Fabrizio Cappa
Istituto di Microbiologia - CRB
Facoltà di Scienze agrarie, alimentari, ambientali
•UCSC, Piacenza – Cremona fabrizio.cappa@unicatt.it
Le spore di clostridi in digestione anaerobica.
«Biogas, aspetti igienico-sanitari e prodotti DOP»
I. Clostridi
II. Clostridi nei digestori anaerobici III. Digestori in termofilia scala reale
IV. Digestori in mesofilia e termofilia scala laboratorio V. Conclusioni
Le spore di clostridi in
digestione anaerobica.
Comunità microbica in un impianto di biogas
Microrganismi
Bacteria 80-98%
Archaea 20-2%
Bacteria
Firmicutes 53%
Bacteroidetes 13%
Actinobacteria 4-6%
Proteobacteria 4-6%
Spirochetes 4-6%
Verrucomicrobium 0.5-2%
Acidobacterium 0.5-2%
Chloroflexy 0.5-2%
Sundberg et al 2013
Firmicutes
Clostridia 31-84%
Sphingobacteria 0.1-8%
Bacilli 0.1-5%
Erysipelotrichi 0.1-2%
Firmicutes sconosciuti
1-14%
Distribuzione della composizione della comunità microbica in un digestore per la produzione di
biogas
Firmicutes 44% Wirth 2012
Clostridia 36%
Bacilli 11%
Identificazioni non coltura dipendente attività
Clostridium thermocellum Cellulolitico → idrogeno, ac. grassi
Clostridium kluyveri Acetato e etanolo → idrogeno e ac. butirrico Clostridium acetobutylicum (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Clostridium perfringens Acidi grassi, idrogeno, CO2
Clostridium saccharolyticum Cellulolitico → idrogeno, ac. grassi
Clostridium straminisolvens (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Clostridium stercorarium Acidi grassi, idrogeno
Clostridium beijerinckii Acidi grassi, idrogeno, CO2 Clostridium phytophermentans Acidi grassi, idrogeno, CO2 Clostridium novyi
Clostridium tetani
I. Clostridi nei digestori anaerobici
Clostridi responsabili di difetti nei formaggi a lunga stagionatura
Genere specie
Clostridium tyrobutyricum Clostridium butyricum Clostridium sporogenes Clostridium beijerinckii Clostridium perfringens Clostridium cochlearium Clostridium septicum Clostridium disporicum
Ricerca dei clostridi nelle
matrici alimentari e digestati
o Campione matrice alimentare o digestato o Trattato a 80°C per 10 min
o Semina su terreno selettivo
o Incubazione in anaerobiosi a 37°C o Conta delle UFC
o risultati espressi → numero di UFC(spore)/grammo
Identificazione dei clostridi isolati
Isolamento di colonie a differente morfologia
Estrazione del DNA
Fingerprinting del DNA per la differenziazione e selezione dei ceppi
Identificazione tramite sequenziamento del 16S rRNA → analisi in banca dati
Categorie di matrici analizzate
Principali matrici In ingresso
Altre matrici
In scala reale Matrici in uscita
Liquame bovino
Triticale Sorgo
Silotriticale Melasso Siero
Scarti di caffè Farina di mais
Puliture di mais essicatoio Scarto di essicazione mais Melasso di agrumi
Sansa di oliva
Digestato tal quale
Letame bovino Digestato Chiarificato
Insilato di mais Digestato Separato
Solido
Separato bovino Digestato Stoccaggio
Impianti in scala reale Altre matrici alimentari
Matrice alimentare Spore/grammo Nr. campioni
triticale <10 3
separato bovino 7,4∙104 6
sorgo <10 1
silotriticale <10 1
melasso <10 1
siero <10 1
scarti di caffè <10 1
Farina di mais <10 1
Puliture di mais essicatoio <10 1
Scarto di essicazione mais 8,0∙102 1
Melasso di agrumi <10 1
Sansa di oliva <10 1
Reattori
Impianto 6 Impianto 3 Impianto 1 Impianto 5 Impianto 2 Impianto 4 Effluenti
bovini
Effluenti bovini
Effluenti bovini
Effluenti bovini
Effluenti bovini
Effluenti bovini
insilati insilati insilati insilati
