ANTOCIANINŲ POVEIKIS ŠIRDIES MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJOMS IR IŠEMIJOS SUKELTAI LĄSTELIŲ ŽŪČIAI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Kristina Škėmienė

ANTOCIANINŲ POVEIKIS ŠIRDIES

MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJOMS

IR IŠEMIJOS SUKELTAI

LĄSTELIŲ ŽŪČIAI

Disertacija rengta 2009–2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje.

Mokslinis vadovas

dr. Julius Liobikas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Konsultantė

prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

TURINYS

ĮVADAS... ... 6

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1. ANTOCIANINAI ... 9

1.1.1. Antocianinų struktūra, įvairovė bei paplitimas ... 9

1.1.2. Antocianinų biologinis poveikis ... 11

1.1.3. Antocianinų biologinis prieinamumas: absorbcija, metabolizmas bei transporto į ląsteles mechanizmai ... 13

1.2. MIOKARDO PAŽEIDIMAI IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS METU ... 17

1.2.1. Išemijos/reperfuzijos sukelta ląstelių žūtis ... 19

1.2.2. Išemijos sukeltas citochromo c išėjimas iš mitochondrijų ir kaspazių aktyvacija ... 21

1.3. APSAUGINIS ANTOCIANINŲ POVEIKIS NUO IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS SUKELIAMŲ PAŽEIDIMŲ ... 24

2. METODIKA ... 26

2.1.TYRIMŲ POBŪDIS ... 26

2.2.MITOCHONDRIJŲ IR CITOZOLIO FRAKCIJŲ ATSKYRIMAS ... 27

2.3.BALTYMO KIEKIO NUSTATYMAS ... 27

2.4.MIOKARDO IŠEMIJOS SUKĖLIMAS, PERFUZIJA IR REPERFUZIJA ... 28

2.5.MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMO GREIČIO MATAVIMAS ... 29

2.6.CITOCHROMOC REDUKCIJOS NUSTATYMAS ... 30

2.7.KASPAZIŲ AKTYVUMO MATAVIMAS ... 31

2.8.MITOCHONDRIJOSE IR CITOZOLYJE ESANČIO CITOCHROMO C KIEKIO NUSTATYMAS ... 32

2.9.DNR TRŪKIUS TURINČIŲ BRANDUOLIŲ ŽYMĖJIMAS IMUNOFERMENTINIU METODU ... 32

2.10.LAKTATO DEHIDROGENAZĖS AKTYVUMO REPERFUZATE NUSTATYMAS ... 33

2.11.ATP KIEKIO MATAVIMAS ... 34

2.12.MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMO GRANDINĖS I KOMPLEKSO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS ... 34

2.13.ANTOCIANINŲ IR FENOLINIŲ RŪGŠČIŲ TIRPALŲ PARUOŠIMAS IR LAIKYMO SĄLYGOS ... 35

3. REZULTATAI ... 36

3.1. TIESIOGINIS ANTOCIANINŲ POVEIKIS MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJAI ... 36

3.1.1. Antocianinų poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo

greičiams antroje ir trečioje metabolinėse būsenose ... 37 3.1.2. Antocianinų poveikis citochromo c efektui širdies

mitochondrijose ... 40 3.2. ANTOCIANINŲ POVEIKIS CITOCHROMOC REDOKSO BŪSENAI ... 43

3.3. ŠIRDIES PERFUZIJA ANTOCIANINAIS IR JŲ POVEIKIS IŠEMIJOS

SUKELTIEMS MITOCHONDRIJŲ PAŽEIDIMAMS ... 47

3.3.1. Antocianinų poveikis išemijos sukeltiems oksidacinio

fosforilinimo pažeidimams po širdies perfuzijos ... 47 3.3.2. Antocianinų poveikis išemijos sukeltam citochromo c kiekio kitimui mitochondrijose po širdies perfuzijos ... 53 3.3.3. Antocianinų poveikis išemijos sukeltam kaspazės-3

aktyvumo kitimui citozolinėje frakcijoje po širdies perfuzijos ... 56 3.4. ANTOCIANINŲ POVEIKIS IŠEMIJOS IR REPERFUZIJOS SUKELTAI

MITOCHONDRIJŲ DISFUNKCIJAI IR LĄSTELIŲ ŽŪČIAI ... 58

3.4.1. Antocianinų poveikis išemijos sukeltiems oksidacinio

fosforilinimo pažeidimams po reperfuzijos ... 59 3.4.2. Antocianinų poveikis išemijos sukeltai ląstelių apoptozei po reperfuzijos ... 61 3.4.3. Antocianinų poveikis ląstelių nekrozei po išemijos ir

reperfuzijos ... 63 3.5. ANTOCIANINŲ POVEIKIS MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIO

FOSFORILINIMO SISTEMOS EFEKTYVUMO ATSTATYMUI PO IŠEMIJOS ... 66

3.6. ANTOCIANINŲ METABOLITŲ POVEIKIS MITOCHONDRIJŲ

FUNKCIJOMS ... 73

3.6.1. Tiesioginis antocianinų metabolitų poveikis mitochondrijų funkcijoms ir citochromo c redokso būsenai ... 74 3.6.2. Antocianinų metabolitų poveikis išemijos sukeltiems

pažeidimams po širdies perfuzijos ... 79

REZULTATŲ APTARIMAS... 83 IŠVADOS ... ... 87

SANTRUMPOS IR TERMINAI

3,4-HBR 3,4-dihidroksibenzoinė rūgštis 4-HBR 4-hidroksibenzoinė rūgštis ADP Adenozino 5′-difosfatas ANT Adenino nukleotidų nešiklis

Apaf-1 Apoptozės proteazes aktyvuojantis veiksnys ATP Adenozino 5′-trifosfatas

ATR Atraktilozidas, adenino nukleotidų nešiklio slopiklis Cy3G Cianidino 3-O-gliukozidas

Cy3R Cianidino 3-O-rutinozidas COX Citochromo oksidazė

DEVD N-acetil–Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilkumarinas DMSO Dimetilsulfoksidas ((CH3)2SO)

DNR Deoksiribonukleorūgštis Dp3G Delfinidino 3-O-gliukozidas Dp3R Delfinidino 3-O-rutinozidas DTT Ditiotreitolis

EGTA Etilenglikol-bis-(β-amino-etileterio)-N,N,N′,N′-tetraacto rūgštis FMN Flavino mononukleotidas

HEPES 4-(2-hydroksietil)-1-piperazinoetanosulfoninė rūgštis KoQ Kofermentas Q

LDH Laktato dehidrogenazė

MES 2-[N-morfolino] etanosulfonato rūgštis Mv3G Malvinidino 3-O-gliukozidas

NADH Nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma NO Azoto monoksidas

NOS Azoto oksido sintazė

Pg3G Pelargonidino 3-O-gliukozidas Pn3G Peonidino 3-O-gliukozidas ROS Reaktyvios deguonies formos

TMPD N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiaminas

Citochromo c efektas – egzogeninio citochromo c priedo sukeltas mitochon-drijų kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje padidėjimas

ĮVADAS

Širdies ir kraujagyslių ligos yra viena pagrindinių komplikacijų ir pa-didėjusio mirtingumo priežasčių ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse ir, deja, mirčių skaičius dėl šių ligų visą laiką didėja [Minino et al., 2011; McCart-ney et al., 2012]. Išemijos metu širdies audinyje sutrikdomas deguonies ir maisto medžiagų patekimas į ląsteles, dėl to vystosi struktūriniai bei funkciniai mitochondrijų pokyčiai bei aktyvinami viduląsteliniai signaliniai keliai, skatinantys ląstelių apoptozę bei nekrozę. Šie pokyčiai sutrikdo viso organizmo homeostazę [Suto et al., 2005; Borutaite and Brown, 2007]. Nustatyta, kad vienas iš ankstyviausiųjų miokardo išemijos sukeliamų pažeidimų yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės komponento, citochro-mo c, išėjimas iš mitochondrijų į citozolį [Piper et al., 1985; Borutaite et al., 1996]. Dėl to ne tik mažėja oksidacinio fosforilinimo efektyvumas [Rouslin, 1983; Toleikis et al., 1984; Toleikis et al., 1985], bet ir inicijuojama apoptozinė ląstelių mirtis [Bialik et al., 1999; de Moissac D. et al., 2000]. Citozolyje esantis citochromas c jungiasi su kofaktoriumi Apaf-1 (angl. apoptosis protease activating factor) ir neaktyvia kaspaze-9, suformuodami apoptosomos kompleksą, kuris aktyvina neaktyvą kaspazę-3, tolimesnę kaspazių kaskadą bei endonukleazes ir ląstelė žūna apoptozės būdu [Li et al., 1997; Yang et al., 1997]. Ilgą laiką buvo manoma, kad po išemijos, kai citochromas c išeina iš mitochondrijų, apoptotinių procesų jau negalima sustabdyti. Tačiau vėliau buvo nustatyta, kad tokį procesą gali reguliuoti citochromo c redokso būsena: redukuotas citochromas c mažiau aktyvuoja kaspazes nei oksiduota citochromo c forma [Pan et al., 1999; Suto et al., 2005; Borutaite and Brown, 2007; Barauskaite et al., 2011].

Pastaruoju metu natūralių augalinių preparatų vartojimas farmacijos pramonėje ženkliai išaugo. Ypatingai daug mokslinių tyrimų atliekama su flavonoidų klasei priskiriamais antocianinais – vandenyje tirpiais augaliniais pigmentais, kurie aptinkami uogose, vaisiuose ir daržovėse ir suteikia jiems mėlyną, raudoną, violetinę ir purpurinę spalvas. Šiuo metu yra žinoma 30 skirtingų antocianidinų ir apie 90 proc. iš jų sutinkamų gamtoje yra šešių pagrindinių antocianidinų (aglikonų) – pelargonidino (Pg), peonidino (Pn), cianidino (Cy), malvinidino (Mv), petunidino (Pt) ir delfinidino (Dp) – dariniai [Kong et al., 2003; Fleschhut et al., 2006; Prior and Wu, 2006]. Yra nustatyta, kad antocianinai veikia kaip uždegimą slopinanti priemonė, saugo nuo navikų susidarymo, stabdo lipidų ir baltymų oksidaciją organizme ir maisto produktuose [Gould, 2004; Glinska et al., 2007; Posmyk et al., 2009]. Remiantis atliktais epidemiologiniais tyrimais, pastebėta, kad antocianinų turinčių vaisių ir daržovių vartojimas apsaugo kepenis ir

smegenis nuo įvairių patologijų sukeliamų pažeidimų [Shin et al., 2006; Dani et al., 2008; Lu et al., 2010] bei reikšmingai sumažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką [Amorini et al., 2003; Toufektsian et al., 2008; Akhlaghi and Bandy, 2009; de Pascual-Teresa et al., 2010]. Toks apsauginis poveikis siejamas su antocianinų antioksidaciniu veikimu, surišant laisvuo-sius deguonies radikalus [Prior and Wu, 2006; Yao and Vieira, 2007].

