1. Introduzione
I carboidrati rappresentano una delle classi di composti organici naturali maggiormente diffusa in natura. Fino a 20 anni fa erano considerati molecole aventi solo funzione di tipo strutturale e di riserva energetica per la cellula e, non essendo stati evidenziati coinvolgimenti nei processi biologici, veniva loro attribuito uno scarso rilievo all’interno della complessa architettura fisiologica umana. Le successive ricerche volte alla comprensione dell’attività biologica espletata dalle strutture macromolecolari umane (glicoproteine, glicolipidi, etc.) hanno dimostrato un ruolo fondamentale dei residui glicidici in numerosi processi biologici, tanto che oggi ad essi vengono attribuite caratteristiche bio-informative. I carboidrati sono considerati, quindi, macromolecole in grado di dare una quantità estremamente elevata d’informazioni, dato che l’innumerevole varietà delle unità monosaccaridiche costituenti strutture più complesse permette loro di espletare un linguaggio (glicocodice) estremamente eloquente. I decifratori di questo linguaggio generalmente sono proteine leganti gli zuccheri chiamate lectine, caratterizzate da un’elevata specificità (le galectine, ad esempio, sono in grado di riconoscere in modo specifico unità β- D -galattosidiche) e per questo coinvolte in numerosi processi che regolano l’omeostasi cellulare, le interazioni cellula- cellula e cellula-matrice, ed il differenziamento cellulare. I carboidrati sono generalmente responsabili di numerosi processi biologi, che vanno dal riconoscimento ed adesione tra cellule fino alla difesa immunitaria e la replicazione virale. Per questo motivo sono strettamene correlati con lo sviluppo di numerose patologie, tra cui i processi infiammatori quali l’osteoartrite e l’artrite reumatoide, le infezioni virali e batteriche ed i tumori. Tra i monosaccaridi costituenti le macromolecole biologiche si possono citare gli “amminozuccheri”, nei quali uno o più gruppi ossidrilici attaccati allo scheletro carbonioso è sostituito da un gruppo amminico libero o anche variamente sostituito (ad esempio acetilato). In particolare, con il termine esosammine si indicano tutti gli amminozuccheri dove il gruppo ossidrilico (OH) in posizione 2 è sostituito con un gruppo amminico (NH
2), mentre le corrispondenti acetilammidi sono indicate con il termine N-acetil-esosammine.
Il primo amminozucchero fu scoperto nel 1876 da Ledderhose, che isolò 1a (più
tardi chiamato glucosammina) (Figura 1) dall’idrolizzato acido di un guscio di aragosta;
tuttavia, l’interesse verso questa classe di zuccheri crebbe solo agli inizi degli anni ’50, in parte come conseguenza della scoperta, nel 1946, che il 2-desossi-2-(metilammino)-
L -glucopiranosio è un componente fondamentale dell’antibiotico streptomicina.
Le N-acetil-esosammine più importanti e diffuse in natura, ottenibili dall’idrolisi acida di macromolecole di origine naturale come le glicoproteine, sono la N-acetil- D - glucosammina (GlcNAc, 1b), la N-acetil- D -galattosammina (GalNAc, 2b) e la N-acetil-
D -mannosammina (ManNAc, 3b), che si trovano in natura, libere o coniugate, sia negli organismi animali superiori (nei tessuti e nei fluidi) sia in alcuni batteri.
Figura 1
OH OH
NH-X O O H
OH
OH O
H
NH-X O O H
OH
OH O
H
NH-X O O H
OH
1a: X=H 1b: X=Ac (GlcNAc)
2a: X=H 2b: X=Ac (GalNAc)
3a: X=H
3b: X=Ac (ManNAc)
Ad esempio, l’unità β- D -ManNAc è un componente dello spaziatore naturale che lega gli acidi teichioici alle catene peptidoglicaniche di alcuni batteri Gram-positivi, ed è anche molto diffusa nei polisaccaridi capsulari di batteri Gram-negativi come Neisseria Meningitidis e Streptococcus Pneumoniae.
1.1. Interesse biologico di D -glucosammina e N-acetil- D -glucosammina
Il 2-ammino-2-desossi- D -glucosio ( D -glucosammina, 1a) è uno dei monosaccaridi più abbondanti in natura. Si trova come costituente principale nei gusci duri dei crostacei e di altri artropodi, in molti funghi, ed è molto diffuso anche negli animali superiori (per esempio, come costituente di numerosi glicosamminoglicani e glicosamminoglicuronani). La D -glucosammina (1a) è un saccaride estremamente importante, tanto che non c’è da stupirsi che quasi la metà della letteratura sugli amminozuccheri ha come oggetto l’ammina 1a ed i suoi derivati,
1tra i quali il più abbondante in natura è sicuramente l’N-acetil- D -glucosammina (GlcNAc, 1b, Figura 1), presente in molte strutture macromolecolari saccaridiche biologicamente importanti.
2La GlcNAc è incorporata in una serie di polisaccaridi strutturali, tra i quali la chitina 4 (Figura 2) è sicuramente il più abbondante. Questo saccaride si trova nell’esoscheletro di invertebrati come insetti, artropodi, nematodi, Plasmodium falciparum e come
costituente delle pareti cellulari di numerosi funghi. Gli enzimi chitinasi, enzimi idrolitici responsabili della demolizione totale della chitina (4) in D -glucosammina (1b), si trovano in organismi come batteri, funghi, piante e vertebrati, ma sono assenti negli esseri umani.
Figura 2
O
O O H
NHAc O HO
O NHAc O
H
O O H
NHAc OH
OH
OH OH
n
4
L’assenza di questi enzimi nell’uomo fa sì che gli inibitori delle chitinasi siano degli ottimi target per lo sviluppo di insetticidi e farmaci contro patogeni umani come la Candida albicans o il P. falciparum, il parassita responsabile della malaria nell’uomo.
Gli inibitori delle chitinasi, sia naturali che sintetici, sono rari e quindi un’importante area di ricerca si basa sulla preparazione di strutture a potenziale attività inibitoria contenenti l’unità GlcNAc.
2Il derivato 3-O-( D -1-carbossietil), anche conosciuto come acido muramico (5, Figura 3) così come il corrispondente N-acetil derivato (X = Ac), è ampiamente distribuito nelle pareti cellulari batteriche.
1La mureina, ad esempio, è un polisaccaride costituito dalla ripetizione di unità di GlcNAc ed acido muramico.
Figura 3
OH O
H
NH-X O RO
OH
5: R = (R)-CHMeCO2H; X = H
All’interno della parete cellulare batterica, le catene polisaccaridiche formano dei cross-link attraverso le catene peptidiche, costruendo così un’impalcatura peptidoglicanica grazie all’azione dell’enzima transpeptidasi. Sarebbe, quindi, utile poter disporre di frammenti semi-sintetici di mureina da usare negli studi di valutazione dell’attività biologica di questo enzima.
2L’acido ialuronico (HA, 6, Figura 4), un glicosamminoglicano che rappresenta il
principale elemento strutturale della matrice extracellulare, è responsabile delle
proprietà visco-elastiche delle cartilagini e dei fluidi sinoviali.
