KAVOS RŪGŠTIES FENETILO ESTERIO POVEIKIO INKSTŲ MITOCHONDRIJOMS TYRIMAS

(1)

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AGNĖ BARANAUSKAITĖ

KAVOS RŪGŠTIES FENETILO ESTERIO POVEIKIO

INKSTŲ MITOCHONDRIJOMS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof., dr. Sonata Trumbeckaitė

Konsultantas Prof. Rasa Banienė

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis _________ _________ (Vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

KAVOS RŪGŠTIES FENETILO ESTERIO POVEIKIO INKSTŲ MITOCHONDRIJOMS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof.,dr. Sonata Trumbeckaitė ___________ ____________ (Pedag. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

Konsultantas Prof. Rasa Banienė ____________ _____________ (Pedag. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

Recenzentas ______________________________ _____________ ______________ (Pedag. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

Darbą atliko Magistrantė Agnė Baranauskaitė _____________ ______________ (Vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

(3)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY...6

1. ĮVADAS ... 8

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

3. 1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos... 10

3.2. Išemija/reperfuzija, jų poveikis inkstų mitochondrijoms ... 11

3.3. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė ... 12

3.4. Oksidacinis fosforilinimas ... 14

3.5. Aktyviosios deguonies formos ... 15

3.6. Antioksidacinė sistema ir oksidacinis stresas ... 16

3.7. Kavos rūgšties fenetilo esterio biologinis veikimas ... 17

4. TYRIMO METODIKA ... 21

4.1. Medžiagos ... 21

4.2. Terpės ... 21

4.3. Aparatūra, indai ... 21

4.4. Tyrimų objektas ir pobūdis ... 21

4.5. Inkstų išemijos (in vitro) sukėlimas... 22

4.6. Inkstų mitochondrijų išskyrimas ... 22

4.7. Baltymo kiekio nustatymas inkstų mitochondrijų suspensijoje ... 23

4.8. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas ... 23

4.9. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I-mo komplekso (NADH dehidrogenazės) aktyvumo matavimas ... 24

4.10. Mitochondrijų surišamo Ca2+ kiekio iki nespecifinio pralaidumo poros susiformavimo matavimas ... 25

4.11. Statistinė duomenų analizė ... 25

5. REZULTATAI ... 26

5.1. Inkstų išemijos (20 minučių) in vitro poveikis mitochondrijų funkcijoms ... 26

5.1.1. Inkstų išemijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ... 26

5.1.2. Išemijos poveikis mitochondrijų nespecifinio laidumo poros susiformavimui ... 29

(4)

5.3. CAFE poveikis inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiui po 20 min išemijos in vitro ... 31

5.4. CAFE poveikis Ca2+ sugėrimui mitochondrijose po 20 min išemijos in vitro ... 35

5.5. CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui po 20 min išemijos in vitro ... 35

6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37

7. IŠVADOS ...40

(5)

SANTRAUKA

A.Baranauskaitės magistro baigiamasis darbas „Kavos rūgšties fenetilo esterio poveikio inkstų mitochondrijoms tyrimas“/ mokslinė vadovė prof.dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra.-Kaunas.

Tyrimo tikslas: ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio (CAFE) poveikį išemijos paveiktų žiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms.

Uždaviniai: įvertinti tiesioginį in vitro CAFE poveikį inkstų mitochondrijų funkcijoms; CAFE poveikį išemijos (20 min) in vitro paveiktų inkstų mitochondrijų funkcijoms; kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui; mitochondrijų gebėjimui kaupti Ca2+

.

Metodai. Wistar veislės žiurkių patinėliai buvo skirstomi į 4 grupes: kontrolinė grupė, 20 min trukmės išemijos, CAFE 22 mg/kg ir CAFE 34 mg/kg. CAFE buvo leidžiamas 1,5 h prieš sukeliant išemiją. Mitochondrijos buvo išskiriamos diferencinio centrifugavimo būdu. Mitochondrijų kvėpavimo greitis mitochondrijoms oksiduojant I ir II komplekso substratus buvo registruojamas poliarografiškai Klarko tipo elektrodu. Ca2+ sugėrimas buvo matuojamas fluorimetriškai. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumas buvo tiriamas spektrofotometriškai.

Rezultatai: CAFE (0,7 – 4,5 M) didina mitochondrijų kvėpavimo greitį 2-oje metabolinėje būsenoje nuo 15 % iki 34 % ir neveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio 3-ioje metabolinėje būsenoje (VADP). Didesnės koncentracijos (5,2 - 6,5 M) slopina mitochondrijų kvėpavimo greitį VADP (16 % ir

43 % atitinkamai). Tiriant CAFE poveikį 20 min išemijos in vitro paveiktų mitochondrijų funkcijoms, nustatyta, jog 22 mg/kg ir 34 mg/kg CAFE, intraperitonealinė injekcija 1,5 h prieš sukeliant inkstų išemiją, 20 % (p<0,05) pagerino mitochondrijų kvėpavimo greitį VADP bei mitochondrijų kvėpavimo

kontrolės koeficientą. Sukcinato oksidacijai CAFE poveikio neturėjo. CAFE (22 mg/kg ir 34 mg/kg) padidino Ca2+ sugėrimą išeminėse inkstų mitochondrijose beveik 9 ir 5 kartus atitinkamai. CAFE 34 mg/kg paskyrimas 1,5 h prieš išemiją 98 % pagerino I komplekso aktyvumą.

Išvados: CAFE (0,7 - 4,5 µM) sąlygojo inkstų mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimą (15 - 34 %), >5µM koncentracijos slopino (16 - 43%) mitochondrijų kvėpavimo greitį 3-ioje metabolinėje būsenoje. CAFE (22 mg/kg ir 34 mg/kg) iš dalies apsaugojo mitochondrijas nuo išeminės pažaidos: padidino (20%) mitochondrijų kvėpavimo greitį 3-ioje metabolinėje būsenoje oksiduojant glutamatą/malatą, pagerino (30% ir 18%) mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, padidino (98 %) mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumą. Sukcinato oksidacijai CAFE poveikio neturėjo. CAFE padidino Ca2+ sugėrimą inkstų mitochondrijose bei apsaugojo nuo nespecifinio laidumo poros susiformavimo išemijos metu.

(6)

SUMMARY

Master thesis "The effect of caffeic acid phenethyl ester on kidney mitochondria" by A. Baranauskaitė. Supervisor prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian University of Health Sciences faculty of farmacy, department of Pharmacognosy - Kaunas.

The aim of investigation: to analyse the effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on kidney mitochodrial functions.

Objectives: to evaluate direct in vitro effect of CAPE on kidney mitochondrial functions; the impact of CAPE on ischemia (20 min) in vitro affected kidney mitochondrial functions; on the mitochondrial respiratory chain complex I activity and on the mitochondria capability to accumulate Ca2+.

Methods. Wistar rats were pretreated intraperitoneal with 22 mg/kg and 34 mg/kg of CAPE. Animals were divided into 4 groups: control group, 20 min of ischemia, CAPE 22 mg/kg group and CAPE 34 mg/kg group. Mitochondria were isolated by means of differential centrifugation. The mitochondrial respiration rate while oxidizing complex I and II dependent substrates was registered polarographically with Clark-type electrode. Ca2+ accumulation was measured fluorometrically. Activity of complex I was measured spectrophotometrically.

Results: the results shown that CAPE 0,7 - 4,5 µM increases mitochondrial State 2 respiration rate by 15 - 34 % and has no effect on the State 3 respiration rate. Higher concentrations (5,2 - 6,5 µM) decreased mitochondrial State 3 respiration rate by 16% and 43%, respectively. Pretreatment with CAPE (22 mg/kg and 34 mg/kg) increased (by 20%) the ischemia suppressed mitochondrial State 3 respiration rate and respiratory control index. CAPE had no effect on succinate oxydation. Pretreatment with CAPE (22 mg/kg and 34 mg/kg) increased Ca2+ accumulation by mitochondria nearly 9 and 5 times as compared to ishemia alone. Pretreatment with CAPE 34 mg/kg improved the activity of mitochondrial complex I by 98%.

Conclusions: CAPE (0,7 – 4,5 µM) uncoupled mitochondial respiration by 15 - 34% and higher concentrations (>5µM) diminished by 16 - 43% the mitochondrial State 3 respiration rate. CAPE (22 mg/kg and 34 mg/kg) protected partialy mitochondria from ischemic damage: increased mitochondrial State 3 respiration rate by 20%, whith glutamate/malate as substrate, improved mitochondrial respiratory control index by 30% and 18% and mitochondrial respiratory chain complex I activity. There was no affect on succinate oxidation. CAPE increased Ca2+ accumulation in kidney mitochondria and prevented from the opening of mitochondrial permeability transition pore.