Remiantis ankstesniais Neuromokslų institute atliktais tyrimais su juodųjų serbentų uogų ekstraktais, kuriuose yra gausu įvairių antocianinų [Liobikas ir kt., 2009], buvo pastebėta, kad antocianinai aktyvina mito-chondrijų kvėpavimą ketvirtoje metabolinėje būsenoje pridėjus egzogeninio citochromo c. Tačiau tokio poveikio mechanizmas nebuvo nustatytas. Mes nustatėme, kad citochromo c aktyvintas kvėpavimas mitochondrijų kvė-pavimas ketvirtoje metabolinėje būsenoje susijęs su antocianinų gebėjimu redukuoti egzogeninį citochromą c ir iškėlėme hipotezę, kad antocianinais redukuotas citochromas c mažiau aktyvina kaspazes ir apsaugo miocitus nuo išemijos/reperfuzijos sukeltos apoptozės.

Šio darbo tikslas yra ištirti antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochon-drijų oksidacinio fosforilinimo sistemos efektyvumui bei nustatyti, kokius už ląstelės žūtį atsakingus viduląstelinius signalinius kelius reguliuoja šie junginiai.

Uždaviniai:

1. Ištirti tiesioginį penkių dažniausiai gamtoje sutinkamų antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimui skirtingose me-tabolinėse būsenose.

2. Nustatyti įvairių antocianinų gebėjimą redukuoti citochromą c in vitro.

3. Nustatyti, ar antocianinai – citochromo c reduktoriai – apsaugo nuo išemijos sukeltų oksidacinio fosforilinimo sistemos pažeidimų ir kaspazių aktyvacijos bei nuo išemijos/reperfuzijos sukeltos kardio-miocitų apoptozės ir nekrozės.

4. Ištirti, ar stipriu citochromą c redukuojančiu aktyvumu pasižymintys antocianinai gali atstatyti mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemos efektyvumą po išemijos.

5. Patikrinti, ar tirtųjų antocianinų poveikis širdies mitochondrijų funkcijoms bei apsauginis nuo išemijos ir išemijos/reperfuzijos su-keliamų pažeidimų veikimas nėra salygotas antocianinų metabolitų.

Mokslinio darbo naujumas

Pratęsdami anksciau atliktus tyrimus [Liobikas ir kt., 2009] nustatėme, kad antocianinais stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis 4-toje metabolinėje būsenoje terpėje esant citochromo c yra susijęs su kai kuriems antocianinams būdingomis citochromą c redukuojančiomis sąvybėmis. Mes pirmieji parodėme, kad dideliu citochromą c redukuojančiu aktyvumu pasižymintys antocianinai redukuodami citozolyje esantį citochromą c gali apsaugoti ląsteles nuo išemijos/reperfuzijos sukeltų pažaidų: redukuotas citochromas c mažiau aktyvina kaspazes, taigi apsaugo nuo išemijos/re-perfuzijos sukeltos ląstelių apoptozės ir nekrozės. Nustatėme, kad dideliu citochromą c redukuojančiu aktyvumu pasižymintys antocianinai atstato oksidacinio fosforilinimo sistemos efektyvumą po miokardo išemijos: veikiant antocianinams padidėja mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumas, kadangi antocianinai gali pernešti elektronus nuo NADH ant KoQ, jei ši vieta buvo pažeista išemijos metu. Taip pat pirmieji parodėme, kad stipriai citochromą c redukuoti galintys antocianinai gali būti naudojami kaip substratai vietoj KoQ ir mitochondrijų kvėpavimo grandinėje atlikti elektronų pernešėjo vaidmenį. Taip pat parodėme, kad citochromą c gerai redukuojantys antocianinai padidina išemijos metu sumažėjusį ATP kiekį ir tai gali būti priežastis, dėl ko dideliu citochromą c redukuojančiu aktyvumu pasižymintys antocianinai apsaugo nuo išemijos/reperfuzijos sukeltos nekrozinės ląstelių žūties. Mes parodėme, kad apsauginis antocianinų poveikis nuo išemijos ar išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų susijęs su antocianinų veikimu, bet ne su jų meta-bolizmo produktais. Tai yra naujos žinios apie galimybę natūralius auga-linius junginius panaudoti ląstelės energijos apykaitos reguliavime ir tai galėtų padėti ieškant racionalių tam tikrų ligų gydymo būdų, kurie slopintų arba aktyvintų apoptozę.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.1. Antocianinų struktūra, įvairovė bei paplitimas

1835 metais Ludwig C. Marquart pirmą kartą paminėjo spalvą su-teikiančius junginius augaluose. Žodis „antocianinas“ kilo iš graikų kalbos žodžių „anthos“ – gėlė ir „kyanos“ – mėlyna, kurie buvo naudojami api-būdinant mėlynus pigmentus, randamus rugiagėlėje Centaurea cyanus [Takeda et al., 2005]. Antocianinai priskiriami plačiai augaluose paplitusiai fenolinių junginių klasei – flavonoidams [Gould et al., 2002; Hou et al., 2003; Kong et al., 2003]. Tai yra augaliniai vandenyje tirpūs pigmentai, išskiriami iš įvairių uogų, daržovių ir vaisių, kuriems suteikia raudoną, violetinę ar mėlyną spalvas [Kong et al., 2003; Fleschhut et al., 2006]. Šiuo metu yra nustatyta daugiau kaip 600 skirtingų antocianinų [Prior and Wu, 2006].

Antocianinai sudaryti iš aglikono (antocianidino), angliavandenių molekulių ir daugumoje atvejų acilo grupės [Kong et al., 2003; Prior and Wu, 2006]. Antocianino aglikono pagrindą sudaro 15 anglies atomų (C6-C3-C6) turinti struktūra, kurią sudaro du aromatiniai benzeno žiedai (A ir B), sujungti trijų anglies atomų grandine, kuri, besijungdama su hidroksilo grupe, suformuoja heterociklinį (C) žiedą (1.1.1.1 pav.) [van Beek and Montoro, 2009]. Antocianidinai yra nestabilūs šviesoje ir netirpūs van-denyje, todėl juos aptikti tokioje formoje labai sunku. Dažniausiai jie randami su prisijungusia cukraus molekule, kuri suteikia jiems stabilumą ir gerą tirpumą vandenyje. Yra nustatyta, kad kuo daugiau angliavandenių molekulių yra prisijungusių prie aglikono, tuo antocianinai labiau poliški. Vieni nuo kitų antocianinai skiriasi hidroksi- ir/arba metoksi- grupių, taip pat ir cukraus molekulių skaičiumi, prisijungimo būdu bei padėtimi [Bloor and Abrahams, 2002; Kong et al., 2003; Fleschhut et al., 2006]. Iki šiol yra žinoma 30 skirtingų antocianidinų ir apie 90 proc. iš jų sutinkamų gamtoje yra šešių pagrindinių antocianidinų (aglikonų) – pelargonidino (Pg), peo-nidino (Pn), ciapeo-nidino (Cy), malvipeo-nidino (Mv), petupeo-nidino (Pt) ir delfipeo-nidino (Dp) – dariniai (1.1.1.1 pav.) [Kong et al., 2003; Fleschhut et al., 2006; Prior and Wu, 2006]. Visi šie šeši antocianidinai skiriasi tik B žiedo 3' ir 5' padėtyse esančiomis hidroksilo ir metoksilo grupėmis, todėl manoma [Galvano et al., 2004; Prior and Wu, 2006; Janeiro and Oliveira Brett, 2007], kad būtent šie radikalai lemia antocianinų biologinio poveikio skirtumus, o ypač jų oksidacines-redukcines savybes.

1.1.1.1 pav. Pagrindinių antocianidinų cheminė struktūra

Angliavandenių molekulės antocianinų struktūroje dažniausiai yra C žiedo 3′ padėtyje arba A žiedo 5′ ir 7′ padėtyse. Angliavandenių molekulės prie antocianidinų dažniausiai jungiasi per O-glikozidines jungtis [Williams and Grayer, 2004; Bjoroy et al., 2007] ir sudaro mono-, di- arba tri- sa-charidų formas. Gliukozė dažniausiai sutinkamas monosacharidas, kuris sudaro apie 90 proc. visų angliavandenių molekulių. Taip pat prie anto-cianidino gali būti prisijungusi galaktozė, arabinozė, ramnozė, ksilozė [Clifford M.N., 2000]. Labiausiai paplitę yra antocianidinų 3-O-glikozidai, kurie sutinkami gamtoje apie du kartus dažniau nei 3,5-O-diglikozidai [Prior and Wu, 2006]. Daugiau nei 65 proc. antocianinų savo struktūroje turi ir acilo grupių. Angliavandenių molekulės gali būti modifikuotos aromati-nėmis acilo grupėmis, pvz., malato, oksalo, acetato, sukcinato, galo, hidro-ksibenzoine ar kitomis rūgštimis [Clifford M.N., 2000].

Daugiausiai antocianinų yra raudonosiose vynuogėse, tam tikrose javų rūšyse, lapinėse ir šakninėse daržovėse (baklažanuose, raudonuosiuose kopūstuose, raudonosiose pupelėse, mėlynuosiuose svogūnuose, ridikė-liuose), bet labiausiai jų gausu vaisiuose, ypač uogose (mėlynėse, span-guolėse, serbentuose, avietėse, šeivamedžio uogose ir t. t.). Yra nustatyta, kad iš 100 gramų šviežio svorio aronijų uogų galima išgauti iki 1,480 g

Antocianidinas R1 R2 Pelargonidinas (Pg) H H Cianidinas (Cy) OH H Delfinidinas (Dp) OH OH Peonidinas (Pn) OCH3 H Petunidinas (Pt) OCH3 OH

antocianinų, iš šeivamedžio uogų – 1,380 g, iš juodųjų aviečių – 687 mg antocianinų [Wu et al., 2006], iš 100 gramų šviežių mėlynių – 588 mg [Nyman and Kumpulainen, 2001], o iš raudonojo kopūsto 322 mg anto-cianinų [Wu et al., 2006]. Raudonasis vynas turi 200–350 mg antoanto-cianinų/l ir vynui senstant antocianinai transformuojasi į įvairias sudėtingas kompleksines struktūras [Chun et al., 2007; Heinonen, 2007; Zamora-Ros et al., 2010]. Antocianinų kiekis labai priklauso ne tik nuo augalo, kuris juos kaupia, bet ir nuo rūšies, klimato, augimo sąlygų, uogų sunokimo laipsnio, apdirbimo ir kitų savybių [Liobikas ir kt., 2009]. Yra žinoma, kad maiste dažniausiai aptinkami yra cianidino dariniai [Manach et al., 2004].