Figura 4
O O H
O O
NHAc O
O O H
OH O
H O O NHAc
OH
COO OH
6 -
Questo polisaccaride lineare è coinvolto anche nelle interazioni fra proteine, influenzando processi naturali quali l’angiogenesi, la mobilità e l’adesione cellulare, l’insorgenza di tumori, nonché il processo di guarigione delle ferite. Alcuni batteri patogeni posseggono l’acido ialuronico (6) nella matrice extracellulare come rivestimento difensivo nei confronti della risposta immunitaria dell’ospite. Nucleotidi e fosfati sintetici del tipo GlcNAc- β-(1-4)-GlcUA sono stati usati come probe per studiare il meccanismo d’azione dell’enzima “acido ialuronico sintasi” (HAS), con lo scopo di chiarire alcune delle malattie legate a disordini dell’acido ialuronico.
1.1.1. Stimolatori del segnale di trasduzione nelle piante
I fattori Nod (NF, 7, Figura 5) sono molecole segnale, contenenti unità ripetitive di GlcNAc, secrete dai batteri del genere Rhizobium che, dopo essersi stabiliti all’interno dei noduli radicali delle Leguminosae, iniziano a fissare l’azoto.
Figura 5
OH O
O O H
NHAc O HO
O NHAc O
H O
O H
NH OCOCH3
O
(CH2)5 H H
C6H13 OH
OSO3H
n
7
Subito dopo la fissazione dell’azoto nei noduli, i fattori Nod vengono escreti e stimolano, in qualità di molecole segnale, gli sviluppi morfologici dei peli radicali e dei meristemi nella corteccia della radice della pianta ospite, nonché l’organogenesi del nodulo stesso.
1.1.2. Recettori batterici
La GlcNAc (1b) è un costituente di quei carboidrati, presenti sulla superficie
cellulare, che sono coinvolti, come recettori, nell’adesione dei batteri e delle loro tossine
alle cellule dell’ospite. Per esempio, l’epitopo GlcNAc-β-(1-4)-GlcNAc presente nelle glicoproteine di superficie delle cellule microvascolari endoteliali (BMEC) è un ligando per la proteina A (OmpA) della membrana esterna di E. coli K1. Questo fenomeno di riconoscimento media il passaggio di E. coli attraverso la barriera ematoencefalica causando, ad esempio, meningiti durante il periodo neonatale. Due chitooligomeri sintetici (8, Figura 6) sono stati studiati come inibitori competitivi solubili per questo riconoscimento, e potrebbero rappresentare la molecola leader per la sintesi di agenti antibatterici basati su strutture saccaridiche contenenti GlcNAc.
Figura 6
OH O
O O H
NHAc OHO
O NHAc O
H O
O H
NHAc OH
OH
OH
n
n = 0-1 8
1.1.3. Glicoproteine ormonali ed enzimatiche
E’ noto che le glicoproteine contenenti il residuo GlcNAc hanno importanti attività enzimatiche. Ad esempio, la bromelina (9, Figura 7) è un enzima glicoproteico presente nel regno vegetale.
Figura 7
O
O O H
NHAc OHO
O OH NHAc
O H
O O H
OH
OH
OH
(1 4')-L-Asn
9
Anche nelle glicoproteine ormonali, quali l’ormone follicolo-stimolante (FSH),
l’ormone luteinizzante (LH), la gonadotropina umana della menopausa (hMP), la
gonadotropina del siero di giumenta gravida, l’ormone stimolante la tiroide (TSH) e la
gonadotropina corionica umana (hCG, 10, Figura 8),
2la porzione polisaccaridica
presenta alcune unità di GlcNAc.
Figura 8
O
H O
O H
NHAc O
O OH
O OH OH
O OH
AcHN O
OH
O
H O
O H
O OH O
H O
O H
O O
H O
O H
OH O O
H O
O H
NHAc O
OH O O H
OH AcHN O
O H
O O
H OH
OH COOH
OH
(1 4')-L-Asn 10
1.2. Interesse biologico di D -lattosammina e N-acetil- D -lattosammina
La N-acetil- D -lattosammina (11, Figura 9) è un disaccaride, composto da un’unità di
D -galattopiranosio ed un’unità di N-acetil-2-desossi- D -glucopiranosio, che spesso appare come elemento strutturale in glicoconiugati d’interesse biologico.
3Figura 9
O OH
O O H
OH OH
O O H
NHAc OH
OH 11
E’ conosciuta anche con molti altri termini, quali: LacNAc, 2-acetammido-2- desossi-4-O- β- D -galattopiranosil- D -glucopiranosio, β- D -Gal-(1 →4)- D -GlcNAc, N- acetil-1,4-O- (β- D -galattopiranosil)- D -glucosammina e β- D -galattosil-1,4-N-acetil- D - glucosammina.
1.2.1. Riconoscimento degli anticorpi
Le IgG sono gli anticorpi più abbondanti nel siero umano e riconoscono i residui
terminali Gal- α-(1-3)-Gal, noti come epitopi (α-Gal), degli xenotrapianti, mediando
quindi un rigetto estremamente acuto nei confronti dello xenotrapianto stesso. Sulla
superficie cellulare sono presenti tre strutture saccaridiche che possiedono questo
antigene, e due di loro (12 e 13, Figura 10) presentano la struttura disaccaridica β- D - Gal-(1 →4)- D -GlcNAc al centro dell’oligosaccaride.
Figura 10
OHO Oceramide O
NHAc OH
O O
OH OH
O O H
OH OH
OH
OH
OHO Oceramide O
OH OH
O O OHO OH
O NHAc OH
O O
OH OH
O O H
OH OH
OH
OH
OH
OH 12
13
Gli antigeni saccaridici 14, 15 e 16 (Figura 11) dei gruppi sanguigni umani sono glicoproteine, contenenti la funzionalità LacNAc, presenti sulla superficie delle cellule rosse del sangue (eritrociti).
Figura 11
OHO O OH OH
O O
OH O
O O H
NHAc OH
O H
O O OH
OH O O
OH
OH
OH
OH OH
O
O H HO
O N
OHO O OH OH
O O
OH O
O O H
NHAc O
H O O OH
OH O O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH O O
H
O OH
O OHO
O OH OH
O O
OH O
O O H O NHAc O OH
OH O O
OH
OH
OH
OH OH
OH
14 H
15 H
AcH
16 H
H
Questi dominanti antigenici sono caratteristici per gli individui e possono
riconoscere gli anticorpi specifici degli individui che hanno gruppi sanguigni diversi.
21.2.2. Lectine
La N-acetil- D -lattosammina (11) ed i suoi derivati sono ampiamente usati nella caratterizzazione e nella investigazione dei ruoli e dell’utilità delle lectine, proteine che legano i carboidrati con alta specificità e sono in genere implicate nei processi biologici di riconoscimento che coinvolgono cellule e proteine provenienti da diverse fonti. Per esempio, le lectine provenienti da Arisaema intermedium, A. wallichianum, A. flavum e A. helleborifolium sono specifiche nei confronti della N-acetil- D -lattosammina.