(7)

SANTRUMPOS

ADP- adenozino difosfatas ATP- adenozino trifosfatas

CAFE- kavos rūgšties fenetilo esteris DNR- dezoksiribonukleorūgštis EDTA- etilendiamintetraacto rūgštis

FAD- flavinadenino dinukleotido oksiduota forma FADH2- flavinadenino dinukleotido redukuota forma

FMN- flavino mononukleotidas

KKK- mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas KoQ- kofermentas Q

NADH- nikotinamidadenino dinukleotido redukuota forma O2-- superoksido radikalas

OH- hidroksilo radikalas

ROS- aktyvios deguonies formos (reactive oxygen species) SOD- superoksido dismutazė

(8)

1. ĮVADAS

Išemijos/reperfuzijos pažaida inkstuose dažnai nustatoma inkstų operacijų metu, pvz., nefrektomijos (inkstų auglio pašalinimo operacijos), organo transplantacijos ar kitų procedūrų, kai užspaudžiama inkstų arterija metu. Išemijos metu nutrūkus kraujotakai bei audinių aprūpinimui deguonimi, pasireiškia tiek morfologiniai, tiek funkciniai audinių pažeidimai. Išeminių inkstų reperfuzija didina ankstyvą išemijos pažaidą skatindama aktyviųjų deguonies formų (ROS) generaciją (superoksido radikalo, vandenilio peroksido, hidroksilo radikalo ir kt [14].

Dėl aktyvių deguonies formų kiekio padidėjimo išemijos/reperfuzijos metu pasireiškia oksidacinis stresas, kuris turi neigiamą poveikį mitochondrijose vykstančiam oksidacinio fosforilinimo procesui- didėja viduląstelinio Ca2+ koncentracija, vystosi mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentų pažaida, slopinama ATP sintezė, vystosi membranų lipidų peroksidacija bei struktūriniai ir funkciniai ląstelės pažeidimai (ląstelės žūtis) [4; 22; 32].

Kavos rūgšties fenetilo esteris (CAFE) yra biologiškai aktyvus junginys randamas bičių surinktame propolyje. Nustatyta, kad CAFE turi nemažai terapiniais tikslais pritaikomų farmakologinių savybių- antioksidacinių, priešuždegiminių, priešvirusinių, imunomoduliacinių ir priešvėžinių [11]. Tyrimais įrodyta, jog CAFE slopina laisvųjų radikalų generaciją neutrofiluose ir ksantino-ksantino oksidazės sistemoje [37], mažina išemijos/reperfuzijos sukeliamą lipidų peroksidaciją [38]. Pastaruoju metu atlikti moksliniai tyrimai su CAFE, kur šis junginys panaudotas norint apsaugoti įvairius organus (inkstus, stuburo smegenis, žarnyną, sėklides) nuo išemijos/reperfuzijos pažaidos [30].

Nors yra atlikta nemažai tyrimų orientuotų į inkstų išemijos/ reperfuzijos prevenciją, CAFE apsauginis poveikis prieš inkstų išemijos/reperfuzijos pažaidą visdar nėra plačiai ištirtas. Šiuo metu yra publikuota tik keletas mokslinių tyrimų, kuriuose pateiktas CAFE apsauginis poveikis inkstams nuo išemijos pažaidos [11; 14; 37]. Tikslus apsauginis mechanizmas, ypač molekuliniame lygmenyje, nėra pakankamai ištirtas. Kadangi mitochondrijos yra atsakingos už ATP sintezę ląstelėje bei reguliuoja ląstelės žūties mechanizmus ir yra labai jautrios išemijos/reperfuzijos sukeltai pažaidai, aktualu ieškoti biologiškai aktyvių junginių, galinčių apsaugoti mitochondrijas nuo šios pažaidos. Todėl norėdami praplėsti turimas mokslines žinias, siekėme ištirti galimą apsauginį CAFE poveikį išemijos in vitro paveiktoms žiurkės inkstų mitochondrijoms.

(9)

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį išemijos paveiktų žiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms.

Uždaviniai:

1. Įvertinti tiesioginį in vitro kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį inkstų mitochondrijų funkcijoms.

2. Ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį išemijos (20 min) in vitro pažeistų inkstų mitochondrijų funkcijoms.

3. Įvertinti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį išemijos (20 min) in vitro pažeistų inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui.

4. Ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį išemijos (20 min) in vitro pažeistų inkstų mitochondrijų gebėjimui kaupti Ca2+

(10)

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3. 1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos

Mitochondrijos yra 0,5 - 2 μm dydžio ląstelės organelės, kurių forma, kiekis ir išsidėstymas ląstelėje priklauso nuo ląstelės tipo. Jų daugiausia audiniuose, kuriuose vyksta intensyvūs fiziologiniai bei biocheminiai procesai. Didžiąją mitochondrijų dalį (65 - 70%) sudaro baltymai. Kiek mažesnę dalį sudaro lipidai (20 - 35%). Mitochondrijos yra ląstelės struktūros, turinčios dvigubą membraną, t.y. išorinę ir vidinę membraną. Išorinė membrana dėl membranoje esančio baltymo porino yra laidi įvairioms medžiagoms bei jonams, kurių dydis < 5 - 6 kDa. Joje yra nedaug fermentų, tačiau čia lokalizuojasi monoaminoksidazė, acil- KoA sintetazė ir aciltransferazė. Vidinė membrana yra nelaidi jonams bei daugeliui medžiagų tirpalų, tačiau ji turi specifinius jonų kanalus bei pernašos sistemas. Vidinė membrana yra susiklosčiusi į kristas (1 pav.). Vidinėje membranoje aptinkami šie fermentai: kvėpavimo grandinės kompleksai, sukcinato dehidrogenazė, 3–fosfatoglicerolio dehidrogenazė, ATP-sintazė, acil-KoA dehidrogenazė ir kt. Tarp išorinės bei vidinės membranų yra siaura (6 - 8 nm) ertmė, kuri vadinama tarpmembraniniu tarpu. Mitochondrijų užpildas yra vadinamas matriksu ir sudaro vidinį mitochondrijų skyrių, kuriame yra išsidėstę mitochondrinė DNR, baltymų sintezės fermentai bei ribosomos. Taip pat matrikse yra trikarboninių rūgščių ciklo fermentai, piruvato dehidrogenazės fermentinis kompleksas bei riebalų rūgščių oksidacijos ciklo fermentai [2; 21; 10].

(11)

Pagrindinė mitochondrijų funkcija ląstelėje yra energijos (ATP) gamyba, vykstanti oksidacinio fosforilinimo metu vidinėjė mitochondrijų membranoje. ATP yra pagrindinis tiek aerobinių, tiek anaerobinių ląstelių energijos šaltinis. Taip pat mitochondrijose yra pradedama amino rūgščių sintezė, vyksta lipidų, hormonų sintezė bei aktyvių deguonies formų (ROS) gamyba [2; 10]. Mitochondrijos yra svarbios ląstelės homeostazės palaikymui-sugeria laisvus Ca2+

jonus. Ca2+ jonai reguliuoja fermentinį aktyvumą (pvz. piruvato dehidrogenazės komplekso), nespecifinio pralaidumo poros atsidarymą [46].

3.2. Išemija/reperfuzija, jų poveikis inkstų mitochondrijoms

Išemija - tai procesas, kurio metu audiniuose nutrūksta kraujotaka, sumažėja organizmo ląstelių aprūpinimas deguonimi bei fiziologinėms funkcijoms atlikti reikalingomis maisto medžiagomis. Taip pat mažėja metabolitų pašalinimas, filtracinis spaudimas. Net ir po trumpo išemijos epizodo audiniuose atsiranda morfologinių ir funkcinių pažeidimų, kurie dar padidėja reperfuzijos fazės metu [35]. Reperfuzija - tai procesas, kai vėl atstatoma nutrūkusi kraujotaka, tačiau šio proceso metu suaktyvėja ROS susidarymo procesas [35]. Šie išemijos/reperfuzijos pažeidimai inkstuose yra dažni inkstų operacijų metu. Inkstų išemija/ reperfuzija sumažina glomerulų filtraciją ir inkstų kraujotaką. Taip pat išryškėja ląstelų mitochondrijų pažeidimas, kuris pasireiškia mitochondrijų membraninio potencialo sumažėjimu (apie 60% lyginant su kontroliniu dydžiu), taip pat žymiai padidėja mitochondrijų tūris, kinta funkcinis heterogeniškumas, bei sukeliamas oksidacinis stresas dėl padidėjusios ROS gamybos. Oksidacinio streso metu mitochondrijose sutrinka oksidacinio fosforilinimo procesas, išeikvojama ATP energija, padidėja viduląstelinio kalcio kiekis, taip pat yra aktyvuojamas proteazės bei fosfatazės, kurios įtakoja ląstelių vientisumo sutrikimą [35].

Išemijos metu atsiranda pakitimų mitochondrijų elektronų pernašos grandinėje bei sumažėja antioksidantinės sistemos aktyvumas. Trumpas išemijos epizodas (mažiau nei 20 min.) gali būti nepakankamas sutrikdyti antioksidantinę sistemą mitochondrijose [4].

Ilgas išemijos periodas (daugiau nei 20 min.) sukelia daug sudėtingesnių pokyčių mitochondrijose. Tai gali pasireikšti sumažėjusiu I ir IV elektronų transporto grandinės kompleksų aktyvumu, kuris sąlygoja ATP gamybos slopinimą bei elektronų pratekėjimą susidarant superoksido radikalams. Išemija veikia mitochondrijų antioksidantinę sistemą mažindama jos aktyvumą, todėl ląstelės tampa mažiau atsparios oksidaciniam stresui reperfuzijos metu [4].

Išemijos pradžioje ATP energija gaunama glikolizės būdu. Tačiau glikogeno bei gliukozės atsargos yra ribotos ir greitai išsenka. Išemijos metu nutrūkus deguonies tiekimui, skatinamas

(12)

anaerobinis metabolizmas, tuomet ATP skyla į ADP ir/arba adenozino monofosfatą, bei vyksta neorganinio fosfato akumuliacija, kuri didina membranų laidumą. Membranų laidumą taip pat didina Ca2+ jonų kaupimasis mitochondrijų matrikse [4; 19].