GP PR PR PR GP GP
mesofilia mesofilia mesofilia termofilia mesofilia mesofilia
Impianti scala reale
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
1 2 3 4 5 6
spore clostridi (log ufc/g)
Impianti
LIQUAME BOVINO LETAME BOVINO INSILATO DI MAIS DIG. TAL QUALE DIG. CHIARIFICATO DIG. S. SOLIDO DIG. STOCCAGGIO
PR GP PR GP PR GP
Bilancio spore in mesofilia
digestori scala laboratorio
Tesi
input tot spore
output tot spore
differenza output tot spore e input tot
spore
rapporto output_tot / input tot spore Liquame 1,7E+08 a 3,1E+08 1,4E+08 1,70
Liquame + silomais
9,7E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,61
Liquame + silomais
+
polpe biet
8,8E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,71
p=0,05
Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in mesofilia
C. perfringens 68%
C. sporogenes 20%
C. bifermentas 5%
C. subterminale 2%
C. butyricum
2% C. beijerinckii 0%
P. polymyxa
1% C. glycolicum 2%
C. perfringens C. sporogenes C. bifermentas C. subterminale C. butyricum C. beijerinckii P. polymyxa C. glycolicum MICRORGANISMO IDENTIFICATI
C. perfringens 108
C. sporogenes 32
C. bifermentas 8
C. subterminale 3
C. butyricum 3
C. beijerinckii 1
P. polymyxa 1
C. glycolicum 3
TOTALE 159
Bilancio spore in termofilia
digestori scala laboratorio
Tesi
input tot spore
output tot spore
differenza output_tot spore e input_tot spore
rapporto output_tot / input_tot spore Liquame 2,8E+08 a 2,9E+08 1,6E+07 1,26
Liquame + silomais
1,6E+08 b 2,5E+08 8,9E+07 1,66
Liquame + silomais
+
polpe biet
1,5E+08 b 3,6E+08 2,0E+08 2,52
p=0,01
MICRORGANISMO IDENTIFICATI
C. perfringens 70
C. sporogenes 38
C. tyrobutyricum 1
C. sordellii 1
C. bifermentans 1
C. glycolicum 1
Bacillus sp. 1
TOTALE 111
Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in termofilia
C. perfringens 62%
C. sporogenes 33%
C. tyrobutyricum 1%
C. sordellii 1%
C. bifermentans 1%
C. glycolicum
1% Bacillus sp.
1%
C. perfringens C. sporogenes C. tyrobutyricum C. sordellii
C. bifermentans C. glycolicum Bacillus sp.
Specie isolate dai campioni analizzati nei sei impianti in scala reale
Altre specie di Clostridi identificate
Clostridium acetobutylycum 3
Clostridium glycolicum 1
Clostridium metallolevans 2
Clostridium tyrobutyricum 4
Clostridium thiosulfatireducens 1
Clostridium butyricum 7
Clostridium beijerinckii 2
Clostridium sartagoforme 3
Clostridium neonatale 2
25
Conclusioni
Impianti scala reale: numero in spore nei digestati piuttosto omogeneo, superiore a 1e104 spore/g
Confrontando impianti in scala reale area Grana Padano e
Parmigiano Reggiano non si evidenziano sostanziali differenze nel contenuto in spore nei digestati in uscita dai reattori
I sottoprodotti alimentari non sembrano essere alimenti apportatori di spore
Risulta una maggiore biodivesità di specie clostridiche negli impianti in scala reale
Negli impianti alimentati senza insilato è dominante il Clostridium perfringens
Impianti scala laboratorio Mesofilia e Termofilia:
Sia in condizioni di mesofilia che di termofilia il letame è
risultato essere la fonte principale di sporigeni seppure con un lieve scarto.
Il bilancio delle spore tra le tre tesi non è statisticamente differente
Dal bilancio tra spore in ingresso e uscita risulta un leggero incremento nel numero di spore in tutte e tre le tesi.
Clostridium perfringens è risultata la specie dominante ed in misura minore è Clostridium sporogenes.
C. tyrobutyricum e C. butyricum sono stati identificati occasionalmente.