4Nel caso della lectina di A. helleborifolium (AHL) è stato dimostrato che questa ha in vitro un effetto anti-proliferativo su diverse linee di cellule tumorali, probabilmente a causa della sua capacità di riconoscere carboidrati contenenti la N-acetil- D -lattosammina presenti su tali linee cellulari. Nello stesso studio, inoltre, è stato dimostrato che la lectina AHL possiede anche una buona attività insetticida.
4a1.2.3. Metastasi
Le cellule tumorali maligne esprimono frequentemente glicolipidi di membrana conosciuti complessivamente come antigeni associati al tumore o semplicemente marcatori tumorali. Questi antigeni giocano un ruolo importante nella diagnosi della malignità del tumore attraverso la rilevazione immunitaria con i loro anticorpi specifici.
2Ne è un esempio il Sialyl-Lewis X (17, Figura 12), conosciuto anche come Sialyl Le
Xo SLe
X, un epitopo che si trova sulla parte terminale dei glicolipidi presenti sulla superficie dei leucociti, come i neutrofili, e contenente nella sua struttura tetrasaccaridica l’unità LacNAc.
4cQuesto epitopo funziona come ligando per quelle proteine di membrana dell’ospite conosciute con il nome di selectine. Si pensa che l’adesione di questo epitopo con le selectine giochi ruoli significativi nella nascita di metastasi nel sangue.
2Figura 12
OH O
OH O
O O O
O
NHAc OH
O O OH AcHN
O H
O O
H OH
OH COOH OH
OH
H
17
Il Sialyl Lewis
Xgioca un ruolo importante anche nei processi infiammatori, mediando l’adesione dei leucociti ai siti della lesione attraverso il riconoscimento della E-selectina, una molecola di adesione presente sulle cellule endoteliali dell’ospite.
4a1.2.4. Oligosaccaridi del latte umano
Il latte umano è caratterizzato da oligosaccaridi solubili, conosciuti collettivamente come HMO (Human Milk Oligosaccharides), e non presenti nel latte di altri mammiferi.
Dal punto di vista biochimico, gli HMO umani vengono sintetizzati nella ghiandola mammaria da enzimi specifici, le glicosil-transferasi, mediante l'aggiunta sequenziale alla molecola base del lattosio (18, Figura 13) di unità monosaccaridiche (galattosio, fucosio, N-acetil- D -glucosammina, acido sialico), con formazione di molecole a struttura lineare o ramificata. Questi oligosaccaridi liberi, di cui 18a ne è un esempio, sono quindi costituiti principalmente da un’unita riducente di lattosio attaccata alla N- acetil- D -lattosammina (11, Figura 9) e/o alla isolattosammina ( β- D -Gal-(1 →3)- D - GlcNAc). Questi saccaridi sono frequentemente L -fucosilati e sialilati attraverso legami α-glicosidici, e le strutture che ne derivano costituiscono i cosiddetti oligosaccaridi acidi del latte umano.
Figura 13
O OH
O O H
OH OH
O O H
OH OH
OH
O O H
OH OH
OH
OH O
OH O
O O O
O
NHAc OH
O H
O OH
OH
OH
O OH
O
OH OH
18 H 18a
Gli HMO esistono in concentrazioni fino a 5-10 g/l e rappresentano così il terzo più
grande componente, dopo proteine e lipidi, all’interno del latte umano. Il loro contributo
alla salute dei bambini allattati al seno nei confronti di bambini nutriti artificialmente è
stato riconosciuto addirittura nel 1892. Sono oligosaccaridi strutturalmente molto
diversi, di cui fino ad ora ne sono stati identificati più di 130 tipi; sono resistenti agli
enzimi idrolitici del tratto gastrointestinale e possono quindi raggiungere l’intestino
crasso ed attraversare il torrente sanguigno, dove agiscono come probiotici e ligandi
competitivi nei confronti di microorganismi patogeni, inibendo così la loro adesione alle
cellule epiteliali. Possiedono, quindi, importanti ruoli di difesa, sono associati alla
diminuzione delle infezioni gastrointestinali, respiratorie e dell’orecchio, e riducono anche la morte post neonatale nei bambini che vengono allattati al seno. Dall’altra parte, agiscono come fonte di acido sialico e di D -galattosio, che sono essenziali per lo sviluppo del cervello e delle abilità linguistiche. Allo stesso tempo, gli oligosaccaridi sialilati del latte umano possiedono epitopi di legame per le selectine, perciò compromettono o favoriscono la loro interazione con i ligandi cellulari modulando così la migrazione dei leucociti dal torrente sanguigno nelle regioni dell’infiammazione. In questo modo funzionano come elementi anti-infiammatori, riducendo così il pericolo di malattie infiammatorie come le enterocoliti necrotizzanti. Inoltre, questi saccaridi modulano anche la formazione del complesso piastrine-neutrofili (PNC) implicato nella risposta immunitaria. La lista dei ruoli difensivi degli HMO sta crescendo e questo spiega i numerosi studi volti sia alla sintesi degli oligosaccaridi del latte, difficilmente separabili da fonti naturali, sia alla valutazione delle loro attività biologiche con lo scopo di preparare nuovi farmaci e vaccini.
21.3. Interesse biologico di D -galattosammina e N-acetil- D - galattosammina
Il 2-ammino-2-desossi- D -galattosio ( D -galattosammina, 2a, Figura 1) rappresenta il secondo amminozucchero trovato in natura. Fu isolato per la prima volta nel 1914, ad opera di Levene e LaForge,
1da preparazioni di condroitin solfato, ed è un costituente fondamentale dell’antibiotico racemomycin e di numerosi polisaccaridi batterici.
1La D -galattosammina (2a) è il costituente di composti naturali altamente
specializzati, in cui è presente come N-acetil derivato (GalNAc, 2b, Figura 1), più
correttamente indicato come 2-acetammido-2-desossi- D -galattopiranosio. In natura, la
N-acetil- D -galattosammina (2b) è stata identificata come uno dei saccaridi base di molte
strutture complesse,
5tra le quali possiamo menzionare le glicoproteine di tipo mucinico,
gli oligosaccaridi determinanti la specificità di alcuni gruppi sanguigni umani, i
gangliosidi ed i glicosamminoglicani (GAG), un tipo di polisaccaridi che rappresenta la
componente glucidica dei proteoglicani. La presenza di strutture complesse contenenti
GalNAc è stata, inoltre, dimostrata negli eritrociti, sulle membrane cellulari, nelle
secrezioni come la saliva ed il succo gastrico e in formazioni patologiche quali le cisti
ovariche.
1.3. Mucine
Le mucine sono glicoproteine
5,6costituite da un residuo di Ser/Thr legato con legame α-O-glicosidico ad un residuo di GalNAc, dove l’enzima responsabile della creazione del legame tra la porzione glucidica e quella proteica è l’UDP-GalNAc transferasi. Le mucine sono prodotte principalmente dalle cellule epiteliali specializzate nella produzione di muco e la principale distribuzione delle cellule secernenti mucine si ha a livello delle ghiandole e dei dotti mammari o salivari, dove la cellula produttrice si trova a livello apicale nel lume del dotto epiteliale. Nell’uomo esistono dodici tipi di mucine aventi come elemento strutturale unificante un “core” di α-GalNAc-1-O- Ser(Thr) e differenziate tra loro a livello della sequenza amminoacidica nella porzione proteica ma, principalmente, caratterizzate da differenti tipi di glicosilazione delle posizioni 3 e/o 6 dell’unità di GalNAc, che portano alla formazione delle otto più comuni strutture di “core” (1-8, Figura 14).
