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Capitolo 3

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Animali

In tutti i protocolli sperimentali sono state utilizzate planarie (Platelminti, Tricladi) asessuate, appartenenti al clone GI di Dugesia japonica (Orii et al., 1993). Gli animali sono stati allevati in acqua di ruscello autoclavata alla temperatura di 18°C, nutriti con fegato di pollo e tenuti a digiuno per una o due settimane prima del loro utilizzo negli esperimenti.

Irradiamento con raggi X

Planarie intatte sono state esposte a 1, 2, 3, 5, 10, 15 o 30 Gray (Gy) di raggi X (200 KVp, 12 mA, 1 Gy/min) mediante l’utilizzo di un apparecchio Stabilipan (Siemens, Gorla-Siama, Milano, Italia) equipaggiato con un dosimetro Radiation Monitor 9010 (Radcal Corporation, Monrovia, CA, USA). Gli animali sono stati sacrificati a:a) 1,2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 23, 27 o 40 giorni dopo l’irraggiamento per gli esperimenti di ibridazione in situ; b) 4, 7, 11, 14 giorni dopo l’irraggiamento per gli esperimenti di immunoistochimica; c) 11 giorni dopo l’irraggiamento per l’analisi al TEM; d) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 25 o 30 giorni dopo l’irraggiamento per la conta delle cellule in fase S e in mitosi; e) 1, 3, 7, 12 giorni dopo l’irraggiamento per l’analisi al FACS. Per gli esperimenti in rigenerazione, gli animali sono stati tagliati 60 ore dopo l’irraggiamento e sacrificati dopo 15, 21 o 28 giorni dopo il taglio per l’ibridazione in situ whole mount. In alcuni esperimenti, le planarie sono state trattate con i 5 Gy, lasciate in acqua per 30 giorni e irradiate di nuovo con una dose di raggi X di 5 Gy. Dopo questo secondo irraggiamento, gli animali sono stati sacrificati 2, 4, 7 o 14 giorni per l’ibridazione in

situ whole mount. Come controllo sono stati utilizzati animali non irradiati.

Isolamento di DjRbAp48 e DjPHB2

La sequenza completa dei due cloni è stata ottenuta mediante l’impiego della tecnica della 3’-5’ RACE, che permette l’amplificazione della sequenza genica di interesse, tra una regione già caratterizzata di un cDNA e le estremità 3’ o 5’, mediante l’utilizzo del kit SMART RACE cDNA (Clontech). I primers sequenza-specifici, progettati sulla base della sequenza EST presente in banca dati, sono i seguenti:

Per la 5’-RACE, i primer antisenso (AS1):

Per PHB2: 5’-GCTTCCTTCGGCATTGACTATT-3’ Per RbAp48: 5’ TTTTCCCTCTGGGCAAGTTACTTC 3’ Per la 3’-RACE, i primer senso (S1):

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Per PHB2: 5’-GTTTTCTAAAACAATACGGCGAAGCA-3’ Per RbAp48 : 5’TCGGTGGTTTCGGATCTGTTAATG3’

I prodotti ottenuti da questa metodica sono stati ulteriormente amplificati con una Nested PCR, utilizzando primers sequenza specifici. In particolare, per la Nested PCR sull’amplificato della 5’-RACE di PHB2, è stato utilizzato il primer antisenso (AS2): 5’-TTGGGCTCGCTGAGCTTCTTGTT -3’

Per la Nested PCR sull’amplificato 3’-RACE, sono stati utilizzati i primer senso (S2): Per PHB2: 5’-GCATCAGAGAAAATCGAAGAAC -3’

Per RbAp48: 5’ ACACGAAACATCCCGCTAAACCC 3’

Clonaggio dei prodotti di amplificazione in plasmide e screening bianco/blu delle colonie

I prodotti di amplificazione ottenuti dalla Nested PCR sono stati purificati da gel utilizzando il kit DNA purification Wizard (Promega) e clonati nel plasmide pGem-T Easy (Promega). Il plasmide viene fornito già linearizzato e possiede una deossitimidina sporgente ad entrambe le estremità 3'. Questo vettore è particolarmente adatto per la clonazione di prodotti di PCR poiché questi possiedono una deossiadenosina alle terminazioni 3’, aggiunta dalla Taq polimerasi al termine della reazione di amplificazione.

È possibile ottenere una reazione di ligation fra plasmide e frammenti di DNA, utilizzando la T4 DNA ligasi (Promega), un enzima che forma ponti fosfodiesterici in corrispondenza dei punti di interruzione. La quantità di prodotto di PCR necessaria per la reazione di ligation è in funzione della concentrazione, della lunghezza del vettore plasmidico e della lunghezza del DNA esogeno. Dopo aver effettuato una breve centrifuga del vettore pGEM-T Easy per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo, è stata messa a punto la seguente reazione di ligation (volume finale 10 μl):

Buffer 2x Rapid Ligation, T4 DNA Ligasi 5 μl Vettore pGEM-T Easy (50 ng) 1 μl

Prodotto di PCR X μl

T4 DNA Ligasi (3 Weiss units / μl) 1 μl H2O deionizzata a volume

La reazione è stata lasciata a 4°C per tutta la notte.

