kasos vėžinėse ląstelėse Hipertermijos ir cisplatinos poveikio mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms įvertinimas

(1)

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

VAIDA STASIULYTĖ

Hipertermijos ir cisplatinos poveikio mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms

įvertinimas kasos vėžinėse ląstelėse

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė:

Prof. dr. Sonata Trumbeckaitė

Kaunas 2018

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė ………… (parašas) Data:

Hipertermijos ir cisplatinos poveikio mitochondrijų kvėpavimo

funkcijoms įvertinimas kasos vėžinėse ląstelėse

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė………. Data: (parašas)

Recenzentė Darbą atliko

Prof. Vilma Petrikaitė Magistrantė

……… Vaida Stasiulytė………….

(parašas) (parašas)

Data: Data:

Kaunas 2018

(3)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

1. ĮVADAS ... 9

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

3.1 Kasos vėžys, epidemiologija, rizikos veiksniai ... 12

3.2 Kasos vėžio gydymas ... 12

3.3 Cisplatina, jos veikimo mechanizmas ir nepageidaujami poveikiai ... 13

3.4 Rezistentiškumas cisplatinai ... 15

3.5 Hipertemijos taikymas vėžiniams susirgimams ... 15

3.6 Hipertermijos veikimo mechanizmas ... 16

3.7 Mitochondrijų sandara bei funkcijos ... 17

3.8 Mitochondrijų kvėpavimo grandinė ir oksidacinis fosforilinimas ... 19

3.9 Hipertermijos poveikis mitochondrijoms ... 20

3.10 Cisplatinos poveikis mitochondrijoms ... 21

4. METODIKA ... 22

4.1 Aparatūra, indai ... 22

4.2 Medžiagos ... 22

4.3 Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos ... 22

4.4 Cisplatinos ir hipertermijos poveikio kasos adenokarcinomos ląstelėms (T3M4) in vitro modelis... 23

4.5 Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimas kasos (T3M4) vėžinėse ląstelėse oksigrafiniu metodu ... 23

4.5.1 Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimo eiga ... 25

(4)

5. REZULTATAI ... 27

5.1 Cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių (T3M4) endogeniniam kvėpavimui ... 27

5.2 Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui kasos vėžinėse ląstelėse (T3M4) .... 27

5.3 Hipertermijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams kasos vėžinėse ląstelėse (T3M4) ...33

5.4 Hipertermijos ir cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams kasos vėžinėse ląstelėse (T3M4) ... 35

6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37

7. IŠVADOS ... 40

(5)

SANTRAUKA

Vaidos Stasiulytės magistro baigiamasis darbas “Hipertermijos ir cisplatinos poveikio mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms įvertinimas kasos vėžinėse ląstelėse”/ mokslinio darbo vadovė prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Tyrimo tikslas. Ištirti kasos vėžinių ląstelių (T3M4) (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu

cisplatina ir/arba hipertermija) mitochondrijų kvėpavimo greičius.

Uždaviniai. Ištirti ir palyginti cisplatina paveiktų ir nepaveiktų kasos vėžinių ląstelių (T3M4)

mitochondrijų kvėpavimo greičius įvairiose mitochondrijų metabolinėse būsenose; Ištirti ir palyginti hipertermija (37°C, 40°C, 43°C temperatūra) paveiktų kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičius; Ištirti ir įvertinti kaip cisplatina ir hipertermija paveikia kasos vėžinių ląstelių išorinės ir vidinės mitochondrijų membranos pralaidumą; Ištirti ir įvertinti, kokį poveikį kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičiams turi hiperterminė chemoterapija (cisplatinos ir temperatūros (40°C ir 43°C) derinys).

Metodai. Kasos vėžinių ląstelių linija (T3M4) buvo skirstoma į kontrolinę ir tiriamąsias grupes,

paveiktas chemoterapiniu vaistu cisplatina (IC50 48µM) ir/arba hipertermija (40°C ir 43°C

temperatūra). Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiai buvo registruojami oksigrafiniu metodu, kuris atliekamas su “Oroboros Oxygraph-2k” oksigrafu 37°C temperatūroje.

Rezultatai. Chemoterapinis vaistas cisplatina slopina ATP sintezę kasos vėžinėse ląstelėse (T3M4) ir

padidina mitochondrijų vidinės ir išorinės membranų pralaidumą oksiduojant glutamatą/malatą bei sukcinatą. Hipertermija neturėjo įtakos kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Chemoterapinė hipertermija padidino kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų vidinės membranos pralaidumą ir tokiu būdu mažino ATP sintezės pajėgumą, tačiau poveikis siejamas su cisplatinos, o ne hipertermijos veikimu.

Išvados. Cisplatina bei chemoterapinė hipertermija atskiria oksidacijos ir fosforilinimo procesus kasos

vėžinėse ląstelėse (T3M4) bei padidina mitochondrijų vidinės ir išorinės membranų pralaidumą. Hipertermija kasos vėžinių ląstelių (T3M4) neveikia ir papildomo sinergistinio poveikio mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms neturėjo.

(6)

SUMMARY

The final master thesis prepared by Vaida Stasiulytė “Assessment of Hyperthermia and Chemotherapy Effects on Mitochondrial Respiratory Functions in Pancreatic Cancer Cells”/ Advisor Prof. Dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmocognosy. – Kaunas.

The aim of the thesis is to measure pancreatic cancer cell (T3M4) mitochondrial respiratory rates in

cases when cells are affected and not affected by chemotherapeutic drug cisplatin and/ or hyperthermia.

The tasks of the thesis are the following: to measure and compare pancreatic cancer cell (T3M4)

mitochondrial respiratory rates in different metabolic states in both cases when the cells are affected and are not affected by cisplatin; to measure and compare pancreatic cancer cell mitochondrial respiratory rates when cells are affected by hyperthermia (40°C and 43°C); to investigate the effect of cisplatin and hyperthermia on the permeability of mitochondrial outer and inner membrane; and to investigate the effect of chemotherapeutic hyperthermia (combination of cisplatin and 40°C, 43°C temperature) on pancreatic cancer cell (T3M4) mitochondrial respiratory rates.