Vienas iš daugybės augalų, turtingų antocianinų ir auginamas Lietuvoje yra juodasis serbentas (Ribes nigrum L., Grossulariaceae). Jo vaisiai kaupia gana didelius kiekius šių veikliųjų medžiagų; iš 100 gramų šviežių uogų išskiriama iki 250 mg antocianinų [Slimestad and Solheim, 2002]. Yra nustatyta, kad nepriklausomai nuo juodojo serbento uogų sunokimo laipsnio, jų uogų ekstraktuose vyrauja keturi pagrindiniai antocianinai: Cy3R, Dp3R, Dp3G ir Cy3G. Taip pat yra aptinkami nedideli kiekiai (1–2 proc. nuo bendro antocianinų kiekio) Mv3G, Pn3G ir Pg3G [Liobikas ir kt., 2009].

1.1.2. Antocianinų biologinis poveikis

Yra manoma, kad antocianinų svarba žmogaus sveikatai susijusi su jų oksidacinėmis-redukcinėmis savybėmis [Kong et al., 2003; Zafra-Stone et al., 2007] arba, kitaip tariant, antioksidaciniu veikimu: jie suriša laisvuosius radikalus, lipoproteinų oksidacijos produktus, veikia kaip uždegimą slopi-nanti priemonė, saugo nuo navikų susidarymo, stabdo lipidų ir baltymų oksidaciją organizme ir maisto produktuose [Gould, 2004; Glinska et al., 2007; Posmyk et al., 2009]. Yra publikacijų skelbiančių, kad vartojant antocianinų turtingus produktus galima sumažinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką [Zern et al., 2005; Falchi et al., 2006; Lazze et al., 2006; Akhlaghi and Bandy, 2009; de Pascual-Teresa et al., 2010]. Suomijoje 2006 metais buvo vykdytas projektas, kurio metu žmonėms buvo skiriama kasdieninė maisto dieta su padidintu uogų kiekiu ir tai sumažino sergamumą širdies ir kraujagyslių ligomis bei insultų tikimybę apie 60 proc. ir privertė kitas Vakarų Europos šalis pradėti rimčiau domėtis uogose esančiomis naudin-gomis medžianaudin-gomis [Jordheim et al., 2007]. Taip pat buvo atlikti eks-perimentai, kurių metu buvo tiriami antocianinų turtingų braškių, raudonųjų slyvų, vyšnių, aviečių ekstraktų ir Cy3G standarto antioksidaciniai poveikiai ir buvo lyginami su vitaminu C, geležimi, α-tokoferoliu [Proteggente et al., 2002]. Tyrimo metu nustatyta, kad antocianinai in vitro turi daug stipresnį

reaktyvių deguonies formų (ROS) surišimo laipsnį nei kiti tirtieji junginiai. Manoma, kad vienas iš antocianinų, kaip ir kitų flavonoidų, anktiok-sidacinių mechanizmų yra tiesioginis laisvųjų radikalų surišimas. Anto-cianinai savo struktūroje turi OH grupių, kurios atiduodamos laisvos hidrok-silo grupės vandenilio atomą suriša superoksido anijoną, hidrokhidrok-silo ir alkoksilo radikalus [Silva et al., 2002; Dorta et al., 2008]. Taip pat yra nustatyta, kad antocianinai apsaugo nuo lipidų peroksidacijos surišdami pereinamųjų metalų jonus (Cu2+_{, Ca}2+_{, Fe}2+_{) ir neleisdami jiems dalyvauti}

ciklinėse oksidacijos-redukcijos reakcijose [Wang et al., 1999; Proteggente et al., 2002].

Atliktose epidemiologinėse studijose įrodyta, kad raudonojo vyno var-tojimas yra naudingas apsaugant nuo širdies ir kraujagyslių ligų. Šis po-veikis buvo pavadintas „prancūzišku parodoksu“ [Belleville, 2002]. Mano-ma, kad pagrindinė apsauginio poveikio priežastis yra polifenoliniai junginiai, įskaitant ir antocianinus, kurių yra gausu raudonajame vyne, ir kurie pasižymi stipriu antioksidaciniu veikimu [Belleville, 2002; Sun et al., 2002]. Nustatyta, kad raudoname vyne esančios biologiškai aktyvios medžiagos tiesiogiai suriša laisvuosius radikalus ir sumažina mažo tankio lipoproteinų kiekį plazmoje, taip mažindami širdies ir kraujagyslių ligų riziką. Kituose epidemiologiniuose in vivo tyrimuose, kuriuose dalyvavo prieš- ir po- menopauzinio laikotarpio moterys, buvo įrodyta, kad vynuo-gėse esantys polifenoliniai junginiai taip pat pasižymi kardioprotekciniu veikimu, efektyviai mažindami lipidų kiekį plazmoje ir oksidacinį stresą [Zern et al., 2005]. Polifenolinių junginių teigiamas terapinis poveikis gydant širdies ir kraujagyslių ligas yra siejamas ne tik su jų atnioksida-cinėmis savybėmis, bet ir sugebėjimu mažinti trombocitų hiperreaktyvumą bei jų agregaciją, arterijų pažaidą, uždegimo mediatorių ir mažo tankio lipoproteinų gamybą, taip pat sugebėjimu padidinti kraujagysles plečiančių veiksnių gamybą mažinant sistolinį kraujo spaudimą [de Pascual-Teresa et al., 2000]. Taip pat įrodyta, kad antocianinais turtingi ekstraktai, išskirti iš paprastosios mėlynės daug efektyviau sumažina kapiliarų pralaidumą ir trapumą nei rutinas bei turi stipresnį priešuždegiminį ir priešedeminį poveikį [Kong et al., 2003].

Antocianinai pasižymi ir priešvėžiniu veikimu. Toks apsauginis poveikis buvo pastebėtas tiriant žmogaus gaubtinės žarnos ir skrandžio vėžio ląsteles, kurios buvo paveiktos antocianinų frakcijomis. Tokių ląstelių augimas buvo slopinamas daug reikšmingiau nei veikiant kitais flavonoidais (pvz., kvercetino, rutino) [Kamei et al., 1995]. Literatūroje yra keletas darbų, ku-riuose aprašomas antocianinų aglikonų poveikis žmogaus vėžinių ląstelių mitochondrijoms ir pateikiami duomenys, jog Dp sukelia hepatomos HepG2,

CaCo-2 ląstelių apoptozę [Lazze et al., CaCo-2004; Yeh and Yen, CaCo-2005]. Tiriant saldžiosios bulvės antocianinus buvo įrodytas efektyvus apsaugantis nuo mutacijų poveikis [Yoshimoto et al., 1999].

Yra duomenų, kad antocianinai apsaugo nuo ūmaus pankreatito mažindami kasos padidėjimą, lipidų peroksidaciją, slopindami adenozino deaminazės aktyvumą [Jankowski et al., 2000]. Tiriant tikrosios kinrožės antocianinus in vivo buvo nustatyta, kad duodant juos žiurkėms prieš tetra-butilo hidroperoksidazės gydymo dozę, yra žymiai sumažinamas kepenų fermentų žymenų (alanino ir aspartato aminotransferazių) lygis serume ir oksidacinė kepenų pažaida [Wang et al., 2000]. Taip pat histopatologinė žiurkės kepenų analizė parodė, kad kinrožės pigmentai sumažino tetra-butilo hidroperoksidazės sukeltus kepenų pažeidimus, įskaitant uždegimą, leu-kocitų infiltraciją ir nekrozę [Wang et al., 2000].

Antocianinai pasižymi ir priešdiabetiniu poveikiu. Toks jų apsauginis veikimas įrodytas skiriant šilkmedžio lapų ekstrakto dietą, kuri apsaugojo nuo streptozotocino sukelto diabeto žiurkėse [Andallu and Varadacharyulu, 2003; Heo et al., 2007]. Šilkmedžio lapų ekstraktai apsaugo ir nuo amiloido fibrilių formavimosi bei pasižymi nervų sistemą apsaugančiu veikimu, todėl manoma, kad gali būti panaudojami Alzheimerio ligos prevencijai [Shin et al., 2006; Niidome et al., 2007]. Be to, antocianinų turintys vaisiai ir uogos pasirodė esantys efektyvūs gerinant atmintį [Andres-Lacueva et al., 2005].

Atlikta literatūros analizė rodo, kad uogose bei vaisiuose esantys anto-cianinai pasižymi plačiu biologiniu poveikiu bei daugelio organų apsauginiu veikimu nuo įvairių patologijų. Nustatyta, kad antocianinų apsauginis mechanizmas dažniausiai aiškinamas antioksidaciniu jų veikimu, apsaugan-čiu organus nuo patologijų metu padaugėjusių laisvųjų deguonies radikalų.

1.1.3. Antocianinų biologinis prieinamumas: absorbcija, metabolizmas bei transporto į ląsteles mechanizmai

Norint suprasti antocianinų biologines savybes ir jų vaidmenį ligų gydyme ar profilaktikoje, pirmiausia reikia išsiaiškinti jų pasiskirstymo organizme kelius in vivo. Daugelis tyrimų, kuriuose minima antocianinų absorbcija ir metabolizmas žmogaus ir eksperimentinių gyvūnų organiz-muose, buvo atlikti naudojant vaisių ekstraktus, kaip antocianinų šaltinį. Reikia paminėti, kad yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų siekiant nustatyti antocianinų biologinį prieinamumą, tačiau gauti duomenys yra pakankamai prieštaringi.