Reperfuzijos metu blogėja mitochondrijų funkcionavimas. Referfuzija charakterizuojama padidėjusia ROS gamyba, sumažėjusia ATP sinteze bei ląstelių žūtimi. Padidinta O2- produkcija

aktyvina reakciją su azoto oksidu, kurios metu susidaro peroksinitritas. Tai labai aktyvi molekulė, kuri nitrozilina baltymus bei oksiduoja tiolius, bei skatina OH- susidarymą [4].

ROS produkcija reperfuzijos metu pažeidžia baltymus, lipidus, DNR. Lipidinių membranų pažaida keičia membranų laidumą. Mitochondrijose didėja viduląstelinio Ca2+_{, dėl to sutrinka}

mitochondrijų funkcijos (slopinama ATP sintezė) taip pat sutrinka ląstelių funkcija, bei struktūra [4]. Buvo parodytas 30 min išemijos ir 30 min išemijos/ 15 min reperfuzijos poveikis žiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimo grandinės I-mo komplekso aktyvumui bei mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje metabolinėje būsenoje (VADP) (substratas piruvatas/malatas). Išeminėse

mitochondrijose I-mo komplekso aktyvumas statistiškai reikšmingai (p<0,05) sumažėjo 25 %, išemijos/reprfuzijos grupėje sumažėjo 48 % lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis, o mitochondrijų kvėpavimo greitis (VADP) išemijos ir išemijos/reperfuzijos grupėse statistiškai

reikšmingai sulėtėjo 24 % ir 48 % atitinkamai [32]. Kiti autoriai nustatė, kad po 30 min išemijos ir 30 min išemijos/ 15 min reperfuzijos žiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimo grandinės III komplekso aktyvumas išemijos ir išemijos/reperfuzijos paveiktose mitochondrijose sumažėjo 22% ir 46% atitinkamai lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis [34]. 30 min išemijos ir 30 min išemijos/ 60 min reperfuzijos trukmė slopina greitį VADP išeminėse žiurkės širdies mitochondrijose 62 % (p<0,05),

o išemijos/reperfuzijos grupėje 38 % (p<0,05) lyginant su kontrole (substratas glutamatas/malatas) [22].

Taip pat yra duomenų kaip 30 min išemija ir 30 min išemija/60 min reperfuzija veikia žiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą (KKK). Eksperimento metu (substratas glutamatas/malatas) buvo nustatyta, jog KKK išeminėse mitochondrijose sumažėjo 66 % (p<0,05), o išemijos/reperfuzijos grupėje 37 % (p<0,05) lyginat su kontrole, o tai parodo neigiamą išemijos bei išemijos/reperfuzijos poveikį mitochondrijų funkcijai ( ATP sintezei) [22].

3.3. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė

Vidinėje mitochondrijų membranoje esanti mitochondrijų kvėpavimo grandinė yra gana sudėtinga oksidacijos ir redukcijos fermentų ir kofermentų sistema, kuri palaipsniui išlaisvina energiją

(13)

iš redukuotų kofermentų NADH ir FADH2 (jie yra tiesioginiai kvėpavimo grandinės substratai

gaminami oksiduojantis baltymams, riebalams bei angliavandeniams) oksidacijos metu ir perduoda elektronus deguoniui [50]. Šio proceso metu susidaręs galinis produktas yra vanduo. O išsiskyrusi energija yra naudojama ATP sintezei. Daugiausia substratų, kurie yra oksiduojami mitochondrijų kvėpavimo grandinėje, pagamina Krebso ciklo dehidrogenazės, piruvato dehidrogenazė, riebalų rūgščių β-oksidacijos ciklo fermentai ir glicerolio fosfato dehidrogenazė [50]. Kvėpavimo grandinę sudaro keturi fermentų kompleksai, kurių prostetinės grupės grįžtamai prisijungia elektronus. Tai nejudrūs, hidrofobiniai, į membranos fosfolipidų dvisluoksnį įsiterpę baltymai. Šie kompleksai sąveikauja tarpusavyje dalyvaujant judriems elektronų nešikliams- kofermentui Q (KoQ) ir citochromui c [50]. Didžiausias mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas yra I kompleksas (NADH dehidrogenazė). Jį sudaro 40 ir daugiau polipeptidinių grandinių. Šio komplekso prostetinės grupės yra flavino mononukleotidas (FMN) ir 8-9 geležies-sieros (Fe-S) centrai. FMN prisijungia elektronus nuo NADH, o Fe-S centrai nuo redukuoto FMN. Elektronai pernešami į KoQ, o protonai išstumiami į mitochondrijų tarpmembraninį tarpą [31].

II kompleksas oksiduoja sukcinatą ir yra vadinamas sukcinato dehidrogenaze. Šio komplekso prostetinės grupės FAD ir 3 Fe-S centrai perneša elektonus kofermentui Q iš FADH2 [23].

Kofermentas Q yra mažos molekulinės masės judrus, hidrofobinis kvėpavimo grandinės nešiklis, kuris jungia I ir II kvėpavimo grandinės kompleksus su III kompleksu [23].

III kompleksas yra sudarytas iš citochromų. Citochromai – tai yra hemoproteinai, turintys stipriai prijungtą hemą. Jie skirstomi į a, b ir c klases. III komplekso prostetinės grupės- citochromai ir Fe-S centras prisijungia elektronus iš KoQH2 ir perneša į citochromą c. Citochromas c perneša

elektronus nuo III į IV mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą. III komplese protonai vėl išstumiami iš mitochondrijų matrikso i tarpmembraninį tarpą [23].

IV kompleksas dar vadinamas citochromoksidaze. Tai didelės molekulinės masės baltymų kompleksas. Veikiant citochromoksidazei vyksta deguonies redukcijos reakcija, kurios produktas yra vanduo:

1,5 O2 + 2e- + 2H+  H2O

IV komplekso prostetinės grupės – citochromai ir Cu 2+/1+ jonai. Šis kompleksas yra trečia protonų išmetimo į tarpmembraninį tarpą vieta (Pav. 2) [28].

(14)

2 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė [52]

Mitochondrijų kvėpavimo grandinės komponentai yra išsidėstę oksidacijos-redukcijos potencialo didėjimo kryptimi, o tai reiškia, kad elektronai nuo neigiamesnio oksidacijos-redukcijos potencialo pernešami prie teigiamesnį potecialą turinčių junginių [28].

3.4. Oksidacinis fosforilinimas

ATP sintezė vyksta ADP fosforilinimo metu. Nuolatinis ADP patekimas į mitochondrijų užpildą yra būtina sąlyga oksidacinio fosforilinimo procesui [8]. Šio proceso metu vyksta reakcija:

ADP + H3PO4  ATP + H2O

ATP sintezei reikalingą energiją teikia mitochondrijų kvėpavimo grandinėje vykstantys oksidacijos-redukcijos procesai. Medžiagų apykaitos metu, oksiduojant redukuotus kofermentus NADH ir FADH2,

kvėpavimo grandinėje protonai išstumiami per pirmą, antrą ir tečią kvėpavimo grandinės kompleksus iš mitochondrijų matrikso į tarpmembraninį tarpą. Vidinės membranos išorinėje pusėje kaupiantis protonams, ji įgyja teigiamą krūvį, o iš mitochondrijų matrikso išmetant protonus, ant vidinės membranos vidinės pusės susidaro neigiamas krūvis. Vyksta chemoosmosinis oksidacinis fosforilinimas, kurio metu ant vidinės membranos susidaro elektrocheminis protonų gradientas (elektros potencialų skirtumas). Taip pat, dėl protonų išmetimo į tarpmembraninį tarpą, abipus membranos susidaro pH gradientas (skirtumas). Šių gradientų suma sudaro elektrocheminį protonų

(15)

gradientą. Šio gradiento dydis nepažeistose mitochondrijose yra apie 0,22 V, tačiau gali kisti. Elektronai yra perduodami deguoniui, kuris redukuojamas iki H2O [13; 29].

Didžioji dalis elektrocheminio protonų gradiento sukauptos energijos ir yra panaudojama ADP fosforilinimui. Šioje reakcijoje dalyvauja vidinės mitochondrijų membranos fermentas ATP-sintazė. Tai iš 9 polipeptidinių grandinių susitelkusių į 3 subvienetus sudarytas fermentas. Protonai, judėdami pro ATP-sintazėje esantį protonų kanalą, ją aktyvina ir skatina ADP fosforilinimą. Vykstant 1 molio NADH oksidacijai susidaro 3 moliai ATP, o 1 molio FADH2 oksidacinio fosforilinimo metu

susidaro 2 moliai ATP. Oksidacinio fosforilinimo veiksmingumas nusakomas P/O santykiu, parodančiu ADP fosforilinimui sunaudojamo neorganinio fosfato kiekį vykstant 1 O atomo redukcijai [13; 29].

Veiksniai, įtakojantys oksidacinio fosforilinimo greitį yra: NADH ir FADH2 koncentracija,

deguonies kiekis bei energijos poreikis [ 29].

3.5. Aktyviosios deguonies formos

Reperfuzijos metu padidėjus neutrofilų skaičiui bei juos aktyvavus, pažeidimo vietoje skatinama toksiškų deguonies metabolitų produkcija bei atpalaidavimas. Šie veiksniai pažeidžia ląsteles [30].