Figura 14
O OH
O R3O
NHAc OR6
CH3(H)
NH O
R 3
R 6
R3, R 6 Core 1: Gal β (1,3)
Core 3: GlcNAc β (1,3) Core 5: GalNAc α (1,3) Core 8: Gal α (1-3)
Core 6: GlcNAc β (1,6) Core 7: GalNAc α (1,6)
Core 2: GlcNAc β (1,6) Gal β (1,3) Core 4: GlcNAc β (1,3) GlcNAc β (1-6)
In molti casi queste strutture di base sono modificate dalla solfatazione sull’unità di GalNAc o dall’ulteriore presenza di unità di acido sialico (NeuAc), di L -fucosio (Fuc), e/o dalla ripetizione di unità di D -galattosio (Gal) e N-acetil- D -glucosammina (GlcNAc) concatenate in unità di D -lattosammina (LacNAc). In questi casi non si parlerà di mucine classiche ma di glicoproteine simili alle mucine (glycoprotein mucine-like).
In base alla dislocazione, questo tipo di glicoproteine possono essere divise in due
gruppi principali:
1. mucine di membrana, che esibiscono sequenze idrofobiche che permettono il legame con il doppio strato lipidico e presentano la porzione C-terminale della catena amminoacidica a livello del cytosol;
2. mucine secretorie, che presentano catene amminoacidiche ricche di Cys, fondamentale per l’oligomerizzazione dei monomeri di mucina e per l’impaccamento di sostanze nelle vescicole secretorie.
Le mucine, essendo importanti elementi di riconoscimento nell’interazione tra cellule, svolgono molte funzioni biologiche:
• trasportano molti degli antigeni dei gruppi sanguigni;
• legano le L- e P-selectine durante i processi infiammatori;
• sono usate come target primari nelle diagnosi dei tumori;
• lubrificano le superfici epiteliali e impacchettano le sostanze nelle vescicole secretorie.
1.3.2. Determinanti dei gruppi sanguigni umani
La N-acetil- D -galattosammina (GalNAc, 2b, Figura 1) è l’unità monosaccaridica immunodeterminante del gruppo sanguigno di tipo A.
5Un residuo di GalNAc, in forma α-piranosidica, è posto all’estremità non riducente delle catene oligosaccaridiche delle glicoproteine delle membrane eritrocitarie, escrete anche nei fluidi biologici. La sua presenza determina la specificità del gruppo stesso che, nel gruppo A, varia in base al legame del galattosio sub-terminale con la successiva unità di N-acetil- D -glucosammina (GlcNAc, 1b, Figura 1). Il gruppo A può, quindi, essere di “Tipo 1”, quando il legame è di natura β-1 →3, o di “Tipo 2”, quando il legame è di natura β-1→4 (Figura 15).
Figura 15
Gruppo A"Tipo 2"
GalNAc-α-(1 3)-Gal-β-(1 3)-GlcNAc 2
L-Fuc-α-1
GalNAc-α-(1 3)-Gal-β-(1 4)-GlcNAc 2
L-Fuc-α-1 Gruppo A "Tipo 1"
Un’unità di GalNAc (2b) si trova anche negli antigeni M e N, presenti
esclusivamente sulle membrane eritrocitarie e non nel siero o nelle secrezioni. Questi
determinanti sono costituiti dal pentapeptide iniziale della glicoforina A, dove il primo
amminoacido della catena è responsabile della specificità M o N e ogni residuo di Ser o
Thr è legato con un legame α-O-glicosidico ad un residuo tetrasaccaridico (Figura 16)
costituito da un’unità di GalNAc legata in 6 ad un residuo di acido neuraminico (o acido sialico, NeuAc) ed in 3 al disaccaride α-NeuAc-(2 →3)-β-Gal.
Figura 16
M
N
Ser - Ser - Thr - Thr - Gly -
Leu - Ser - Thr - Thr - Glu -
A A A
A A A
A =
α - NeuAc 2
3 β - Gal
1
3 α - GalNAc
1 6
α - NeuAc 2
1.3.3. Antigene T
La GalNAc (2b) è l’unità monosaccaridica costituente il disaccaride Gal- β-(1→3)- GalNAc, che viene anche detto antigene T (Figura 15), presente solamente nelle glicoproteine delle cellule tumorali del colon, dello stomaco e del seno. Il disaccaride T e le glicoproteine di cui esso è costituente sono stati oggetto di intensi studi per cercare di elucidare tutte le possibili correlazioni dell’antigene con il cancro.
Tale disaccaride è, inoltre, un costituente essenziale delle glicoproteine “anti-freeze”
presenti nel siero dei pesci antartici, dove l’unità saccaridica è legata ad una struttura ripetitiva del tripeptide Ala-Ala-Thr (Figura 17).
Figura 17
O CH3
OH O HN N
H NH
H
CH3
CH3 O
O
n O
O
O
NHAc O H
O H
OH
OH OH
OH
E’ da sottolineare come, in queste specifiche glicoproteine, l’unità di GalNAc sia
legata alla porzione peptidica con un legame di tipo β-piranosidico, a differenza di tutte
1.3.4. Condroitina ed analoghi mucopolisaccaridici
La condroitina è il più abbondante mucopolisaccaride dell’organismo,
5presente principalmente nei tessuti molli e nel tessuto scheletrico isolato dalla cartilagine. Le catene polisaccaridiche della condroitina sono costituite dalla ripetizione di 30-50 unità di base del disaccaride 19 (Figura 18), formato da un residuo di acido glucuronico legato con legam e α-(1→3) ad un residuo di β-GalNAc, ed ogni catena è poi legata covalentemente ad un “core” proteico. In realtà le unità ripetitive presentano un notevole livello di eterogenicità dovuto alla presenza, su un certo numero di esse, di residui di GalNAc solfatati in 4 o in 6, rispettivamente strutture 20 e 21 (Figura 18), per cui più propriamente si parla di condroitina solfato.
La funzione principale della condroitina solfato è quella di:
• supporto di fibre o cellule nei tessuti;
• lubrificante;
• mantenimento dell’equilibrio idro-salino dell’organismo grazie all’intrappolamento di cationi ad opera dei gruppi anionici.
Figura 18
O O O
NHAc OR1 OR O
O OH OH COOH
n
19: R=R1=H 20: R=SO3-, R1=H 21: R=H, R1=SO3-
Un altro importante mucopolisaccaride di cui è costituente GalNAc (2b) è il dermatan solfato, la cui struttura è del tutto analoga a quella della condroitina solfato, ad eccezione della presenza, al posto del residuo di acido D -glucuronico, del suo epimero al C-5, cioè l’acido L -iduronico.
