II MATERIALI E METODI

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II

MATERIALI E METODI

Il lavoro affrontato presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie

dell'Università di Pisa aveva l'obiettivo di descrivere la situazione

epidemiologica del genere

Aspergillus

in Italia centrale e meridionale, mettendo in relazione i risultati ottenuti di resistenza e sensibilità nei

confronti degli antimicotici con i risultati di mera emergenza delle altre

nazioni europee. All'uopo ci siamo avvalsi di tecniche avvalorate da alto

coefficiente di attendibilità e riproducibilità, quale l'EUCAST, al fine di

caratterizzare con piena concordanza con i metodi europei il

comportamento del genere

Aspergillus

nei confronti dell'itraconazolo, antimicotico di largo uso sia in Medicina Veterinaria che Umana, con

meccanismo d'azione comune ad altri azoli impiegati come

anticrittogamici in campo agricolo.

2.1 Provenienza degli isolati

Sono stati eseguiti N. 96 campionamenti, ambientali e da lesioni aviari

compatibili con aspergillosi in diverse zone delle provincie di Pisa,

Livorno e Pistoia, e nella Regione Sicilia nella provincia di Siracusa. I siti

di prelievo sono stati selezionati allo scopo di cercare eventuali

correlazioni con la gestione agronomica delle aziende locali, e

caratterizzarli con collegamenti deduttivi tra le varie attività svolte nelle

sedi di campionamento, in virtù della presenza di allevamenti, e di

colture anche intensive.

Allo scopo, per i campionamenti ambientali, veniva compilata una

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anticrittogamici e dei principi impiegati.

La sperimentazione è stata suddivisa in due fasi. La prima consisteva

nell’isolamento ed identificazione delle colonie fungine, la seconda nella

effettuazione delle prove di sensibilità delle specie di aspergilli isolati

agli azoli.

La sperimentazione è stata effettuata presso il laboratorio di micologia

del Dipartimento di Scienze Veterinarie.

In relazione alle stagioni, i campionamenti sono stati effettuati da

gennaio 2011 a gennaio 2013 per quanto riguarda i substrati di origine

ambientale, mentre i campionamenti provenienti dai casi clinici sono

stati effettuati nella prima decade di Febbraio 2013.

La lavorazione dei campioni in laboratorio fino all'ottenimento dei

risultati finali sulla sensibilità in vitro degli isolati si è protratta fino alla

fine di Ottobre 2013.

I campioni seguono una numerazione crescente in base all'ordine di

lavorazione. I campioni provenienti dalla Regione Toscana saranno

preceduti nella numerazione dalla lettera T, i campioni provenienti dalla

Regione Sicilia saranno preceduti dalla lettera S, i campioni clinici

provenienti dal C.R.U.M.A. di Livorno saranno preceduti dalla lettera C:

per quest'ultima categoria la numerazione parte dal numero 1: C1, C2,

etc.

Tra i campioni ambientali di origine toscana sono stati esaminati n. 9

campioni provenienti da San Piero a Grado (T1-T9),

4

campioni provenienti da San Rossore (T10-T13),

11

campioni ambientali dal Cruma di Livorno (T14; T15), (T24-T26), (T30-T34). Altri

6

campioni sono stati

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prelevati a Pistoia (T18-T23) e per finire con la Toscana n.

28

campioni, T16 e T17 e da T47 a T72, provengono dalla provincia di Siena. Dalla

Sicilia invece provengono i campioni S28 e S29 e i campioni da S35 a

S46.

Un discorso a parte meritano i 24 campioni di casi clinici recuperati al

C.R.U.M.A. Salvo quando trattasi di lettiera proveniente da beccapesci

(

Thalasseus sandvicensis)

, i campioni sono stati recuperati da sacchi aerei, cloache, trachee di N. 19 gabbiani zampegialle (

Larus cachinnans

michahellis)

e di N.1 pappagalli cenerini (

Psittacus erithacus)

dopo l'effettuazione di esame autoptico. Tutti i volatili indagati con esame

autoptico mostravano segni clinici riferiti da esperti e macroscopici

compatibili con aspergillosi. Su questi è stato condotto un

campionamento tramite tampone dei già citati organi, dopodiché si è

proceduto con la messa in coltura su agar Sabouraud addizionato a

gentamicina per inibire la carica microbica. Il procedimento differisce

dallo studio dei casi ambientali solo nella prima semina per la differenza

di antibiotico usato, in quanto come sarà meglio visto nella sezione 2.2

dedicata alla metodologia d'isolamento per gli ambientali abbiamo

preferito usare cloramfenicolo secondo protocollo standard.

In Tabella N. 2.1 si elencano i substrati utilizzati per le indagini, nonché

numerazione e provincia di provenienza dei campioni/substrati.

