Discussione
In questo lavoro di tesi abbiamo effettuato registrazioni di potenziali d’azione ed esperimenti di Western blot per determinare a durata d’azione di BoNT/E dopo iniezione nell’ippocampo di topo. I nostri dati elettrofisiologici e biochimici concordano nell’indicare che tale durata d’azione è pari a 14 giorni.
Come BoNT/E anche la tossina BoNT/A, che pure taglia SNAP-25, è in grado di silenziare l’attività elettrica cerebrale. I nostri dati sperimentali mostrano una durata d’azione più lunga rispetto alla BoNT/E e una diffusione dell’attività proteolitica di BoNT/A anche nell’ippocampo non iniettato.
Inoltre abbiamo cercato di verificare l’eventuale dipendenza dell’azione di BoNT/E dall’attività elettrica, questione fino ad ora mai affrontata a livello del Sistema Nervoso Centrale in vivo.
Infine abbiamo fornito una prima dimostrazione delle proprietà neuroprotettive di BoNT/E in un modello di ischemia cerebrale focale nel ratto.
4.1 Effetti di BoNT/E e di BoNT/A nell’ippocampo.
4.1.1. Silenziamento dell’attività elettrica
Grazie al suo taglio proteolitico altamente selettivo sulla proteina SNAP-25 del complesso SNARE, un’ iniezione profilattica di BoNT/E nell’ippocampo di ratto mostra un effetto anticonvulsivante sulle crisi focali e generalizzate indotte dal Kainato (Costantin et al., 2005). In accordo con queste evidenze, i nostri dati indicano che BoNT/E riduce significativamente la frequenza dei potenziali d’azione dei neuroni piramidali nell’ippocampo di topo. Questo silenziamento dell’attività si osserva anche in seguito al trattamento con BoNT/A ed è in accordo con la localizzazione preferenziale del bersaglio molecolare delle due neurotossine nei terminali glutammatergici.
In questi esperimenti elettrofisiologici abbiamo utilizzato come controllo l’ippocampo controlaterale dei topi iniettati con BoNT/E. Questa scelta si giustifica con il fatto che non abbiamo mai osservato diffusione dell’effetto di BoNT/E all’emisfero non iniettato.
Tuttavia è necessario tenere in considerazione che esiste una comunicazione funzionale tra i due ippocampi assicurata dalle fibre commisurali. L’esistenza di connessioni tra l’ippocampo iniettato con BoNT/E e l’ippocampo controlaterale potrebbe in qualche modo influenzare l’attività spontanea di quest’ultimo che perciò non rappresenterebbe più l’adeguato riferimento di normale attività spontanea. A questo proposito sarebbe opportuno verificare che la frequenza dei potenziali d’azione delle regioni CA1 e CA3 che abbiamo utilizzato come controllo non sia signficativamente differente da quella registrabile in animali non sottoposti ad alcun trattamento.
4.1.2 Diversa durata d’azione delle due neurotossine.
L’effetto di silenziamento dell’attività dovuto ad una singola iniezione di BoNT/E persiste per circa 14 giorni nell’ippocampo trattato, come si evidenzia dall’espressione della banda per SNAP-25 tagliata e dalle registrazioni in vivo di potenziali d’azione.
BoNT/A è in grado di ridurre significativamente l’attività spontanea ippocampale per periodi notevolmente maggiori, di almeno 60 giorni. Infatti, i livelli della forma tagliata di SNAP-25 rimangono pressoché inalterati fino al sessantesimo giorno dall’iniezione.
La diversa durata d’azione delle due neurotossine che abbiamo riscontrato nel nostro modello sperimentale è in accordo con i dati pubblicati in letteratura. Eleopra e collaboratori (1998) mostrano come la paralisi indotta dalla somministrazione di BoNT/E a livello del Sistema Nervoso Periferico umano abbia un recupero funzionale molto più rapido rispetto a quella derminata da BoNT/A. Keller et al. (1999), intossicando neuroni del midollo spinale in coltura, dimostrano che l’azione proteolitica di BoNT/E su SNAP-25 persiste per periodi inferiori a 18 giorni mentre quella di BoNT/A supera gli 80 giorni. Infine, i risultati ottenuti da Foran e collaboratori (2003) mostrano che in neuroni cerebellari di ratto in coltura, BoNT/E blocca il rilascio del neurotrasmettitore per un periodo di 0,8 giorni mentre l’azione di BoNT/A persiste per 31 giorni.