1.3.5. N-acetil-esosammine come agonisti delle cellule “Natural Killer”
Le cellule “Natural Killer” (NK) sono un comparto del sistema immunitario
innato, e sovrintendono all’eliminazione di agenti che esse stesse sono in grado di
riconoscere come estranei all’organismo (non-self) mediante recettori antigenici di
membrana. Sono state oggetto di un interesse scientifico crescente per la possibilità di
essere impiegate nella terapia antitumorale non farmacologica, una volta identificate le
sostanze in grado di attivarle efficientemente. Studi effettuati sui ratti hanno evidenziato che tra i ligandi capaci di attivare le NK attraverso interazione specifica con il recettore proteico NKR-P1, un ruolo importante è ricoperto dalle N-acetil-esosammine TalNAc, GlcNAc, GalNAc e ManNAc.
7In particolare, la GalNAc (2b) come tale, come β-p- nitrofenil glicoside (22, Figura 19) o come costituente di disaccaridi con altre N-acetil- esosammine, tipo β-GalNAc-(1 →4)-GlcNAc (23, Figura 19) o β-GalNAc-(1→4)- ManNAc (24, Figura 19), costituisce attualmente uno dei più promettenti agonisti delle cellule NK.
Figura 19
OPh-pNO2 O
OH
NHAc OH
O H
O OH OH
O H
NHAc
O OH
O O
H
OH
NHAc O
OH OH
O H
NHAc
O OH
O O
H
OH NHAc
22 23 24
Anche i disaccaridi a struttura β-TalNAc-(1 →4)-Glc (25, Figura 20) e β-ManNAc- (1 →4)-Glc (26, Figura 20), preparati nel nostro Laboratorio, evidenziano un’elevata attività agonista (inferiore di un ordine di grandezza rispetto al più attivo 24) per i recettori NKR-P1 e CD69 delle cellule NK, rispettivamente di ratto e umane.
8E’ da sottolineare che il disaccaride 26 presenta un’attività agonista paragonabile alla ManNAc, utilizzata come riferimento nei test biologici condotti dal Prof. Křen di Praga, e costituisce il primo esempio di disaccaride in cui l’unità N-acetil-esosamminica più attiva (ManNAc) si trova in posizione non riducente legata, attraverso un legame β- (1 →4)-glicosidico, ad un’unità D -glucopiranosica.
Figura 20
O OH OH
O H
NHAc
O OH
O O
H
OH
OH O
O H
OH
O H
NHAc
O OH
O O
H
OH OH
25 26
Gli imminozuccheri come la nojirimicina (NJ, 27, Figura 21) possono essere
considerati, da un punto di vista puramente strutturale, una particolare tipologia di
esosammine, in cui il gruppo amminico è in posizione 5 anziché 2, come nella quasi
totalità delle esosammine naturali. La diversa posizione del gruppo amminico è, quindi,
determinando così la struttura azapiranosica. Sia la NJ (27) che la 1-desossinojiromicina (DNJ, 28, Figura 21) sono strutturalmente correlate al D -glucosio, dato che l’ossigeno piranosico è sostituito qui con un atomo di azoto.
Figura 21
CHO OH HO
OH NH2 CH2OH
O H HO
NH OH
OH
OH
O H
HN O H
OH OH
28 27
Questi azazuccheri sono molto diffusi in natura e sono stati oggetto, negli ultimi 20 anni, di un particolare interesse per le proprietà biologiche manifestate.
9Molti di loro, infatti, si sono mostrati potenti inibitori di glicosidasi e glicosiltransferasi, evidenziando importanti proprietà antitumorali, antibatteriche, antivirali e potenziale attività terapeutica nel trattamento specifico dell’HIV, dell’epatite C e dei disordini metabolici come l’obesità e il diabete. La DNJ è il rappresentante più studiato degli imminozuccheri e, nonostante i numerosi studi volti ad evidenziare la sua attività biologica, solo recentemente,
1010
nell’ambito di uno studio svolto nel nostro Laboratorio in collaborazione con il Prof. Křen, è stata evidenziata la sua capacità di interagire con il sistema immunitario attraverso un’azione agonista sui recettori NKR-P1 (ratto) e CD69 (umano) delle cellule NK. In particolare, è stata valutata l’attività come agonista per le cellule NK della DNJ (28) e dei corrispondenti disaccaridi a struttura β-TalNAc-(1 →4)- DNJ (29, Figura 22) e β-ManNAc-(1 →4)-DNJ (30, Figura 22), mimici di 25 e 26 dove l’unità D -glucopiranosica è sostituita da un’unità di DNJ.
Figura 22
OHO NH OH OH NHAc
O O H
OH
OH
OHO NH OH O
H
NHAc O O H
OH
29 OH
β-TalNAc-(1>4)-DNJ 30
β-ManNAc-(1>4)-DNJ
Nei test biologici, condotti dal gruppo del Prof. Křen, sono stati usati le singole N-
acetil-esosammine (TalNAc, ManNAc), la DNJ e, come standard di controllo, la
GlcNAc, che rappresenta l’N-acetil-esosammina più attiva nei confronti del recettore
CD69. Inaspettatamente, nel caso del recettore NKR-P1 la DNJ ha dato risultati
(-logIC
50= 5.0) comparabili a quelli della GlcNAc (-logIC
50= 5.6), mentre per i
disaccaridi 29 (-logIC
50= 5.5) e 30 (-logIC
50= 6.5) l’unione delle due unità ha solo un effetto additivo e non moltiplicativo. Una diversa situazione è stata trovata per l’affinità con il recettore CD69 umano del mimico 30 (-logIC
50= 4.5), dove il legame dell’unità ManNAc (-logIC
50= 0) con la DNJ (-logIC
50= 3.2) aumenta l’affinità di legame per il recettore di più di un ordine di grandezza.
1.4. Approcci sintetici a derivati N-acetil- D -esosamminici a partire da glicali
I glicali sono degli utilissimi glicosil donatori, spesso utilizzati come versatili materiali di partenza nella sintesi di C(2)-amminoglicosidi in quanto consentono la N- funzionalizzazione sul C(2) e la contemporanea formazione del legame glicosidico (Schema 1). Sono stati sviluppati molti metodi che utilizzano i glicali per l’inserimento di un atomo di azoto sul C(2), attraverso l’introduzione sia di precursori ossidati di ammine, quali azidi, idrazine, triazine, gruppi nitro, sia di ammine protette come ammidi, carbammati, solfonammidi e fosforammidi.
Schema 1
R' O
PO R OP
R' O OR
PO
NHAc R OP
R = OH; R' = H R = H; R' = OH R = H; R' = O-β-Gal
I principali metodi riportati in letteratura
11per trasformare glicali di carboidrati comuni, come glucosio e galattosio, nelle corrispondenti N-acetil- D -esosammine (Schema 1) sono:
1. azidonitrazione;
2. cicloaddizione;
3. fosforammidoglicosilazione;
4. sulfonammidoglicosilazione;
5. ammidazione metallo-mediata;
6. acetammidoglicosilazione.
1.4.1. Reazioni di azidonitrazione
L’azidonitrazione dei glicali è stata studiata nel 1979 da Lemieux
11e viene condotta, ad esempio, a partire dal tri-O-acetil- D -galattale (31) a bassa temperatura (-20°C) ed in presenza di un eccesso di cesio-ammonio nitrato (CAN) e sodio azide in CH
3CN anidro.