Tiriant antocianinų biologinį prieinamumą keliose skirtingose eksperi-mentinių gyvūnų ir žmonių farmakokinetinėse studijose buvo parodyta, kad antocianinų absorbcija vyksta labai greitai po jų suvartojimo – maksimali

antocianinų koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama praėjus 15–60 min. po jų suvartojimo. Jų pasišalinimas iš kraujo plazmos yra taip pat labai greitas ir jau po 4–6 val. plazmoje nerandama antocianinų arba jų kiekiai labai minimalūs [Cao et al., 2001]. Manoma, kad greita jų absorbcija gali priklausyti nuo transportinio baltymo bilitranslokazės, kuris padeda me-džiagų pernašai per kepenų ląstelių ir skrandžio epitelinių ląstelių mem-branas [Passamonti et al., 2003], bei nuo maisto terpės – vartojant anto-cianinus su kitais maisto produktais, kurie stabdo skrandžio išsituštinimą, ypač su produktais, turinčiais daug riebalų, antocianinų pikas plazmoje gali būti pasiekiamas ir po 4–6 val. [Mazza et al., 2002; Norton et al., 2005; Mullen et al., 2008; Kalea et al., 2010]. Suvartojus 0,7-10,9 mg/kg anto-cianinų maksimali jų koncentracija žmogaus plazmoje svyruoja nuo 1 iki 100 nmol/l [Prior, 2003; Kurilich et al., 2005]. Lyginant antocianinų absorbcijos ir ekskrecijos į šlapimą proporcijas, nustatyta, kad antocianinų procentas šlapime yra labai mažas, tik apie 1 proc. nuo suvartoto anto-cianinų kiekio. Tačiau iki šiol mažai žinoma apie jų pasiskirstymą audi-niuose ir duomenys yra prieštaringi. Tiriant antocianinų pasiskirstymą po jų suvartojimo praėjus 4 val. jie aptinkami dvylikapirštėje, klubinėje, gaub-tinėje ir aklosiose žarnose [Wu et al., 2006]. Tiriant kaip antocianinai pasiskirsto organuose buvo atliekama tyrimai su pelėmis, jas dvi savaites maitinant maistu, kurio racione 0,5 proc. sudarė antocianinai iš mėlynių ekstrakto [Sakakibara et al., 2009]. Paaiškėjo, kad antocianinai pasiskirsto tam tikruose organuose – daugiausiai jų buvo rasta kepenyse 0,605 nmol/g, inkstuose 0,207 nmol/g, sėklidėse 0,149 nmol/g ir plaučiuose 0,116 nmol/g, o blužnyje, širdyje, raumenyse, smegenyse ir akyse jų nebuvo nustatyta [Sakakibara et al., 2009]. Kiti tyrimai parodė, kad antocianinų ar jų metabolitų produktų aptinkama ir smegenyse bei akyse [Matsumoto et al., 2006; Kalt et al., 2008]. Šiuos rezultatus patvirtino ir Talavera vadovaujama mokslininkų grupė, kuri taip pat parodė, kad žiurkių maisto racioną praturtinus antocianinais jie patenka į žiurkės smegenis ir gana nemažais kiekiais – 0,25 nmol/g audinio [Talavera et al., 2005]. Taip pat Passamonti tyrėjų grupė nustatė nepakitusius antocianinus žiurkės smegenyse praėjus vos keliom minutėm po suvartojimo per os [Passamonti et al., 2005]. Šie duomenys buvo labai netikėti, nes yra žinoma, kad kraujo-smegenų barjero nepereina daugiau nei 98 proc. smulkių, poliškų molekulių, atsiradusių kraujo plazmoje. Nors atlikti in vivo ir in vitro tyrimai parodė, kad anto-cianinai vaidina svarbų vaidmenį apsaugant nuo širdies ir kraujagyslių ligų [Bell and Gochenaur, 2006; Erlund et al., 2008; Toufektsian et al., 2008], tačiau širdies audinyje antocianinų nenustatyta arba nustatyti palyginti maži kiekiai [Felgines et al., 2009]. Felgines su kolegomis pirmieji nustatė, kad dvi savaites girdant žiurkes gervuogių ekstraktu, kuriame nustatyta net 15

skirtingų antocianinų, širdyje buvo aptikti tik nedideli kiekiai antocianinų, perskaičiuoti Cy3G ekvivalentais – 0,06 nmol Cy3G ekvivalento/g audinio. Tuo tarpu pūslėje ir prostatoje jų nustatyta žymiai didesni kiekiai – 2,37 ir 0,304 nmol Cy3G ekvivalento/g audinio, atitinkamai [Felgines et al., 2009].

Manoma, kad yra keli pagrindiniai antocianinų absorbcijos mechanizmai. Visų pirma, jie gali būti absorbuojami plonosiose žarnose [Miyazawa et al., 1999; Tsuda et al., 1999] kaip glikozidai aktyviosios pernašos būdu [Matuschek et al., 2006]. Absorbciją šiuo būdu lemia cheminė struktūra (prie B žiedo prisijungusių hidroksilo ir metilo grupių skaičius bei prie aglikono prisijungusių cukraus molekulių rūšis bei skaičius). Keletas mokslininkų grupių pateikė duomenis apie antocianinų ir antocianidinų buvimą žmogaus ir žiurkės plazmoje po suvartojimo per burną [Tsuda et al., 1999; Cao et al., 2001; Talavera et al., 2004; Galvano et al., 2004]. Tyrimo metu žiurkėms buvo sugirdyta vaivoro uogų ekstrakto ir nustatyta, kad Cy glikozidai patenka į kraujo plazmą iš virškinamojo trakto visai nepakitę [Talavera et al., 2004; Talavera et al., 2005]. Tokie rezultatai leidžia manyti, kad jie į plazmą gali patekti ir organinių anijonų nešiklio – bilitranslokazės– pagalba [Passamonti et al., 2002; Passamonti et al., 2003]. Antocianinai yra stabilūs rūgščioje skrandžio aplinkoje, o tai paaiškina jų tiesioginę absorb-ciją per skrandžio gleivinę į kraują ir greitą, bet trumpalaikį jų koncentra-cijos padidėjimą serume [Fleschhut et al., 2006]. Ilgai buvo manoma, kad tiktai antocianidinai gali būti absorbuojami žarnų ląstelėse (nes jie sugeba pereiti per žarnų sienelę) ir taip patenka į kraujotaką. Anksčiau nebuvo žinoma jokių fermentų, kurie galėtų specifiškai hidrolizuoti glikozidines jungtis, todėl buvo manoma, kad antocianinai yra prastai absorbuojami. Ši nuomonė pasikeitė, kai atliktų tyrimų rezultatai parodė, jog antocianinų glikozidai, ypač Cy3G ir kiti cianidino glikozidai, buvo absorbuoti in vivo [Passamonti et al., 2002; Ichiyanagi et al., 2006]. Nepakitę antocianinai yra per daug hidrofiliški absorbcijai per plonąsias žarnas [Hollman and Katan, 2004], todėl jie yra hidrolizuojami fermentų (pvz., laktazės floridzino hidrolazės, LPH) arba žarnyno mikrofloros prieš absorbciją [Passamonti et al., 2002; Wu et al., 2002]. Dviejuose tyrimuose, atliktuose su žiurkėmis, taip pat pateikta, kad Cy3G yra dalinai hidrolizuojamas (hidrolizės reak-cijoje dalyvaujant žarnyno bakterijų β-glikozidazei) plonosiose žarnose ir tai galėtų paaiškinti, kodėl dalis aglikonų yra randama ir tuščiojoje žarnoje [Tsuda et al., 1999].

Randami gliukuronil-, metil-, ir sulfokonjugatai kepenyse, inkstuose, žarnyne yra siejami su antocianinų metabolizmu [Tsuda et al., 1999; Wu et al., 2002; Talavera et al., 2004; Talavera et al., 2005; He et al., 2006]. Pagrindiniai antocianinų metabolitai randami šlapime yra gliukuronil- ir metil- konjungatai bei antocianidinai (aglikonai). Sulfokonjungatų kiekiai

yra labai maži. Teigiama, kad kepenys yra pagrindinis organas, kuriame vyksta gliukuronizacija ir metilinimas. Metilintos antocianinų formos didžiausiomis koncentracijomis yra aptinkamos kepenyse. Vėliau metilinti antocianinai gali būti sekretuojami į tulžį, nes kraujo plazmoje randama labai maži jų kiekiai. Inkstuose irgi aptinkami metil- ir glukuronil- kojungatai, todėl manoma, kad konjungacija yra vienas pagrindinių anto-cianinų metabolizmo kelių [Wu et al., 2002]. Manoma, kad antocianinai, kurie nebuvo absorbuoti, gali būti skaidomi gaubtinėje žarnoje. O absorbuoti antocianinai su tulžimi taip pat gali būti išskiriami į gaubtinę žarną, kur jie metabolizuojami žarnyno mikrofloros iki fenolinių junginių, hidrolizės ir demetilinimo reakcijų pagalba [Selma et al., 2009; Forester and Waterhouse, 2010]. Taip pat yra nustatyta, kad skirtingi antocianinai gali būti tiesiog chemiškai suskaidomi iki fenolinių rūgščių: galo rūgšties, protokatecho rūgšties ir 4-hidroksibenzoinės rūgšties (1.1.3.1 pav.), alyvų rūgšties, vanilino rūgšties [Kay et al., 2009]. Atlikti tyrimai parodė, kad pagrindinis augaluose aptinkamo antocianido Cy3G metabolitas yra protokatecho rūgštis (3,4-dihidroksibenzoinė rūgštis (3,4-HBR)) [Vitaglione et al., 2007]. Remiantis literatūros duomenimis, po Cy3G suvartojimo per os tik 1 proc. nepakitusio antocianino randama kraujo plazmoje ir šlapime, tuo tarpu kai 3,4-HBR kraujyje yra randama 44 proc., o šlapime 28 proc. nuo suvartoto Cy3G kiekio. Kay ir grupė parodė tokius pačius rezultatus tiriant žmogaus kraujo ir šlapimo pavyzdžius [Kay et al., 2004]. Tsuda ir kolegų atlikti tyrimai su žiurkėmis parodė, kad žiurkių, kurių maisto racione buvo Cy3G, kraujo plazmoje 8 kartus daugiau nustatyta 3,4-HBR nei Cy3G, o Cy aglikono iš viso nenustatyta [Tsuda et al., 1999]. Wu ir kolegos pastebėjo, kad antocianino aglikonas ir prie jo prijungtas cukrus turi įtakos antocianinų absorbcijai ir metabolizmui [Wu et al., 2004]. Jie nustatė, kad priklausomai nuo dozės Cy3G ir Cy3R panašiu kiekiu eks-kretuojami į šlapimą, tačiau skiriasi metabolitų kiekiu jame ir eliminavimo laiku iš organizmo: 69 proc. į šlapimą išskirto Cy3G buvo transformuota į metabolitus (panašiai ir Pg3G), tuo tarpu kai Cy3R buvo aptiktas nepakitęs (81 proc.). Taip pat parodyta, kad Cy3R buvo stabilesnis ir jo pasišalinimas iš plazmos buvo lėtesnis nei Cy3G [Wu et al., 2004]. Lyginant skirtingo antocianidino įtaką absorbcijai ir metabolizmui, nustatyta, kad Pg3G ir jo metabolitų šlapime aptikta 7 kartus daugiau nei Cy3G ir jo darinių [Wu et al., 2004]. Tą patvirtina ir Felgines bei kolegų atlikti tyrimai [Felgines et al., 2003].