Aktyvios deguonies formos (ROS) – toksiški dalinės deguonies molekulės redukcijos produktai. Nors ROS perteklius sukelia nemenkų ląstelės pažeidimų, tačiau šios formos gali turėti ir organizmui naudingų savybių. Pvz., dalyvauja kraujospūdžio reguliavime (NO), naikina mikroorganizmus (superoksidas), dalyvauja tiroksino sintezėje (H2O2), dalyvauja ląstelės

signalizacijos procesuose, tačiau taip pat gali sukelti ląstelės apoptozę [24; 26].

Mitochodrijų kvėpavimo grandinė yra vienas pagrindinių ROS šaltinių ląstelėje. Šiems junginiams priklauso radikalai bei chemiškai aktyvūs deguonies bei azoto junginiai. Tai superoksido radikalas (O2-), hidroksiradikalas (OH), azoto oksido radikalas (NO), lipidų peroksidų radikalai

(LOO) taip pat vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl), ozonas (O3). ROS gamyba

I ir III mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksuose vyksta ir fiziologinėmis sąlygomis, tačiau labai sustiprėja reperfuzijos metu [21]. Fiziologinėmis sąlygomis 0,1 - 4 % deguonies gali būti nepilnai redukuojama ir taip sudaryti ROS [3].

O2- radikalas susidaro vykstant vienelektronei O2 redukcijai [42]. OH yra aktyvus ir labai

(16)

baltymus, lipidus bei nukleorūgštis bei pažeidžia ląsteles. OH susidaro Fentono reakcijos metu iš H2O2 :

H2O2 + Fe2+ + H+  OH + H2O + Fe3+ [41].

Taip pat ROS yra gaunami iš šių šaltinių: ksantino oksidazės sistema, aktyvinti neutrofilai bei lipooksigenazė [17; 20].

ROS sukelia mitochondrijų bei ląstelių žūtį inicijuodamos grandinines lipidų peroksidacijos, DNR ar baltymų oksidacijos reakcijas [11; 39]. Lipidų peroksidacijos reakcija vyksta laisviesiems radikalams sąveikaujant su nesočiaisiais lipidais. Ši grandininė reakcija sukelia lipidų skilimo produktų (pvz.,alkoholių, lipidų) gamybą. Šių reakcijų kaskada suardo lipidus bei pažeidžia ląstelių membranas [6].

Baltymų oksidacijos metu pastebimi žymūs baltymų destrukciniai pokyčiai. Šioje modifikacijoje dalyvauja ne tik deguonies, bet ir kiti radikalai, pavyzdžiui, lipidų peroksidacijos radikalai [33].

Branduolio bei mitochondrijų DNR pažeidimas aktyviosiomis deguonies formomis sukelia įvairias mutacijas, kurios gali pasireikšti polinukleotidinės grandinės trūkiais, bazių modifikacija bei pentozės žiedo skaidymu [45].

3.6. Antioksidacinė sistema ir oksidacinis stresas

Kaip ir kiti organai, inkstai turi fermentinę ir nefermentinę antioksidacinę ląstelių apsaugą. Antioksidantai žmogaus organizme užtikrina ROS surišimą, modifikavimą, poveikio slopinimq bei ardymą. Fermentinė apsauga - antioksidaciniai fermentai, kurie ardo ROS. Tai superoksido dismutazė (SOD), katalazė, glutationo peroksidazė, glutationo reduktazė. Nefermentinė apsauga- antioksidaciniai vitaminai (vitaminas C, E) ir junginiai, prijungiantys ROS (karotinoidai) [16].

Superoksido dismutazė katalizuoja O2- skaidymo reakciją iki H2O2 ir O2:

O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2.

(17)

Hemoproteinas katalazė, esantis peroksisomose bei citoplazmoje, katalizuoja H2O2 skaidymą

iki H2O ir O2:

2H2O2  O2 + 2H2O [16].

Glutationo peroksidazė, kurios yra visose žmogaus organizmo ląstelėse, skaido H2O2 ir lipidų

hidroperoksidus:

H2O2 + 2GSH  2H2O + 2GS-SG;

LOOH + 2GSH LOH + 2GS-SG + H2O [16].

Vitaminas C prisijungia ROS hidrofilinėje aplinkoje ir juos naikina, o vitaminas E slopina ROS sąlygotą lipidų peroksidaciją hidrofobinėje aplinkoje, tuo tarpu karotinoidai, virškinimo metu patekę į kraują, stabdo lipidų peroksidaciją prijungdami lipidų peroksidus [11; 1].

Antioksidantinei sistemai nepajėgus susilpninti padidėjusios ROS produkcijos bei sumažėjus aktyvių deguonies formų ardymo galimybei gali kilti oksidacinis stresas. Jo metu susidaro negrįžtami ląstelių pakitimai [15].

Buvo įrodyta, kad ROS gali diferencijuotai inaktyvuoti mitochondrijų kvėpavimo grandinę. Vienas OH- radikalas bei jo derinys su deguonimi greitai inaktyvuoja I ir II mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus, O2- inaktyvuoja I kompleksą, tuo tarpu H2O2 I mitochondrijų kvėpavimo

grandinės kompleksą inaktyvuoja nepilnai. IV kompleksas yra atsparus laisvųjų radikalų pažaidai, tačiau gali būti dalinai inaktyvuojamas veikiant H2O2 [51].

I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas, kuriame vyksta O2- gamyba taip pat yra ir

pagrindinis ROS taikinys. Dėl ROS poveikio sutrinka elektronų transporto grandinės funkcija, tai pasireiškia nuo Ca2+ _{priklausoma mitochondrijų membranos depoliarizacija – sumažėja ATP}

produkcija ir dar labiau didėja ROS gamyba [5]. Oksidacinis stresas sukelia/pagreitina ląstelių senėjimo procesą [12].

3.7. Kavos rūgšties fenetilo esterio biologinis veikimas

Fenolinės rūgštys savo struktūra yra paprasti fenoliai. Didžiausias fenolių pogrupis yra hidroksicinamatai. Kartu su fenilpropanoidais jie yra plačiai paplitę augaluose. Pastaruoju metu nustatyta, kad fenolinės rūgštys pasižymi antioksidantinėmis savybėmis, dėl kurių, jos gali būti

(18)

pritaikomos tokių ligų, kaip aterosklerozė ar vėžys, gydyme [27]. Fenolinių rūgščių gausu bičių surinktame propolyje, kuris plačiai naudojamas liaudies medicinoje. Be jų, propolyje yra fenolinių rūgščių esterių, flavanoidų, terpenų, amino rūgščių. Kavos rūgšties fenetilo esteris (CAFE), kuris priklauso hidroksicinamono rūgščių kategorijai yra farmakologiškai saugus, aktyvus bičių propolio ekstrakto komponentas [11]. CAFE yra esteris, sudarytas iš kavos rūgšties bei fenetilo alkoholio. Tai yra balti milteliai tirpūs etilo acetate, etanolyje, dimetilsulfokside. Cheminė CAFE formulė parodyta 3 paveiksle.

3 pav. Cheminė CAFE (2 - fenetil(2E) – 3 - (3, 4 - dihidroksifenil)akrilatas (pavadinimas pagal IUPAC nomenklatūrą))formulė [7]

CAFE pasižymi antioksidantinėmis, antiuždegiminėmis, priešvėžinėmis ir imuninę sistemą stimuliuojančiomis savybėmis [11]. Kiti propolio komponentai taip pat pasižymi antioksidantiniu poveikiu, tačiau buvo nustatyta, kad CAFE turi stipriausią antioksidantinį veikimą. Tyrimai parodė, jog antioksidantiniu požiūriu etanolinis propolio ekstraktas, kuriame nebuvo CAFE buvo mažiau veiksmingas nei ekstraktas, turintis CAFE [38].

Pastarająjį dešimtmetį buvo stengiamasi nustatyti CAFE veiksmingumą apsaugant ląsteles nuo išemijos/reperfuzijos pažaidos. Studijos parodė, jog CAFE gali prasiskverbti pro ląstelių membranas ir veikti kaip antioksidantas net mikromolinės koncentracijos ribose [48]. Dabar žinoma, jog 50 μM·kg-1 CAFE paskyrimas parenteraliai į veną (10 minučių prieš išemijos sukelimą ir tęsiama išemijos metu naudojant infuzinę pompą) sumažina širdies miokardo infarkto dydį bei rizikos zonos plotą (atitinkamai 50 ± 4% ir 32 ± 6%) žiurkių išemijos/reperfuzijos modelyje. Išemija užspaudus kairiąją vainikinę arteriją buvo vykdoma 30 minučių, o reperfuzijos trukmė - 120 minučių. Taip pat CAFE buvo panaudotas norint apsaugoti ir kitus organus - inkstus, stuburo smegenis, žarnyną, sėklides nuo išemijos/reperfuzijos pažaidos [30]. Išsiaiškinta, jog svarbus terapinis efektas apsaugant ląsteles nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų yra susijęs su CAFE antioksidantinėmis savybėmis [30].