L’attacco iniziale sul doppio legame viene condotto da un radicale azidico, ottenuto per ossidazione di uno ione azide con Ce(IV) secondo la reazione seguente:
Ce(IV) + N
3- Ce(III) + N
3.
La presenza del gruppo azidico in C-2 in tutti i prodotti di reazione è spiegato dall’attacco del radicale N
3., che avviene in maniera regiospecifica e con forte preferenza nella direzione opposta al sostituente al C-4 a causa del suo impedimento sterico. Questa reazione, quindi, è altamente regioselettiva, anche se, molto spesso, si ottengono miscele epimeriche di 2-azido-2-desossi-1-O-nitropiranosi, il cui rapporto è fortemente dipendente dalla stereochimica del glicale di partenza. Per esempio, per il D - galattale 31 (Schema 2) è altamente favorito il prodotto in cui il gruppo azidico si trova in posizione equatoriale: si ottengono, infatti, i corrispondenti nitrati 2-azido-2- desossigalattosio 31a e 31b con una resa globale del 75%.
Schema 2
O AcO
OAc OAc
ONO2 O AcO
OAc OAc
N3 ONO2
O AcO
OAc OAc
N3
31a (53%) 31b (22%)
31
(NH4)2Ce(NO2)6 , NaN3
CH3CN, - 20°C
+
Nel caso del tri-O-acetil- D -glucale (32), invece, la reazione di azidonitrazione fornisce miscele dei corrispondenti 2-azido derivati a configurazione D -gluco 33 e D - manno 34 (Schema 3). Questa minore regioselettività può essere spiegata dal minore ingombro sterico presente sulla faccia β del D -glucale (C-4 equatoriale) rispetto a quella del D -galattale (C-4 assiale).
Schema 3
O AcO
OAc AcO
ONO2 O AcO
OAc AcO
N3 ONO2
O AcO
OAc AcO
N3 (NH4)2Ce(NO2)6 , NaN3
CH3CN, - 20°C
+
33 34
32
Una volta ottenuti i prodotti di azidonitrazione 31a e 33, la trasformazione nelle corrispondenti GalNAc (2b) e GlcNAc (1b) è realizzata attraverso una reazione di scambio anomerico con AcONa-AcOH a formare i precursori α-acetil-2-azidici (35a,b, Schema 4) dai quali, con tre passaggi successivi di riduzione dell’azide, N-acetilazione e O-desacetilazione, si arriva alle N-acetil- D -esosammine 1b e 2b, derivati recanti la funzionalità 2-acetammidica. La riduzione del gruppo azidico può essere condotta con una grande varietà di condizioni, come ad esempio l’idrogenazione catalitica (H
2, Pd/C), il trattamento con l’1,3-propanditiolo, la ligazione di Staudinger (Ph
3P in THF/H
2O) o la riduzione di Birch (Na/NH
3liquida), mentre l’acetilazione riduttiva può essere condotta usando acido tiolacetico.
Schema 4
ONO2 O
AcO OAc R'
N3 R
ONO2 O
AcO OAc R'
N3 R
OH O AcO
OAc R'
AcHN R AcONa
AcOH.
31a: R=OAc; R'=H 33: R=H; R'=OAc
35a: R=OAc; R'=H 35b: R=H; R'=OAc
2b: R=OH; R'=H 1b: R=H; R'=OH
1.4.2. Reazioni di cicloaddizione con azadicarbossilati
Questo metodo di sintesi, studiato da Leblanc,
11prevede l’irradiazione con luce UV (350 nm) di una soluzione di glicale tri-O-sililato con dibenzil azadicarbossilato in cicloesano. A titolo di esempio riportiamo l’applicazione della reazione al D -glucale 36 che, in queste condizioni, è trasformato nel cicloaddotto [4+2] 37 in resa del 70%
(Schema 5).
Schema 5
RO
O RO
OR
N
O OBn
N
O OBn O
RO
O RO
N OR
N OBn BnO2C
RO
O RO
N OR
OMe
BnO2C NHCO2Bn
RO O
RO
NHAc OR
OMe
R = t-BuMe2Si +
350 nm, CH2Cl2 cicloesano
MeOH, p-TsOH
1. Ni-Raney, MeOH, AcOH, 40 psi H2 2. Ac2O, Py
36 37
38 39
Questa iniziale sorprendente diasteroselettività è stata attribuita alla preferenza del glucale tri-O-sililato di adottare la conformazione
1C
4o la conformazione a semi-sedia.
In questo modo, il sostituente silil etereo in posizione 3, essendo in assiale, ostacolerebbe la cicloaddizione sulla faccia β favorendo quindi la formazione del cicloaddotto 37. Il trattamento del cicloaddotto 37 con quantità catalitica di p-TsOH in MeOH fornisce il corrispondente metil β-glicoside 38 (resa 88%) che, per idrogenazione catalitica in presenza di Ni-Raney seguita da N-acetilazione, è trasformato nel metil 2-acetammido-2-desossi-β-glicoside 39 con una resa del 72%.
1.4.3. Reazioni di fosforammidoglicosilazione
Questa metodologia, sviluppata per la prima volta da Lafont e Descotes,
11prevede la preparazione di 2-amminozuccheri mediante elaborazione di derivati 1,2-aziridinici attivati ottenuti per inserzione diretta da glicali. Come esempio riportiamo la fosforammidoglicosilazione del tri-O-benzil-glucale 40 (Schema 6) che, per trattamento con iodoazide seguita da reazione di Staudinger (Ph
3P, THF-H
2O), fornisce il derivato 2-desossi-2-iodomannopiranosil fosforammidato 41 (resa 58%), dove i sostituenti in posizione 1 e 2 si trovano in modalità trans-diassiale. La successiva reazione di 41 con MeONa in MeOH porta al corrispondente metil β-glucoside 42 (resa 92%) attraverso una contemporanea inversione di configurazione del C-1 e del C-2 che avviene, in maniera altamente stereospecifica, attraverso la formazione di un intermedio aziridinico.
Schema 6
O OBn
BnOBnO
NHPO(OMe)2 IO
BnOBnO OBn
O BnOBnO
OBn
NHPO(OMe)2 OMe
NHPO(OMe)2 IO
BnOBnO OBn
O H R 40
1. NaN3
2. P(OMe)3
41
MeONa
42 MeOH
Questo approccio sintetico, efficiente nel caso di alcoli semplici (MeOH, BnOH,
etc.), ha delle limitazioni quando si usano accettori glicosidici (ad esempio 1,2:3,4-di-O-
isopropiliden- D -galattopiranoside) portando ai corrispondenti disaccaridi in basse rese
(29%).
1.4.4. Reazioni di solfonammidoglicosilazione
L’azaglicosilazione dei glicali, descritta precedentemente, è stata studiata anche da Danishefsky,
11che ne ha proposto una variante basata sulla considerazione che scambiando il sostituente all’azoto con un gruppo elettron-attrattore si migliorerebbe significativamente la potenziale glicosilazione dell’intermedio aziridinico e si realizzerebbe la glicosilazione anche con glicosil accettori non reattivi, che costituisce la principale limitazione del metodo precedentemente descritto. Ad esempio, la reazione del tri-O-benzil-glucale 40 con iodonio perclorato (IDCP) e benzensolfonammide fornisce la iodosolfonammide 43, 1,2-trans-diassiale, con una resa del 78% (Schema 7).