In seguito, i prodotti di ligation sono inseriti in cellule di Escherichia coli (ceppo DH5α) competenti: queste cellule, una volta messe in coltura, in presenza di

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ampicillina, potranno crescere soltanto se correttamente trasformate con il plasmide pGem-T Easy, che possiede un sito di resistenza verso questo antibiotico. In particolare, il protocollo utilizzato è il seguente: devono essere preparate due piastre LB / ampicillina / IPTG / X-Gal per ogni reazione di ligation, più due piastre per determinare l’efficienza di trasformazione. Tutte le piastre devono essere equilibrate a temperatura ambiente prima di effettuare la piastratura. I tubi contenenti le reazioni di ligation devono essere centrifugati per far precipitare il contenuto sul fondo. 2 μl di ogni reazione devono essere messi in tubi sterili da 1,5 ml, posti in ghiaccio. Un ulteriore tubo da 1,5 ml deve essere posto in ghiaccio, in cui deve essere messi 0,1 ng di plasmide non tagliato per determinare l’efficienza di trasformazione delle cellule competenti. Dopo aver scongelato ed agitato delicatamente i tubi contenenti le cellule competenti di E. coli, 50 μl di cellule sono trasferiti in ciascun tubo preparato precedentemente, 100 μl nel tubo per determinare l’efficienza di trasformazione. Dopo averli agitati delicatamente, i tubi vengono lasciati in ghiaccio per 20 minuti. A questo punto le cellule sono sottoposte ad uno shock termico, ponendo i tubi per 45 secondi a 42°C in bagnetto, quindi riportati in ghiaccio per 2 minuti. Lavorando a temperatura ambiente, vengono aggiunti 950 μl di SOC medium ai tubi contenenti le cellule trasformate con i prodotti della reazione di ligation, 900 μl in quelli contenenti le cellule trasformate con plasmide non tagliato. I tubi vengono messi in incubazione a 37°C per 1 ora e 30 minuti, in agitazione. Ogni coltura trasformata può essere, quindi, piastrata in duplice copia sulle piastre LB/ampicillina/IPTG/X-Gal, lasciate in incubazione overnight a 37°C per permettere alle cellule di proliferare e formare colonie. Le colonie sono state sottoposte a screening bianco-blu: le colonie con plasmidi aventi l’inserto presentano colore bianco, quelle con plasmidi che si sono chiusi senza legare la sequenza amplificata dalla Nested PCR hanno colore blu. La differenza di colorazione delle colonie avviene grazie alla presenza nel plasmide del gene reporter della β-Galattossidasi (β-Gal), all’interno del quale è presente il polilinker. Se è stato clonato un inserto, ilgene della β-Gal risulta interrotto e non più in grado di codificare per una proteina funzionale. Sul terreno di coltura è presente una sostanza cromogena, analoga al galattosio, l’X-Gal, che, se digerita dall’enzima β-Gal, produce un precipitato di colore blu che caratterizza le colonie con cellule possedenti un plasmide privo di inserto. Le cellule che possiedono un plasmide con l’inserto e prive, quindi, di un enzima funzionale, non sono in grado di metabolizza l’XGal e la colonia rimane bianca.

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Nel terreno di coltura è anche presente Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG), analogo del lattosio, che funge da attivatore della reazione catalizzata dalla β-Gal.

Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina (mini-prep)

Tale metodo permette di estrarre 2-20 μg di DNA plasmidico da cellule trasformate per successiva digestione con enzimi di restrizione. A partire da una colonia di

Escherichia coli recante il plasmide di interesse prelevata da piastra o da uno stock di

batteri in glicerolo al 10%, viene effettuato, in maniera sterile, un inoculo in un tubo batteriologico da 10-15 ml contenente 3 ml di brodo di coltura LB (5 g yeast extract, 10 g NaCl, 10 g bactotriptone pH = 7/litro) con ampicillina (100 μg/ml). Il tubo è incubato per 12-16 ore a 37°C in agitazione affinchè la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene quindi centrifugata per ottenere un pellet di cellule batteriche che viene risospeso in 200 μl di soluzione 1 (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA) contenente anche 400 μg/ml RNAsi I allo scopo di eliminare l’RNA. A questa sospensione si aggiungono 200 μl di soluzione 2 (0.2 M NaOH, 1% SDS). La reazione di lisi alcalina non deve procedere per una durata superiore a 5’, trascorsi i quali si aggiungono 200 μl di soluzione 3 (3M KAcetato, 11.5% acido acetico), necessaria a far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico. Dopo una centrifugazione viene recuperata la fase acquosa, contenente il DNA plasmidico e le proteine batteriche. Si aggiungono 0.7 volumi di isopropanolo alla fase acquosa e si lascia 10 minuti a temperatura ambiente. In questo modo il DNA plasmidico precipita e sarà recuperato mediante centrifugazione. Seguono il lavaggio del pellet in EtOH-70% e la sua risospensione in H2O.

Estrazione di DNA plasmidico su media scala (midi-prep)

Per poter disporre di maggiori quantità di DNA si effettua un’estrazione del DNA plasmidico per mezzo di colonnine cromatografiche a scambio anionico, incluse nel kit NUCLEOBOND © AX-100 (Eppendorf). Con questa tecnica è possibile estrarre da 80 a 140 μg di DNA altamente purificato a partire da 100 ml di sospensione batterica.

Digestione di DNA con enzimi di restrizione

I cloni ricombinanti sono stati digeriti utilizzando l’enzima di restrizione EcoRI (Promega). Due siti di restrizione per questo enzima, localizzati lateralmente alla

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regione in cui viene inserito il DNA esogeno, sono presenti nel sito di clonaggio multiplo del vettore pGem-T Easy vector (Promega).

Estrazione di RNA totale e produzione di cDNA

RNA totale è stato estratto da planarie intatte mediante l’utilizzo del kit NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel). 1μg di RNA totale è stato retro trascritto mediante l’utilizzo del kit Superscript First Strand Synthesis System for RTPCR (Invitrogen).

Esperimenti di interferenza genica

Per il silenziamento genico, sono state adoperate piccole molecole di RNA a doppio filamento. Le planarie sono state iniettate nell’intestino, a livello della branca anteriore, utilizzando il microiniettore Nanoject (Drummond Scientific Company).