Tabella N. 2.1 Substrato utilizzato Campio -ne N. Provincia di provenienza Scheda

anamnestica con principi impiegati

Terreno vicino Ospedale

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Veterinario Terreno appena

lavorato T 2 Pisa S. Piero a Grado / Terreno T 3 Pisa S. Piero a Grado

Insilato di mais T 4 Pisa S. Piero a Grado Insilato triticale T 5 Pisa S. Piero a Grado Prato T 6 Pisa S. Piero a Grado Sabbia umida T 7 Pisa S. Piero a Grado Lettiera cavalli T 8 Pisa S. Piero a Grado Paglia T 9 Pisa S. Piero a Grado Letamaia cavalli T 10 Pisa San Rossore Lettiera box T 11 Pisa San Rossore Lettiera box T 12 Pisa San Rossore Terreno adibito

a pascolo T 13 Pisa San Rossore Lettiera

gabbiani T 14 Livorno Cruma Lettiera

gabbiani T 15 Livorno Cruma Lettiera pulcini 20 gg T 16 Siena Lettiera pulcini 11 gg T 17 Siena Foglie rose trattate T 18 Pistoia N.D Terreno rose trattate T 19 Pistoia N.D Terreno rose

non trattate T 20 Pistoia /

Terreno per vasi

di rose T 21 Pistoia N.D

Terreno rose

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Terreno rose

trattate T 23 Pistoia N.D

Alimento per

volatili T 24 Livorno Cruma /

Lettiera

gabbiani T 25 Livorno Cruma /

Piume tordo T 26 Livorno Cruma / Lettiera capinera T 27 Livorno Cruma / Vinaccia residuo di mostificazione T 28 Siracusa / Residui palmento T 29 Siracusa / Lettiera

gabbiani cruma T 30 Livorno Cruma / Lettiera

gabbiani cruma T 31 Livorno Cruma / Lettiera cruma T 32 Livorno Cruma / Lettiera cruma T 33 Livorno Cruma / Lettiera

gabbiani cruma T 34 Livorno Cruma / Terreno carciofi S 35 Siracusa / Lettiera pecore

in disuso S 36 Siracusa /

Serra con rose e

Zucchine S 37 Siracusa /

Letamaia cavallo S 38 Siracusa / Lettiera conigli S 39 Siracusa / Serra garofani S 40 Siracusa

Terreno in

riposo S 41 Siracusa /

Letamaia di

origine canina S 42 Siracusa /

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gigli coltivati Ricoveri animali

vari S 44 Siracusa /

Letamaia pecore S 45 Siracusa / Letamaia cavallo S 46 Siracusa / Piantagione mais T 47 Siena / Piantagione grano T 48 Siena DISERBANTE PER DICOTILEDONI

Vigneto T 49 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME Vigneto T 50 Siena DIMETOMORF (azotorganici) RAME PENCONAZOLO METRAFENONE FOSETIL Al (fosforganici) Vigneto T 51 Siena DIMETOMORF (azotorganici) RAME PENCONAZOLO METRAFENONE FOSETIL Al (fosforganici) Fieno T 52 Siena / Lettiera conigliera T 53 Siena /

Oliveto T 54 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME Oliveto/Vigneto T 55 Siena DIMETOMORF (azotorganici) RAME PENCONAZOLO METRAFENONE FOSETIL Al (fosforganici) Piantagione alberi da frutto/Oliveto

T 56 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME

Oliveto/Vigneto T 57 Siena RAME ZOLFO MANCOZEB (ditiocarbammati)

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CIMOXANIL (acetammidi) FOSETIL Al (fosforganici) Piantagione pomodori T 58 Siena CLORPIRIFOS METILE (piridina) RAME Vigneto T 59 Siena MANCOZEB (ditiocarbammati) METALAXIL RAME ZOLFO Piantagione

insalata T 60 Siena /

Piantagione

cavoli T 61 Siena /

Fieno T 62 Siena /

Insilato mais T 63 Siena /

Oliveto T 64 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME

Piantagione

grano T 65 Siena

DISERBANTE PER DICOTILEDONI

Oliveto T 66 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME Vigneto T 67 Siena DIMETOMORF (azotorganici) RAME PENCONAZOLO METRAFENONE FOSETIL Al (fosforganici) Piantagione orzo T 68 Siena / Vigneto T 69 Siena DIMETOMORF (azotorganici) RAME PENCONAZOLO METRAFENONE FOSETIL Al (fosforganici)

Oliveto T 70 Siena DIMETOATO (fosforganici) RAME

Lettiera bovini

finissaggio T 71 Siena /

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finissaggio 1 cenerino

sacchi aerei C 1 C.R.U.M.A. /

1 cenerino trachea C 2 C.R.U.M.A. / 1 cenerino lettiera C 3 C.R.U.M.A. / 1 beccapesci lettiera C 4 C.R.U.M.A. / Gabbiano1 cloaca C 5 C.R.U.M.A. / Gabbiano2

