso informato da pazienti arruolati nell’ambito di in un protocollo clinico-genetico presso l'Unità di Neurochirurgia dell'Ospedale di Livorno (SCS 2008-0019) e presso l’Unità di Neurochirurgia II della Azienda ospedaliera-Universitaria di Pisa.

3.2 COLTURE CELLULARI.

La linea U87MG e la linea ADF di Glioblastoma umano sono state coltivate in

mezzo completo: RPMI 1640, integrato con 10% di FBS (Fetale Bovine Serum),

2mM L-glutammina, 100 unità/mL penicillina, 100 µg/mL streptomicina e

aminoacidi non essenziali, e mantenute in condizioni di coltura standard (37°C,

umidità 95%, CO

2

5% ).

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3.3 COLTURE PRIMARIE.

Porzioni di glioma, ottenute durante operazioni chirurgiche finalizzate a rimuovere un tumore cerebrale primario sono state poste in DMEM/F12 addizzionato di PEN/STREP (1ml in 50 ml) in ghiaccio all’interno della sala operatoria.

Successivamente il pezzo è stato tagliato, in una piastra petri, con un bisturi affilato in

cubetti di 1 mm x 1 mm. Due o tre cubetti sono stati risospesi in DMEM/F12

addizionato di collagenasi IA (concentrazione finale 200U/ml) e DNAsi (2U/ml) ed

incubati per 1h e 30 minuti a 37°C in agitazione. Al termine dell’incubazione i pezzi

grossolani non dissociati sono stati rimossi ed il surnatante è centrifugato a 1500rpm

per 10 minuti, il pellet così ottenuto è stato risospeso in 0,5 ml di PBS e sottoposto a

lisi degli eritrociti mediante l’aggiunta di 7 ml di ELS (per un litro di soluzione

10X:89,9g NH4Cl, 10g KHCO, 370mg tetrasodium EDTA, pH 7,3 conservato a

4°C). I campioni sono stati poi incubati per 3-8 minuti a temperatura ambiente e

successivamente centrifugati a 1.500 rpm per 8 minuti a temperatura ambiente. Il

pellet così ottenuto è stato lavato con 5 ml di PBS ed infine risospeso in 1ml di

DMEM/F12 integrato con 10% di FBS (Fetale Bovine Serum), 2mM L-glutammina,

100 unità/mL penicillina e 100 µg/mL streptomicina, ed è stata mantenuta in

condizioni di coltura standard (37°C, umidità 95%, CO

2

5% ).

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3.4 ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE, PRODUZIONE DEL cDNA.

L’RNA totale delle cellule U87MG e dai campioni di glioma e di cervello normale è stato estratto mediante l’utilizzo del TRIzol LS Reagent (Invitrogen) seguendo le procedure indicate dal produttore. La qualità e la quantità dell’RNA ottenuto sono state valutate sia mediante elettroforesi su gel di agarosio che mediante analisi spettrofotometrica a 260 e 280 nm. 500 ng di RNA sono stati utilizzati per produrre il cDNA che è stato ottenuto utilizzando random esameri (Invitrogen 1µg/µl) e l’enzima Superscript II (Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore.

3.5 AMPLIFICAZIONE DEGLI ESONI DI BTG2 DA DNA GENOMICO ED ANALISI DI SEQUENZIAMENTO.

Il DNA genomico dai campioni di glioma è stato estratto con TRIzol LS Reagent (Invitrogen) utilizzando le procedure indicate dal produttore. Dal DNA genomico è stato amplificato l’esone 1 utilizzando i seguenti primers: BTG2 5UTRs

5’GGGTAACGCTGTCTTGTGG3’, BTG2 3UTRas

5’AGGTGGAGGTATGTGGTGG3’; e l’esone 2 utilizzando i seguenti primers:

BTG2 INTs 5’TGCCCCTGGTCCTGTCTC3’, BTG2 INTas

5’TAGAAGAAAGACGGCCCTG3’.

Gli esoni sono stati amplificati utlizzando le seguenti condizioni:

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Esone 1: 2 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 35 cicli di 30 secondi a 95°C, 1 minuto a 59°C e 45 secondi a 72°C, l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 5 minuti.