Nustatyta, jog CAFE slopina ROS susidarymą neutrofiluose, slopina ksantino oksidazės aktyvumą (ji yra ROS šaltinis) (tyrimas atliktas neutrofilus išskyrus iš šviežaus donoro kraujo ir ROS aktyvumas įvertintas stebint luminiscencijos pokyčius) ir slopina lipooksigenazės sistemą, kai CAFE koncentracija yra 10 μmol·kg-1_{[37; 30; 43]. Dėl šių savybių CAFE buvo panaudota norint ištirti CAFE}

gebėjimą apsaugoti audinius triušių stuburo smegenyse išeminės pažaidos metu [19]. Taip pat nustatyta, jog 50-80 M CAFE slopina NF-κB baltymų aktyvaciją, kurią sukelia uždegimo

(19)

mediatoriai. Žinoma, jog NF-κB aktyvavimas sukelia uždegimą žiurkės organizme [11; 25]. Kituose tyrimuose nustatyta, jog CAFE padidina ląstelinio antioksidanto glutationo ir antioksidantinių fermentų, tokių kaip superoksido dismutazė, katalazė ir glutationo peroksidazė kiekį, kurie, kaip buvo paminėta anksčiau, padeda mažinti ROS susidarymą, bei turi savybių tiesiogiai surišti O2- radikalus

gaminamus fermentinių bei nefermentinių reakcijų metu, taip pat difenil-2-pikrilhidrazilo bei galvinoksilio radikalus [48; 49].

Kiti autoriai, naudodami žmogaus eritocitų ir žiurkės kepenų mikrosomų membranų modelį palygino CAFE antioksidantinį aktyvumą in vitro slopinant lipidų peroksidaciją. Lipidų peroksidacija buvo sukelta dviejų skirtingų ROS šaltinių – 2 - amidinopropano (sukeliančio ROO produkciją) bei Fe2+/ askorbato (jie Fentono reakcijos metu gamina OH). Poveikis buvo palygintas su keletu CAFE analogų - kavos rūgštimi, ferulo rūgštimi ir etilferulatu). Tyrimo metu į eritrocitų suspensiją pridėjus 2 - amidinopropano buvo sukelta eritrocitų hemolizė.10 M CAFE pridėjimas į žmogaus eritrocitų suspenciją sukėlė žymų 2-amidopropano poveikio slopinimą. Į mikrosomų membranų suspensiją veikiamą Fe2+

/askorbato pridėjus CAFE taip pat buvo stebimas ryškus antioksidantinis poveikis. Abiem atvejais CAFE antioksidantinis poveikis buvo stipresnis nei jos analogų. Stipresnį CAFE poveikį lemia jos struktūra, t.y. orto-dihidroksilo grupė katecholio žiede [49].

Kiti autoriai siekė išsiaiškinti, ar CAFE gali apsaugoti inkstų mitochondrijas nuo sunkiojo metalo kadmio toksinio poveikio, kadangi šis metalas sukelia ypač sunkius nepageidaujamus poveikius inkstams. Šio tyrimo metu iš žiurkių inkstų išskirtos mitochondrijos buvo veikiamos įvairiomis kadmio ir/ar CAFE koncentracijomis (10 M) ir buvo vertinama mitochondrijų funkcijos, ultrastruktūra bei oksidacinio streso lygis. Kadmio paveiktos mitochondrijos išbrinko, jose sumažėjo membraninis potencialas, padidėjo ROS gamyba bei sutriko mitochondrijų struktūra. Šie pažeidimai susiję su azoto oksido kiekio padidėjimu bei sumažėjusiu superoksido dismutazės aktyvumu [18]. Išskirtas inkstų mitochondrijas paveikus vien tik CAFE (10 M) nežymiai (5 %) sumažėjo fiziologinė ROS gamyba, mitochondrijų membraninis potencialas nepakito. Tai rodo, kad CAFE neturi reikšmingo poveikio normalioms inkstų mitochondrijų funkcijoms. CAFE įvedimas prieš paveikiant kadmiu sumažino visus kadmio sukeliamus pažeidimus [18].

Kito tyrimo metu buvo vertinamas CAFE efektas išemijos/reperfuzijos pažaidai žiurkės inkstuose, bei šis poveikis lygnamas su α-tokoferolio poveikiu. CAFE (10 M/kg) ir α-tokoferolis (10 mg/kg) buvo suleidžiami intraperitonealiai 10 min prieš 30 minučių trukmės išemiją. Po išemijos sekė 30 min trukmės reperfuzija. Eksperimento metu gauti duomenys, vertinant malondialdehido kiekį bei morfologinę audinių pažaidą, parodė, jog CAFE slopino inkstų audinių pažaidą bei lipidų peroksidaciją labiau nei α-tokoferolis [14].

(20)

Tačiau tyrimų apie CAFE poveikį išemijos/reperfuzijos pažeistoms inkstų mitochondrijoms vis dar nėra atlikta, taip pat vis dar nėra aiškus CAFE ir jos analogų ląsteles nuo išeminės /reperfuzinės pažaidos apsaugantis mechanizmas, ypač mitochondrijose [9].

Vertinant CAFE apsaugini poveikį, nemažai svarbu yra įvertinti ir CAFE metabolizmą bei koncentracijos kitimą kraujo plazmoje. Yra žinoma, jog CAFE yra hidrolizuojama iki kavos rūgšties žiurkės plazmoje in vitro ir in vivo, o žmogaus plazmoje ši hidrolizė nevyksta. Manoma, jog žmogaus plazmoje nėra karboksilesterazės, kuri gali būti atsakinga už CAFE hidrolizę. Nustatyta, jog CAFE pasižymi trumpu eliminacijos pusperiodžiu, kuris yra nepriklausomas nuo dozės [47].

(21)

4. TYRIMO METODIKA

4.1. Medžiagos

ADP, amitalis (SIGMA), antimicinas (SIGMA), atraktilozidas (SIGMA), Biureto reagentas (SIGMA), CAFE (SIGMA), CaCl2, Calcium Green 5N, citochromas c (SIGMA), deoksicholatas

(REANAL), EDTA (SIGMA), etanolis, glutamatas (SIGMA), KCl (ROTH), KH2PO4 (ROTH),

kofermentas Q (SIGMA), malatas (SIGMA), MgCl2 (LACHEMA), MgCl26HCl (SIGMA), rotenonas

(ROTH), sacharozė (ROTH), sukcinatas (SIGMA), Tris-HCl (ROTH).

4.2. Terpės

Mitochondrijų izoliavimo terpė yra naudojama mitochondrijų išskyrimui. Sudėtis: 250 mM sacharozė, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl. pH 7,3 ( 0 - 4º C temepratūroje).

Mitochondrijų inkubacijos terpė yra naudojama mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimui. Sudėtis: 150 mM KCl, 10 mM HCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl, pH 7,2 (37 °C temperatūroje).

4.3. Aparatūra, indai

Šaldytuvas, ledų vonelės, vandeninis termostatas, magnetinė maišyklė, analitinės svarstyklės, pH-metras, CO2 kamera, homogenizatorius, spektrofotometras (BIOTECHA), Klarko tipo deguonies

elektrodas, poliarografinė sistema BioMed, kompiuteris, stiklinėlės, petri lėkštelės, plastikiniai graduoti indeliai, mėgintuvėliai, Hamilton mikrošvirkštai, automatinės pipetės, antgaliai, kiuvetės.

4.4. Tyrimų objektas ir pobūdis

Eksperimentai buvo vykdomi su 2,5 - 3 mėn. Wistar veislės žiurkių patinėliais. Tą pačią dieną buvo atliekami tiek kontrolės, tiek išemijos (in vitro) eksperimentai. Buvo išskiriamos kontrolinės bei

(22)

išemijos paveiktos mitochondrijos bei registruojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis, mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumas, bei mitochondrijų gebėjimas kaupti Ca2+

. Siekiant rezultatų atsikartojamumo, kiekvienas matavimas buvo pakartojamas ne mažiau kaip tris kartus. Atliekant biologinius tyrimus, su eksperimentiniais gyvuliukais vykdomi 3-5 eksperimentai, duomenys turi būti statistiškai patikimi. Tokiu būdu, eksperimentai yra vykdomi ir kitų šalių mokslininkų praktikoje. Vykdomų eksperimentų metu buvo stengiamasi naudoti kuo mažesnį eksperimentinių gyvūnų skaičių. Eksperimentams su gyvūnais laboratorija turi LR Valstybinės Maisto ir Veterinarijos Tarnybos leidimą (Nr. 0217).

4.5. Inkstų išemijos (in vitro) sukėlimas

Totalinė inkstų išemija in vitro buvo sukeliama autolizės būdu. CO2 dujomis apsvaiginus

eksperimentinę žiurkę, nutraukiamos stuburo smegenys, tuomet prakerpama krūtinė ir išimami inkstai. Vienas inkstas, naudojamas kontrolei, atšaldomas 0 °C temperatūros 0,9 % KCl tirpalu. Iš taip paruošto kontrolinio inksto išskiriamos kontrolinės mitochondrijos. Kitas inkstas plaunamas 37 °C 0,9 % KCl tirpalu ir numatytam laikui (20 min) patalpinamas į KCl garų pripildytą kamerą. Kameroje palaikoma 37 °C temperatūra. Pasibaigus numatytam laikui inkstai išimami iš kameros ir atšaldomi 0 °C 0,9 % KCl tirpalu ir iš jų išskiriamos bandymui reikalingos mitochondrijos.