1.1.3.1 pav. Antocianinų skilimo produktų susidarymo reakcijos (pagal [Kay et al., 2009])

Nors duomenys apie antocianinų pasiskirstymo organizme kelius yra pakankamai painūs ir prieštaringi, tačiau aišku, kad antocianinų vartojimas turi teigiamą poveikį apsaugant nuo tam tikrų patologijų sukeltų pažeidimų. Reikia paminėti, kad literatūroje pateikti duomenys apie antocianinų pakankamai greitus metabolinius virsmus bei jų skilimo produktus pakitus aplinkos pH leidžia iškelti klausimą, ar daugelio atvejų pastebėtas anto-cianinų apsauginis poveikis įvairių patologijų metu yra susijęs su a-ntocianinų ar jų metabolizmo produktų veikimu.

1.2. Miokardo pažeidimai išemijos/reperfuzijos metu

Miokardo išemija – tai patologinė širdies raumens būsena, kuomet sutrikdomas kraujo pritekėjimas į širdį, dėl ko ląstelėms ima trūkti deguo-nies, substratų bei nepašalinami ląstelės metabolizmo produktai [Jennings, 1969]. Išemija gali pasireikšti kai kraujas nepakankamai prisotintas deguonimi dėl ženkliai sumažėjusio arterinio kraujo spaudimo, arterijų spindžio susiaurėjimo, dėl kraujagyslių dalinio arba visiško užsikimšimo trombu, dujų burbulu arba stambesnėmis dalelėmis (embolija). Išemija gali pažeisti visą širdį arba nedidelę miokardo dalį.

Ilgą laiką negaunant deguonies ir maisto medžiagų širdies ląstelėse prasideda įvairūs struktūriniai ir funkciniai pakitimai, kurie priklausomai nuo išemijos trukmės gali būti negrįžtami ir ląstelė gali žūti apoptozės arba nekrozės būdu. Yra duomenų, kad jau po 40–60 min. nuo miokardo išemijos

pradžios prasideda miokardo infarktas – negrįžtamų pakitimų fazė [Jennings and Reimer, 1981]. Yra žinoma, kad išemijos metu pirmiausia sumažėja ATP lygis ląstelėje [Blanchoin and Pollard, 2002]. Didžiausias ATP kiekis (apie 80–90 proc.) susidaro mitochondrijose oksidacinio forforilinimo metu. Todėl kraujyje trūkstant deguonies, sutrinka oksidacinio fosforilinimo intensyvumas, dėl ko mažiau gaminama ATP [Di Lisa F. et al., 1998]. Buvo parodyta, kad jau po 5 min. nuo miokardo išemijos pradžios ATP kiekis širdies ląstelėse sumažėja 25 proc., po 15 min. – 35 proc., o po 60 min. – 94 proc. [Jennings and Reimer, 1981]. Oksidacinio forforilinimo efektyvu-mo sumažėjimas gali būti sąlygotas mitochondrijų kvėpaviefektyvu-mo grandinės, Krebso ciklo fermentų aktyvumo sumažėjimo [Jennings, 1969; Jennings and Ganote, 1976; Kotaka et al., 1982], ATP-sintazės [Rouslin, 1983; Di Lisa and Bernardi, 2006], adenino nukleotidų nešiklio (ANT) bei išorinės ir vidinės mitochondrijų membranos pažeidimų [Toleikis et al., 1984; Toleikis et al., 1985; Toleikis A. et al., 1989]. Nustatyta, kad išemijos metu pir-miausia pažeidžiamas mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksas (NADH dehidrogenazė) [Jennings, 1969; Jennings and Ganote, 1976; Hardy et al., 1991]. Manoma, kad šio komplekso aktyvumas išemijos metu mažėja dėl nekovalentiškai prijungto FMN disociacijos. Taip pat šio komplekso aktyvumo sumažėjimui įtakos turi ir H+ _{koncentracijos sumažėjimas}

mat-rikse, mitochondrijų vidinės membranos pažeidimų [Toleikis A. et al., 1989; Piper et al., 1994; Borutaite et al., 1996] bei specifinio vidinės mito-chondrijų membranos fosfolipido – kardiolipino – kiekio sumažėjimo dėl laisvųjų deguonies radikalų [Kowaltowski et al., 1995; Castilho et al., 1995]. Taip pat yra duomenų, kad išemijos metu padidėjęs azoto monoksido (NO) kiekis gali sukelti I komplekso aktyvumo sumažėjimą [Brown, 1995; Jekabsone et al., 2003]. Yra žinoma, kad išemija paveikia ir kitus mito-chondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus, tačiau mažesniu laipsniu – II komplekso aktyvumas sumažėja 24 proc., III ir IV kompleksų aktyvumas mažėja 9–13 proc. [Rouslin, 1983; Piper et al., 1985; Toleikis A et al., 1989; Lebuffe et al., 2003]. Citochromo oksidazės (COX) aktyvumo sumažėjimas siejamas su tiesioginiu komplekso pažeidimu arba su citochromo c nete-kimu. Spektrofotometriškai buvo nustatyta, kad po 30 min. totalinės išemijos citochromo c kiekis širdies mitochondrijose sumažėja 25 proc., o po 60 min. – apie 60 proc. [Toleikis A et al., 1989]. Nepažeista išorinė mitochondrijų membrana yra nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš mitochondrijų išemijos metu siejamas su išorinės membranos pažaidomis. Miokardo išemijos metu dėl suaktyvėjusių mitochondrinių fos-folipazių intensyviai vyksta hidrolizė, tuomet susidaro fosfolipidų skilimo produktai, kurie veikia kaip skyrikliai ir padidina mitochondrijų membranos laidumą bei citochromo c išėjimą.

Širdies reperfuzija dar labiau pagilina išemijos sukeltus mitochondrijų ir visos ląstelės pažeidimus. Šie pažeidimai siejami su kalcio jonų koncentracijos padidėjimu ląstelėje bei mitochondrijose [Shen and Jennings, 1972; Jennings R.B., 1984]. Buvo nustatyta, kad po 80 min. išemijos laisvo kalcio jonų koncentracija padidėja apie 4 kartus ir siekia iki 1 μM, o po reperfuzijos išauga iki 5 μM [Allen et al., 1993]. Toks kalcio jonų kon-centracijos padidėjimas yra žalingas, nes pažeidžia mitochondrijų kvėpa-vimo grandinę [Gunter et al., 1994; Borutaite et al., 1996], aktyvina fosfolipazes, kurios ardo membranos fosfolipidus didinant membranos laidumą protonams [Jennings and Reimer, 1981] bei stimuliuoja laisvųjų deguonies radikalų generaciją [Castilho et al., 1995].

1.2.1. Išemijos/reperfuzijos sukelta ląstelių žūtis

Išemijos poveikyje vystosi ląstelių pažaidos, sukeliančios jų žūtį nekro-zės ir apoptonekro-zės būdu. Nekronekro-zės metu mažėja mitochondrijų membraninis potencialas, aktyvuojami degradacinius procesus sąlygojantys fermentai, ląstelės brinksta, sutrūkinėja jų membranos, o išsiliejęs turinys pažeidžia gretimas ląsteles, kurios taip pat žūna [Vanlangenakker et al., 2008]. Terminas apoptozė arba kitaip vadinama genetiškai programuota ląstelių mirtis pradėtas taikyti 1972 m., kai Kerr, Wyllie ir Currie aprašė mor-fologinius pokyčius, kurie visiškai skyrėsi nuo požymių būdingų nekrozei – ląstelė ir visi ląstelės organoidai traukiasi, kondensuojasi branduolio chromatinas, vėliau branduolio DNR skyla į 180–200 bazių porų turinčius fragmentus, ląstelė pasidalina į mažas plazminės membranos apsuptas daleles, apoptotinius kūnelius, kuriuose yra pasiskirstę nesuirę organoidai ir branduolio fragmentai [Kerr et al., 1972]. Apoptotinius kūnelius fagocituoja makrofagai ir kaimyninės ląstelės, todėl degradaciniai fermentai neišeina iš ląstelės ir nesukelia uždegiminio proceso. Yra nustatyta, kad mitochondrijos iki fagocitozės išlieka nepažeistomis membranomis ir atlieka savo pagrindinę funkciją – ATP sintezę [Nicotera and Leist, 1997]. Be šios mitochondrijų funkcijos ląstelė negalėtų vykdyti apoptozės, nes ATP energija reikalinga citoskeleto degradacijai, kaspazių aktyvacijai, ligandų, kuriuos atpažįsta fagocituojančių ląstelių receptoriai, raiškai į ląstelės membranos išorę ir kitoms reakcijoms vykdyti [Eguchi et al., 1997; Leist et al., 1997; Eguchi et al., 1999].

Vienas iš pirmųjų apoptozės požymių yra kaspazių aktyvumo kitimas ląstelių citoplazmoje. Yra duomenų, kad ląstelė gali išgyventi, jei apop-totiniai procesai sustabdomi iki kaspazių aktyvacijos [Loddick et al., 1996]. Kaspazėmis vadinamos aspartatui specifinės cisteino proteazės ardančios baltymuose esančias peptidines jungtis. 1991 metais Ellis, Yuan ir Horwitz

pirmą kartą aprašė apoptotines proteazes kaip nematodo Caenorhabditis elegans genų ced-3 ir ced-4 produktus [Ellis et al., 1991]. Ced-3 produktas buvo labai artimas žmogaus imuninės sistemos baltymui ICE (angl. inter-leukin-1β-converting enzyme) [Yuan et al., 1993], kuris vėliau tapo žinomas kaip kaspazė-1.

Pastaraisiais dešimtmečiais plačiai tyrinėjant apoptozę nustatyta, kad apoptozė gali atsirasti po eksperimentinės išemijos/reperfuzijos [Gottlieb et al., 1994; Freude et al., 1998], po išemijos/reperfuzijos in vivo [Holly et al., 1999], miokardo infarkto, išeminės kardiomiopatijos bei širdies nepakankamumo [Narula et al., 1996; Olivetti et al., 1997; Saraste et al., 1997]. Kelios mokslininkų grupės parodė, kad vien tik išemija gali sąlygoti apoptozę [Long et al., 1997; de Moissac D. et al., 2000]. Tačiau yra duomenų, kad apoptozę sukelia ne išemija, bet po jos sekanti reperfuzija, kuri manoma dar labiau padidina išemijos sukeltus pažeidimus [Freude et al., 1998; Holly et al., 1999]. Buvo parodyta, kad palyginti trumpa išemijos trukmė sukelia ląstelių apoptozę, ilgesnė išemijos trukmė skatina nekrozę, o reperfuzija sužadina nekrozę su papildoma apoptoze [Schumer et al., 1992; Fliss and Gattinger, 1996; Kametsu et al., 2003], tačiau tikslus ryšys tarp šių įvykių nėra nustatytas.

