Vista l’alta concentrazione dei patogeni nei liquami, si può ipotizzare l’uso di questa piattaforma per valutare la qualità microbiologica dei reflui.

Discussione

L’alta concentrazione di virus e batteri enterici nei liquami urbani, la loro rimozione durante i trattamenti di depurazione e i potenziali rischi per la salute, legati alla contaminazione dell’ambiente e al riuso delle acque reflue depurate, sono argomenti di grande interesse in tema di sanità pubblica.

Ad oggi, le normative Italiane per il monitoraggio della qualità microbiologica degli reflui trattati si basano sulla ricerca di indicatori (E.coli, Enterococchi e Salmonella), mediante metodi colturali.

Questi organismi risultano inaffidabili in quanto sono più sensibili ai trattamenti rispetto ai patogeni di cui sono spia, inoltre non sono correlabili con la presenza di virus enterici. La mancanza di metodiche innovative, rapide e standardizzate per determinare la presenza di patogeni batterici e virali, in matrici ambientali quali i liquami, rende necessario lo studio di nuove strategie adatte a questo tipo di indagine. La qPCR è una metodica standardizzata per la ricerca dei patogeni in matrici ambientali (La Rosa et al., 2010; Donaldson et al., 2002) in quanto molto sensibile e specifica, ma non è indicata per la ricerca simultanea di più patogeni. Il microarray è una metodica molecolare alternativa in quanto specifica e permette la ricerca multi-specie di patogeni. Al momento questa tecnologia non trova impiego in campo ambientale, in quanto scarsamente sensibile. Diversi lavori (Call et al., 2003; Small et al., 2001; Wu et al., 2001) osservano che la bassa sensibilità del microarray limita il suo uso come strumento per il monitoraggio di organismi patogeni in matrici ambientali.

Vista l’alta concentrazione dei patogeni nei liquami, si può ipotizzare l’uso di questa piattaforma per valutare la qualità microbiologica dei reflui.

Un precedente lavoro, condotto su campioni di liquame artificialmente contaminati, ha evidenziato la necessità di aumentare la purificazione del campione per migliorare la resa della qPCR e contemporaneamente, aumentare la concentrazione del campione per ottimizzare la risposta della piattaforma microarray.

In una prima fase di questo lavoro si è messo a punto il protocollo di concentrazione di un campione di liquame artificialmente contaminato, mediante centrifuga e ultracentrifuga.

Nel precipitato ottenuto in seguito a centrifuga, per quanto riguarda Salmonella, si sono trovate 1,86x10

copie genomiche (recupero medio del 38%), mentre per Human Adenovirus e Enterovirus si sono trovate rispettivamente 6,5x10

(recupero medio dell’1%) e 0 copie genomiche.

Nel precipitato ottenuto utilizzando due fasi successive di ultracentrifuga, si sono recuperate rispettivamente: 2,1x10

(4%) nella prima e 1,4x10

(3%) copie genomiche di Salmonella nella seconda; 2,5x10

(50%) nella prima e 1,5x10

(3%) copie genomiche di Adenovirus nella seconda;

6,2x10

(60%) nella prima e 0 copie genomiche di Enterovirus nella seconda.

Da questi dati si evince che l’ultracentrifuga è efficiente nel concentrare i virus (ma non i batteri) già dalla prima fase, mentre la centrifuga è in grado di concentrare maggiormente i batteri ma non i virus.

Dopo la messa a punto della metodica di concentrazione su campioni artificialmente contaminati si è verificato l’effettivo incremento della concentrazione, mediante ultracentrifuga, del target virale in campioni ambientali. L’analisi dei dati ha evidenziato un incremento del titolo del campione ultracentrifugato (1,716±0,019 logCG/mL) e l’esistenza di una correlazione statisticamente significativa (R

=0,601; p=0,001) tra i titoli precedenti e successivi alla concentrazione.

Questi dati confermano quanto osservato da alcuni autori (La Rosa et al., 2010; Fumian et al., 2010) riguardo l’efficacia dell’ultracentrifuga nel concentrare i virus presenti in matrici complesse quali i liquami.