La diversa durata d’azione dei due serotipi può essere motivata dal diverso sito di taglio di BoNT/A e di BoNT/E su SNAP-25 o da una maggiore stabilità enzimatica di BoNT/A nel citosol neuronale.
I risultati ottenuti da Eleopra et al. (1998) nel Sistema Nervoso Periferico umano favoriscono la prima motivazione: una co-somministrazione dei due serotipi a livello della
giunzione neuromuscolare determina un rapido recupero funzionale equivalente a quello determinato dalla sola BoNT/E.
In altre parole BoNT/E, che rimuove un frammento di 26 amminoacidi dall’estremità C-terminale di SNAP-25 intatta, utilizzerebbe come substrato anche la forma di SNAP-25 tagliata da BoNT/A che contiene ancora il sito di taglio di BoNT/E. La forma di SNAP-25 tagliata da BoNT/E è talmente danneggiata da essere rimossa rapidamente e rimpiazzata da molecole di SNAP-25 di nuova sintesi. Al contrario l’intossicazione con la sola BoNT/A produce una SNAP-25 tagliata che non viene riconosciuta come alterata dai sistemi di degradazione. Questa forma di SNAP-25 tagliata si comporta da dominante negativo, sequestrando molecole di VAMP e Sintaxina in un complesso ternario non in grado di supportare l’esocitosi (Eleopra et al., 1998).
A favore della maggior stabilità enzimatica di BoNT/A, troviamo i risultati di Keller et al (1999). Esperimenti di Western Blot mostrano che nei neuroni del midollo spinale in coltura intossicati sequenzialmente con BoNT/A e BoNT/E, la forma di SNAP-25 tagliata da BoNT/A ricompare al termine dell’effetto proteolitico di BoNT/E. Ciò suggerisce una persistenza della catena leggera di BoNT/A nella terminazione presinaptica.
I risultati ottenuti da Fernandez-Salas et al. ( 2004) forniscono una possibile spiegazione alla maggior stabilità enzimatica di BoNT/A. Trasformando cellule PC12 con plasmidi codificanti per la proteina di fusione GFP-Catena Leggera (CL) di BoNT/A o di BoNT/E, gli autori dimostrano che la CL di BoNT/A è associata con la membrana delle cellule neuronali in prossimità del suo prodotto di taglio mentre sia BoNT/E che la forma di SNAP-25 tagliata da BoNT/E sono presenti nel citoplasma. Questa diversa localizzazione subcellulare potrebbe rendere la CL di BoNT/E più accessibile alla degradazione rispetto a quella di BoNT/A che risulta invece parzialmente protetta dalla sua localizzazione sulla membrana.
Indipendentemente dal reale motivo della diversa durata d’azione delle neurotossine, i nostri dati sperimentali indicano che durata d’azione più lunga di BoNT/A potrebbe significare una migliore efficacia terapeutica futura.
Pertanto sono in programma ulteriori esperimenti per definire per quanto tempo persiste esattamente l’effetto di BoNT/A. Per prima cosa andremo a valutare se la forma tagliata di SNAP-25 e il silenziamento dell’attività spontanea ippocampale sono ancora rilevabili a 120 giorni dall’iniezione.
4.1.3 Trasporto di BoNT/A o del suo prodotto di taglio nell’ippocampo non iniettato.
Dagli esperimenti di elettrofisiologia, di Western blot e di immunoistochimica risulta che la forma di SNAP-25 tagliata da BoNT/A è rilevabile anche nell’ippocampo controlaterale a partire dal terzo giorno dall’iniezione.
Questa inaspettata evidenza potrebbe essere spiegata considerando un eventuale trasporto di BoNT/A o di 25 tagliata nell’ippocampo controlaterale. Sappiamo però che SNAP-25 tagliata da BoNT/A rimane sempre legata alla membrana presinaptica attraverso la palmitolazione di residui di Cisteina (Foran et al., 2003). Consideriamo quindi più probabile che il trasporto coinvolga unicamente la neurotossina.