4.6. Inkstų mitochondrijų išskyrimas

Inkstai nuvalomi (nuimamas apvalkalas) ir plaunami bei šaldomi 0 - 4 °C KCl tirpalu apie 5 minutes, tuomet inkstai greitai smulkinami ant ledų laikomoje stiklinėlėje įpylus šiek tiek izoliavimo terpės. Gauta masė perkeliama į homogenizatoriaus indą, įpilama dar šiek tiek izoliavimo terpės ir homogenizuojama 4 kartus. Tuomet gautas homogenizatas išpilstomas į centrifuginius mėgintuvėlius, jei reikia, pripilama izoliavimo terpės iki 25 ml. Šį homogenizatą centrifuguojame iki 3 °C temperatūros atšaldytoje centrifugoje 750 × g greičiu, 5 minutes. Ląstelės nuolaužos ir branduoliai nusėda. Viršutinė dalis – supernatantas- nupilamas į švarų męgintuvėlį per dvigubą marlę ir centrifuguojama dar kartą 10 000 × g greičiu, 10 minučių. Šio centrifugavimo metu dugne nusėda mitochondrijos. Nupylus supernatantą, mitochondrijos praplaunamos nedideliu kiekiu izoliavimo terpės ir suspenduojamos automatine pipete įpylus 250 l izoliavimo terpės. Gauta mitochondrijų suspensija perkeliama į Ependorfo mėgintuvėlį ir laikoma ledų vonelėje viso eksperimento metu.

(23)

4.7. Baltymo kiekio nustatymas inkstų mitochondrijų suspensijoje

Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatomas Biureto metodu [2]. Į 50 l mitochondrijų pridedame 950 l 33% deoksicholato tirpalo, 4 ml Biureto reagento ir 30 minučių inkubuojama vandens termostate 37 °C temperatūroje. Vėliau matuojamas gauto tirpalo optinis tankis 536 nm ilgio bangose. Baltymo kiekis nustatomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti buvo naudojamas standartinis baltymo tirpalas.

4.8. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas

Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas poliarografiškai Klarko tipo elektrodu ir poliarografine sistema BioMed. Matavimai buvo atliekami 37 °C tempratūroje.Mokslinėje literatūroje pateikiamas deguonies tirpumas yra - 1 mL terpės yra 420 nanomolių deguonies [2]. Kvėpavimo greičio matavimo vienetai yra nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo. Mitochonrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas į inkubacijos terpę pridedantnt du skirtingus substratus: I-mojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso (NADH-specifinį) substratą glutamatą/malatą bei II-ojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso (FADH2-specifinį) substratą sukcinatą, šiuo atveju,

kaip I-mojo komplekso slopiklį naudojant amitalį. Pirmiausia, į matavimo terpę įvedus substratą (glutamatą/malatą) ir reikiamą (apskaičiuotą) kiekį mitochondrijų (0,5 mg/ml), registruojama antra mitochondrijų metabolinė būsena V2 (būsena, kai terpėje yra deguonies, oksiduojamo substrato bei

mitochondrijų) (4 pav.). Šioje būsenoje, paprastai, registruojamas mažas mitochondrijų kvėpavimo greitis. Vėliau į terpę pridedame ADP ir mitochondrijos pereina į trečiąją matabolinę būseną (VADP).

Šios būsenos metu ATP sintazė pradeda ADP fosforilinimą. Čia mitochondrijų kvėpavimo greitis priklauso nuo ATP sintazės ir kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumo. Į matavimo terpę pridėjus citochromo c vertinama, ar pažeista mitochondrijų išorinė membrana, kadangi nepažeista mebrana yra nelaidi egzogeniniam citochromui c, todėl į terpę pridėto citochromo c sukeltas kvėpavimo stimuliavimas rodo išorinės mitocondrijų membranos pažeidimą. Į terpę pridėjus ATP/ADP nešiklio inhibitoriaus atraktilozido mitochondrijos pereina į ketvirtą metabolinę būseną (VAtr). Šioje būsenoje

mitochondrijų kvėpavimo greitis vėl yra nedidelis, jei nepadidėjęs mitochondrijų vidinės membranos pralaidumas. Mitochondrijų kokybei įvertinti labai svarbus parametras yra mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK). Kuo šis koeficientas didesnis, tuo geresnis oksidacijos ir fosforilinimo

(24)

procesų apjungimas ir tuo geresnė mitochondrijų fukcija. KKK nustatomas pagal greičių VADP ir V2

santykį (KKK= VADP/ V2). 4 paveikslėlyje pateikiama originali mitochondrijų kvėpavimo kreivė.

4 pav. Inkstų mitochondrijų kvėpavimo kreivė

4.9. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I-mo komplekso (NADH dehidrogenazės)

aktyvumo matavimas

Pirmiausia, siekiant padidinti mitochondrijų laidumą, mitochondrijos suardomos. Inkstų mitochondrijų suspensija keturis kartus staigiai užšaldoma bei atšildoma (temperatūrinis šokas). Tuomet į 10 mM KH2PO4 matavimo buferį, kurio pH=8, 25°C temperatūroje pridedame 100 M

kofermento Q, 1g/mL antimicino A, 0,07 mg/mL temperatūriniu šoku suardytų mitochondrijų suspensijos bei 0,1 mM NADH ir „Hitachi 557“ spektrofotometru nustačius NADH koncentracijos mažėjimo greitį 340 nm bangoje, vertinamas mitochondrijų kvėpavimo grandinės I-mo komplekso aktyvumas [44]. Registruojamas I-mo komplekso slopikliui rotenonui (10M) jautrus greitis.

I-mo komplekso (NADH dehidrogenazės) aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:

aktyvumas = A_/t  m V

 106

(25)

Kur ΔA – šviesos sugerties pokytis; Δt – laiko pokytis;  – molinis sugerties koeficientas (340 = 6,22 mM-1 cm-1); V – tiriamo tirpalo tūris (1 mL); m – mitochondrijų baltymo kiekis 0,07 mg).

I komplekso aktyvumo matavimo vienetai yra nmol/min/mg mitochondrijų baltymo.

4.10. Mitochondrijų surišamo Ca

2+

kiekio iki nespecifinio pralaidumo poros

susiformavimo matavimas

Fluorimetrinės analizės metu buvo stebimas Ca2+ _{koncentracijos kitimas mitochondrijų}

inkubavimo terppėje ( naudojant Calcium Green 5 N). Į 3ml terpę (kurią sudaro 200mM sacharozės, 10mM Tris-HCl, 1 mM KH2PO4, 10M EGTA, 0,3mM glutamato, 0,3mM malato; pH 7,4; 25ºC)

buvo dedama 100nM Calcium Green 5N ir 0,2mg/ml mitochondrijų suspensijos. Vėliau, kas 3 minutes buvo pridedama po 10 M CaCl2 iki mitochondrijų nespecifinio laidumo poros susiformavimo.

Tuomet mitochondrijose susikaupęs Ca2+

, patekęs į terpę, padidindavo fluorescencijos signalą.

4.11. Statistinė duomenų analizė

Mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų duomenų vidurkiai yra pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Šie duomenys buvo statistiškai palyginti tarpusavyje pagal Tukey kriterijų ir Mann-Whitney testą naudojant kompiuterinę programą Sigma Plot 10.0. Laikoma, jog skirtumai tarp vidurkių yra patikimi, jei p<0,05.

(26)

5. REZULTATAI

5.1. Inkstų išemijos (20 minučių) in vitro poveikis mitochondrijų funkcijoms

5.1.1. Inkstų išemijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui

Inkstų išemijos tyrimai yra ypač aktualūs nefrektomijos (inkstų auglio pašalinimo), inkstų transplantacijos bei miokardo išemijos metu. Viena iš labiausiai pažeidžiamų organelių išemijos metu yra mitochondrijos. Mitochondrijų pažaida labai stipriai priklauso nuo išemijos laiko. Todėl yra svarbus ne tik išemijos trukmės poveikis mitochondrijoms, bet ir apsauginių junginių paieška, siekiant kiek įmanoma sumažinti šią pažaidą.

Eksperimentiniu būdu pasirinktas 20 minučių trukmės inkstų išemijos in vitro modelis. Tyrėme išemijos poveikį mitochondrijų kvėpavimo greičiui, joms oksiduojant I ir II mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų substratus – glutamatą/malatą ir sukcinatą. Rezultatai pateikti 5 paveiksle. Išemija nekeitė mitochondrijų kvėpavimo greičio antroje metabolinėje būsenoje (V2), kai terpėje buvo

tik pirmo komplekso substratas glutamatas/malatas, tačiau trečioje metabolinėje būsenoje, kuomet į inkubacijos terpę pridedama ADP, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo statistiškai reikšmingai (p<0,05) slopinamas 49 % lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Papildomas citochromo c pridėjimas į inkubacijos terpę padidino kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje tik 6 % ir neatstatė mitochondrijų kvėpavimo greičio (VADP+cyt c) iki kontrolinio lygio, todėl galima manyti, jog

mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimas trečioje metabolinėje būsenoje yra galimas dėl mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų ar fosforilinimo posistemės (ATP-azės, Pi nešiklio) pažaidos.

Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V2) ir greitis, pridėjus

atraktilozido (VAtr), kuris yra ADP/ATP nešiklio inhibitorius, po 20 minučių išemijos nesikeitė

lyginant su kontrole, todėl galima manyti, jog 20 minučių išemija mitochondrijų neveikė vidinės membranos laidumo.