La metodica di concentrazione così messa a punto è stata applicata a 13 campioni di liquame

ultrafiltrato, provenienti da un depuratore urbano. I campioni sono stati quantificati mediante qPCR

e analizzati mediante piattaforma microarray. Andando ad analizzare i risultati nel dettaglio, per

quanto riguarda Adenovirus tutti i campioni sono risultati positivi alla qPCR con un titolo medio di

1,57x10

CG/mL. La concentrazione media di Adenovirus durante tutta la durata del monitoraggio non è risultata essere la più alta tra i target virali, in disaccordo con quanto osservato in altri lavori (Katayama et al., 2008; Pina et al., 1998; Irving et al., 1981).

Dal momento che HAdV è stato ritrovato con titoli elevati in tutti i campioni analizzati, si è deciso di indagare l’esistenza di una correlazione tra le copie genomiche e la relativa infettività (quantificata mediante titolazione di Spearman-Karber) di ciascun campione su cellule HeLa. Il virus è risultato infettivo (titolo infettivo medio 1,03±0,63 logTCID

/mL) in tutti i campioni ma non si è riscontrata una correlazione con le copie genomiche presenti (R

=0,014; p=0.70). Questo risultato può dipendere dal fatto che solo alcuni ceppi di HAdV (genotipo 2 e 5) sono in grado di infettare le cellule HeLa. L’analisi al microarray ha dato un riscontro positivo per 10 campioni, mentre 3 campioni (relativi al mese di agosto e novembre 2013, gennaio 2014) sono risultati negativi, nonostante i loro titoli siano dello stesso ordine di grandezza di altri campioni risultati positivi. La negatività di questi campioni potrebbe essere dovuta alla procedura di marcatura del campione utilizzata nel microarray.

L’analisi di Enterovirus mediante real time PCR ha evidenziato un andamento stagionale, caratterizzato dall’assenza del target nei mesi invernali dell’anno (dicembre 2013, gennaio e marzo 2014), in contrasto con quanto osservato da altri autori (Katayama et al., 2008; Irving et al., 1981;

Krikelis et al.; 1984), che hanno evidenziato una presenza costante durante tutto l’anno del target.

Il titolo virale medio (4,78x10

CG/mL) risulta essere maggiore rispetto a quello osservato in altri monitoraggi (Schvoerer et al., 2001; La Rosa et al.; 2010).

La piattaforma microarray ha dato esito positivo solo in alcuni campioni (giugno, luglio, settembre e ottobre 2013). I restanti campioni sono risultati negativi perché, oltre alle concentrazioni al di sotto della quantità minima rilevabile, è possibile siano intervenute problematiche relative alla marcatura del campione.

Norovirus GII è risultato negativo alla real time ad eccezione di un campione (novembre 2013), con una concentrazione di 3,56x10

CG/mL, inferiore a quanto rilevato da altri autori (Victoria et al., 2010; La Rosa et al., 2010). Non si è riscontrato alcun andamento stagionale, contrariamente a quanto osservato da Katayama e colleghi nel 2007. Tutti i campioni sono risultati negativi all’array, in quanto al di sotto della quantità minima rilevabile.

Rotavirus è risultato positivo alla qPCR solo in un campione (aprile 2014) con un titolo di 1,62x10

CG/mL, in accordo con le quantità medie rilevate nei liquami in entrata di un depuratore (Fumian et al., 2010); al microarray tutti i campioni sono risultati negativi, in quanto al di sotto del limite minimo rilevabile. Non è stato riscontrato alcun andamento stagionale, contrariamente a quanto osservato in uno studio condotto da He e colleghi (2011).

Hepatitis A Virus (HAV) è stato risultato positivo alla qPCR in 4 campioni (da giugno a settembre 2013), con un titolo medio di 3,06x10

CG/mL. Questo dato concorda con quanto osservato in un altro monitoraggio riguardante i reflui in entrata (Rodriguez-Manzano; 2010). In accordo con i risultati riportati in letteratura (Barrella et al., 2009) non è stata riscontrata una distribuzione stagionale. Al microarray i campioni sono risultati tutti negativi, in quanto al di sotto del limite minimo rilevabile.

