Il genere Clostridium in digestione anaerobica

Fabrizio Cappa

Istituto di Microbiologia - CRB

Facoltà di Scienze agrarie, alimentari, ambientali

•UCSC, Piacenza – Cremona [email protected]

Le spore di clostridi in digestione anaerobica.

«Biogas, aspetti igienico-sanitari e prodotti DOP»

I. Clostridi

II. Clostridi nei digestori anaerobici III. Digestori in termofilia scala reale

IV. Digestori in mesofilia e termofilia scala laboratorio V. Conclusioni

Le spore di clostridi in

digestione anaerobica.

Comunità microbica in un impianto di biogas

Microrganismi

Bacteria 80-98%

Archaea 20-2%

Bacteria

Firmicutes 53%

Bacteroidetes 13%

Actinobacteria 4-6%

Proteobacteria 4-6%

Spirochetes 4-6%

Verrucomicrobium 0.5-2%

Acidobacterium 0.5-2%

Chloroflexy 0.5-2%

Sundberg et al 2013

Firmicutes

Clostridia 31-84%

Sphingobacteria 0.1-8%

Bacilli 0.1-5%

Erysipelotrichi 0.1-2%

Firmicutes sconosciuti

1-14%

Distribuzione della composizione della comunità microbica in un digestore per la produzione di

biogas

Firmicutes 44% Wirth 2012

Clostridia 36%

Bacilli 11%

Identificazioni non coltura dipendente attività

Clostridium thermocellum Cellulolitico → idrogeno, ac. grassi

Clostridium kluyveri Acetato e etanolo → idrogeno e ac. butirrico Clostridium acetobutylicum (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Clostridium perfringens Acidi grassi, idrogeno, CO₂

Clostridium saccharolyticum Cellulolitico → idrogeno, ac. grassi

Clostridium straminisolvens (cellulolitico) Butanolo, etanolo, Idrogeno Clostridium stercorarium Acidi grassi, idrogeno

Clostridium beijerinckii Acidi grassi, idrogeno, CO₂ Clostridium phytophermentans Acidi grassi, idrogeno, CO₂ Clostridium novyi

Clostridium tetani

I. Clostridi nei digestori anaerobici

Clostridi responsabili di difetti nei formaggi a lunga stagionatura

Genere specie

Clostridium tyrobutyricum Clostridium butyricum Clostridium sporogenes Clostridium beijerinckii Clostridium perfringens Clostridium cochlearium Clostridium septicum Clostridium disporicum

Ricerca dei clostridi nelle

matrici alimentari e digestati

o Campione matrice alimentare o digestato o Trattato a 80°C per 10 min

o Semina su terreno selettivo

o Incubazione in anaerobiosi a 37°C o Conta delle UFC

o risultati espressi → numero di UFC(spore)/grammo

Identificazione dei clostridi isolati

 Isolamento di colonie a differente morfologia

 Estrazione del DNA

 Fingerprinting del DNA per la differenziazione e selezione dei ceppi

 Identificazione tramite sequenziamento del 16S rRNA → analisi in banca dati

Categorie di matrici analizzate

Principali matrici In ingresso

Altre matrici

In scala reale Matrici in uscita

Liquame bovino

Triticale Sorgo

Silotriticale Melasso Siero

Scarti di caffè Farina di mais

Puliture di mais essicatoio Scarto di essicazione mais Melasso di agrumi

Sansa di oliva

Digestato tal quale

Letame bovino Digestato Chiarificato

Insilato di mais Digestato Separato

Solido

Separato bovino Digestato Stoccaggio

Impianti in scala reale Altre matrici alimentari

Matrice alimentare Spore/grammo Nr. campioni

triticale <10 3

separato bovino 7,4∙10⁴ 6

sorgo <10 1

silotriticale <10 1

melasso <10 1

siero <10 1

scarti di caffè <10 1

Farina di mais <10 1

Puliture di mais essicatoio <10 1

Scarto di essicazione mais 8,0∙10² 1

Melasso di agrumi <10 1

Sansa di oliva <10 1

Reattori

Impianto 6 Impianto 3 Impianto 1 Impianto 5 Impianto 2 Impianto 4 Effluenti

bovini

Effluenti bovini

Effluenti bovini

Effluenti bovini

Effluenti bovini

Effluenti bovini

insilati insilati insilati insilati

GP PR PR PR GP GP

mesofilia mesofilia mesofilia termofilia mesofilia mesofilia

Impianti scala reale

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

1 2 3 4 5 6

spore clostridi (log ufc/g)