Kadangi yra nustatyta, kad išemijos metu mitochondrijos pažeidžiamos pirmiausiai, tikėtina, kad išemijos paveiktų kardiomiocitų apoptozė su-keliama daugiausiai mitochondriniu keliu. Nuo mitochondrijų priklau-sančioje apoptozėje pagrindinį vaidmenį vaidina mitochondrijų tarpmem-braninėje ertmėje ir išorinėje membranoje esantys baltymai, kurie pasižymi apoptozę aktyvinančiomis ar slopinančiomis sąvybėmis. Vienas iš tokių baltymų yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės komponentas citochro-mas c, kuris perneša elektronus tarp trečiojo ir ketvirtojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų. Šis baltymas dalyvauja susidarant apop-tosomai ir yra specifinis apoptozės aktyvatorius [Kluck et al., 1997; Li et al., 1997]. Taip pat yra žinoma, kad mitochondrijų tarpmembraninėje ertmėje yra AIF (angl. apoptosis-inducing factor) [Susin et al., 1996], Smac/ DIABLO (angl. second mitochondria-derived activator of caspases) [Verhagen et al., 2000], endonukleazė G [van Loo G. et al., 2001]. Visi šie baltymai dalyvauja apoptozės reguliacijoje. Bcl-2 šeimos baltymai taip pat yra svarbūs apoptozės procese [Shimizu et al., 2000; Shimizu and Tsu-jimoto, 2000]. Atlikti tyrimai parodė, kad iš suaugusių žiurkių išskirtuose kardiomiocituose buvo nustatyta padidėjusio baltymo Bcl-2 raiška, dėl ko sumažėjo išemijos sukeltas citochromo c išėjimas iš mitochondrijų bei nuslopinta kaspazių-3 ir -9 aktyvacija [Kang et al., 2000].

Apopotozė yra labai svarbi organizmo augimo reguliacijai, audinių homeostazei ir nereikalingų ląstelių pašalinimui [Suto et al., 2005; Borutaite

and Brown, 2007]. Sutrikus apoptozei, gali pasireikšti keletas ligų, pvz. nepakankama apoptozė gali būti susijusi su vėžio, imuninių ligų vystymusi, o intensyvesnė apoptozė gali lemti neurodegeneracines, širdies ir krauja-gyslių sistemos bei kitas ligas [Meier et al., 2000; Zuzarte-Luis and Hurle, 2002]. Daugelio šių ir kitų ligų gydymas galėtų būti grindžiamas apoptozės aktyvinimu arba slopinimu, todėl racionalių gydymo metodų paieškos skatina toliau tyrinėti apoptozės mechanizmus.

1.2.2. Išemijos sukeltas citochromo c išėjimas iš mitochondrijų ir kaspazių aktyvacija

Citochromas c yra nedidelis (12 kDa) mitochondrijų baltymas lokali-zuotas tarpmembraninėje erdvėje ir silpna elektrostatine jungtimi prisijungęs prie vidinės mitochondrijų membranos išorinio bisluoksnio. Šis baltymas yra mitochondrijų kvėpavimo gradinės dalis ir perneša elektronus nuo citochromo c oksireduktazės (III mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas) iki citochromo c oksidazės (IV mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas). Citochromas c taip pat laikomas specifiniu apopto-zės aktyvatoriumi [Kluck et al., 1997; Li et al., 1997].

Citochromo c išėjimas iš mitochondrijų yra vienas iš ankstyviausiųjų miokardo išemijos sukeliamų pažeidimų [Piper et al., 1985; Borutaite et al., 1996]. Atliekant tyrimus in vitro nustatyta, kad citochromas c iš mito-chondrijų gali išeiti dėl mitomito-chondrijų membranos nespecifinio laidumo [Scarlett and Murphy, 1997], kuomet vyksta mitochondrijų depoliarizacija ir mitochondrijų brinkimas [Heiskanen et al., 1999]. Šiuos procesus skatina kalcio jonai. Fiziologinėmis sąlygomis citozolyje laisvo kalcio jonų koncentracija yra 0,1 μM. Nustatyta, kad po 50 min. hipoksijos kalcio jonų koncentracija padidėja 2 kartus, po 80 min. išemijos daugiau nei 4 kartus [Miyata et al., 1992; Allen et al., 1993], o po išemijos/reperfuzijos jų koncentracija ląstelėje ir mitochondrijose padidėja iki 5 μM [Allen et al., 1993]. Buvo pastebėta, kad kai kuriais atvejais citochromas c išeidavo iš mitochondrijų net ir panaudojus nespecifinio laidumo slopiklius [Kim et al., 2000; Shimizu et al., 2000]. Kitų mokslininkų atlikti tyrimai patvirtino, kad citochromas c iš mitochondrijų gali išeiti ir nuo kalcio jonų nepriklausomu būdu, kuomet mitochondrijos išlieka funkciškai nepakitusios ir neišbrinksta [Gogvadze et al., 2001]. Tokiu atveju, citochromas c iš mitochondrijų išeina dėl pokyčių membranoje, atsirandančių dėl sąveikos su Bcl-2 šeimos baltymais, kurie pasižymi tiek priešapoptoziniu, tiek proapoptoziniu veikimu [Antonsson and Martinou, 2000; Vander Heiden et al., 2000].

Iš mitochondrijų tarpmembraninės erdvės patekęs į citoplazmą cito-chromas c dalyvauja susidarant daugiamolekuliniam, prokaspazę-9

aktyvi-nančiam kompleksui – apoptosomai. Buvo nustatyta, kad komplekso susidarymui būtini komponentai yra citochromas c, Apaf-1 (angl. apoptosis protease-activating factor-1), prokaspazė-9 bei reikalinga dA TP energija [Riedl and Salvesen, 2007; Fadeel et al., 2008]. Apaf-1 – tai citozolinis bal-tymas esantis neaktyvioje, monomerinėje formoje ir uždaroje konfor-macijoje tol, kol neatsiranda apoptotinis signalas – į citozolį patekęs cito-chromas c. Citocito-chromas c jungiasi prie Apaf-1. Apaf-1 molekulės susijungia tarpusavyje ir susidaro oligomerinis kompleksas apoptosoma, kurios CARD domenas jungiasi su neaktyvios prokaspazės-9 CARD domenu ir akty-vuojama kaspazė-9 [Kim et al., 2005] (1.2.2.1 pav). Vėlyvesnėje stadijoje prokaspazė-3 verčiama į aktyvią formą, kuri paleidžia tolimesnę kaspazių kaskadą [Jeong and Seol, 2008].

1.2.2.1 pav. Apoptosomos susiformavimas ir kaspazės 9 aktyvavimas (pagal [Acehan et al., 2002])

Žinoma, kad citochromą c sudaro vientisas 104 amino rūgščių peptidas su geležies hemu kovalentiškai susijungęs su dviem cisteino liekanomis. Citochromas c gali būti dviejų formų – oksiduotas arba redukuotas. Šių formų struktūra yra panaši, tačiau skiriasi savo fizikinėmis ir biocheminėmis savybėmis [Nicholls, 1974; Trewhella et al., 1988]. Todėl mokslininkams kilo klausimas, ar šios dvi formos sugeba vienodai aktyvuoti apoptosomą? Ilgą laiką buvo manoma, kad citochromo c redokso būsena nėra svarbi apoptosomos funkcionavimui [Kluck et al., 1997; Hampton et al., 1998], tačiau buvo pastebėti kai kurie faktai, leidžiantys manyti apie citochromo c redokso būsenos svarbą. Kluck [Kluck et al., 1997] vadovaujama moks-lininkų grupė pastebėjo, kad mielių citochromas c negali aktyvuoti kaspazių, o šio citochromo c struktūra labai panaši į žinduolių ir žuvų citochromą c, kuris pasižymi kaspazes aktyvuojančiomis sąvybėmis. Taip pat Hampton grupė [Hampton et al., 1998] nustatė, kad citochromas c neturintis hemo buvo neaktyvus ir negalėjo aktyvuoti kaspazių. Todėl atlikus detalesnius tyrimus kelios mokslininkų grupės įrodė, kad apoptosomos susidaryme

labiau linkęs dalyvauti oksiduotos formos citochromas c [Hancock et al., 2001; Suto et al., 2005; Borutaite, 2010], kuris greitai aktyvuoja kaspazę-9 ir kaspazę-3 citozolyje, o tuo tarpu viduląsteliniai reduktoriai, tokie kaip askorbatas, redukuotas glutationas, cisteinas, N-acetil-cisteinas, cheminiai junginiai, pvz., TMPD, DTT, ir redukuojantys ląstelės fermentai, tokie kaip citochromas b5, P450, NOS, neuroglobinas, citozolinė NAD(P)H oksidazė, redukuoja iš mitochondrijų į citozolį išėjusį citochromą c, neaktyvuoja apoptosomos ir nesukelia apoptozės [Pan et al., 1999; Suto et al., 2005; Borutaite and Brown, 2007] (1.2.2.2 pav).