Anatomicamente sappiamo che dalla CA3 partono proiezioni, chiamate fibre commisurali che collegano questa regione con le varie zone ippocampali dell’altro emisfero. Queste fibre collegano in primis le regioni CA3 dei due ippocampi e potrebbero rappresentare la via preferenziale seguita dalla tossina per raggiungere il lato non iniettato. Gli esperimenti di immunoistochimica eseguiti a 3 giorni dall’iniezione mostrano infatti che la marcatura per SNAP-25 tagliata è presente soprattutto a livello degli ingressi sinaptici ai neuroni piramidali nello stratum oriens e radiatum della regione CA3.
Sarebbe interessante riuscire a capire se il trasporto interemisferico è di tipo anterogrado o retrogrado. Poniamo il caso che il trasporto avvenga in senso anterogrado: la tossina dovrebbe entrare nel corpo cellulare dei neuroni piramidali della CA3 nell’emisfero iniettato, raggiungere il terminale assonale a livello della CA3 dell’emisfero controlaterale e qui effettuare il taglio proteolitico su SNAP-25. Studi recenti (Dong et al., 2006) mostrano come BoNT/A utilizzi specificatamente il recettore SV2 per entrare nei neuroni. SV2 è una proteina trasmembrana della membrana delle vescicole sinaptiche e quindi esposta unicamente a livello del terminale presinaptico. Il meccanismo di internalizzazione mediato da SV2 non giustifica quindi l’entrata della tossina nel soma neuronale.
Nell’eventualità che il trasporto sia retrogrado, la tossina dovrebbe entrare nel terminale presinaptico e raggiungere il corpo cellulare dei neuroni piramidali della CA3 controlaterale. A questo punto attraverso un meccanismo di transcitosi dovrebbe fuoriuscire dal corpo cellulare ed essere imternalizzata dalle terminazioni presinaptiche, perché è qui che si ritrova la marcatura per SNAP-25 tagliata. Un simile meccanismo di transcitosi è già stato descritto per la tossina tetanica che, dopo intossicazione, risale retrogradamente dalla giunzione neuromuscolare fino al corpo cellulare dei motoneuroni nelle corna ventrali del
midollo spinale, ed è poi reinternalizzata dai terminali presinaptici GABAergici afferenti agli stessi motoneuroni.
Il trasporto di BoNT/A che abbiamo osservato è comunque un tipo di trasporto lento perché SNAP-25 tagliata si rileva nell’ippocampo controlaterale a partire dal terzo giorno dall’iniezione.
L’unico modo per valutare se il trasporto riguarda la tossina o SNAP-25 tagliata è l’utilizzo di un anticorpo che riconosca la tossina botulinica di tipo A. Per capire se il trasporto è di tipo anterogrado o retrogrado abbiamo in programma specifici esperimenti basati su iniezione di BoNT/A nel sistema visivo. In particolare effettueremo l’iniezione a livello del collicolo superiore e valuteremo l’espressione di SNAP-25 tagliata nella retina per testare il possibile trasporto retrogrado della BoNT/A.
4.1.4 Effetto paradossale del trattamento con KA sull’azione proteolitica di BoNT/E.
È noto che nel Sistema Nervoso Periferico l’azione di BoNT/A è attività-dipendente: se il terminale nervoso viene stimolato ad alta fraquenza, la paralisi neuromuscolare avviene più rapidamente (Simpson et al., 1980).
A livello del SNC l’attività-dipendenza dell’azione delle BoNT rimane una questione ancora dibattuta. Esperimenti svolti su neuroni ippocampali in coltura mostrano che l’azione delle tossine BoNT/B e BoNT/F non è attività-dipendente: se i neuroni vengono incubati con le due tossine dopo depolarizzazione, non si rivela nessuna differenza nel taglio del target VAMP/Sinaptobrevina (Verderio et al., 1999).
Al contrario, i recenti risultati di Dong et al. (2006), mostrano come l’internalizzazione di BoNT/A sia attività-dipendente in neuroni ippocampali in coltura.
Sulla base di tutte queste osservazioni abbiamo voluto verificare se nel Sistema Nervoso Centrale in vivo l’azione di BoNT/E fosse influenzata dall’attività sinaptica. Risolvere tale questione risulta importante nell’ambito delle applicazioni terapeutiche di BoNT/E in neuropatologie dove l’attività sinaptica è molto elevata.