Methodology used to perform the tasks of the thesis is the following: the pancreatic cancer cell line

(T3M4) was divided into controls and research groups affected by chemotherapeutic drug cisplatin (IC50 48µM) and/ or hyperthermia (40°C and 43°C temperature). The pancreatic cancer cell

mitochondrial respiratory rates were measured by oxygraphic method (at 37°C temperature), which is performed using “Oroboros Oxygraph-2k” oxygraph.

The results of the reasearch are the following: the chemotherapeutic drug cisplatin increases the

permeability of mitochondrial inner membrane and inhibits ATP synthesis in pancreatic cancer cells (T3M4) with both glutamate/malate and succinate and increases the permeability of mitochondrial outer membrane. The research demonstrates that hyperthermia has no effect on pancreatic cancer cell mitochondrial respiratory rates. The chemotherapeutic hyperthermia also increases the permeability of pancreatic cancer cell mitochondrial inner membrane. Nevertheless, this effect is observed due to application of cisplatin rather than hyperthermia.

The conclusions are the following: cisplatin and chemotherapeutic hyperthermia uncouples

mitochondrial oxidative – phosphorylation processes of pancreatic cancer cells (T3M4) and increase the permeability of mitochondrial inner and outer membrane. Hyperthermia has no effect on pancreatic cancer cells (T3M4) and shows no additional synergistic effect on mitochondrial respiratory functions.

(7)

Padėka

Nuoširdžiai dėkoju šio mokslinio darbo vadovei prof. dr. Sonatai Trumbeckaitei už vertingus patarimus bei paaiškinimus, kantrybę bei konsultacijas vykdant bei rašant mokslinį darbą. Taip pat dėkoju Neuromokslų instituto biochemijos laboratorijos kolektyvui, ypač Virškinimo sistemos tyrimų instituto chirurginės gastroenterologijos darbuotojai Aldonai Jakštaitei už pagalbą vykdant mokslinius tyrimus.

(8)

SANTRUMPOS

ADP – adenozino 5’ – difosfatas ATP – adenozino 5’ – trifosfatas

FAD – flavinadenino dinukleotido oksiduota forma FADH2 – flavinadenino dinukleotido redukuota forma

KoQ – kofermentas Q (ubichinonas)

NAD – nikotinamido adenino dinukleotido oksiduota forma NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma RCI – mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas FMN – flavino mononukleotidas

(9)

1. ĮVADAS

Kasmet diagnozuojama vis daugiau naujų vėžinių susirgimų atvejų. 2012 metais diagnozuota 14,1mln naujų onkologinių susirgimų atvejų, o nuo vėžinių susirgimų mirė 8,2mln žmonių. 2015 metais mirčių, kurias sukėlė onkologiniai susirgimai, padaugėjo 600 tūkstančių [1]. Dažniausiai diagnozuojamas plaučių, krūties, storosios ir gaubtinės žarnos, prostatos ir skrandžio vėžys. Daugiausiai žmonių miršta nuo plaučių, kepenų, skrandžio bei storosios ir gaubtinės žarnos vėžio. Pagal mirštamumą kasos vėžys užima septintąją vietą. Vien tik Jungtinėje Karalystėje 2015 metais buvo diagnozuota beveik 10 tūkstančių kasos adenokarcinomos atvejų, o 2016 metais nuo kasos vėžio mirė daugiau nei 9 tūkstančiai pacientų [2]. Kasos vėžio išgijamumas yra vienas mažiausių, lyginant su kitomis onkologinių ligų rūšimis, nes kasos adenokarcinoma yra rezistentiška chemoterapiniam bei radioterapiniam gydymui. Dėl šios problemos yra taikomos įvairios gydymo strategijos – tarpusavyje derinamas chirurginis, radioterapinis bei chemoterapinis gydymo metodai. Manoma, jog taikant kelis gydymo metodus, navikas greičiau sunaikinamas arba pasiekiama ligos remisija.

Šio tyrimo metu, in vitro, kasos adenokarcinomos ląstelės buvo paveiktos chemoterapiniu vaistu cisplatina arba hipertermija (40°C ir 43°C temperatūra) bei cisplatinos ir temperatūros deriniu – chemoterapine hipertermija. Dažniausiai kasos vėžio gydymui yra naudojamas gemcitabinas, tačiau šio tyrimo metu pasirinkome taip pat plačiai visų onkologinių ligų gydymui skiriamą vaistą – cisplatiną. Kadangi nėra duomenų apie cisplatinos poveikį kasos adenokarcinomos ląstelių energetinei būklei (t.y. mitochondrijoms), atlikome šį tyrimą, norėdami išsiaiškinti, ar chemoterapinis vaistas cisplatina turi poveikį kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų funkcijoms, mitochondrijų išorinės ir vidinės membranų pralaidumui. Taip pat tyrėme kokią įtaką turi hipertermija (40°C, 43°C temperatūra) mitochondrijoms kasos vėžinėse ląstelėse. Pastarųjų tyrimų metu išsiaiškinta, jog chemoterapiniai vaistai indukuoja vėžinių ląstelių apoptozę per mitochondrinius kelius, todėl labai svarbu išsiaiškinti, kaip chemoterapiniai vaistai veikia į vėžinių ląstelių mitochondrijų funkcijas ar slopinama ATP sintezė hipertermijos ir chemoterapijos poveikyje. Taip pat nėra tyrimų, ar hipertermija (temperatūros pakėlimas) sustiprina cisplatinos poveikį kasos vėžinėse ląstelėse.