Esone 2: 2 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 5 cicli di 30 secondi a 95°C, 30 secondi a 58°C e 39 secondi a 72°C, altri 25 cicli di 30 secondi a 95°C, 30 secondi a 62°C e 30 secondi a 72°C l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 5 minuti.

Dopo amplificazione gli esoni sono stati purificati, quantificati e sequenziati su entrambi i filamenti utilizzando i primers usati per la amplificazione. Il sequenziamento è stato eseguito in service presso la ditta IDT.

3.6 REAL TIME PCR QUANTITATIVA.

Per quantificare i livelli dei trascritti di BTG2 e PTEN nei campioni di cDNA sono stati condotti esperimenti di Real Time PCR quantitativa relativa utilizzando la metodica del ∆Ct. Il gene della βactina è stato utilizzato come reference interna. Le reazioni di amplificazione sono state condotte a partire da circa 20ng di cDNA utilizzando il kit Maxima SYBR green qPCR master mix (Fermentas) ed i seguenti primers specifici:

BTG2 S Real-time: 5’-GCGTGAGCGAGCAGAGGCTT-3’ (2µM finale)

BTG2 AS Real-time: 5’-TGGGGCTGGCTGAGTCCGAT-3’ (2µM finale)

PTEN S Real-time: 5’-AAACAGTAGAGGAGCCGTCA-3’ (10µM finale)

PTEN AS Real-time: 5’-GACTTTTGTAATTTGTGTATGCT-3’ (10µM finale)

Actin S Real-time: 5’-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’ (5µM finale)

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Actin AS Real-time: 5’-GAGCCGCCGATCCACACG-3’ (5µM finale) Alle seguenti condizioni:

BTG2: 10 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 40 cicli di 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 58°C e 30 secondi a 72°C, l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 5 minuti.

PTEN: 10 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 40 cicli di 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 56°C e 30 secondi a 72°C, l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 5 minuti.

βACTINA: 10 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 40 cicli di 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 55°C e 30 secondi a 72°C, l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 5 minuti.

Tutti i primers sono stati testati su una curva di calibrazione a 4 punti costituita da numeri crescenti di molecole di ampliconi specifici (1000, 10000, 100000, 1000000) e la loro efficienza di amplificazione è risultata compresa tra 0.98 e 1.

3.7 CLONAGGIO DEI VETTORI DI ESPRESSIONE RICOMBINANTI.

Il cDNA full-length di BTG2 è stato amplificato utilizzando dei primers specifici che contenevano alle estremità 5’ degli adattatori corrispondenti a sequenze riconosciute da diversi enzimi di restrizione. I primers usati sono i seguenti: BTG2 senso 5’CGGAATTCACCATGAGCCACGGGAAGG3’ contenente il sito di restrizione

riconosciuto dall’enzima Eco RI e BTG2 antisenso

5’CGCGGATCCTAGCTGGAGACTGCCAT3’ contenente il sito di restrizione

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riconosciuto dall’enzima Bam HI per costruire i costrutti con i vettori pIRES- AcGFP1 e pEGFP CI. Le condizioni sperimentali delle PCR sono state le seguenti:

2 minuti a 95°C per la denaturazione iniziale, 5 cicli di 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 56°C e 45 secondi a 72°C, altri 30 cicli di 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 60°C e 45 secondi a 72°C l’estensione finale è avvenuta a 72°C per 7 minuti.

I frammenti amplificati sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio, purificati mediate estrazione fenolica e precipitazione in etanolo, quantificati e digeriti con i corrispondenti enzimi di restrizione: Bam HI ed Eco RI. I frammenti così ottenuti sono stati ulteriormente purificati e clonati, all’interno dei vettori pIRES- AcGFP1 e pEGFP CI precedentemente digeriti con gli stessi enzimi, defosforilati mediante l’utilizzo dell’enzima Shrimp alkaline phosphatase (Fermentas) e purificati mediate estrazione fenolica e precipitazione in etanolo. La reazione di ligation è stata condotta utilizzando l’enzima T4 DNA ligase (Fermentas) seguendo le istruzioni del produttore.