1.2.2.2 pav. Citochromą c redukuojančių medžiagų vaidmuo apoptozės kelyje

COX – citochromo oksidazė; Cyt.cox – citochromo c oksiduota forma;

Cyt.cred – citochromo c redukuota forma (pagal [Brown and Borutaite, 2008])

Šiuo metu vis dar nėra pakankamai duomenų, kaip redukuotas cito-chromas c slopina apoptosomos susiformavimą. Oksiduotas ir redukuotas citochromas c gali turėti skirtingą giminingumą prisijungiant prie Apaf-1. Šis mechanizmas galėtų būti aiškinamas tuo, kad aplink citochromo c hemą yra lizino liekanų, kurių dėka vyksta prisijungimas prie Apaf-1 [Qi et al.,

1996][Qi et al., 1996; Yo and Wang, 2001] ir citochromo c redukcijos metu keičiasi šių liekanų santykinė padėtis [Qi et al., 1996], dėl ko sumažėja redukuoto citochromo c giminingumas Apaf-1. Taip pat oksiduotas ir redukuotas citochromas c gali turėti skirtingą sugebėjimą aktyvinti Apaf-1 po prisijungimo. Yra žinoma, kad apoptosoma aktyvuojama, kai Apaf-1 ir citochromo c prisijungimo metu dATP hidrolizuojama į dADP. Redukuotas citochromas c prisijungia prie monomerinio Apaf-1, tačiau nesukelia dATP hidrolizės ir apoptosoma tampa neaktyvi [Chandra et al., 2006]. Taip pat yra žinoma, kad redukuotas, t.y. turintis teigiamą krūvį, citochromas c gali prisijungti prie kitų neigiamą krūvį turinčių ląstelės komponentų, tokių kaip DNR, viduląstelinių membranų ir prie citozolinių baltymų (tokių kaip citochromas b5 ir IP3 receptorių). Redukuotas citochromas c gali silpniau

aktyvuoti apoptosomą, kadangi redukuotoje formoje jis giminingesnis prisijungiant prie kitų ląstelės komponentų [Chandra et al., 2006].

Yra duomenų, kad citochromo c redokso būsena svarbi aktyvuojant apoptozę ir iki kaspazių aktyvacijos. Alikti tyrimai parodė [Kagan et al., 2005; Basova et al., 2007], kad oksiduota citochromo c forma sukelia mitochondrijų kardiolipino peroksidaciją ir gali padėti citochromui c išeiti iš mitochondrijų. Redukuota citochromo c forma nepajėgi oksiduoti kardio-lipino, o tai galėtų būti vienas iš apoptozės reguliacijos mechanizmų iki citochromo c išėjimo.

Nors jau daug tyrimų yra atlikta tyrinėjant antocianinų biologinio vei-kimo ypatumus, vis dar nėra pakankamai duomenų apie antocianinų poveikį mitochondrijų funkcijoms, poveikį citochromo c išėjimui iš mitochondrijų, o ypač apie jų galimą vaidmenį apoptozės reguliavime ir apsauginiame širdies mechanizme, kuris, mūsų nuomone, susijęs ne su pastebėtų antioksidaciniu veikimu, bet su antocianinų sugebėjimu redukuoti citozolyje esantį citochromą c (1.4 pav.). Ši informacija galėtų padėti ieškant racio-nalių tam tikrų ligų gydymo būdų, kurių pagrindą sudaro apoptozės ak-tyvinimas arba slopinimas.

1.3. Apsauginis antocianinų poveikis nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų

Šiuo metu yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų, kurių metu tyrinėtas polifenolinių junginių apsauginis poveikis nuo išemijos sukeliamų funkcinių ir struktūrinių ląstelių pažeidimų. Manoma, kad šis poveikis yra susijęs su šių junginių antioksidacinėmis, kraujagysles atpalaiduojančiomis ir prieš-uždegiminėmis savybėmis bei antiagregaciniu efektu [Sener et al., 2005; Akhlaghi and Bandy, 2009]. Yra duomenų, kad flavonoidų klasės jun-giniams patekus į organizmą per os, jie apsaugo širdį nuo išemijos/

reperfuzijos sukeliamų pažeidimų [Modun et al., 2003; Ikizler et al., 2007]. Geriausiai ištirtas antocianinų apsauginis poveikis nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų susijęs su antocianinų antioksidaciniu veikimu. Manoma, kad vienas iš antocianinų, kaip ir kitų flavonoidų, antioksidacinių mechanizmų yra tiesioginis laisvųjų radikalų surišimas, atiduodant laisvos hidroksilo grupės vandenilio atomą [Silva et al., 2002; Dorta et al., 2008]. Buvo įrodyta, kad ilgalaikė antocianinų dieta žiurkėms sąlygojo mažesnį miokardo jautrumą išemijai/reperfuzijai tiek in vivo, tiek ex vivo ban-dymuose. Yra manoma, kad šis apsauginis mechanizmas susijęs su širdies endogeninių antioksidantų moduliacija [Berthonneche et al., 2007; Tuo-fektsian et al., 2008].

Yra duomenų, kad antocianinai gali apsaugoti miokardą nuo išemijos/ reperfuzijos sukeltų pažeidimų ir ne antioksidacinio mechanizmo pagalba. Scarabelli ir grupė nustatė, kad 1 val. inkubacija su Dp kultivuojamose kardiomiocituose sumažina tiek apoptozinių, tiek nekrozinių ląstelių skaičių ir sumažina infarkto zonos dydį žiurkių širdyse ir abu šie efektai susiję su STAT1 (angl. signal transducers and activators of transcription) akty-vacijos slopinimu[Scarabelli et al., 2009]. Kitas tyrimas parodė, kad 8 valandas inkubuojant jaučio arterijų endotelio ląsteles su 0,1 μM Cy3G, buvo stebima padidinta eNOS ekspresija ir NO produkcija [Xu et al., 2004]. Nustatyta, kad širdies pripratinimo metu padidėjusi eNOS geno raiška ir aktyvumas gali apsaugoti širdį nuo išeminių/reperfuzinių pažeidimų [Bolli et al., 1997; Schulz et al., 2004; Jones and Bolli, 2006]. Svarbu yra tai, kad ankščiau paminėti apsauginiai mechanizmai buvo pastebėti po palyginti ilgos (1–8 val) pre-perfuzijos antocianinais.

Pastaruoju metu nustatyta, kad antocianinai, kurie pasižymi atnioksi-daciniu veikimu, priklausomai nuo tam tikrų eksperimentinių sąlygų, gali turėti ir prooksidacines savybes [Ziberna et al., 2010]. Šios tyrimų grupės atlikti eksperimentai parodė, kad mėlynių ekstrakto antocianinai apsaugo nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų žiurkių širdį veikiant ma-žomis antocianinų koncentracijomis, tuo tarpu kai didesnės koncentracijos pasižymi kardiotoksiniu poveikiu. Tokiu būdu didelės antocianinų kon-centracijos galėtų veikti prooksidantiškai, didinant reaktyviųjų deguonies formų kiekį, kurios pažeidžia biologines molekules [Halliwell, 2008]. Reperfuzijos metu didelė antocianinų koncentracija dar labiau didina ok-sidacinį stresą sukeliant dar didesnes miokardo pažaidas. Tačiau tikslus ap-sauginis antocianinų mechanizmas dar nėra nustatytas.

2. METODIKA

Tyrėme antocianinų (delfinidino gliukozido (Dp3G), cianidino O-gliukozido (Cy3G), pelargonidino O-O-gliukozido (Pg3G), malvinidino 3-O-gliukozido (Mv3G), peonidino 3-3-O-gliukozido (Pe3G)) bei Cy3G ir Pg3G metabolitų – 3,4-dihidroksibenzoinės rūgšties (3,4-HBA) ir 4-hid-roksibenzoinės rūgšties (4-HBA) tiesioginį poveikį žiurkės širdies mito-chondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai – mitomito-chondrijų pradiniam kvėpavimo greičiui (V0), kvėpavimo greičiui trečioje metabolinėje būsenoje

(V3), bei citochromu c aktyvuotam kvėpavimo greičiui ketvirtoje

meta-bolinėje būsenoje (V4) substratais naudojant piruvatą (6 mM ) ir malatą

(6 mM) (3.1 poskyris ir 3.6 poskyris). Spektrofotometriškai ištyrėme penkių pagrindinių antocianinų ir ankščiau paminėtų antocianinų metabolitų sugebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c (3.2 poskyris ir 3.6 po-skyris). Taip pat nustatėme tiesioginį Dp3G, Cy3G ir Pg3G poveikį širdies mitochondrijoms, išskirtoms po 45 min. išemijos – įvertinome tiriamųjų medžiagų poveikį mitochondrijų kvėpavimo greičiams skirtingose metabolinėse būsenose, ATP kiekio kitimui ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumo kitimui (3.5. poskyris). Galimai nuo iše-mijos apsaugančio antocianinų poveikio tyrimui buvo pasirinkti du išeiše-mijos modeliai: 45 min. išemijos, ir 45 min. išemijos/30 min. reperfuzijos. Iš išemijos ir išemijos/reperfuzijos paveiktų žiurkių širdžių diferencinio cent-rifugavimo metodu buvo išskiriamos mitochondrijos ir tiriamas pasirinktų medžiagų (Cy3G ir Pg3G bei jų metabolitų 3,4-HBR ir 4-HBR) ne-tiesioginis poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo greičiui skirtingose metabolinėse būsenose, substratais naudojant piruvatą ir malatą bei suk-cinatą terpėje esant amitalio. Spektrofotometriškai imunofermentinių reak-cijų pagalba buvo nustatytas citochromo c kiekis mitochondrinėje ir cito-zolinėje frakcijose. Mitochondrijų izoliavimo metu atskirtoje citocito-zolinėje frakcijoje spektrofotometru buvo matuojamas kaspazių aktyvumas (3.3 poskyris ir 3.6 poskyris). Nekroziniams pažeidimams įvertinti spektro-fotometriškai buvo matuojamas laktato dehidrogenazės (LDH) aktyvumas reperfuzate (3.4 poskytis). Apoptozei nustatyti buvo daromi širdies audinio pjūviai, kuriuose imunofermentinių reakcijų pagalba buvo įvertinta kardiomiocitų branduolio DNR fragmentacija (3.4 poskyris).

Visiems eksperimentams atlikti buvo naudojamos 2-4 mėnesių, suau-gusios Wistar žiurkės (patinai), veisiamos LSMU Veterinarijos akademijos vivariume. Visi tyrimai buvo atliekami atsižvelgiant į Europos Sąjungoje ir

Lietuvos Respublikoje galiojančius teisės aktus, reglamentuojančius eksperimentus su gyvūnais (Valstybinės Veterinarijos tarnybos leidimas atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0155 ir Nr. 0217).