Queste molecole una volta iniettate nell’animale, vengono processate all’interno delle cellule diventando molecole a singolo filamento e, appaiandosi specificamente con l’mRNA endogeno complementare, ne favoriscono la degradazione da parte di enzimi specifici impedendo che possa esprimersi.

Il dsDjPiwi-1 è stato ottenuto come descritto in Rossi et al. (2006).

I dsDjPHB2 e dsDjRbAp48, sono prodotti mediante reazione di trascrizione. Nella reazione di trascrizione sono necessari 500 ng di DNA: questo quantitativo è ottenuto dall’amplificazione di cDNA di planaria mediante PCR, utilizzando i seguenti primers: Per dsDjPHB2:

Primer Senso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAATTACTGATTTATCGTTTTC-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

Primer Antisenso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAAACAACACTACAAAAACTTTCC-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

Per dsDjRbAp48: Primer Senso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATGATTTGGTAATGACTCATGCT-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

Primer Antisenso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTTAATCTAAGATCGG-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

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Il cDNA e tali primers sono stati utilizzati nella seguente reazione di PCR: 1 ciclo a 94°C per 15 minuti per l’attivazione della Hot-start taqpolimerasi (Quiagen);

5 cicli da: 30 secondi a 94°C - 45 secondi a 54°C - 45 secondi a 72°C; 30 cicli da: 30 secondi a 94°C - 45 secondi a 68°C - 45 secondi a 72°C; 1 ciclo di allungamento da 5 minuti a 72°C.

500 ng di amplificato sono stati utilizzati nella seguente reazione di trascrizione (volume finale 20 μl):

DNA x μl

Buffer 10x (Ambion) 2 μl rNTP 5x 4 μl

RNA pol T7 (Ambion) 2 μl H2O nuclease-free a volume

La soluzione è stata lasciata per 2 ore e 30 minuti alla temperatura di 37°C, dopo di che è stato aggiunto 1 μl di DNAasi-1 (Ambion) e lasciati per altri 30 minuti a 37°C, quindi o.n. a -20°C.

Vengono unite due reazioni di trascrizione, ottenendo un nuovo volume totale di 40 μl, ad ognuno dei quali vengono aggiunti 380 μl di Stop Buffer (NH4OAc 10 M, EDTA 0,5 M, SDS 10%/H2O ribonuclease free), quindi 200 μl di fenolo/cloroformio. Dopo aver agitato con il vortex la soluzione, si effettua una centrifuga a 12.000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Alla fase acquosa prelevata, vengono aggiunti altri 200 μl di fenolo/cloroformio, agitato il tutto con vortex e centrifugato a 12.000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. La fase acquosa viene quindi trasferita in eppendorf da PCR (100 μl ciascuna) e messa nella macchina da PCR con il seguente programma: 70°C, 15 minuti – 67°C, 3 minuti – 63°C, 3 minuti – 60°C, 3 minuti – 57°C, 3 minuti – 53°C, 3 minuti – 50°C, 3 minuti – 47°C, 3 minuti – 43°C, 3 minuti – 40°C, 3 minuti – 37°C, 1 ora – 30°C, 10 minuti – 20°C, 10 minuti Successivamente, il dsRNA viene precipitato aggiungendo 1 ml di EtOH- 100%. Dopo aver agitato con il vortex, viene effettuata una centrifugata a 12.000 rpm per 15 minuti a 4°C. Al pellet è, quindi, aggiunto 1 ml di EtOH- 80% ed effettuata una centrifuga a 12.000 rpm per 10 minuti a 4°C. Il pellet così ottenuto viene risospeso in 5 μl di H2O ribonuclease-free (RF).

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Protocolli di iniezione di RNA a doppia elica (dsRNA)

Planarie intatte sono state iniettate con dsDjPiwi-1 per 4 giorni consecutivi e poi irradiati con una dose di raggi X di 5 Gy. Una settimana dopo la prima serie di iniezioni, gli animali irradiati sono stati nuovamente iniettati una volta e poi fissati per gli esperimenti di ibridazione in situ whole mount 2, 4, 7 giorni dall’irraggiamento.i controlli negativi sono stati iniettati con double strand per la βGal o acqua.

Planarie intatte sono state iniettate con DjPHB2 o DjRbAp48 per 4 giorni consecutivi, a seguito dei quali viene effettuato il primo taglio sopra al faringe per lo studio di planarie in prima rigenerazione, oppure, per lo studio nelle planarie intatte, non si esegue il taglio, ma vengono continuate le iniezioni 2 volte alla settimana, fino alla morte dell’animale. Anche su animali in prima rigenerazione vengono effettuate iniezioni 2 volte a settimana e, al settimo giorno dall’inizio del protocollo, può essere effettuato un ulteriore taglio al fine di eliminare il blastema rigenerativo (per lo studio di planarie in seconda rigenerazione). Agli animali amputati sono state somministrate dosi di dsDjPHB2 o dsDjRbAp48 2 volte a settimana, fino alla morte dell’animale.

Per gli esperimenti di terza e quarta rigenerazione, i frammenti di coda sono stati tagliati all’undicesimo e quindicesimo giorno dopo la prima iniezione, rispettivamente.

Animali iniettati con lacZ dsRNA o acqua sono stati utilizzati come controlli negativi.

Gli animali iniettati sono stati osservati giornalmente con uno stereo microscopio Wild Heerbrugg.