I prodotti di ligation sono stati inseriti in cellule competenti di E.Coli (DH5α), tramite

shock termico. Le cellule sono state cresciute su piastre Luria Berton (LB: 10g Bacto-

Tryptone, 5g Bacto-Yeast e 10g NaCl in 1 litro di H

₂

O a pH 7 con 15 g di Bacto-

Agar) contenenti 30 ng/ml di kanamicina per pEGFP C1 e 50 ng/ml di kanamicina

per pIRES-AcGFP1. Per ogni clonaggio dalle 10 alle 20 colonie sono state inoculate

in 100 µL di LB dei quali 2 microlitri sono stati destinati ad una reazione di PCR,

utilizzando i primers BTG2 S Real-time e BTG2 AS Real-time per verificare la

presenza dell’inserto. Da alcune delle colonie che presentavano l’inserto sono stati

ottenuti cloni in glicerolo. Alcuni cloni selezionati (clone 2 per pIRES-BTG2, clone

1e 2 per pEGFPC1-BTG2) sono stati cresciuti in 75 ml di LB più antibiotico e per

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mezzo del kit “Perfectprep Plasmid Midi” (Eppendorf), è stato estratto il DNA plasmidico utilizzato per gli esperimenti di trasfezione.

3.8 TRASFEZIONE E RETRO-TRASFEZIONE.

Per gli esperimenti di trasfezione e retro-trasfezione è stato utilizzato il reagente Turbofect (Fermentas) seguendo i protocolli indicati dal produttore.

La trasfezione è stata effettuata piastrando le cellule U87MG al 90% sospese in mezzo completo in Well, (1.500 cellule in 200µl di mezzo per Well 96 ,150.000 cellule in 1 ml di mezzo per Well 24, 800.000 cellule in 4 ml per Well da 6). A 24 ore dalla piastratura è stata costituita una soluzione contenente: Optimen (invitrogen), DNA e Turbofect, (20µl di Optimen, 0,2µg di DNA e 0,4µl di Turbofect per Well da 96; 100µl di Optimen, 1µg di DNA e 2µl di Turbofect per Well da 24; 400µl di Optimen, 4µg di DNA e 6µl di Turbofect per Well da 6). La soluzione è stata vortexata e incubata per 20 minuti a temperatura ambiente, dopodiche è stata aggiunta al mezzo nella Well contenente le cellule, (20µl del mix in Well da 96, 100µl in Well da 24, 400µl in Well da 6). La Well è stata poi agitata gentilmente in modo da uniformare la distribuzione della soluzione in piastra ed è stata messa ad incubare a 37°C, CO

₂

5% per il tempo voluto senza la necessita di cambiare il mezzo alle cellule per tutta la durata dell’esperimento.

La retro-trasfezione è stata effettuata inserendo in un pozzetto vuoto una soluzione

composta da Optimen, DNA e Turbofect, (20µl di Optimen, 0,2µg di DNA e 0,4µl di

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Turbofect aggiungendone 20µl per Well da 96; 100µl di Optimen, 1µg di DNA e 2µl di Turbofect aggiungendone 100µl per Well da 24; 400µl di Optimen, 4µg di DNA e 6µl di Turbofect aggiungendone 400µl per Well da 6) precedentemente vortexata e incubata a temperatura ambiente per 20 minuti, dopodichè il mezzo completo con le cellule in sospensione viene aggiunto al pozzetto (1.500 cellule in 200µl di mezzo per Well 96 ,150.000 cellule in 1 ml di mezzo per Well 24, 800.000 cellule in 4 ml per Well da 6), dopo una breve agitazione la Well è stata messa ad incubare a 37°C CO

2

5% per il tempo voluto senza la necessita di cambiare il mezzo alle cellule per tutta la durata dell’esperimento.

I livelli massimi di espressione per i vettori utilizzati sono stati raggiunti a 48 ore dalla trasfezione.