Šiame darbe surinkta ir išnagrinėta literatūra apie kasos vėžį, gydymo metodus taip pat galimus rezistentiškumo mechanizmus visiems taikomiems gydymo metodams. Ištyrėme kasos adenokarcinomos ląstelių (T3M4 linijos) mitochondrijų kvėpavimo greičius, jas paveikus cisplatina ir/arba hipertermija. Išsiaiškinome ar derinant hipertermiją su chemoterapija, padidėja chemoterapinio vaisto cisplatina poveikis kasos adenokarcinomos ląstelių mitochondrijoms. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičiai buvo registruojami „Oroboros Oxygraph-2k“ aparatu. Stebėjome, kaip skirtingose mitochondrijų metabolinėse būsenose kinta kontrolinių (nepaveiktų chemoterapiniu vaistu ir

(10)

hipertermija) ląstelių ir tiriamųjų (paveiktų cisplatina ir/arba hipertermija) ląstelių kvėpavimo greičiai. Įvertinome, kokią įtaką chemoterapinis vaistas cisplatina ir hipertermija turi mitochondrijų kvėpavimo koeficientams, kurie rodo, kaip efektyviai vykdoma ATP sintezė mitochondrijose.

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Tyrimų apie kasos adenokarcinomos ląstelių energetinę būseną yra labai mažai. Nėra duomenų, kaip chemoterapinis vaistas cisplatina paveikia mitochondrijų kvėpavimo greičius, vidinės ir išorinės membranų laidumą kasos vėžinėse ląstelėse, bei kokį poveikį joms turi cisplatinos ir hipertermijos derinys. Šiame tyrime gauti nauji rezultatai rodantys, jog cisplatina, kasos adenokarcinomos ląstelių mitochondrijose atskiria oksidacijos ir fosforilinimo procesus ir slopina mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, tokiu būdu slopinamas mitochondrijų ATP sintezės efektyvumas. Nustatėme, kad tik hipertermija (40°C ir 43°C temperatūra) poveikio kasos vėžinėms ląstelėms neturi. Be to, nustatyta, kad hipertermija cisplatinos paveiktose ląstelėse papildomo poveikio mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms neturėjo. Taigi, didžiausią poveikį mitochondrijoms kasos vėžinėse ląstelėse turėjo cisplatina. Šis tyrimas atskleidė naujų žinių apie cisplatinos ir hiperterminės chemoterapijos poveikį kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijoms ir yra pagrindas tolimesniems tyrimams aiškinantis šio poveikio mechanizmus skirtingose vėžinių ląstelių linijose.

(11)

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti kasos vėžinių ląstelių (T3M4) (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu

cisplatina ir/arba hipertermija) mitochondrijų kvėpavimo greičius.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti ir palyginti cisplatina paveiktų ir nepaveiktų kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičius antroje, trečioje bei ketvirtoje mitochondrijų metabolinėse būsenose. 2. Ištirti ir palyginti hipertermija (37°C, 40°C, 43°C temperatūra) paveiktų kasos vėžinių ląstelių

mitochondrijų kvėpavimo greičius.

3. Ištirti ir įvertinti kaip cisplatina ir hipertermija paveikia kasos vėžinių ląstelių išorinės ir vidinės mitochondrijų membranos pralaidumą.

4. Ištirti ir įvertinti, kokį poveikį kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičiams turi hiperterminė chemoterapija (cisplatinos ir temperatūros (40°C ir 43°C) derinys).

(12)

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1 Kasos vėžys, epidemiologija, rizikos veiksniai

Vienas agresyviausių vėžinių susirgimų yra kasos adenokarcinoma. Ji yra apibūdinama kaip greit progresuojanti liga, kuriai būdingas ankstyvas metastazavimas, ji ribotai reaguoja į chemoterapiją bei radioterapiją. Tai viena sunkiausiai gydomų vėžio formų, užimanti ketvirtą vietą Europoje pagal sergamumą [3]. Prognozė daugeliu atvejų yra ganėtinai prasta, mažiau nei 3% pacientų išgyvena penkis metus nuo ligos diagnozavimo [4]. Dažniausiai kasos vėžys yra diagnozuojamas pažengusioje ligos stadijoje, kuomet gydymas nebeteikia teigiamų rezultatų. Kasmet Jungtinėse Amerikos Valstijose nuo kasos vėžio miršta apie 30 tūkstančių žmonių, nepaisant to, jog taikoma pažangi chirurginė bei medicinos terapija [5].

Mažiau nei 10% žmonių, kurie suserga kasos vėžiu yra jaunesni nei 55 metų amžiaus. Vidutinis amžius, kuomet yra nustatomas kasos vėžys yra 71 metai. Pastebima, jog kasos vėžys dažniau pasireiškia juodaodžiams vyrams. Tai rodo, jog kasos vėžio vystymuisi įtaką gali daryti rasė, amžius, lytis, demografinė padėtis. Taip pat yra daug kitų rizikos faktorių, tokių, kaip nesaikingas alkoholio vartojimas, rūkymas, mitybos įpročiai, nutukimas. Nustatyta, jog diabetas paskatina išsivystyti kasos vėžį, tačiau duomenys kolkas, gana prieštaringi [6].

Kasos vėžio ląstelės yra apsuptos tankia fibroblastine stroma, kuri susideda iš I ir III tipo kolageno bei fibronektino [5,7]. Auglys susideda iš vėžinių ląstelių, žvaigždinių ląstelių, smulkių kraujagyslių, uždegiminių ląstelių bei likusių parenchiminių kasos audinių. Anot C. Logsdon D. Simeone, C. Binkley ir kitų mokslininkų, nustatyta, jog sveikos kasos ląstelės nuo vėžinių skiriasi tuo, jog ekspresuoja skirtingus genus, specifinius neoplastiniam epiteliui. Minėtame tyrime nustatyta, jog vėžinės ląstelės genus ekspresuoja greičiau nei sveikos kasos ląstelės [4]. Sergant kasos vėžiu, ekspresuojamas didelis netinkamų mikro RNR kiekis [8].

3.2 Kasos vėžio gydymas

Ankstyvosiose kasos vėžio stadijose jokie simptomai nepasireiškia, todėl šią ligą pastebėti yra ypač sunku. Kuomet kasos vėžys pasiekia vėlyvąją stadiją, atsiranda pilvo arba nugaros skausmas, obstrukcinė gelta, pasireiškia svorio kritimas.

Kasos vėžiu sergantys pacientai klasifikuojami į: rezektabilius (operuotinus), tarpiškai (ribiškai) rezektabilius, neoperuotinus, bei kai liga yra metastazavusi (išplitusi) [9].