La successiva reazione di glicosilazione è realizzata, in buone rese, con nucleofili sia ossigenati che solforati, come dimostra la preparazione del tioglicoside 45 (resa 85%) attraverso migrazione del gruppo solfonammidico dal C-1 al C-2 e contemporanea inversione di queste posizioni, realizzata effettuando la reazione con litio etantiolato.
Schema 7
O OBn
BnOBnO
NHSO2Ph IO OBn
BnOBnO SEt
O
NHSO2Ph BnO
OBn
BnO
40
IDCP H2NSO2Ph DCM, 4A MS
43
EtSH, LHMDS DMF, da -40°C a t.a.
44
E’ da sottolineare che la reazione di glicosidazione di 43 con derivati monosaccaridici, a differenza di quanto illustrato precedentemente, risulta più efficiente e porta a derivati disaccaridici con rese più elevate (60-65%). Inoltre, gli O-glicosidi 2- solfonammidici ottenuti con questo metodo possono essere facilmente convertiti nei corrispondenti derivati 2-acetammidici per trattamento con un eccesso di sodio in ammoniaca seguito da una N-acetilazione.
Ad oggi, l’efficacia e la versatilità della reazione di solfonamidoglicosilazione è stata dimostrata dalla sintesi di strutture saccaridiche complesse contenenti unità di GlcNAc, come ad esempio l’antigene Sialyl-Lewis X (17, Figura 12).
1.4.5. Reazioni di ammidazione metallo-mediata
Nel 1997, Carreira e coll.
11hanno realizzato l’ammidazione di glicali con
formazione di derivati 2-desossi-2-trifluoroacetilammidici attraverso un approccio
manganese sono in grado di trasferire un’unità trifluoroacetamminica a silil enol eteri elettron-ricchi per reazione con anidride trifluoroacetica (Tf
2O). Ad esempio, l’attivazione del glicale 45 (Schema 8) con sali di nitruro di manganese seguita da trattamento con Tf
2O fornisce derivati 2-N-trifluoroacetammidici 45a in buone rese e con un’eccellente diasteroselettività, controllata dal vicino stereocentro C-3 e dalla presenza dell’acetale isopropilidenico in posizione 3,4. La successiva glicosidazione di 45a con tiofenolo e BF
3-OEt
2fornisce il desiderato tioglicoside 46 con completa β- stereoselettività, derivante da apertura regio- e stereospecifica dell’intermedio ciclico 45a.
Schema 8
O O
O OBn
N O O
F3C O O OBn
O O
N O OBn
O F3C
SPh O O
NHTFA O OBn
(saltmen)Mn(N) (CF3CO)2O, DCM
PhSH, BF3OEt2 - 78°C
46 45a
45
1.4.6. Reazioni di acetammidoglicosilazione
La maggior parte dei C(2)-amminozuccheri presenti in natura sono N-acetilati, e questo sottolinea l’importanza di avere a disposizione metodi che consentono l’installazione diretta del gruppo C(2)-acetammido in un glicale donatore con la contemporanea formazione del legame glicosidico. Tutti gli approcci sintetici descritti precedentemente necessitano, per inserire un gruppo NHAc sul C-2, di diversi passaggi, quali l’installazione di una funzionalità azotata protetta, la glicosilazione e la manipolazione della funzionalità azotata a dare il gruppo N-acetammido desiderato.
Allo scopo di evitare queste ultime trasformazioni, nel corso di studi condotti dal gruppo di ricerca del Prof. David Gin è stato individuato un metodo sintetico che permette di realizzare in modo estremamente efficace e con completa stereoselettività l’installazione della funzionalità N-acetammidica sulla posizione 2 del glicale donatore e il contemporaneo accoppiamento glicosidico con vari alcoli o glicosil accettori in un procedimento one-pot che prende il nome di “acetammidoglicosilazione”.
12In questo protocollo sintetico l’attivazione del glicale è realizzata con lo ione solfonio 48 che si forma in situ dalla combinazione del tiantrene-5-ossido (47) e dell’anidride triflica (Schema 9). La reazione di acetammidoglicosilazione di glicali
avviene con una procedura estremamente semplice, esemplificata dalla glicosilazione del 2-propanolo con il tri-O-benzil- D -glucale (40) che permette di ottenere l’isopropil 2- acetammido-3,4,6-tri-O-benzil-2-desossi-β- D -glucopiranoside (49, resa 73%).
Schema 9
O BnO
BnO
OBn
O O
NHAc BnO
BnO
OBn S
S O
S S+ OTf
40 49
47 Tf2O
AcNHSiMe3, Et2NPh;
Amberlyst-15, (CH3)2CHOH;
CHCl3/CH2Cl2 (4:1) TfO-
48
Il meccanismo della reazione (Schema 10) è stato accuratamente dimostrato mediante sofisticati esperimenti di
1H e
13C NMR a bassa temperatura, utilizzando isotopi marcati quali
15N e
18O.
12bLo stadio iniziale coinvolge l’attivazione, a bassa temperatura, del tiantrene-5-ossido (47) con anidride triflica (Tf
2O) per generare in situ il tiantrene bis(triflato) (48). L’attivazione elettrofila della funzionalità enol eterea del generico glicale 50 con la specie 48 porta alla formazione dell’intermedio 51 che incorpora una funzionalità ossacarbenio triflato sul C-1 ed un gruppo tiantrenil solfonio sul C-2, stereoselettivamente in β. L’introduzione del gruppo acetammido avviene in seguito all’aggiunta dello scambiatore acido, N,N-dietilanilina, e di N-TMS- acetammide.
La funzione chiave del gruppo protettivo N-trimetilsilile presente nel reagente
ammidico è quella di fornire un ingombro sterico attorno all’atomo di azoto allo scopo
di favorire l’attacco iniziale da parte dell’ossigeno del reattivo sul C-1 del glicale
attivato 51 per generare l’intermedio α-glicosilacetimmidato 52. Successivamente,
l’azoto del gruppo acetimmidato presente sul C-1 determina uno spiazzamento
intramolecolare del buon gruppo uscente presente sul C-2, ovvero del gruppo tiantrene,
per generare l’α-ossazolidina intermedia 53, con contemporanea perdita del gruppo
protettivo sull’azoto (TMS) come addotto con la N,N-dietilanilina. Il processo di
apertura dell’ossazolidina 53, catalizzato da acidi in presenza di un glicosil accettore,
fornisce il glicoside 54 nello stadio finale dell’acetammidoglicosilazione.