Solo alcuni campioni sono risultati positivi alla real time PCR per E. Coli STX1 (con titolo medio di 6,15x10

CG/mL) ed E. Coli STX2 (con un titolo medio di 1,38 CG/mL). Questi risultati risultano inferiori a quanto osservato in letteratura (Shannon et al., 2007; La Rosa et al., 2010).

Nessun campione è risultato positivo all’analisi con microarray, in quanto al di sotto della quantità minima rilevabile.

Salmonella è risultata positiva alla qPCR in 11 campioni (da giugno 2013 ad aprile 2014), con un

titolo medio di 4x10

CG/mL, in accordo con quanto osservato in altro studio (Langeland et al.,

1982). Al microarray solo quattro campioni risultano negativi: due campioni (maggio e giugno 2014)

sono al di sotto della quantità minima rilevabile, mentre per i campioni agosto e novembre 2013, gennaio 2014 si è ipotizzata l’esistenza di un mismatch tra la sonda e il campione.

L’analisi dei campioni positivi ha permesso di stimare la quantità minima rilevabile dal microarray, pari a 10

CG/µL. Questo valore si riscontra quando le concentrazioni medie dei target, positivi alla real time pcr e al microarray, sono pari a: 1,87x10

CG/10L (HAdV); 2,33x10

CG/10L (Enterovirus);

2,38x10

CG/10L (Salmonella). In altri studi di monitoraggio dei liquami in entrata, le concentrazioni medie di HAdV, Enterovirus e Salmonella risultano essere rispettivamente di circa 1x10

CG/10L (Bofill-Mas et al., 2006), 1x10

CG/10L (Schvoerer et al., 2010) e 1x10

CG/10L (Langeland et al., 1982).

Le quantità medie di HAdV e Salmonella sono correlabili con quelle riscontrate nel lavoro di monitoraggio oggetto di questa tesi. Pertanto si può ipotizzare che il microarray possa essere utilizzato per monitorare la presenza di Adenovirus e Salmonella nei liquami, purché le concentrazioni dei target siano maggiori o uguali rispetto a quelle da noi riscontrate. Per quanto riguarda gli Enterovirus, la discordanza dei dati dovuta ad un titolo inferiore a quello da noi identificato, può essere attribuita a variabili legate alla stagionalità di questi virus e alla metodica utilizzata per concentrare il campione.

Conclusioni

Le difficoltà riscontrate nel monitorare la presenza dei virus a livello ambientale, hanno reso necessario lo studio di metodiche innovative ed efficaci.

L’utilizzo della piattaforma multidetection microarray permette la ricerca contemporanea di più target batterici e virali. Tuttavia il suo uso in ambito ambientale è limitato dalla sua scarsa sensibilità.

Per tanto è stato necessario aumentare la concentrazione del campione, mediante ultracentrifuga, al fine di ottimizzare la risposta della piattaforma array per identificare i virus.

Questo ci ha permesso di stabilire la quantità minima rilevabile, pari a 10

CG/µL. I risultati ottenuti dall’analisi dei campioni del monitoraggio ambientale, al microarray, hanno evidenziato una buona risposta della piattaforma nell’identificare il target virale (Human Adenovirus) e batterico (Salmonella). Sono stati osservati vari campioni negativi per i target HAdV ed Enterovirus, nonostante avessero concentrazioni superiori alla quantità minima rilevabile. Questo fenomeno può essere dovuto all’esistenza di problematiche relative sia alla variabilità biologica dei target che ad interferenze legate alla natura e al trattamento del campione.

I target HAdv e Salmonella, per cui si è evidenziato un segnale positivo dal micoarray, hanno titoli

correlabili con i valori medi riportati in letteratura. Di conseguenza si ipotizza che il microarray possa

essere utilizzato per valutare la presenza dei target HAdV e Salmonella nei liquami.