Contrariamente a quanto ci aspettavamo, abbiamo riscontrato una diminuizione paradossale, rispetto ai controlli, dell’attività proteolitica di BoNT/E su SNAP-25 negli animali trattati con KA, utilizzato sperimentalmente per aumentare l’attività elettrica cerebrale.
Dati presenti in letteratura (Xu et al., 2004) e dati non ancora pubblicati (Matteoli et al.), mostrano che aumenta il numero di molecole SNAP-25 fosforilate sulla Ser187 quando l’attività sinaptica è elevata. In particolare la somministrazione di KA nei topi aumenta i livelli di SNAP-25 fosforilata nell’ippocampo (Matteoli et al., dati non pubblicati; Fig. 24) Il residuo fosforilato si trova proprio in prossimità del sito di taglio di BoNT/E (residuo 180). Per spiegare la diminuizione dell’attività proteolitica in seguito al trattamento con KA, si potrebbe ipotizzare che la fosforilazione di Ser187 crei un ingombro sterico che rende inaccessibile il residuo 180 a BoNT/E. Esperimenti sono attualmente in corso per esaminare questo punto.
Per completare il quadro della caratterizzazione degli effetti di BoNT/A nel Sistema Nervoso Centrale, sarebbe inoltre interessante impiegare lo stesso protocollo sperimentale utilizzato per BoNT/E per vedere se l’attività proteolitica di BoNT/A su SNAP-25 è influenzata dall’attività elettrica.
salina KA
salina kainato 30 min
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Dens it à otti ca di P -S N A P ( no rm a lizzata r isp eto a lla t ubulina )
Fig. 24: Immunoblotting per SNAP-25 fosforlata (P-SNAP) effettuato sugli estratti proteici di ippocampo di
topi trattati con una somministrazione sistemica di KA. Come controllo è stata utilizzata la SNAP-25 totale non fosforilata e come standard interno, la β-tubulina . Il Western blot dimostra come, negli animali trattati con KA, rimane inalterata la quantità SNAP-25 totale mentre aumantano i livelli di SNAP-25 fosforilata. A fianco è mostrata la quantificazione biochimica dei livelli di P-SNAP. Si può notare come questi siano più elevati negli animali trattati con KA rispetto ai controlli.
4.1.4.1 Ruolo di SNAP-25 nell’eccitabilità neuronale
La fosforilazione attività-dipendente di SNAP-25 e i risultati ottenuti da Verderio et al., (2004) offrono uno spunto di riflessione sul ruolo di SNAP-25 nell’eccitabilità neuronale. Verderio e collaboratori mostrano infatti come SNAP-25 sia cruciale per la regolazione della dinamica intracellulare del Ca2+. Da esperimenti in vitro risulta che rispetto ai neuroni glutammatergici, che esprimono alti livelli di SNAP-25, i neuroni GABAergici, privi di SNAP-25, sono caratterizzati da un elevata responsività del Ca2+ alla depolarizzazione. Inoltre nei neuroni GABAergici che esprimono SNAP-25 ricombinante la dinamica intracellulare del Ca2+ diventa equivalente a quella dei neuroni gutammatergici e il silenziamento di SNAP-25 in questi ultimi aumenta notevolmente la responsività.
Gli autori identificano la porzione della proteina compresa tra i residui 180 e 197 come la regione implicata nel meccanismo di regolazione negativa e sostengono che potrebbe essere coinvolta l’interazione di SNAP-25 con il sensore per il Ca2+ sinaptotagmina in quanto tale interazione è mediata da alcuni residui amminoacidici della regione proteica identificata. Tutti questi dati suggeriscono che SNAP-25, e in particolare la porzione compresa tra i residui 180-197, potrebbe avere un ruolo di modulazione dell’eccitabilità neuronale. Questa regione contiene infatti i residui responsabili dell’interazione con la sinaptotagmina e il sito di fosforilazione Ser187. La fosforilazione attività-dipendente potrebbe in qualche modo influenzare la capacità di SNAP-25 di regolare la dinamica intracellulare del Ca2+.