Gabbiano3 C 7 C.R.U.M.A. / Gabbiano4 C 8 C.R.U.M.A. / Gabbiano5 C 9 C.R.U.M.A. / Gabbiano6 C 10 C.R.U.M.A. / Gabbiano7 cloaca C 11 C.R.U.M.A. / Gabbiano8 trachea C 12 C.R.U.M.A. / Gabbiano9

Gabbiano10 C 14 C.R.U.M.A. / Gabbiano11 cloaca C 15 C.R.U.M.A. / Gabbiano12 cloaca C 16 C.R.U.M.A. / Gabbiano12

Gabbiano13 C 18 C.R.U.M.A. /

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Gabbiano19

2.2 Metodologia d'isolamento

Due grammi del materiale in esame sono stati disciolti in 8 ml di acqua

distillata contenente l'1% di Tween (10ml/litro) e cloramfenicolo in

quantità pari a 0,5 g/litro. Il tutto veniva fatto riposare fino a 60 minuti.

Cento microlitri materiale così ottenuto sono stati inoculati in quattro

capsule Petri: due piastre con agar Sabouraud addizionato a

cloramfenicolo (0,5 gr/litro) e itraconazolo (4 mg/litro), le altre della

stessa composizione, ma priva di itraconazolo. Le piastre così preparate

venivano contrassegnate come piastre “ITZ+” e piastre “ITZ-”.

Dopo la semina, 1 coppia di piastre ITZ+ e ITZ- veniva posta ad incubare

a 37 °C, 1 coppia ITZ+ e ITZ- veniva invece posta ad incubare a

temperatura di 42 °C, per valutare la termotolleranza dell’isolato. Il

tempo di incubazione in entrambi i casi era fissato in 48 ore.

2.3 Identificazione di genere e specie

Le colonie venivano identificate come appartenenti al genere

Aspergillus

sulla base delle caratteristiche macro e microscopiche. L’identificazione

a livello di specie è stata effettuata su base fenotipica, utilizzando le

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2.4 Coltura in purezza degli identificati

Le specie identificate come appartenenti al genere

Aspergillus

venivano mantenute in coltura su terreno di Czapeck, per effettuare le successive

indagini.

2.5 Creazione inventario delle specie isolate

Gli isolati così ottenuti sono stati utilizzati per le prove di sensibilità in

vitro effettuate con metodo EUCAST. Dapprima le colonie pure venivano

riseminate in terreno Czapek e, dopo incubazione a 25 gradi, in seguito

a crescita avvenuta, una quantità di 5 ml di acqua sterile contenente lo

0,1% di Tween 20 veniva versata sulle piastre. Dopodiché tramite una

spatolina si cercava di liberare i conidi dal resto della colonia, così da

renderle singolarmente visibili al microscopio e permetterne la conta di

ogni singola spora sul reticolo di una camera Thoma.

2.6 Prove di sensibilità con metodo della microdiluizione seriale

(EUCAST E.DEF 9.1)

Consta di 5 fasi

•

preparazione del brodo di coltura RPMI 1640

•

preparazione di 10 provette contenente 10 ml di RPMI 1640

ciascuna dove ogni provetta doveva avere concentrazione di

itraconazolo da 0,0156 mg/L a 8 mg/L. Le provette venivano

numerate da 1 a 10 con concentrazioni decrescenti di itraconazolo

(da 8 mg/L a 0,0156 mg/L).

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compresa tra 2- 5 x 105 CFU/mL da saggiare con le diluizioni

8 mg/L

1 4 mg/L

2 2 mg/L

3 1 mg/L

4 0,5 mg/L

5 0,25 mg/L

6 0,125 mg/L

7 0,0625 mg/L

8 0,03125 mg/L

9 0,0156 mg/L

10

Tutte le determinazioni sono state eseguite in doppio.

Lettura dei campioni e valutazione

delle MIC:

avvalendosi di uno

stereomicroscopio potevano

essere individuati i pozzetti in cui

la crescita micotica aveva avuto

luogo. I pozzetti per essere

positivi dovevano essere

impegnati dai miceti per l'intera

area coperta da terreno, piccoli

spot non sarebbero stati indicativi di crescita.

I valori delle MICs venivano poi valutati sulla base dei valori di

breakpoint utilizzati dal “

Mycology Reference Centre Manchester”

per la specie di

A. niger

, e con i dati esposti dall'EUCAST (Antifungal Clinical

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Breakpoint) in data 11 Marzo 2013, per l'assegnazione delle classi di

sensibilità per le restanti specie identificate:

A. fumigatus, A. flavus, A.

terreus

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