(13)

Pagal aukščiau pateiktą klasifikaciją, parenkamas tinkamiausias gydymas individualiam pacientui. Galimi keli gydymo būdai ar gydymo būdų deriniai. Dažniausiai taikomas chirurginis, radioterapinis bei chemoterapinis gydymo metodas ar jų deriniai.

Chirurginis gydymas apibūdinamas, kaip visos kasos ar jos dalies ir šalia esančių audinių pašalinimas. Operuojamas kasos vėžio darinys apibūdinamas, kaip auglys, kuris dar nemetastazavo, bei matoma aiški riba tarp pakitusių ląstelių bei aplinkinių arterijų [10].

Radioterapinis gydymas – dažnai taikomas, kuomet liga yra vietiškai pažengusi. Tokiu atveju, kasos ar jos dalies rezekcija (pašalinimas) yra negalima. Kuomet navikas yra vėlyvojoje vystymosi stadijoje, jis turi gerai išvystytą kraujagyslių struktūrą, tokią kaip mezenterinę arteriją, celiakinę arteriją, didžiają mezenterinę veną tolimosiose metastazėse [10].

Chemoterapijos tikslas – sumažinti pacientų, sergančių kasos vėžiu, simptomus ir prailginti gyvenimą [11]. Chemoterapija dažnai įvardijama kaip adjuvantinės (pagalbinės) terapijos dalis tiems pacientams, kuriems jau buvo taikomas chirurginis gydymas, kad visame kūne esančios vėžinės ląstelės nebesidaugintų [10]. Pagrindinis chemoterapinis vaistas, skirtas gydyti kasos adenokarcinomą, yra gemcitabinas, kuris įterpiamas į DNR replikacijos proceso metu. Laikui bėgant pasireiškia rezistentiškumas gemcitabinui, todėl siekiant pagerinti citotoksinį vaisto poveikį, jis skiriamas kartu su kitais chemoterapiniais vaistais. Vienas iš kartu su gemcitabinu vartojamų vaistų yra cisplatina.

3.3 Cisplatina, jos veikimo mechanizmas ir nepageidaujami poveikiai

Cisplatina plačiai naudojama vėžinių susirgimų atvejais. Šį gydymą skiria įvairiems piktybiniams navikams, įskaitant ir sėklidžių, kiaušidžių, galvos ir kaklo, šlapimo pūslės, plaučių vėžiui gydyti [12,13,14]. Taip pat cisplatina gydomos įvairios karcinomos, limfomos, sarkomos [13], skrandžio, bei kiti virškinamojo trakto piktybiniai navikai [15].

Cisplatinos molekulė yra nedidelė. Ji sudaryta iš platinos jono, kuris apsuptas keturiai ligandais: amino grupėmis bei dvejais chloro jonais. (1 pav.)

(14)

Amino grupės šiame junginyje padeda suformuoti stipresnius ryšius su platinos jonu. Kiti du pakaitai leidžia cisplatinos molekulei prisijungti prie DNR bazių ir suformuoti ryšius su jomis [13]. Dažnai pradinis vėžio gydymas cisplatina duoda teigiamų rezultatų ir vėžio plitimas yra stabilizuojamas [12,15], tačiau šiai ligai atsinaujinus, vėžinės ląstelės tampa atsparios tolimesnei platinos terapijai [15]. Manoma, jog atsinaujinusį vėžį veikia oksaliplatina, tačiau remiantis klinikiniais duomenimis, gali atsirasti įvairaus laipsnio kryžminis rezistentiškumas [12]. Yra duomenų, jog pacientas yra jautrus cisplatinos gydymui, jei nuo paskutinio šio preparato pavartojimo yra praėję bent du metai [15], tokiu atveju, tikimybė, jog pacientui padės cisplatinos gydymas, yra daugiau nei 70 procentų [16].

Anot L. Alamble, cisplatinos molekulei patekus į ląstelę, ji gali būti pernešama iš ląstelės transmembraninių nešiklių sistemos pagalba, neutralizuojama arba gali sureaguoti su baltymais, RNR arba DNR [15]. Nustatyta, jog cisplatina patekusi į ląstelę prisijungia prie joje esančios DNR sekos ir sutrikdo DNR replikaciją.

Į ląstelę patekusi cisplatinos molekulė tampa hidratuota, netenka chloridų jonų. Cisplatinos molekulei prisijungus dvi vandens molekules, ji įgauna teigiamą krūvį. Būtent tokia molekulė gali sąveikauti su DNR, RNR ir baltymais. Cisplatinos molekulė prisijungia prie guanino ir adenino bazių, kurios yra DNR, azoto atomų ir tokiu būdu sukelia DNR sekos sulenkimą [13]. Galimi 3 būdai, kaip pažeidžiama purino bazių seka DNR:

• kuomet prijungiama viena cisplatinos molekulė (angl. monoadduct); • suformuojama kryžminė jungtis vienoje DNR gijoje (ang. intrastrand);

• suformuojama kryžminė jungtis tarp priešingų gijų DNR sekoje (angl. interstrand) [17].

Kuomet prijungiama viena cisplatinos molekulė (angl. monoadduct), ji praranda vieną vandens molekulę, tačiau apie 90% tokių molekulių suformuoja kryžmines jungtis. Dauguma kryžminių jungčių yra suformuojama vienoje DNR gijoje. Tokiu būdu suformuojami vienos gijos arba dviejų gijų DNR pažeidimai [17]. Kuomet DNR padaroma neatitaisoma žala, ląstelė žūva. [15]

Cisplatina sukelia sunkius šalutinius poveikius – inkstų pažeidimą, kurtumą, periferines neuropatijas [15,17], mielosupresiją [17]. Inkstų pažeidimas pastebimas 20-41% pacientų, ototoksiškumas pasireiškia 23-50% suaugusių pacientų, periferinės neuropatijos – 30-86%, mielosupresija <5% cisplatina gydomų pacientų. Pediatriniams ligoniams (>50% pacientų) pasireiškia ototoksiškumas, periferinės neuropatijos pastebimos 10% cisplatina gydomų pediatrinių pacientų [17].