Produzione sonde

Gli stampi di DNA per la reazione di trascrizione di sonde a RNA sono stati preparati: per DjPiwi-1 come descritto in Rossi et al., (2006), per DjAHNAK e

DjRbAp48 come descritto in Rossi et al. (2007); per DjMCM2 e DjSyt come descritto in

Salvetti et al. (2000); per DjPum come descritto in Salvetti et al. (2005); per CIP29 come descritto in Rossi et al. (2007).

Le sonde ad RNA per il gene DjPHB2, Djnos e Djinx1 sono state ottenute utilizzando come stampo prodotti di PCR. Dalle sequenze dei rispettivi geni sono stati disegnati i seguenti primers:

Per DjPHB2:

Primer Senso: 5’-CAGAGTACGCGGGGGCATTT-3’ Primer Antisenso:

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5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTACTCTCAGAGAAATATTCACC-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

Per Djnos:

Primer senso: 5’- CTTTGGCAATCGGTAACTTC-3’ Primerantisenso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAAGAATTTGAAGAGATAGGAC-3’ (in corsivo: sequenza del promotore T7)

Per Djinx1:

Primer senso: 5’- CAATCCCGAAACTGCAAGAAA-3’ Primer antisenso:

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACATATTTTCTACTACCGAATCC-3’ Il cDNA e tali primers sono stati utilizzati nella seguente reazione di PCR:

1 ciclo a 95°C per 5 minuti per l’attivazione della Hot-start taq-polimerasi (Promega); 40 cicli da: 30 secondi a 95°C - 1 minuti a 57°C - 1 minuti a 72°C;

1 ciclo di allungamento da 5 minuti a 72°C.

Il prodotto della PCR ottenuto per ciascun gene, è stato analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio, purificato con il kit DNA purification Wizard (Promega) e utilizzato come stampo per la produzione di sonde a RNA marcate con digossigenina (Dig).

1 μg di DNA plasmidico linearizzato o 300 ng di amplificato sono stati utilizzati nella seguente reazione di trascrizione (volume finale 20 μl):

DNA x μl

5x Buffer di trascrizione 4 μl

100 mM DTT 2 μl

10x DIG RNA labelling mix (Roche) 2 μl

RNA pol T7 (Promega) 1 μl

H2O nuclease-free a volume

La soluzione è stata lasciata per 2 h e 30 minuti alla temperatura di 37°C, dopo di che è stato aggiunto 1 μl di DNAasi-1 (Ambion) per 30 minuti a 37°C e successivamente 2 μl di EDTA 200 mM, 2,5 μl di LiCl 4 M e 75 μl di EtOH al 100% RF. Dopo incubazione overnight (O/N) a -20°C la sonda è stata precipitata centrifugando a 12.000 rpm per 30 minuti alla temperatura di 4°C. Il pellet è stato quindi lavato con 300 μl di EtOH al 70% RF, e nuovamente centrifugato a 12.000

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rpm per 5 minuti a 4°C. Il pellet ottenuto è stato risospeso in 20 μl di H2O

nuclease-free e la sonda è stata quantificata mediante corsa elettroforetica in parallelo con un marcatore di quantità. Gli esperimenti di ibridazione in situ whole mount sono stati condotti utilizzando il metodo descritto da Agata et al. (1998). Planarie intatte e rigeneranti sono state trattate con acido cloridrico al 2% diluito in Holtfreter, fissate in Carnoy e depigmentate in acqua ossigenata/metanolo. L’ibridazione è stata condotta utilizzando 200 ng/ml di sonda marcata con digossigenina (Dig) per 72 ore a 55°C. Il segnale è stato rivelato mediante l’utilizzo di anticorpi anti-Dig coniugati con la fosfatasi alcalina e incubando i campioni in AP buffer con 340 μg/ml di NBT e 175 μg/ml di BCIP (Boehringer). Maggiori dettagli possono essere ottenuti consultando la TABELLA A.

TABELLA A

Ibridazione in situ whole mount

SOLUZIONE Temperatura Tempo

2%HCl/5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

Carnoy 4°C 2 ore

Metanolo -20°C 1 ora

5%H2O2/Metanolo TA 20 ore

70%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C -20°C

50%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

30%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

0,1%Triton-X-100/PBS (TPBS)(3 lavaggi) 4°C-TA-37°C 10 minuti

20μg/ml Proteinasi K/TPBS 37°C 6 minuti

5/8 Holtfreter 4°C 1 minuto

4% Formalina/5/8 Holtfreter 4°C 1 ora

5/8 Holtfreter 4°C 1 minuto

5/8 Holtfreter 4°C 1 ora

Trietanolammina in H2O (2 lavaggi) TA 15 minuti

Trietanolammina + 0,25% Anidride Acetica TA 15 minuti Trietanolammina + 0,50% Anidride Acetica TA 15 minuti 5/8 Holtfreter TA 1 minuto Preibridazione 55°C 1 ora Ibridazione 55°C 56 ore 50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 5 minuti 50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 1 ora 50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 1 ora 50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 1 ora

MAB 1X/ 0,1%Triton (Buffer I) TA 5 minuti

Buffer I TA 30 minuti

1%blocking/Buffer I (Buffer II) TA 30 minuti

1:2000AntiDIG/Buffer II TA 3 ore

Buffer I TA 5 minuti

Buffer I TA 1 ora

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Buffer I TA 1 ora AP buffer TA 5 minuti 340 μg/ml di NBT + 175 μg/ml di BCIP in AP buffer TA or 37°C TA or 37°C TE TA 10 minuti 50%glicerolo/10%metanolo/TE 4°C

5/8 Holtfreter: per 1 litro, NaCl 2.188 gr, KCl 0.031 gr, CaCl2 0.063 gr,

NaHCO3 0.125 gr.

Carnoy: 60% EtOH, 30% Cloroformio, 10% Acido acetico.