Schema 10
S+ S
O
H RO
RO OR O
RO RO
OR
S S+ OTf
NHTMS O
S+ S
O RO
RO RO
N O Si
S S
O O
N OR
RO Nu RO
O
NHAc RO
RO OR
+ TfO- TfO-
51 50
TfO-
CHCl3/CH2Cl2 (4:1) -78°C
PhNEt2
TfO-
52
PhNEt2TMS + TfO-
53 catalizzatore
acido
54 48
Nu-H
Complessivamente, la reazione di acetammidoglicosilazione di semplici alcoli, quali il 2-propanolo, porta alla formazione dei corrispondenti 2-acetammido glicosidi direttamente dai glicosil donatori opportunamente protetti. Inoltre, questo processo di glicosilazione è compatibile con molti gruppi protettivi presenti sui glicali come eteri benzilici, tri-isopropilsililici ed allilici e gruppi acido-labili come acetali isopropilidenici. E’ interessante notare che quando viene utilizzato come glicosil donatore un glicale portante in posizione C-6 un etere allilico, il solfossido attivato 48 reagisce selettivamente con la funzionalità enol eterea del glicale e non con il semplice doppio legame del gruppo protettivo. Nello stadio di apertura dell’anello ossazolidinico possono essere utilizzati, in alcuni casi ed in alternativa all’Amberlyst-15, acidi di Lewis relativamente deboli come MgI
2o LiClO
4allo scopo di minimizzare la rimozione indesiderata di gruppi protettivi acido-labili eventualmente presenti.
In questo innovativo processo di acetammidoglicosilazione, alcuni aspetti sono di particolare interesse e meritano di essere portati all’attenzione. In primo luogo, l’attacco del tiantrene bis(triflato) (48) avviene sulla faccia β del glicale generico 51, come dimostrato, anche in questo caso, da accurati esperimenti NMR con isotopi marcati.
Sebbene questo modo di attivazione possa sembrare stericamente sfavorito, l’addizione
stereoselettiva del reagente elettrofilo sulla faccia β del glicale porta ad un piranoside
stabile in quanto recante una sostituzione 1,2-trans diassiale (come mostrato in 52).
A dimostrazione del meccanismo proposto, che prevede l’eliminazione del tiantrene nello stadio di formazione dell’ossazolidina, dalla reazione vengono recuperati da 0.7 a 0.9 equivalenti di solfossido. Infine, a conferma che l’intermedio reale nel processo di acetammidoglicosilazione è rappresento dall’ossazolidina 53, quando l’attivazione di 51 è realizzata in CDCl
3l’analisi NMR (
1H,
13C) della miscela di reazione mostra chiaramente che l’ossazolidina 53 è il monosaccaride principale presente nel mezzo di reazione. Inoltre, ad ulteriore conferma della validità del meccanismo proposto, le ossazolidine tipo 53 possono essere isolate mediante cromatografia su colonna di gel di silice, prima dell’introduzione dell’acido e dell’alcol o del glicosil accettore.
La procedura proposta dal Prof. Gin rappresenta, quindi, un nuovo processo per il trasferimento di azoto ai glicali, che utilizza tiantene-5-ossido ed anidride triflica quale nuova utile combinazione di reagenti per l’attivazione del glicale donatore. Viene in questo modo realizzata per la prima volta l’installazione diretta della funzionalità C(2)- N-acetammidica, con contemporaneo accoppiamento glicosidico con vari alcoli quali glicosil accettori, in una innovativa procedura one-pot che permette la preparazione di N-acetil- D -gluco- e D -galattosammine anche disaccaridiche, come ad esempio 55-57 (Figura 23), a partire dai corrispondenti glicali.
Figura 23
O O
BnO BnO
OBn OMe O
NHAc OBn BnO
BnO
O O
BnO BnO
OBn OMe O
NHAc O
O BnO
O O
BnO BnO
OBn OMe O
NHAc OAllyl BnO
BnO
55 (60%) 56 (45%) 57 (60%)
1.5. Approcci sintetici a N-acetil- D -esosammine β-glicosilate con un’unità di DNJ
I glicosidi naturali di tipo 58, costituiti da unità azapiranosiche e unità N-acetil- D -
esosamminiche (GalNAc, GlcNAc, TalNAc e ManNAc), non sono noti, ma sono noti gli
analoghi ossigenati come ad esempio 58a, isolato dai semi del legume Xanthocercis
Zambesiaca (Figura 24).
Figura 24
OHO NH O OH
H
NHAc O O H
OH
OH
OHO HN O
H
OH O O H
OH
58 58a OH
Da un’analisi della letteratura si evidenzia che la preparazione di mimici disaccaridici contenenti un’unità di DNJ e un’unità monosaccaridica ossigenata prevede essenzialmente tre tipi di approcci:
1. reazioni di glicosidazione chimica tra unità saccaridiche e unità azapiranosiche;
2. reazioni di glicosidazione enzimatica o chemo-enzimatica;
3. impiego di disaccaridi naturali in cui il legame interglicosidico risulta preformato.
1.5.1. Glicosidazioni chimiche tra unità saccaridiche e unità azapiranosiche
In generale, le reazioni di glicosidazione chimica comportano un attacco nucleofilo da parte di un alcol (glicosil accettore) sul carbonio anomerico di un monosaccaride (glicosil donatore), opportunamente attivato con un buon gruppo uscente in modo da esaltare le caratteristiche elettrofile. Un esempio di questo approccio sintetico (Schema 11) è costituito dalla sintesi dell’azadisaccaride 61, un potenziale inibitore dell’enzima glucosilceramide β-glucosidasi implicato nel disordine di Gaucher.
9Schema 11
O
Br AcO
AcO OAc
OAc
O
H N
OBn
OTBDMS
BnO N
OH O
H O O OH O H
O H
OH
OH
59 60 61 (resa 20%)
+
Reagenti: i: AgOTf, 4A, CH2Cl2, -78°C ii: Bu4NF, THF; iii: MeONa-MeOH; iv: H2, Pd/C al 10%.
i-iv
In particolare, il glicosil accettore 60, avente il gruppo OH-4 libero, va ad attaccare
il carbonio anomerico opportunamente attivato del glicosil donatore 59. Le reazioni di
glicosidazione necessitano della protezione di tutte le funzioni ossidriliche sia di 59 che
di 60, con l’ovvia eccezione del gruppo OH del glicosil accettore coinvolto nel
coupling. Il procedimento complessivo comporta, perciò, sia una serie di manipolazioni
di protezione e deprotezione dei gruppi ossidrilici, sia di vari processi di purificazione
che, accompagnati al basso stereocontrollo nella formazione del legame interglicosidico, portano spesso a basse rese.
1.5.2. Glicosidazione enzimatica o chemo-enzimatica
La sintesi enzimatica o chemo-enzimatica può spesso rappresentare un’interessante alternativa alla sola sintesi chimica. Un azadisaccaride può essere ottenuto o per condensazione enzimatica di un monosaccaride con un’unità azapiranosica oppure per trans-glicosidazione, operazioni che sono mediate da glicosidasi oppure da glicosiltransferasi, enzimi a specificità di substrato e, talvolta, di tipo e stereochimica della giunzione. Un esempio di letteratura
9è quello riportato nello Schema 12, dove la preparazione dell’azadisaccaride 62 si ottiene per trasferimento di un’unità di D - galattosio dal lattosio (18) ad un’unità della 1-desossinojirimicina (28) ad opera di una β-galattosidasi.
Schema 12
H N
OH O
H O H
OH OH
O OH
O
O OH
OH OH O
H
OH O
H
OH O OH
O
N
OH H
OH O
H
OH O
H
18
β-galattosidasi
62 (resa 27%)