(15)

3.4 Rezistentiškumas cisplatinai

Pagrindinė problema, taikant cisplatinos terapiją – rezistentiškumas. Jis gali išsivystyti dėl užsitęsusio chemoterapinio gydymo [18]. Pradėjus gydymą cisplatina, 50% pacientų pasireiškia teigiamas chemoterapinis poveikis, tačiau ligai atsinaujinus, tik 15% pacientų gydomų cisplatina ar jos dariniais, pasireiškia teigiamas poveikis [19]. Kitiems pacientams išsivysto atsparumas tolimesnei platinos darinių terapijai [15]. Rezistentiškumas cisplatinai gali atsirasti dėl kelių priežasčių: membraninio cisplatinos kaupimosi, pakitusios DNR atkūrimo ir cisplatinos citozolinės inaktyvacijos [12,15]. Spėjama, jog už mažo laipsnio rezistentiškumą atsakingas DNR atkūrimas, vidutinio laipsnio rezistentiškumą atsakingas pakitęs vaisto kaupimasis, o aukšto laipsnio rezistentiškumą nulemia cisplatinos citozolinė inaktyvacija [15]. Jei vėžinės ląstelės buvo atsparios priešvėžiniams vaistams, jos įgyja atsparumą naujai taikomai chemoterapijai. Dėl šio fenomeno chemoterapijos efektyvumas priklauso nuo kiekvieno individualaus atvejo. Piktybinis navikas gali būti dalinai arba visiškai atsparus chemoterapiniam gydymui. Bandymas taikyti skirtingų priešvėžinių vaistų derinius, nėra tinkamas problemos sprendimo būdas, kadangi piktybiniai navikai geba įgauti atsparumą tuo pačiu metu keliems skirtingiems neoplastiniams vaistams [20]. Todėl ieškoma efektyvesnių būdų, galinčių sustiprinti chemoterapinio vaisto poveikį.

Gydant kasos adenokarcinomą skiriamas gemcitabinas arba gemcitabino ir cisplatinos kombinacija. Toks vaistų derinys pasirenkamas dėl skirtingų chemoterapinių vaistų veikimo mechanizmų, šiems vaistams nebūdingo kryžminio rezistentiškumo bei skirtingų nepageidaujamų poveikių [21]. Klinikinių tyrimų metu nustatyta, jog gemcitabinas padidina cisplatinos sukeltas DNR pažaidas, inhibuoja DNR atstatančius mechanizmus. Cisplatina sustiprina gemcitabino susijungimą su DNR, taip pat sukelia vėžinių ląstelių apoptozę [22]. Duomenys rodo, jog cisplatinos ir gemcitabino derinys veikia sinergistiškai.

3.5 Hipertemijos taikymas vėžiniams susirgimams

Hipertermija – tai reguliuojamas temperatūros pakėlimas vėžiniame darinyje, audinyje arba organe, esančiame aplink vėžinį darinį. Temperatūra gali būti pakeliama ne tik viename organe ar audinyje, tačiau ir dalyje kūno arba visame kūne [23]. Kai pacientas yra gydomas chemoterapiniais vaistais, gydymą galima kombinuoti kartu su hipertemija. Yra nustatyta, jog tiesioginis hipertermijos citotoksinis poveikis daugiausia remiasi baltymų denatūravimu [23].

Hipertermijos taikymas gydant vėžinius susirgimus parodė didelį aktyvumą įvairių vėžinių darinių atžvilgiu. Šis gydymo metodas kombinuojant kartu su kitais metodais taikomas galvos ir kaklo,

(16)

krūtinės, smegenų, šlapimo pūslės, gimdos kaklelio, plaučių, taip pat ir kitoms vėžio rūšims gydyti. Tyrimai rodo, jog taikant hipertermiją ilgiau nei 40 minučių ir kuomet temperatūra yra 42°-42,5°C centrinė nervų sistema yra negrįžtamai pažeidžiama [24]. Buvo studijuojami atitinkami fiziologiniai ir biocheminiai parametrai, norint nustatyti organizmo toleranciją bei toksiškumą. Įrodyta, jog hipertermija gali sukelti aritmijas bei paviršinius odos nudegimus [25], gali atsirasti pūslių, pasireikšti skausmas ar net nekrozė. Taip pat audinyje, kuriame buvo taikoma hipertermija, gali pasireikšti išemija dėl kraujo krešulių ar kraujavimo, tačiau visi hipertermijos nepageidaujami poveikiai yra laikini ir pranyksta nustojus taikyti termoterapiją [26].

Kuomet temperatūra pakeliama 40-43°C, pasireiškia selektyvus poveikis vėžiniam dariniui. Nustatyta, jog hipertermijos pagalba, priešvėžinio vaisto aktyvumas pasiekia aukščiausią lygį, kai temperatūra svyruoja 40,5° - 43°C. Kai auglys gydomas platinos dariniais ir gydymas derinamas kartu su hipertermija – cisplatinos poveikis palaipsniui didėja kylant temperatūrai. Didžiausias efektas pasiekiamas, kai iškart po cisplatinos pavartojimo, taikoma hipertermija [23]. Šį gydymo metodą galima kombinuoti su visais priešvėžiniais vaistais įskaitant ir platinos darinius, alkilinančias medžiagas, antibiotikus, alkaloidus išskirtus iš Vinca rosae L., taksanus, nukleosidanalogus [23]. Hipertermija negali pakeisti nei vieno gydymo, nes taikant tik šį gydymo metodą, vėžinių ląstelių augimas nebūtų stabdomas. Tačiau tai yra pakankamai efektyvus metodas, norint sustiprinti chemoterapinių vaistų veikimą [27].

3.6 Hipertermijos veikimo mechanizmas

Anot Issels R.D. galimi hipertermijos veikimo mechanizmai yra susiję su padidėjusiu chemoterapinių vaistų alkilinimo greičiu, padidėjusiu vaisto pasisavinimu bei sistemų, atsakingų už DNR atkūrimą, inhibicija [23].