PBS: per 1 litro, KCl 0.031 gr, NaCl 8 gr, KH2PO4 0.2 gr, Na2HCO3x2H2O 1.44

gr.

Trietanolammina: in 600 ml, 8 ml di trietanolammina, H2O RF a volume, HCl

per portare il pH a 7.6 (ca. 3 ml).

Preibridazione: 50% formammide, 5XSSC, 0,1 mg/ml RNA di lievito, 0,1

mg/ml eparina, 0,1% Tween 20, 10 mM DTT.

Ibridazione: 50% formammide, 5XSSC, 0,1 mg/ml RNA di lievito, 0,1 mg/ml

eparina, 10% Dextran-solfato, 0,1% Tween 20, 10 mM DTT, 200 ng/ml Sonda a RNA marcata.

SSC 20x: per 1 litro, NaCl 175.3 gr, Na-citrato 88.2 gr.

MAB 5x: per 1 litro, Acido maleico 58 gr, NaCl 43.85 gr, pH 7.5. AP buffer: 0.1M Tris HCl, 0.1 M NaCl.

TE: 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA.

Ibridazione in situ su sezioni

Gli esperimenti di ibridazione in situ su sezioni sono stati condotti utilizzando il metodo descritto da Kobayashi et al. (1998). Le planarie sono trattate in 2% acido cloridrico e fissate in 2% formaldeide/0,2% acido picrico saturo per 30’, in 2% formaldeide/0,2% acido picrico saturo/0,1% glutaraldeide per 1h e infine in in 2% formaldeide/0,2% acido picrico saturo per 2h. Gli organismi sono successivamente disidratati ed inclusi in paraffina seguendo procedure standard. Sezioni al microtomo di 6 µm sono deparaffinate, idratate e permeabilizzate con proteinasi K (Sigma). L’ibridazione è condotta in 50% formammide, 5XSSC, 0,1 mg/ml RNA di lievito, 0,1mg/ml eparina, 10% Dextran-solfato, 0,1% Tween 20, 10mM DTT e 100ng di sonda marcata con digossigenina per 16h a 55°C. La rivelazione è la stessa di quella effettuata per l’ibridazione in situ whole mount.

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TABELLA B:

Ibridazione in situ su sezioni

2% HCl 5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

2% Formaldeide, 0,2% acido picrico saturo

4°C 30minuti

2% Formaldeide, 0,2% acido picrico saturo, 0,1% glutaraldeide

4°C 1ora

2% Formaldeide, 0,2% acido picrico saturo

4°C 2 ore

30% EtOH/5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

100% EtOH 4°C 30 minuti 100% EtOH 4°C 30 minuti 20% xilolo/EtOH 4°C 15 minuti 33% xilolo/EtOH 4°C 15 minuti 50% xilolo/EtOH 4°C 15 minuti 70% xilolo/EtOH 4°C 15 minuti Xilolo100% 4°C 15 minuti

Xilolo caldo 60°C 15 minuti

50% Xilolo/50% paraffina 60°C 20 minuti

paraffina 60°C 20 minuti

paraffina 60°C 10-13 ore

Inclusione in piastre petri, montaggio e taglio di fette di 5µm

Xilolo RT 15 minuti

Etoh 100% 4°C 5 minuti

Etoh 90%/5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

TPBS 4°C 5 minuti

20µm/ml proteinasi K/TPBS 37° 6 minuti

5_/

8 Holtfreter 4% 1 minuto

4% formalina 5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

5_/ 8 Holtfreter 4°C 1 minuto 5 /8 Holtfreter 4°C 30 minuti Trietanolammina 0,1 M, 0,09% HCl, 0,25% anidride acetica 4°C 15 minuti 5_/ 8 Holtfreter 4°C 1 minuti 2x SSC TA 5 minuti Preibridazione 55°C 30 minuti Ibridazione 55°C 16 ore 50% formammide/5xssc/tween20 55°C 1 minuto 50% formammide/5xssc/tween20 55°C 30 minuti 50% formammide/5xssc/tween20 55°C O/N 50% formammide/5xssc/tween20 55°C 15 minuti 50% formammide/5xssc/tween20 55°C 15 minuti 2x SSC TA 15 minuti 2x SSC TA 15 minuti MAB 1X TA 5 minuti MAB 1X TA 15 minuti 1% blocking/MAB 1X TA 30minuti

1:2000 Anti DIG antibody TA 2 ore

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MAB 1X TA 30 minuti MAB 1X TA 30 minuti MAB 1X TA 30 minuti AP buffer TA 10 minuti 80 µg/ml NBT+175 µg/ml BCIP 14°C 10-13 ore TE TA 10 minuti

4% formalina / 5/8 Holtfreter TA 10 minuti

5/8 Holtfreter TA 1 minuto

Chiusura vetrini ed analisi microscopica

Trattamento con colchicina

Al fine di bloccare le mitosi, gli animali sono stati immersi in una soluzione di colchicina al 3‰ in acqua per 6 ore, dopo di che sono stati processati per l’analisi dell’indice mitotico e per esperimenti di immunolocalizzazione con anticorpo contro H3 fosforilato.

Analisi delle mitosi

Per ottenere cellule dissociate del corpo degli animali, è stata effettuata una macerazione dei campioni trattati con colchicina: ogni planaria è stata lasciata 20 ore a 4°C in 250 μl di una soluzione contenente glicerolo, acido acetico e acqua sterile con un rapporto di 1:1:13. Dopo le 20 ore, è stato aggiunto colorante Hoescht ad una concentrazione di 20 μg/ml.