Per le sue capacità di regolazione della responsività neuronale e, probabilmente, di modulazione dell’eccitabilità, SNAP-25 va considerata una proteina fondamentale per il funzionamento cerebrale in condizioni fisiologiche e patologiche.
4.2 Effetto neuroprotettivo di BoNT/E in un modello di ischemia
cerebrale focale
4.2.1 Modello di ischemia cerebrale focale utilizzato.
Il modello di ischemia cerebrale che abbiamo utilizzato si basa sulla somministrazione dell’ET-1 nella regione CA1 dell’ippocampo di ratti adulti.
L’ET-1 è un potente vacostrittore che blocca transitoriamente il flusso sanguigno nella zona di iniezione (Caleo et al., dati non pubblicati) ed è in grado di determinare una lesione ischemica dall’estensione media di 66000 μm con tutte le caratteristiche tipiche delle lesioni cerebrali, come l’attivazione astrocitaria.
Per questo motivo, tra i modelli di ischemia cerebrale focale, questo è quello che si presta meglio alla valutazione dell’effetto neuroprotettivo di BoNT/E. La dose di tossina che iniettiamo è infatti in grado di determinare il suo effetto in una zona circoscritta alla regione di iniezione e i classici modelli di ischemia cerebrale focale, come l’MCAO, determinano un danno cerebrale in una porzione dell’encefalo più grande. In una situazione come questa non si riuscirebbero a valutare appieno le proprietà neuroprotettive della tossina perchè il danno è troppo esteso. Nel nostro modello invece, il danno rimane ristretto alla zona di iniezione di ET-1 e la tossina viene iniettata proprio nella regione in cui si forma la lesione ischemica. In questo modo l’effetto neuroprotettivo di BoNT/E si può valutare più precisamente.
Per verificare le proprietà neuroprotettive di BoNT/E, siamo partiti dall’ipotesi che la degenerazione neuronale osservata in questo modello fosse innescata dall’eccessivo rilascio di gutammato dai neuroni danneggiati. Per verificare se effettivamente l’iniezione di ET-1 determini l’eccessivo rilascio di glutammato, sono in corso esperimenti per valutare, mediante registrazioni EEG, la presenza in animali iniettati, di fenomeni di eccitossicità e per vedere i cambiamenti che questi ultimi subiscono in animali trattati con BoNT/E rispetto ai controlli.
4.2.2 Finestra terapeutica di BoNT/E
Per poter applicare terapeuticamente BoNT/E nell’ischemia cerebrale, un punto importante da considerare è quale sia la finestra terapeutica di BoNT/E.
Nel nostro protocollo sperimentale la tossina viene iniettata dopo 20 minuti la somministrazione di ET-1, un periodo troppo ristretto per l’eventuale sperimentazione clinica.
Sarebbe opportuno quindi valutare se l’applicazione della tossina dopo periodi maggiori, sia in grado di determinare lo stesso effetto neuroprotettivo osservato nei nostri esperimenti. Per ora abbiamo provato ad iniettare BoNT/E a 3 ore dal trattamento con ET-1 e i risultati sembrano promettenti: a 24 ore diminuisce l’estensione della lesione ischemica negli animali trattati con BoNT/E rispetto ai controlli.
Bisogna comunque valutare ulteriori punti temporali per stabilire con esattezza la finestra temporale in cui le modificazioni molecolari e cellulari indotte dall’ET-1 risultino ancora parzialmente recuperabili dal trattamento con BoNT/E.
4.2.3 L’effetto neuroprotettivo di BoNT/E è a lungo-termine?
I nostri dati mostrano che a 24 ore dall’iniezione di ET-1 esiste una netta e significativa differenza in estensione del danno tra gli animali trattati con BoNT/E e quelli controllo iniettati con RSA.
Sebbene questo risultato sia molto promettente non è sufficiente ai fini dell’applicazione terapeutica di BoNT/E nell’ischemia cerebrale. Bisogna infatti verificare che la tossina conferisca neuroprotezione per lunghi periodi dall’instaurarsi del danno ischemico e per questo stiamo svolgendo esperimenti volti a chiarire tale questione. Abbiamo iniettato ratti adulti con ET-1 e dopo 20 min con BoNT/E o con la soluzione controllo ed andremo a valutare l’estensione del danno a circa un mese dall’iniezione di ET-1.