Termoterapiją derinant su kitais gydymo metodais (radioterapija ar chemoterapija) jie papildo vienas kito veikimą – pasireiškia sinergistinė sąveika. Hipertermija suaktyvina ląstelių kraujotaką, padidina ląstelių membranų laidumą, o tai pagerina chemoterapinių vaistų įsisavinimą [28].

Tikslus hipertermijos veikimo mechanizmas subląsteliniame lygmenyje nėra išaiškintas. M. Mallory kartu su kitais mokslininkais įvardija ir karščio sąlygotą nekrozę bei baltymų inaktyvaciją. Nustatyta, jog hipertermija sukelia pokyčius vėžinio darinio citoskelete bei membraninėse struktūrose [24].

Nustatyta, jog hipertermija veikia ląsteles skirtingose jų dalijimosi fazėse. Pastebėta, jog ląstelės jautriausios hipertermijai mitozinėje fazėje. Šios fazės metu, ląsteles paveikus hipertermija,

(17)

mitozė tampa neefektyvi ir pasireiškia nuosekli poliploidija. Taip pat hipertermija veikia ir S fazę, nes buvo pastebėtas chromosomų pažeidimas. G1 fazėje ląstelės yra atsparios hipertermijai [27,29].

Hipertermija pažeidžia ląsteles bei padidina jų jautrumą tiek radioterapijai, tiek chemoterapijai. Kaip stipriai pažeidžiamos ląstelės priklauso nuo temperatūros ir trukmės. Jei pailgėja gydymo trukmė ar padidinama temperatūra, tai sukelia greitesnę ląstelių žūtį. Gerai krauju aprūpinamų audinių trumpalaikis gydymas hipertermija (<42°C) padidina vėžinio darinio perfuziją, o tai lemia didesnį vėžinių ląstelių jautrumą chemoterapijai, todėl vėžinės ląstelės greičiau žūva [29]. Vėžinės ląstelės yra veikiamos hipertermijos labiau, nei normalios ląstelės. Taip yra todėl, kad normaliuose audiniuose kraujotaka labai gerai išvystyta – tai efektyvus arterijų, kapiliarų bei venų tinklas. Tuo tarpu vėžiniame darinyje kraujotaka yra chaotiška, neefektyvi [30]. Esant tokiai chaotiškai kraujotakai, sumažėja vėžinio darinio perfuzija, o tai lemia hipoksinę aplinką [24].

Hipertermija sumažina kraujo tekėjimo greitį bei kraujagyslių tankumą, o tai lemia hipoksiją, acidozę bei sumažėjusį energijos kiekį vėžiniame darinyje. Taip pat yra sukeliama mikrotrombozė dėl homeostazės aktyvinimo, pasikeičia kraujo ląstelių membranų tąsumas. Visi šie faktoriai lemia mažesnį deguonies bei maisto medžiagų patekimą į vėžinį darinį [27].

J. Man kartu su kitais mokslininkais įvardija ir kitus galimus hipertermijos veikimo mechanizmus, tokius kaip: inhibuojami pagrindiniai vėžinių ląstelių signaliniai keliai, kaip proteinkinazė, suaktyvinama apoptozė, slopinama vėžinių ląstelių proliferacija bei kiti [31]. Iki galo išaiškinto hipertermijos veikimo mechanizmo, ypač subląsteliniame (mitochondrijų) lygmenyje nėra, pateikiamos įvairios nuomonės.

3.7 Mitochondrijų sandara bei funkcijos

Mitochondrijos yra būtinosios ląstelės organelės, kurių pagrindinė funkcija – ATP sintezė [32]. Jos yra randamos eukariotinių ląstelių citoplazmoje. Priklausomai nuo audinio, mitochondrijų kiekis ląstelėse gali ženkliai skirtis. Pavyzdžiui, skersaruožių raumenų ląstelėse ar širdies raumenyje, mitochondrijų bus daugiau, nes raumenims reikia daugiau energijos. Mitochondrijų funkcijos – energetinė, metabolinė ir reguliacinė [33]. Taip pat žinoma, jog šios organelės dalyvauja ląstelių apoptozėje ir nekrozėje. Mitochondrijų struktūra pavaizduota žemiau (2 pav.).

(18)

Pav. 2. Mitochondrijų struktūra [34]

Mitochondrijos yra mažos organelės, turinčios 2 membranas: išorinę ir vidinę. Tarp vidinės ir išorinės membranų yra tarpmembraninė erdvė. Ji yra svarbi elektronų transportui bei oksidaciniam fosforilinimui [31]. Išorinė membrana suformuoja mitochondrijos apvalkalą, kuris yra ypatingai svarbus, nes jo pagalba mitochondrijos gali keistis įvairiomis molekulėmis su citozoliu ar kitomis organelėmis (pvz., endoplazminiu tinklu), esančiomis ląstelėje [32,33]. Išorinė mitochondrijų membrana praleidžia mažos molekulinės masės junginius (iki 600kDa) [35]. Vidinė mitochondrijų membrana gaubia užpildą ir yra selektyviai pralaidi mažos molekulinės masės junginiams. Mitochondrijų vidinės membranos paviršiaus plotas yra daug didesnis nei išorinės, nes vidinė membrana suformuoja kristas, kurios gali būti įvairių dydžių ir formų [32]. Kristose yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai. Dėl didesnio mitochondrijų vidinės membranos paviršiaus ploto yra intensyviau vykdoma ATP sintezė. Mitochondrijos turi dvigrandinę žiedinę DNR (mtDNR), kurią sudaro 37 genai ir yra randama užpilde [33].

Pagrindinė mitochondrijų funkcija – gaminti ATP, oksidacinio fosforilinimo būdu. Šio proceso metu, susidarę NADH ir FADH2, esantys mitochondrijų užpilde, yra oksiduojami molekulinio

deguonies į NAD+_{ir FADH. Energija yra išlaisvinama, kai elektronai keliauja nuo kofermento}

elektronų transporto grandine iki deguonies atomų. ATP-azės fermentas, kuris yra vidinėje membranoje, prijungia fosfatinę grupę prie ADP užpilde. ATP pernešama į citoplazmą, kur yra panaudojama visoms reakcijoms, kurioms yra reikalinga energija. Kuomet ATP yra panaudojama, ji virsta į ADP ir nukeliauja atgal į mitochondrijas, kur vėliau vėl vyksta tos pačios reakcijos, susidarant ATP [33].