20 μl di macerato con Hoescht sono stati deposti su vetrini poli-D-lisinati, lasciati asciugare per circa 2 ore a temperatura ambiente ed infine montati per analisi al microscopio (5 minuti in PBS e chiusura dei vetrini in glicerolo/PBS (2:1)). L’indice mitotico è stato calcolato analizzando i preparati al microscopio a fluorescenza Axioplan (Zeiss) e il numero di cellule totali è stato contato mediante l’utilizzo di un ematometro.

Colorazione preparati istologici con ematossilina ed eosina

Come coloranti dei preparati istologici sono stati utilizzati l’ematossilina e l’eosina: il primo un colorante basico di colore blu-viola che va ad evidenziare i nuclei, il secondo un colorante acido di colore rosa-fucsia che, invece, mette in evidenza i citoplasmi.

Le planarie sono state fissate, incluse in paraffina, tagliate al microtomo e poste su vetrini gelatinati (vedi paragrafo successivo), quindi le fette ottenute sono state deparaffinate e colorate, seguendo il protocollo descritto in TABELLA C.

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TABELLA C

Inclusione in paraffina e colorazione in ematossilina ed eosina SOLUZIONE Temperatura Tempo

HCl/Holtfreter 4°C 5 minuti

Liquido di Bouin 4°C 15 ore

EtOH/5/8 Holtfreter 50% (5 lavaggi) 4°C 30 minuti ciascuno

EtOH/5/8 Holtfreter 70% 4°C 30 minuti

EtOH/Holt 100% 4°C 30 minuti

2 ml EtOH 100% TA 5 minuti

Aggiunta xilolo graduale: 0.5, 0.5, 0.5, 1 e 3 ml TA 15 minuti ciascuno

Xilolo assoluto TA 15 minuti

50% Xilolo – 50% Paraffina 60°C 20 minuti

Paraffina (x3) 60°C 20 minuti ciascuno

Inclusione in petri TA 4°C

Preparazione di sezioni con 6 μm di spessore. Sono stati utilizzati vetrini gelatinati

Xilolo (x2) TA 15 minuti ciascuno

EtOH 100% TA 5 minuti

EtOH/5/8 Holtfreter 95% TA 5 minuti

Ematossilina 1:10 TA 3 minuti

Acqua distillata TA 1 minuto

Eosina TA 3 minuti

Acqua distillata TA 30 secondi

EtOH 95%/Acqua distillata TA 30 secondi

EtOH 100% TA 30 secondi

Xilolo TA 5 minuti

Montare con BIOMOUNT Mounting Medium (British BioCell International)

Liquido di Bouin: soluzione satura acquosa di acido picrico 15/21, formalina

5/21, acido acetico glaciale 1/21.

Analisi ultrastrutturali al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Sono stati fissati piccoli frammenti ricavati dalla zona di interesse seguendo il protocollo, descritto in TABELLA D.

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TABELLA D

Fissazione in ultrastruttura

Tampone cacodilato 0.2 M, pH 7.4 4°C 5 minuti

2.5% Glutaraldeide/Tampone cacodilato 0.1M 4°C 1 ora

Tampone cacodilato 0.1M (2 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

1% Osmio/Tampone cacodilato 0,2M TA 2 ore

Tampone cacodilato 0,1M (2 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

EtOH: 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100% (x3) TA 10 minuti ciascuno

OxPropilene (3 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

EPON/OxPropilene 1:1 TA O/N

EPON/OxPropilene 2:1 TA 5 ore

EPON 60°C 48 ore

Le sezioni ultrafini, ottenute mediante l’utilizzo di una lama diamante (Micro Star) e di un ultramicrotomo (Ultracut Reichert-Jung ultramicrotome), vengono poste sopra dei retini di rame, e colorate con acetato di uranile e citrato di piombo. L’osservazione dei preparati è stata condotta con un microscopio elettronico a trasmissione Jeol 100 SX.

Per visualizzare le cellule marcate con BrdU al TEM, gli animali sono stati tagliati e dopo 30 minuti iniettati con BrdU. Le planarie sono state fissate dopo 3 e 6 giorni dal taglio e processati per l’analisi al TEM. I neoblasti marcati con BrdU sono stati analizzati come descritto in Bode et al., (2006). Le sezioni sono state poste su vetrini di e sono state incubate con l’anticorpo monoclonale anti BrdU alla diluizione 1:100 (BD Pharmingen) in gelatina 0,1%, BSA 0,5% e Tween-20 0,05% (blocking buffer) per 12 ore. Dopo alcuni lavaggi, le sezioni sono state incubate per 1 ora con l’anticorpo secondario antimouse 10 nm gold coniugato (BBInternational) alla diluizione 1:30 in blocking buffer. Le sezioni sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo. I controlli negativi sono stati incubati solo con l’anticorpo secondario.

Inclusione in paraffina ed esperimenti di immunoistochimica

Gli animali sono stati inclusi in paraffina e poi sottoposti ad esperimenti di immunolocalizzazione su sezione secondo il protocollo descritto nella TABELLA E. Come anticorpi primari sono stati utilizzati: antisinapsina ricavato da topo alla diluizione 1:20 (3C11, Developmental Studies Hybridoma Bank), e/o antiPCNA (ricavato da coniglio) alla diluizione 1:100 o anticorpo anti istone H3 fosforilato (ricavato da coniglio) alla diluizione 1:250 (Upstate). Come anticorpi secondari sono stati utilizzati: antimouse o antirabbit FITC alla diluizione 1:200 (Molecular Probes) o antimouse rodaminato alla diluizione 1:200 (Molecular Probes).