3.9 VALUTAZIONE DELLA VITALITA’ CELLULARE MEDIANTE IL SAGGIO DI COLORAZIONE CON IL CRYSTAL VIOLETTO.

La vitalità cellulare è stata valutata mediante un saggio colorimetrico in cui è stato

utilizzato come colorante il Crystal Violetto. Le cellule sono state lavate due volte

con PBS contenete 1mM CaCl

2

(PBSC), precedentemente riscaldato a 37°C, e fissate

con Paraformaldeide al 4% in PBSC per 15 minuti. Dopo la fissazione, sono stati

effettuati due lavaggi in PBSC a temperatura ambiente e le cellule adese al pozzetto

sono state colorate con 0,5 ml/0,1 ml di soluzione di Crystal Violetto (Crystal

Violetto 0,5% e metanolo 20%) per 10 minuti a temperatura ambiente rispettivamente

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per i multi-wells da 24 o da 96 wells. Dopo Rimozione della soluzione di Crystal Violetto mediante aspirazione, il colorante in eccesso è stato eliminato mediante immersione delle piastre in abbondante acqua di rubinetto. Le piastre sono state poi asciugate in stufa a 37°C. Infine, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 0,6 ml/0,1 ml di soluzione di decolorazione del Crystal Violetto (etanolo 50%, citrato di sodio 0,1 M, pH 4,2) rispettivamente per gli esperimenti condotti nei multi-well da 24 e 96 wells.

Dopo un breve periodo di agitazione, l’assorbanza a 540 nm è stata valutata mediante lettore di piastra. In ogni esperimento ciascun campione era rappresentato in triplicato e tre esperimenti indipendenti sono stati condotti per ogni valutazione della vitalità. Il valore di assorbanza misurato in ogni well di ogni piastra è stato sottratto dal background medio ottenuto misurando l’assorbanza di 3 pozzetti per piastra in cui era stato posto il solo mezzo senza cellule e che hanno subito l’intero processo di colorazione e decolorazione. La Concentrazione Inibente (IC50, concentrazione del farmaco che uccide il 50% delle cellule) per il trattamento con MG132 è stato calcolato da una sigmoide curva dose-risposta, utilizzando il programma GraphPad Prism 4.

3.10 VALUTAZIONE DEGLI EVENTI DI APOPTOSI E MITOSI MEDIANTE COLORAZIONE CON HOECHST.

Gli eventi di apoptosi e mitosi sono stati valutati mediante l’utilizzo del colorante

nucleare fluorescente Hoechst 33342 (Fluka) che si lega specificatamente alle

molecole di DNA. Le cellule di 3 repliche indipendenti sono state staccate mediante

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tripsinizzazione, raccolte mediante centrifugazione (1500 rpm 8 minuti a temperatura ambiente) ed i pellet, così ottenuti, sono stati risospesi ciascuno in 40 µl di una soluzione di glicerolo, acido acetico, PBS (1:1:13), contenente Hoechst alla concentrazione di 5 µg/ml ed incubate over-night a 4°C. Due aliquote di 10 µl per ogni campione sono state usate per contare il numero di cellule totali con un emocitometro e altre due aliquote di 5µL sono state invece collocate su di un vetrino e lasciate ad asciugare per alcune ore a 37°C. Il numero di figure mitotiche e apoptotiche è stato poi valutato in ciascuna aliquota al microscopio a fluorescenza. La media delle apoptosi e delle mitosi contate in ciascuna aliquota è stata poi normalizzata verso la media delle cellule totali per calcolare l’indice apoptotico e mitoico di ogni campione. Gli indici mitotici delle tre repliche sono stati poi utilizzati per l’analisi statistica.

3.11 SAGGIO DI COLORAZIONE DELLO IODURO DI PROPIDIO

Le cellule U87MG sono state piastrate in multi-well da 96 pozzetti alla

concentrazione di circa 20’000 cellule per pozzetto. Il giorno successivo, le cellule

sono state trattate con i farmaci alle concentrazioni selezionate e, dopo ulteriori 24 o

48 ore, sono state colorate con 2 µg/ml di Ioduro di Propidio (PI, Sigma-Aldrich) per

10 minuti a 37°C. Dopo la colorazione, sia le cellule in sospensione che quelle

aderenti al pozzetto sono state raccolte. Le cellule positive al PI e quelle totali sono

state contate al microscopio a flurescenza usando un emocitometro. Le cellule che

erano PI positive sono state considerate cellule necrotiche. E’ stato poi calcolato il

rapporto tra cellule necrotiche e cellule totali (rapporto N/T). Le cellule staccate da

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ogni well sono state contate in duplicato e il rapporto N/T è stato calcolato per tre repliche per ogni condizione sperimentale.