2.2. Mitochondrijų ir citozolio frakcijų atskyrimas

Širdies mitochondrijos buvo izoliuojamos diferencinio centrifugavimo metodu [Scholte et al., 1973]. Širdis (kontrolinė arba po išemijos) buvo praplaunama ir atšaldoma 1–4°C temperatūros 0,9 proc. KCl tirpalu, kad širdis nustotų susitraukinėti, sulėtėtų metabolizmas bei nevyktų autolizės procesai. Buvo apkarpomas jungiamasis bei riebalinis audinys, prakerpami skilveliai ir širdis nusausinama filtriniu popieriumi. Širdies audinys buvo susmulkinamas žirklutėmis ant ledų padėtoje Petri lėkštelėje. Susmulkintas audinys buvo dedamas į stiklinį homogenizatorių, užpilamas 10–12 ml homogenizavimo terpe, kurios sudėtis yra: 180 mM KCl, 10 mM Tris HCl, 2 mM EGTA (pH 7,4 2ºC) ir homogenizuojama teflonine piestele 20–30 s. Homogenatas išpilstomas į centrifuginius mėgintuvėlius. Literatūroje pateikti duomenys rodo, kad KCl slopina kaspazių aktyvaciją [Cain et al., 2001; Segal and Beem, 2001], todėl ruošiant citoplazminę frakciją kaspazių aktyvumo matavimui, buvo naudojama kita homogenizavimo terpė: 250 mM sacharozės, 5 mM HEPES, 2 mM EGTA (pH 7,3 2ºC). Homoge-natas buvo centrifuguojamas 750 × g 5 min. (centrifuga Eppendorf 5810 R), po to supernatantas buvo perkošiamas per dvigubą marlinį filtrą, nenupilant nuosėdų ir paskutinių supernatanto lašų, ir vėl centrifuguojamas 6800 x g 10 min. Taip atskiriamos mitochondrijų ir citozolio frakcijos. Citozolio frakcija dar kartą buvo centrifuguojama 10000 × g 30 min. ir naudojama nustatant citochromo c kiekį, esantį citozolyje, ir matuojant kaspazių aktyvumą. Gautos mitochondrijų frakcijos paviršius atsargiai buvo praskalaujamas suspendavimo terpe bei suspenduojama į mėgintuvėlį įpylus 0,05–0,07 ml suspendavimo terpės, kurios sudėtis yra: 180 mM KCl, 20 mM Tris/HCl (pH 7,3 2ºC). Paruošta mitochondrijų suspensija buvo laikoma leduose viso eksperimento metu.

2.3. Baltymo kiekio nustatymas

Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje bei citozolio frakcijoje buvo nustatomas modifikuotu biureto metodu [Gornall et al., 1949]. Stikliniame mėgintuvėlyje buvo sumaišoma 0,05 ml mitochondrijų suspensijos ir 0,95 ml 0,33 proc. dezoksicholato tirpalo ir 5 min. inkubuojama termo-statuojamoje vandens vonelėje palaikant 37ºC temperatūrą. Nustatant bal-tymo kiekį citozolio frakcijoje buvo sumaišoma 0,5 ml išskirtos citozolio

frakcijos ir 0,5 ml 0,33 proc. dezoksicholato tirpalo. Po to, tiek nustatant mitochondrijų baltymą, tiek citozolio frakcijoje esantį baltymą, buvo įpilama 4 ml biureto reagento, sumaišoma ir 15 min. inkubuojama 37ºC vandens termostate. Po to spektrofotometru Helios α (Thermo Electron, Anglija), esant 536 nm bangos ilgiui, buvo matuojamas paruošto tirpalo optinis tankis. Baltymo kiekis buvo nustatomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti buvo naudojami standartiniai žmogaus serumo albumino tirpalai.

2.4. Miokardo išemijos sukėlimas, perfuzija ir reperfuzija

Eksperimentinis gyvūnėlis buvo užmigdomas anglies dioksido dujomis ir užmušamas nutraukiant stuburo kanalą. Prakirpus krūtinės ląstą, tam kad širdies kraujagyslėse nesusidarytų krešuliai, į kairįjį širdies skilvelį buvo suleidžiamas 1 ml (5000 aktyvumo vienetų/ml, 37ºC) heparino tirpalo. Tuomet nukerpamos širdies kraujagyslės bei pasaitai. Išemija buvo su-keliama patalpinus išimtą širdį į termostatuojamą (37ºC) uždarą kamerą ir laikoma 45 min. Taikant išemijos po perfuzijos modelį į išimtos širdies aortą buvo įstatoma plastikinė kaniulė, kuri yra prijungta prie Langendorfo tipo širdies perfuzijos sistemos. Norint išvengti širdies kraujagyslių užkimšimo oro kamščiais, perfuzijos tirpalas per sistemą pradedamas leisti jau prieš įstatant kaniulę. Laisvai ant kaniulės pakabinta širdis buvo pa-talpinama į termostatuojamą (37ºC) pusiau uždarą kamerą ir 15 min. perfuzuojama perfuzijos tirpalu. Perfuzijai buvo naudojamas Krebs-Henseleit tirpalas, kurio sudėtis: 11 mM gliukozės, 118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,6 mM MgSO4,

ir 0,7 mM Na-piruvato (prisotintas 95 proc. O2 ir 5 proc. CO2, pH 7,4 37ºC),

esant 80 cm H2O spaudimui. Po 10 min. nusistovėjimo periodo, papildomai

buvo pridedama tyrimui naudojamų 1 µM, 10 µM, 20 µM ar 40 µM (max. tūris 80 μl) antocianinų (Cy3G arba Pg3G) arba jų metabolitų (4-HBA, 3,4-HBA) ir širdis perfuzuojama dar 15 min. Kontrolinės širdys buvo perfu-zuojamos tokį patį laiko tarpą į terpę nepridedant antocianinų. Srauto tekėjimo greitis – 20–25 ml/min. Tais atvejais, kai po širdies perfuzijos buvo sukeliama išemija (autolizė), tirpalo tekėjimas buvo sustabdomas ir širdis 45 min. laikoma uždaroje drėgnoje termostatuojamoje kameroje. Reperfuzijos modeliui po 30 min. išemijos terpės tekėjimas atnaujinamas ir reperfuzuojama 30 min. be arba su tiriamosiomis medžiagomis. Reperfu-zijos metu reperfuzatas buvo surenkamas ir naudojamas laktato dehidro-genazės aktyvumo matavimui. Prieš izoliuojant mitochondrijas širdis kelias minutes buvo palaikoma 0,9 proc. 2–4ºC KCl tirpale, kad sustotų miokardo susitraukimas ir jame vykstantys procesai.

2.5. Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimas

Izoliuotų mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas naudojant oksimetrinę sistemą Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Austrija). Mitochondrijų kvėpavimo matavimai buvo atliekami inkubacinėje terpėje (0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM

taurino, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozės (pH 7,1

37ºC), pridedant 6 mM piruvato ir 6 mM malato, arba 10 mM sukcinato (kartu su 2 mM amitalio) kaip kvėpavimo substratų. Matavimai buvo atlikti 37ºC temperatūroje. 2.5.1 pav. pavaizduota tipinė mitochondrijų kvėpavimo registravimo kreivė. Pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) antroje

metabolinėje būsenoje buvo matuojamas į oksimetrinę kiuvetę, užpildytą inkubacine terpe, pridedant kvėpavimo substratų (piruvatas + malatas) ir 0,125 mg/ml mitochondrijų baltymo. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje buvo pasiekiamas į kiuvetę pridedant 1 mM ADP (V3). Mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būse-

2.5.1 pav. Tipinė oksigrafinė kreivė vaizduojanti izoliuotų širdies mitochondrijų kvėpavimo greičio kitimą skirtingose metabolinėse būsenose

A linija - deguonies kiekis kiuvetėje (nmol/ml); B linija - deguonies sunaudojimo greičio išvestinė, leidžianti įvertinti kvėpavimo efektyvumą (pmol/(s·ml)). Pradinis (V0)

mitochodrijų kvėpavimo greitis gaunamas į kiuvetę pridėjus 0,125 mg mitochondrijų ir 6 mM piruvato+6 mM malato. Į kiuvetę pridedant skirtingų antocianinų registruojamas jų

poveikis skirtingoms metabolinėms būsenoms; kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje pasiekiamas į kiuvetę pridedant 1 mM ADP; nuslopinus adenino nukleotidų nešiklį 140 µM atraktilozidu pasiekiamas ketvirtos metabolinės būsenos kvėpavimo greitis

noje (V4) registruojamas pridedant 140 μM atraktilozido (ATR) – ADP/ATP

nešiklio slopiklio. Citochromo c efektas (gebėjimas aktyvuoti 140 µM atraktilozido nuslopintą mitochondrijų kvėpavimą) buvo nustatytas į kiuvetę įdedant 32 µM šio baltymo. Galutinė mitochondrijų baltymo koncentracija oksimetro kiuvetėje buvo 0,125 mg/ml. Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreiškiamas pmol O2/s–1/0,125 mg–1 mitochondrijų baltymo.

2.6. Citochromo c redukcijos nustatymas

Citochromo c redukcija buvo matuojama spektrofotometriškai [Rieske and Tisdale, 1967], naudojant Helios α (Thermo Electron, Anglija) spektro-fotometrą. Absorbcijos spektrai buvo gaunami, matuojant 500–600 nm bangos ilgių ribose, o citochromo c redukcijos maksimumas buvo stebimas 550 nm bangos ilgyje. Skirtingų antocianinų ir 3,4-HBR bei 4-HBR po-veikis citochromo c redukcijos spektro kitimui buvo registruojamas į spektrofotometro kiuvetė pridėjus 1 ml inkubavimo terpės (0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM KH2PO4,

20 mM HEPES, 110 mM sacharozės (pH 7,1 37ºC)), 20 μM arba 40 μM tiriamųjų antocianinų ar metabolitų bei 32 µM citochromo c. Siekiant išvengti antocianinų ir citochromo c spektrų persidengimo po tiriamųjų antocianinų priedo, jų spektras buvo prilyginamas 0 (angl. baseline) ir pridėjus citochromo c buvo matuojamas citochromo c spektro kitimas veikiant tiriamiesiems antocianinams arba metabolitams. 2.6.1 pav. pa-vaizduotas tipinis citochromo c absorbcijos spektro pavyzdys. Citochromo c redukcijos spektrai buvo įvertinti pirmąją minutę (A), po 3 min. (B) ir 6 min (C). Matavimai atlikti kambario temperatūroje. Citochromo c redukcijos lygis buvo nustatytas pagal absorbcijos padidėjimą esant 550 nm (redukuoto citochromo c maksimumas) bangos ilgiui lyginant su visiškai redukuoto citochromo c absorbcijos lygiu 550 nm bangos ilgyje pridėjus kelis ditionito kristalus. Ditionitu redukuoto citochromo c absorbcijos maksimumas buvo prilygintas 100 proc. redukuoto citochromo c (2.6.1 pav. (D)). Tuomet, kai siekėme išmatuoti tiriamųjų antocianinų poveikį citochromo c redukcijos efektyvumui terpėje esant mitochondrijų, matavimai buvo atliekami analogiškai aprašytiems, tik į spektrofotometro kiuvetę papildomai buvo pridedama 0,125 mg mitochondrijų suspensijos ir citochromo oksidazės slopiklio 10 μM azido.