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TABELLA E

Inclusione in paraffina e immunolocalizzazione su sezione

2% HCl/5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

Soluzione rilassante di Kobayashi 4°C O/N

2 ml EtOH 100% TA 5 minuti

Aggiunta xilolo graduale: 0.5, 0.5, 0.5, 1 e 3 TA 15 minuti ciascuno

Xilolo assoluto TA 15 minuti

50% Xilolo – 50% Paraffina 60°C 20 minuti

Paraffina (3 lavaggi) 60°C 20 minuti ciascuno

Inclusione in petri TA 4°C

Preparazione di sezioni con 8 μm di spessore.

Xilolo (2 lavaggi) TA 15 minuti ciascuno

EtOH 100% 4°C 5 minuti

PBS 1x TA 10 minuti

Blocking solution (B.Sol.) TA 2 ore

Anticorpo I/B.Sol. 4 C O/N

PBS 1x + 0,3% TRITON (4 lavaggi) TA 15 minuti ciacuno

B.Sol. TA 30 minuti

Anticorpo II TA 2 ore

PBS 1x + 0,3% TRITON (3 lavaggi) TA 15 minuti ciascuno

PBS 1x TA 5 minuti

H2O

Chiusura vetrini con glicerolo/PBS (2:1)

Soluzione rilassante di Kobayashi: 1,6% Formaldeide-37%, 20 μM

MgSO4·7H2O 1 M, 1% HNO3 (65%)/5/8 Holtfreter

Blocking solution: 1% BSA, PBS 1x, 0,3% TRITON

Esperimenti di immunoistochimica sono stati condotti anche su animali trattati con colchicina al 3‰ in acqua. I vetrini sono stati immersi in una soluzione di Hoechst No.33342 (Sigma-Aldrich) per rivelare le mitosi presenti nelle sezioni. I campioni sono stati analizzati con il microscopio a fluorescenza Zeiss Axioplan.

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Dopo ibridazione in situ whole mount alcuni campioni sono stati processati per immunoistochimica con l’anticorpo antisinapsina, come precedentemente descritto (Cebrià e Newmark, 2005). L’anticorpo anti-sinapsina è stato usato alla diluizione di 1:20 e come anticorpo secondario è stato utilizzato un anti-mouse FITC 1:200 (Molecular Probes).

Trattamento con spantide

La soluzione stock di spantide (Sigma-Aldrich) è stata preparata in PS 2 x 10-4(NaCl 6 mM; CaCl2 0,048 mM; KCl 0,1 mM; MgCl2 0,1 mM; NaHCO3 0,12 mM; pH 7,4).

Per testare l’effetto della spantide sulla proliferazione cellulare, gli animali intatti sono stati posti in una soluzione di spantide 10-7 M per 3 giorni e poi sono stati irradiati con la dose di raggi X di 5 Gy. Dopo l’irraggiamento gli animali sono stati lasciati nella soluzione di spantide per 4 o 7 giorni e poi processati per la conta delle mitosi. I diversi controlli utilizzati sono i seguenti: animali non irradiati, animali lasciati in PS e poi irradiati, animali trattati con sostanza P (Sigma-Aldrich) e spantide.

Analisi al FACS

Gli animali intatti sono stati dissociati e analizzati al FACS come precedentemente descritto (Salvetti et al., 2005; Hayashi et al., 2006). Dopo filtrazione con un filtro 25 μm, le cellule, al di sotto di questo diametro o al di sopra di questo diametro, sono state incubate con calceina AM (0,5 μg/ml, Sigma), fissate in etanolo al 70% e poi incubate per 30 min a temperatura ambiente in PBS contenente: ioduro di propidio (PI, 50 μg/ml, Roche), RNAsi (6,25 μg/ml, Roche) e IGEPAL CA-630 (0,5% v/v Sigma Aldrich). L’analisi delle cellule è stata eseguita mediante un FACScalibur cytofluorimeter (Becton Dickinson) e i dati sono stati analizzati con CELL Quest analysis software (Becton Dickinson).

Diffusion assay

Gli animali sono stati dissociati in cellule singole come descritto in Salvetti et al., (2005). Le frazioni arricchite in neoblasti sono state ottenute mediante filtrazioni seriali attraverso filtri di nylon con diametro dei pori decrescente (150, 50, 25 μm). Le frazioni arricchite in cellule differenziate sono state ottenute utilizzando filtri con pori superiori ai 25 μm. Il DNA diffusion assay è stato condotto come descritto in Singh (2005).

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Brevemente, le cellule sono state mescolate con agarosio e lisate con NaCl 2,5 M, TrisHCl 10 mM, EDTA 0,1 M, Triton-X-100 1%, DMSO 10%, pH 10. I frammenti diffusi di DNA erano rivelati tramite marcatura con bromuro di etidio.

Real-time RT-PCR

Real-time RT-PCR è stata eseguita usando la master mix Brilliant II SYBRGreen QPCR (Stratagene) per amplificare 20 ng di cDNA retro trascritto da RNA totale. Il gene costitutivamente espresso DjEF2 è stato usato per normalizzare.