(27)

5 pav. Išemijos (20 min) poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui oksiduojant I komplekso substratą glutamatą/malatą

V2- mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, kuomet terpėje yra 0,5

mg/ml mitochondrijų, 5 mM glutamato + 2 mM malato; VADP- mitochondrijų kvėpavimo greitis

trečioje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus 1 mM ADP; VADP+cit c- mitochondrijų kvėpavimo greitis

trečioje matabolinėje būsenoje papildomai pridėjus 32 mM citochromo c; VAtr- mitochondrijų

kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus 0,12 mM atraktilozido.

*- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05; n=4-5. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų.

Tyrimo metu taip pat buvo vertinamas mitochondrijų kvėpavimo greitis oksiduojant II-o kvėpavimo grandinės komplekso substratą sukcinatą. Išemijos (20 min) paveiktose mitochondrijose buvo nustatytas statistiškai reikšmingas VADP greičio slopinimas 47 % (p<0,05) lyginant su

kontrolinėmis mitochondrijomis (panašiu laipsniu VADP buvo slopinamas ir oksiduojant

glutamatą/malatą) (6 pav.).

Į išemines mitochondrijas pridėjus citochromo c, buvo stebimas statistiškai reikšmingas ir ryškus kvėpavimo greičio VADP padidėjimas nuo 196 ± 14 iki 259 ± 11 (t.y. 33 %), šie rezultatai

parodo akivaizdų išorinės membranos pažeidimą (ir citochromo c netekimą) išemijos metu. Kadangi į terpę pridėjus citochromo c, greitis VADP+cyt c neatsistatė iki kontrolinio dydžio, manoma, jog VADP gali

būti sumažėjęs ne tik dėl citochromo c trūkumo, bet ir dėl mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų pažeidimo. Tyrimo metu gauti rezultatai patvirtina ir kitų mokslininkų tyrimų metu gautus rezultatus [44], jog išorinės mitochondrijų membranos pažaida bei citochromo c efektas geriau stebimas mitochondrijoms oksiduojant sukcinatą. Taigi, mitochondrijų išorinės membranos pažeidimui

(28)

įvertinti citochromo c testą tikslinga atlikti su FAD - specifiniu substratu sukcinatu. Sukcinato oksidacijos metu, 20 minučių išemijos paveiktose mitochondrijose V2 greitis nesikeitė, o VAtr ,

padidėjo nežymiai (16 %) ir statistiškai nereikšmingai (p>0,05), tai rodo, jog mitochondrijų vidinės membranos intaktiškumas po 20 minučių išemijos nesikeitė.

6 pav. Išemijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo grečiui oksiduojant II komplekso substratą sukcinatą

mg/ml mitochondrijų, 15 mM sukcinato ir 2 mM pirmo komplekso slopiklio amitalio; VADP-

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus 1 mM ADP; VADP+cit c-

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje matabolinėje būsenoje papildomai pridėjus 32 mM citochromo c; VAtr- mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus

0,12 mM atraktilozido.

Mitochondrijoms oksiduojant tiek glutamatą/malatą, tiek oksiduojant sukcinatą, mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK) statistiškai reikšmingai sumažėjo 50 % ir 46 % atitinkamai (1 lentelė). Kadangi KKK parodo mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo pajėgumą, galima teigti, jog išemijos (20 min) paveiktose mitochondrijose buvo nustatyta pablogėjusi mitochondrijų funkcinė

(29)

būklė (t.y. pajėgumas sintetinti ATP), nes sveikose mitochondrijose oksidacijos ir fosforilinimo procesai yra pilnai apjungti.

1 lentelė. 20 min išemijos poveikis inkstų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams (KKK)

Glutamatas/malatas Sukcinatas

Kontrolė 20 min inkstų išemija Kontrolė 20 min inkstų išemija

4,00±0,20 2,00±0,25* 2,89±0,10 1,55±0,05#

#- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05; n=4-5. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų.

5.1.2. Išemijos poveikis mitochondrijų nespecifinio laidumo poros

susiformavimui

Ca2+ jonai svarbūs oksidacinio fosforilinimo procese, nes aktyvina tris svarbiausias trikarboksirūgščių ciklo dehidrogenazes, kurios tiekia redukuotus kofermentus mitochondrijų kvėpavimo grandinei. Ca2+ koncentracija ląstelės išorėje yra 104 kartų didesnė nei ląstelės citozolyje, tačiau patologinių būklių metu, pvz., išemijos, Ca2+ _{koncentracija ląstelės viduje smarkiai padidėja.}

Pernelyg didelis Ca2+ kiekis gali sukelti žalingą poveikį, todėl mitochondrijos yra vienos iš organelių, kurios patologinėmis sąlygomis suriša kalcio jonų perteklių. Mitochondrijų matrikse Ca2+

koncentracijai viršijus 1-2 M ribą, susiformuoja mitochondrijų nespecifinio pralaidumo pora, per kurią Ca2+ _{ir kai kurios kitos molekulės yra pašalinamos atgal į citozolį. Nespecifinio pralaidumo poros}

susidarymas (MNP) yra būdingas tik patologinių procesų, tokių kaip išemija, metu [4].

MNP susiformavimas inkstų mitochondrijose išemijos metu buvo registruojamas fluorimetriškai, pagal Ca2+ _{jonų koncentracijos kitimą mitochondrijų inkubavimo terpėje ( naudojant}

Calcium Green 5 N. Į terpę buvo dedama 100 nM Calcium Green 5N ir 0,2 mg/ml mitochondrijų suspensijos. Vėliau, kas 3 minutes buvo pridedama po 10 M CaCl2. Priedai buvo dedami tol, kol

(30)

Eksperimento metu gavome jog 20 minučių trukmės išemija slopina Ca2+ _sugėrimą

mitochondrijose bei skatina MNP susiformavimą. Ca2+ _{sugėrimas išemijos pažeistose mitochondrijose}

sumažėjo 31 % lyginant su kontrole (nuo16 ± 1 M/ mg baltymo iki 11 ± 0,5 M/ mg baltymo).

5.2. CAFE poveikis mitochondrijų funkcijoms

in vitro

Apsauginio poveikio nuo išeminio pažeidimo tyrimams pasirinkta CAFE, kadangi ji pasižymi antioksidantinėmis savybėmis slopindama laisvųjų radikalų generaciją, mažina membranų lipidų peroksidaciją [45]. Todėl pirmųjų eksperimentų metu buvo siekiama nustatyti, koks yra tiesioginis CAFE poveikis mitochondrijoms. Norint įvertinti CAFE poveikį antroje metabolinėje būsenoje (nesant ADP), į kiuvetę, kurioje yra mitochondrijų ir oksiduojamo substrato, buvo pridedamos vis didesnės CAFE koncentracijos. Rezultatai rodo, kad CAFE turi savybę atskirti oksidacijos ir fosforilinimo procesus. Pastebėta, kad didinant CAFE koncentraciją nuo 0,7 M iki 4,5 M, oksidacijos ir fosforilino procesų atskyrimas didėjo nuo 15 ± 21 % iki 34 ± 0,2 % (2 lentelė). CAFE, iki 0,7 M koncentracijos, nepasižymėjo atskiriančiu poveikiu (duomenys nepateikti). Yra žinoma, kad nedidelio laipsnio oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas yra naudingas ląstelėms, nes mitochondrijose mažėja aktyvių deguonies formų generacija [40]. Todėl, galima daryti prielaidą, kad CAFE gali turėti teigiamą poveikį mitochondrijoms skatindama oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimą, dėl ko mitochondrijose gali sumažėti aktyvių deguonies formų generacija.

2 lentelė. CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje (V2)

CAFE koncentracija

0,7 M 1,3 M 1,9 M 2,6 M 3,2 M 3,9 M 4,5 M

Poveikis į V2 15±2 % 19±1 % 28±1 % 19±3 % 32±1 % 38±1 % 34±0,2 %

mg/ml mitochondrijų, 5 mM glutamato + 2 mM malato.

Svarbu nustatyti, kaip CAFE veikia mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje ( VADP), kurio metu vyksta ATP sintezė. Nustatytos koncentracijos, kurioms esant CAFE

(31)

slopinamas 16 % ir 43 % atitinkamai (3 lentelė), todėl, didelės CAFE koncentracijos jau gali turėti neigiamą poveikį ATP sintezei.

3 lentelė. CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje metabolinėje būsenoje (VADP)

CAFE koncentracija

1,3 M 2,6 M 3,9 M 5,2 M 6,5 M

Poveikis į VADP -3±1 % -5±2 % -10±2 % -16±2 %* -43±3 %*

VADP- mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus 1 mM

ADP. Substratas glutamatas/malatas.

*- statistiškai reikšmingi duomenys (p<0,05)

5.3. CAFE poveikis inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiui po 20 min išemijos in

vitro

Tiriant apsauginį CAFE poveikį 20 min. išemijos paveiktoms inkstų mitochondrijoms, 1,5 h prieš sukeldami inkstų išemiją, tiriamoms žiurkėms suleidome intraperitonealiai dvi skirtingas dozes (22 mg/kg ir 34 mg/kg) CAFE. Po 1,5 val. buvo sukeliama 20 min inkstų išemija in vitro ir po to izoliuojamos mitochondrijos. CAFE poveikį tyrėme mitochondrijoms oksiduojant I-mo mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratą glutamatą/malatą ir II-o komplekso substratą sukcinatą. Glutamato/malato oksidacijos metu buvo pastebėta, jog 22 mg/kg CAFE statistiškai reikšmingai (p<0,05) 20 % pagerino mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje (VADP)

lyginant su išemijos (20 min) grupe (7 pav.). CAFE nekeitė išorinės membranos laidumo, nes citochromo c poveikio nebuvo. CAFE 22 mg/kg net 30 % (p>0,05) pagerino mitochondrijų KKK lyginant su išemine grupe, nors jis ir nebuvo atsatytas iki kontrolės lygio (4 lentelė).