(19)

3.8 Mitochondrijų kvėpavimo grandinė ir oksidacinis fosforilinimas

Glikolizė, riebalų rūgščių oksidacija ir Krebso ciklas generuoja redukuotas NADH ir FADH2

molekules, kurios vėliau yra oksiduojamos mitochondrijose. Energija iš šių oksidacinių reakcijų yra paverčiama į protonų gradientą vidinėje mitochondrijų membranoje ir yra vykdoma ATP sintezė. Tai vadinama oksidaciniu fosforilinimu. Yra pagrindiniai 5 mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplesai: I kompleksas - NADH dehidrogenazė, II kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, III kompleksas – ubichinono citochromo c reduktazė, IV kompleksas – citochromo c oksidazė, V komplesas – ATP sintazė [36] (3pav.).

Pav. 3. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė [37]

I kompleksas – NADH dehidrogenazė. Tai yra flavoproteinas ir šis kompleksas katalizuoja NADH oksidaciją ir KoQ redukciją. Jis sudarytas iš 46 baltymų subvienetų. Taip pat į jo sudėtį įeina viena FMN molekulė bei aštuoni Fe-S baltymai [35]. Eukariotinėse ląstelėse I kompleksas turi L formos struktūrą, kurios hidrofilinė dalis yra nukreipta į užpildą. Hidrofilinėje dalyje yra visi redokso kofaktoriai, kurie reikalingi elektronų pernašai. Už protonų pernašą yra atsakinga ilga, truputį pakrypusi α spiralinė membraninė dalis [36].

II kompleksas – sukcinato dehidrogenazė. Antrasis kvėpavimo grandinės kompleksas susideda iš 2 subvienetų, turinčių redukuojančių kofaktorių, susijusių su membranos pagrindu [36]. Tai yra pagrindinis kompleksas, dalyvaujantis Krebso cikle, kuris katalizuoja sukcinato oksidaciją į fumaratą mitochondrijos užpilde. Sukcinato oksidacija yra susijusi su ubichinono redukcija mitochondrijų vidinėje membranoje. Elektronai pernešami nuo sukcinato iki ubichinono per prostetines grupes (FAD), 2Fe-2S, 4Fe-4S ir 3Fe-4S grupes ir hemo, kuris suformuoja integralinę komplekso dalį [38].

(20)

III kompleksas – ubichinono citochromo c reduktazė. Šio komplekso funkcija – elektronų pernaša iš ubichinolio į citochromą b, vėliau į citochromą c. Šis kompleksas turi 11 subvienetų, 2 hemo grupes ir FeS baltymą [39].

IV kompleksas – citochromo c oksidazė. Šis kompleksas katalizuoja elektronų pernašą nuo tirpaus citochromo c deguoniui ir prisideda prie elektrocheminio potencialo sukūrimo. Šis kompleksas yra sudarytas iš 13 subvienetų [40]. Tai yra paskutinis žingsnis kvėpavimo grandinėje [41].

V kompleksas – ATP sintazė. Šis kompleksas atsakingas už ATP sintezę iš ADP ir neorganinės fosfato grupės. ATP sintazė susideda iš 2 pagrindinių dalių – F1 ir F0. F1 – katalitinė dalis,

o F0 – dalis esanti membranoje atsakinga už protonų pernašą [42].

3.9 Hipertermijos poveikis mitochondrijoms

Nustatyta, jog taikant hipertermiją, padidėja išskiriamų aktyviųjų deguonies formų kiekis, suintensyvėja jų gamyba mitochondrijose [43], vystosi ląstelių membranų pažaida, sutrikdomos mitochondrijų funkcijos, taip pat pažeidžiama jų DNR [44]. Kadangi mitochondrijos yra atsakingos už apoptozės ir nekrozės procesus, taikoma hipertermija gali sukelti ląstelių žūtį per mitochondrinius kelius. Nustatyta, jog hipertermija sukelia mitochondrijų membranų laidumą, sumažina ATP kiekį, taip pat mažina ADP/O santykį [45]. Taikant hipertermiją, pasikeičia mitochondrijų energetinis aktyvumas, nes mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai yra jautrūs temperatūros pakėlimui. Karščio stresas inhibuoja ATP sintezę mitochondrijose, ir sutrikdoma elektronų pernašos sistema. Nustatyta, jog karščio stresas inaktyvuoja mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksą. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė tampa redukuota, sumažėja O2 įsisavinimas, todėl kvėpavimas lėtėja ir sumažėja

ATP sintezės greitis [46]. Kaip termoterapija kartu su kitais vėžio gydymo metodais veikia ląstelės energetiką, tyrimų nėra, tačiau tokie tyrimai in vitro leistų ištirti pokyčius mitochondrijose ir ieškoti dar efektyvesnių būdų, kaip išgydyti vėžinius susirgimus. Tyrimai rodo, kad termoterapija veikia į pirmąjį mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą. Kvėpavimo grandinės komponentų inaktyvacija gali vykti dviem skirtingais keliais: tiesioginiu baltymų denatūravimu, kuris turi įtakos sukcinato dehidrogenazės aktyvumui ir netiesioginiu vieno ar kelių komponentų denatūravimu NADH-UQ reduktazės segmente [47].

(21)

3.10 Cisplatinos poveikis mitochondrijoms

Mitochondrijos yra intensyviai tyrinėjamos, kaip galimi priešvėžinių vaistų taikiniai. Anksčiau atliktuose tyrimuose nustatyta, jog galimai mitochondrijų DNR ir yra pagrindiniai taikiniai į kuriuos veikia chemoterapiniai vaistai [48].