I primer utilizzati nella reazione di amplificazione sono i seguenti:

DjMCM2 senso 5’-TCTGGCGATCTAAGAAGAGG-3’; DjMCM2 antisenso 5’-ATCCCAATGTTTCACCTGCC3’; DjRbAp48 senso 5’-TGATTTGGTAATGACTCATGCT-3’; DjRbAp48 antisenso 5’-ATCTGTGGGTATATGAGCAGT-3’; DjIfb senso 5’-GGGGTAAAGAAACTGCCAGA-3’;

DjIfb antisenso 5’-CTGAGTAGCATCATTTAATTCC-3’; DjMHC-b senso 5’-CAACATCATCAACGTGAATTGG-3’; DjMHC-b antisenso 5’-AGCTCATTAAGTTTATCAACGG-3’; DjEF2 senso 5’-GCGTAAATGGTTACCAGCAG-3’;

DjEF2 antisenso 5’-GACACGGCAATTTCATCATCT-3’;

Analisi dei nuclei

Una sospensione cellulare arricchita di neoblasti è stata ottenuta come descritto in Salvetti et al., (2005) da 6 planarie di controllo e trattate con dsRbAp48 uccise dopo 10 giorni dalla prima iniezione. Le cellule sono state disposte su vetrini porta oggetto, che sono stati poi asciugati e colorati con Hoechst No. 33342 20 ug/ml. La fuoresecenza è stata esaminata con un microscopio Zeiss Axioplan e le immagini sono state acquisite con una camera Nikon. Le immagini digitali sono state quantificate con il programma Image J (Abramoff et al., 2004). Sono stati analizzati 60 nuclei rappresentativi ottenuti da due campioni indipendenti. Come controllo è stata utilizzata una sospensione di cellule arricchita in neoblasti, ottenuta da planarie trattate con NaBt 30 mM per 24 ore. La dose massima di NaBt che non produce difetti morfologici evidenti è stata determinata conducendo esperimenti a differenti concentrazioni di NaBt (da 5 mM a 35mM). Come controllo negativo, è stato utilizzata una sospensione cellulare arricchita in neobklasti ottenuta da planarie trattate con un veicolo.

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Isolamento di estratti nucleari e saggio dell’attività delle deacetilasi

Un insieme di 60 planarie trattate con DjRbAp48 e 60 planarie di controllo sono state omogeneizzate in 1 ml di buffer di lisi (TrisHCl 10mM, pH 7.4, NaCl 10 mM, MgCl2

15 mM, EGTA 0,1 M, saccarosio 250 mM). Dopo l’aggiunta di NP-40 alla concentrazione finale di 0,5%, gli omogenati sono stati agitati con il vortex per 10 secondi e posti in ghiaccio per 15 min. I nuclei venivano raccolti mediante centrifugazione su un cuscinetto di saccarosio freddo di 4 ml ( saccarosio 30%, TrisHCl 10mM, pH 7.5, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM) a 1300 g per 10 min a 4°C. Il pellet di

nuclei veniva risospeso in 50 ml di buffer RIPA (TrisHCl 80mM, pH 7.5, NaCl 800 mM, 0,4% acido deossicolico, NP-40 1,6%. EDTA 1,6 mM), incubati in ghiaccio per 30 minuti, e centrifugati a 10000 g per 10 min a 4°C (protocollo modificato da Di Renzo et al., 2007). I surnatanti, contenenti le proteine nucleari, sono stati conservati a -80°C fino al loro utilizzo. L concentrazione delle proteine è stata determinata con il saggio Bradford (Bio-Rad). Per determinare l’attività delle deacetilasi sono stati utilizzati 15 ul di estratto nucleare contenente 30 μg di proteine in un saggio fluorimetrico (Upstate).

Rivelazione di cellule marcate con BrdU

Le planarie sono state iniettate con una soluzione di BrdU 10 mM (Sigma) usando un Nanoject Microinjectior (Drummond). Per la rivelazione di cellule marcate con BrdU su macerati, le planarie dopo 6 ore dall’iniezione, sono state dissociate in 250 μl di un a soluzione composta da glicerolo/acido acetico/acqua distillata (1:1:13) per 20 ore a 4°C. 20 μl di sospensione cellulare sono stati posti su un vetrino e asciugato per un paio di ore e poi trattati secondo il protocollo descritto nella TABELLA F.

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TABELLA F

Rivelazione di cellule marcate con BrdU

PBS/Triton X-100 0,5% (2 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

PBST(0,5%)/HCl 2N TA 30 minuti

PBST(0,5%)(3 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

PBST(0,1%)/proteinasi K 20 uM 37°C 5 minuti PBST( 0,1%) TA 1 minuto 10% Latte in PBST(10%) TA 10 minuti PBST(0.1%) TA 1 minuto 1% Latte in PBST(0.1%) + 1:50 Ab Anti BrdU(Abcam) TA 30 minuti

PBST(0.5%)(3 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

PBST(0.1%) TA 1 minuto

Latte 1% in PBST(0.1%) + 1:200 Ab Anti

mouseFITC (Molecular Probes) TA 30 minuti

PBST(0.5%)(2 lavaggi) TA 10 minuti

PBS TA 10 minuti

Chiusura dei vetrini in glicerolo/PBS 2:1.

Il numero di cellule marcate con BrdU è stato contato analizzando i preparati al microscopio a fluorescenza Axioplan (Zeiss) e il numero di cellule totali è stato contato mediante l’utilizzo di un ematometro.

Per la rivelazione di cellule marcate con BrdU su sezioni le planarie sono state iniettate con BrdU e poi fissate in soluzione rilassante e incluse in paraffina come descritto sopra. Dopo reidratazione in serie di etanoli le sezioni sono state trattate con 5 ug/ml di proeteinasi K (Sigma) per 5-15 minuti a 37°C e poi incubate in HCl 1 N in PBS/Triton X-100 0,5%. Dopo alcuni lavaggi in PBS/Triton X-100 0,5%, i campioni sono stati incubati prima in 10% siero di capra per 30 minuti a temperatura ambiente e poi con 1/100 anticorpo anti BrdU (BD Pharmigen) in siero di capra al 10% per 1 ora. Dopo alcuni lavaggi in PBS/Triton X-100 0,5%, i campioni sono stati incubati in 1/100 anticorpo anti mouse HRP coniugato e il segnale è stato amplificato usando il kit di amplificazione del segnale della tirammide seguendo il manuale delle istruzioni (Molecular Probes).