(32)

7 pav. Išemijos paveiktų mitochondrijų kvėpavimo greitis (V2, VADP, VADP+cit c) veikiant

22mg/kgCAFE kai oksiduojamas substratas yra glutamatas/malatas

trečioje matabolinėje būsenoje papildomai pridėjus 32 mM citochromo c;

*- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05; n=4-5. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų ir Mann-Whitney testą.

#- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 min išemijos grupe; p<0,05; n=4. Duomenys palyginti naudojant Tukey.

Padidinus CAFE dozę iki 34 mg/kg, pastebėjome, kad CAFE pagerino (20 %) 20 min išemijos sulėtintą mitochondrijų kvėpavimo greitį (VADP) (p<0,05) taip pat, kaip ir mažesnė (22 mg/kg) CAFE

koncentracija (8 pav). Lyginant su 20 min išemijos grupe, mitochondrijų KKK padidėjo 18 % t.y.nuo 2,00 ± 0,25 iki 2,35 ± 0,21 (nors ir statistiškai nereikšmingai). Tačiau neatstatė iki kontrolės (4,00 ± 0,20) (4 lentelė).

(33)

34mg/kgCAFE kai oksiduojamas substratas yra glutamatas/malatas

trečioje matabolinėje būsenoje papildomai pridėjus 32 mM citochromo c;

#- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 min išemijos grupe; p<0,05; n=4. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų.

4 lentelė. Išemijos (20min) povekis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientui(KKK)pridedant CAFE in vitro(substratas glutamastas/malatas)

Kontrolė 20 min išemija CAFE 22 mg/kg 1,5 h prieš išemiją

CAFE 34 mg/kg 1,5 h prieš išemiją

KKK 4,00±0,20 2,00±0,25* 2,60±0,16* 2,35±0,21*

CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo grandinės II komplekso substrato sukcinato oksidacijai pateiktas 9 paveiksle. CAFE - nei 22 mg/kg, nei 34 mg/kg nekeitė sukcinato oksidacijos greičio nei antroje, nei trečioje metabolinėje būsenoje. Galima teigti, kad mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo CAFE taip pat nekeitė bei poveikio KKK oksiduojant sukcinatą neturėjo (5 lentelė). Citochromo c pridėjimas trečioje metabolinėje būsenoje padidino mitochondrijų kvėpavimo

(34)

greitį 59 % (22 mg/kg) ir 54 % (34 mg/kg) (p<0,05), tačiau neatstatė iki kontrolės lygio. Taigi, rezultatai rodo, kad 22 mg/kg ir 34 mg/kg CAFE koncentracijos neapsaugo nuo 20 min išemijos sukeliamo išorinės membranos pažeidimo (9 pav.).

22mg/kg ir 34mg/kg CAFE kai oksiduojamas substratas yra sukcinatas

mg/ml mitochondrijų, 15 mM sukcinato ir 2 mM pirmo komplekso slopiklio amitalio; VADP-

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje į terpę pridėjus 1 mM ADP; VADP+cit c-

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje matabolinėje būsenoje papildomai pridėjus 32 mM citochromo c

#- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 min išemijos grupe; p<0,05; n=4-5. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų.

5 lenetelė. Išemijos (20min) paveiktų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK)pridedant CAFE in vitro(substratas sukcinatas)

Kontrolė 20 išemija 22mg/kg CAFE 34mg/kg CAFE

KKK 2,89±0,10 1,55±0,05* 1,67±0,10* 1,49±0,12*

*- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05; n=4. Duomenys palyginti naudojant Tukey kriterijų ir Mann-Whitney testą.

(35)

5.4. CAFE poveikis Ca

2+

sugėrimui mitochondrijose po 20 min išemijos in vitro

CAFE (22 arba 34 mg/ kg) poveikis inkstų mitochondrijų nespecifinio laidumo poros susiformavimui po 20 min išemijos pateiktas 10 paveiksle. CAFE (22 mg/ kg), padidino Ca2+ _sugėrimą

inkstų mitochondrijose statistiškai patikimai beveik 9 kartus (iki 61,8 ± 2,13 mM Ca2+

/mg baltymo) lyginant tiek su kontrole, tiek su 20 min išemijos grupe. 34 mg/ kg CAFE, inkstų mitochondrijų gebą sukaupti Ca2+ padidino beveik 5 kartus iki 54,3 ± 11,8 mM Ca2+/mg baltymo. Tai rodo, jog eksperimentuose in vitro CAFE padidino Ca2+ sugėrimą inkstų mitochondrijose bei apsaugojo nuo nespecifinio laidumo poros susiformavimo išemijos metu.

10 pav. CAFE poveikis Ca2+ sugėrimui in vitro *- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05.

#- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 min išemijos grupe; p<0,05.

5.5. CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui

po 20 min išemijos in vitro

Gauti rezultatai, kad jau po 20 minučių trukmės išemijos mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumas sumažėjo 26 % (p<0,05) lyginant su kontroline grupe (11 pav.). Nustatėme, kad 22 mg/kg CAFE, suleistas 1,5 h prieš išemiją, I komplekso aktyvumą pagerino 18 % lyginant su išemine grupe, tačiau duomenys nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0,05). Padidinus CAFE

(36)

koncentraciją iki 34 mg/kg, nustatėme, jog CAFE statistiškai reikšmingai (p<0,05) 98 % (1,7 kartus) pagerino I komplekso aktyvumą lyginant su išemijos grupe (11pav). Duomenys leidžia manyti, kad 34 mg/kg CAFE gali apsaugoti nuo 20 minučių išemijos sukeliamo glutamato oksidacijos slopinimo.

11 pav. CAFE poveikis mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui *- statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontrole; p<0,05; n=4.

(37)

6. REZULTATŲ APTARIMAS

Inkstų išemijos/reperfuzijos pažaidos mechanizmai gana plačiai ištyrinėti, tačiau patofiziologija nėra gerai ištirta. Daugelis tyrimų orientuojasi į inkstų apsaugą nuo išemijos/ reperfuzijos pažaidos. Buvo pastebėta, kad medžiagos, tokios kaip vitaminas E ar resveratrolis, kurios yra žinoma, slopinana lipidų peroksidaciją, pasižymi apsauginiu poveikiu nuo išemijos/reperfuzijos pažaidos inkstuose[11]. Tačiau vis dar labai mažai studijų atlikta siekiant nustatyti CAFE apsauginį poveikį inkstams. Todėl šio darbo tikslas buvo ištirti CAFE poveikį išemijos paveiktų žiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms.

CAFE yra biologiškai aktyvus junginys, randamas bičių surinktame propolyje. Šis junginys pasižymi antioksidantiniu,priešuždegiminu poveikiu [11], bei reguliuoja ląstelės žūties (apoptozės būdu) mechanizmą [49]. Apsauginio CAFE poveikio tyrimams pasirinkome 20 minučių trukmės išemijos in vitro modelį, kadandi jau po 20 minučių išemijos mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas slopinamas 49 % oksiduojant NAD – specifinį substratą glutamatą/malatą ir 47 % oksiduojant FAD – specifinį substratą sukcinatą. Nustatėme, kad išemijos (20 min) poveikyje, tiek I komplekso substrato glutamato/malato, tiek II komplekso substrato sukcinato oksidacija slopinama panašiu laipsniu (49 – 47 %). Nors daugelis tyrėjų teigia, kad išemijos (pvz., širdies) metu labiau pasižeidžia I komplekso substratų oksidacija [32], mūsų duomenys rodo, kad abiejų ( tiek NAD – specifinių, tiek FAD – specifinių substratų oksidacija pažeidžiama panašiu laipsniu. Nustatėme vieną iš galimų glutamato/malato oksidacijos pažeidimo priežasčių – mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumo sumažėjimas. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksas jautrus pH pokyčiams [31], o pH išemijos metu mažėja. Be to, išemijos poveikyje didėja Ca2+

koncentracija [4], kuri irgi gali slopinti mitochondrijų I kvėpavimo grandinės komplekso aktyvumą. Mūsų tyrimas yra aktualus ir tuo, jog nustatėme ankstyvą (jau po 20 minučių) išemijos sukeltą pažaidą mitochondrijoms. I kompleksas, kitaip NADH-ubichinono oksidoreduktazė, yra daugiakomponentis integralinis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas, kuris katalizuoja elektronų pernašą nuo NADH ubichinonui. Literatūroje teigiama, kad I kompleksas yra prisijungęs prie mitochondrijų vidinės membranos baltymo kardiolipino [32]. Kardiolipinas dalyvauja pernešant elektronus nuo NADH ubichinomui. Jis taip pat svarbus struktūriniam bei funkciniam mitochondrijų vidinėje membranoje esančių kvėpavimo grandinės kompleksų vientisumui palaikyti. Išemijos/reperfuzijos metu dėl kardiolipino peroksidacijos, I kompleksas yra sutrikdomas, o tai gali lemti ROS sintezės padidėjimą, bei mitochondrijų kvėpavimo slopinimą.