3.12 SAGGIO DI ESPRESSIONE DELLA SA-β–GAL SU TESSUTO.

Sezioni al criostato di campioni di glioma raccolti previo consenso informato dalla

Unità di Neurochirurgia II della Azienda ospedaliera-Universitaria di Pisa e fissati in

paraformaldeide al 4% più 4% di saccarosio in PBS overnight, sono state scongelate e

lasciate asciugare per 10-15 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati

successivamente lavati per due volte di 5 minuti ciascuna in PBS. Dopodichè le

sezioni sono state coperte con 300-500 µl di staining solution (per 1 ml: 200 µl

tampone acido citrico/sodio ph 5 o 6, 50 µl X-Gal 20mg/ml, 50 µl potassio

ferrocianuro, 50 µl potassio ferricianuro, 30 µl NaCl 5M, 2 µl MgCl2 1M, 618 µl

H

2

O) preparata al momento dell’utilizzo ed incubate over night a 37°C in camera

umida). Alcune sezioni sono state incubate in staining solution a pH5 (per la

rivelazione di tutte le beta galactosidasi), altre in staining solution a pH 6 per la

rivelazione della beta galactosidasi SA .Il giorno dopo i vetrini sono stati lavati in

PBS e montati con PBS/glicerolo/Hoechst.

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3.13 VALUTAZIONE DEGLI ORGANELLI VESCICOLARI ACIDI.

Come marcatore di autofagia abbiamo analizzato la colorazione con arancio di acridina che colora in verde fluorescente nucleo e citoplasma ed in arancione brillante i vacuoli con pH acido, particolarmente abbondanti in caso di autofagia. Sono state piastrate 20’000 cellule in piastre da 96 pozzetti. Il giorno successivo, le cellule sono state trattate con i farmaci alle concentrazioni selezionate e dopo 24 e 48 ore sono state incubate con del mezzo privo di siero, contenente arancio di acridina alla concentrazione di 1 µg/ml per 15 minuti a 37°C. L’arancio di acridina è stato rimosso e immagini sono state acquisite usando il microscopio fluorescente invertito.

3.14 MICROSCOPIA ELETTRONICA.

Cellule trattate e di controllo sono state staccate mediante tripsinizzazione e fissate in glutaraldeide al 2,5% in PBS per 2h a 4°C. i pellets sono stati poi lavati per 2 volte di 10 minuti ciascuna in PBS e post-fissati in tetrossido di osmio all’1% in PBS per 2h a temperatura ambiente. Dopo due lavaggi in PBS di 10 minuti ciascuno i campioni sono stati disidratati come segue:

30% ETOH in acqua per 10’

50% ETOH in acqua per 10’

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70% ETOH in acqua per 10’

90% ETOH in acqua per 10’

95% ETOH in acqua per 10’

100% ETOH per 10’

Ossido di propilene per 10’

Si è poi proceduto alla infiltrazione in resina epossidica (Araldite rossa 5g, Epon 812 12g, Ddsa 29g, DMP 1g) incubando i campioni in resina diluita 1:1 con ossido di propilene over night. In seguito i campioni sono stati incubati per 2 ore in resina diluita 2:1 in ossido di propilene. I campioni sono stati poi incubati in resina pura per 2 ore e poi trasferiti in nuova resina ed incubati per 72 ore a 60°C.

Fette ultrasottili sono state ottenute mediante l’utilizzo dell’ultramicrotomo (LKB) e

sono state disposte su retini di rame ricoperti con suppor films formvar carbon (Ted

pella), i retini sono stati poi contrastati mediante colorazione con acetato di uranile e

citrato di piombo. I preparati sono stati osservati al microscopio elettronico Jeolx100.