Impianti

LIQUAME BOVINO LETAME BOVINO INSILATO DI MAIS DIG. TAL QUALE DIG. CHIARIFICATO DIG. S. SOLIDO DIG. STOCCAGGIO

PR GP PR GP PR GP

Bilancio spore in mesofilia

digestori scala laboratorio

Tesi

input tot spore

output tot spore

differenza output tot spore e input tot

spore

rapporto output_tot / input tot spore Liquame 1,7E+08 a 3,1E+08 1,4E+08 1,70

Liquame + silomais

9,7E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,61

Liquame + silomais

+

polpe biet

8,8E+07 b 1,6E+08 6,8E+07 1,71

p=0,05

Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in mesofilia

C. perfringens 68%

C. sporogenes 20%

C. bifermentas 5%

C. subterminale 2%

C. butyricum

2% C. beijerinckii 0%

P. polymyxa

1% C. glycolicum 2%

C. perfringens C. sporogenes C. bifermentas C. subterminale C. butyricum C. beijerinckii P. polymyxa C. glycolicum MICRORGANISMO IDENTIFICATI

C. perfringens 108

C. sporogenes 32

C. bifermentas 8

C. subterminale 3

C. butyricum 3

C. beijerinckii 1

P. polymyxa 1

C. glycolicum 3

TOTALE 159

Bilancio spore in termofilia

digestori scala laboratorio

Tesi

input tot spore

output tot spore

differenza output_tot spore e input_tot spore

rapporto output_tot / input_tot spore Liquame 2,8E+08 a 2,9E+08 1,6E+07 1,26

Liquame + silomais

1,6E+08 b 2,5E+08 8,9E+07 1,66

Liquame + silomais

+

polpe biet

1,5E+08 b 3,6E+08 2,0E+08 2,52

p=0,01

MICRORGANISMO IDENTIFICATI

C. perfringens 70

C. sporogenes 38

C. tyrobutyricum 1

C. sordellii 1

C. bifermentans 1

C. glycolicum 1

Bacillus sp. 1

TOTALE 111

Specie isolate dai campioni analizzati nei digestori scala laboratorio in termofilia

C. perfringens 62%

C. sporogenes 33%

C. tyrobutyricum 1%

C. sordellii 1%

C. bifermentans 1%

C. glycolicum

1% Bacillus sp.

1%

C. perfringens C. sporogenes C. tyrobutyricum C. sordellii

C. bifermentans C. glycolicum Bacillus sp.

Specie isolate dai campioni analizzati nei sei impianti in scala reale

Altre specie di Clostridi identificate

Clostridium acetobutylycum 3

Clostridium glycolicum 1

Clostridium metallolevans 2

Clostridium tyrobutyricum 4

Clostridium thiosulfatireducens 1

Clostridium butyricum 7

Clostridium beijerinckii 2

Clostridium sartagoforme 3

Clostridium neonatale 2

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Conclusioni

 Impianti scala reale: numero in spore nei digestati piuttosto omogeneo, superiore a 1e10⁴ spore/g

 Confrontando impianti in scala reale area Grana Padano e

Parmigiano Reggiano non si evidenziano sostanziali differenze nel contenuto in spore nei digestati in uscita dai reattori

 I sottoprodotti alimentari non sembrano essere alimenti apportatori di spore

 Risulta una maggiore biodivesità di specie clostridiche negli impianti in scala reale

 Negli impianti alimentati senza insilato è dominante il Clostridium perfringens

Impianti scala laboratorio Mesofilia e Termofilia:

 Sia in condizioni di mesofilia che di termofilia il letame è

risultato essere la fonte principale di sporigeni seppure con un lieve scarto.

 Il bilancio delle spore tra le tre tesi non è statisticamente differente

 Dal bilancio tra spore in ingresso e uscita risulta un leggero incremento nel numero di spore in tutte e tre le tesi.

 Clostridium perfringens è risultata la specie dominante ed in misura minore è Clostridium sporogenes.

 C. tyrobutyricum e C. butyricum sono stati identificati occasionalmente.

Conclusioni

Grazie:

Dott. Roberto Tumolo (UCSC) pHD. Susanna Ferrari (UCSC)

Dott. Lorella Rossi (CRPA)

Dott. Paola Vecchia (CRPA)