S. P. Wisnovsky kartu su kitais mokslininkais atliko tyrimą, kurio metu priešvėžiniais vaistais (cisplatinos dariniais) selektyviai buvo paveikta mitochondrijų DNR. Prie cisplatinos molekulės buvo prijungtas selektyvai į mitochondrijas prasiskverbiantis peptidas (angl. mitochondria-penetrating peptide). Šio tyrimo metu nustatyta, jog cisplatina pažeidžia mitochondrijų DNR seką, turi įtakos ląstelės ciklui, taip pat pastebėta, jog pažeidus mitochondrijas, jos gali imti gaminti aktyviuosius deguonies junginius (ang. reactive oxygen species (ROS)), o tai gali sukelti mitochondrijų funkcijos sutrikimus ir ląstelės žūtį [48]. Šis tyrimas suteikė tiesioginių įrodymų, jog paveikus vėžinių ląstelių mitochondrijų DNR platinos dariniais, jos tampa toksiškos vėžinėms ląstelėms, todėl yra potencialus priešvėžinės terapijos taikinys.

R. Marullo kartu su kitais mokslininkais taip pat tyrė cisplatinos poveikį prostatos vėžio ląstelių mitochondrijoms. Šio tyrimo metu nustatyta, jog gaminamos ROS formos padidina cisplatinos citotoksinį efektą. Cisplatina kaupiasi mitochondrijose ir prisijungia prie mitochondrijose esančios DNR bei baltymų [49]. Dėl šios priežasties, kaip jau minėta anksčiau, mitochondrijos gali pradėti gaminti ROS formas, kurios pažeidžia ląsteles ir sukelia jų žūtį. Atlikus šį tyrimą paaiškėjo, jog tos ląstelės, kurios turi labiau pažeistų mitochondrijų yra daug atsparesnės cisplatinos poveikiui. Tyrimas patvirtino, jog cisplatinos poveikis padidina nuo mitochondrijų priklausomą ROS atsaką, kuris reikšmingai prisideda prie ląstelių mirties dėl padidėjusio citotoksinio efekto. Cisplatinos indukuojama ROS gamyba, yra tiesioginio efekto į mitochondrijų DNR, pasekmė [49].

Taip pat buvo tirtos žiurkių kepenų ląstelių mitochondrijos, kurios buvo paveiktos cisplatina in vivo. Mitochondrijos buvo išskirtos, žiurkėms buvo skiriama 10mg/kg cisplatinos dozė. Gauti rezultatai rodo, jog ATP sintezė cisplatina paveiktoje grupėje ženkliai sumažėjo lyginant su kontroline grupe. Tiriamojoje grupėje, po cisplatinos skyrimo, buvo pastebėta, jog mitochondrijų membranos takumas buvo sumažėjęs, o taip pat sumažėjo ir NADPH kiekis ląstelėje [50]. Tokius pokyčius lemia tai, jog cisplatina inhibuoja I, III, IV mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus. Nustatyta, jog cisplatina inhibuoja adenozintrifosfatazės aktyvumą [51].

(22)

4. METODIKA

4.1 Aparatūra, indai

Oroboros Oxygraph-2k, centrifuga (Eppendorf 5810 R), analitinės svarstyklės (KERN-ABJ-220-4M), pH-metras (pH-METER 766), magnetinė maišyklė (VARIOMAG), mikrošvirkštai (Hamilton), automatinės pipetės, antgaliai, mėgintuvėliai, stiklinėlės, kiuvetės.

4.2 Medžiagos

Glutamatas (SIGMA); Malatas 99% grynumo (SIGMA); Digitoninas (SIGMA); ADP 98% grynumo (SIGMA); Amitalis (SIGMA); Sukcinatas 99% grynumo (SIGMA); Citochromas c 99% grynumo (SIGMA); CAT (karboksiatraktilozidas) (SIGMA); Dinitrofenolis (SIGMA); EGTA 99% grynumo (ROTH); MgCl2•6H2O (ROTH); K-laktobionatas (ALDRICH); Taurinas (SIGMA);

KH2PO4 98% grynumo (ROTH); HEPES 99,5% (SIGMA); Sacharozė 99,5% grynumo (ROTH), etanolis.

4.3 Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos

T3M4 linijos – kasos latako adenokarcinomos ląstelės, buvo gautos, kaip dovana iš Europos kasos tyrimų centro (Heidelberg, Vokietija).

Kasos vėžio ląstelės T3M4 buvo auginamos steriliuose 75 cm2_{talpos lėkštelėse (TPP), RPMI}

terpėje (5ml) su 10 % fetalinio veršelio serumo (FBS) bei antibiotikais 1 % pen./strep. CO2

inkubatoriuje – 37○C temperatūroje, 5 % CO2 ir esant 95-98 % aplinkos drėgmei.

Ląstelės inkubuotos 24 valandas nurodytose sąlygose. Po inkubacijos vėžinės ląstelės 1 valandą paveiktos temperatūra (37°C, 40°C, 43°C) ir cisplatina (IC50 48µM) arba be jos. Po to terpė

buvo pakeista ir ląstelės augintos nurodytomis sąlygomis dar 48 valandas. MTT testas atliktas ląstelių gyvybingumui įvertinti. Ląstelės augintos ir MTT testas atliktas Virškinimo sistemos tyrimų instituto chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje.

T3M4 ląstelių auginimo terpė nupilama į 50ml talpos mėgintuvėlį ir flakono dugnas nuplaunamas PBS tirpalu, kuris taip pat surenkamas į tą patį 50 ml mėgintuvėlį, kad būtų surinktos visos atkibusios ląstelės. Tuomet į flakoną įpilama 2ml 1x 0,25 % tripsino tirpalo, inkubuojama 7-10 min, kad ląstelės atsiskirtų nuo flakono dugno. Po inkubacijos su tripsinu ląstelių atkibimas

(23)

įvertinamas mikroskopu. Tripsino poveikiui sustabdyti į ląstelių suspensiją įpilama augimo terpės (2 ml tripsino inaktyvuoti reikia 10 ml terpės). Ląstelių suspensija perkeliama į tą patį 50 ml talpos mėgintuvėlį, centrifuguojama centrifugoje (Eppendorf 5810 R) 5 min, 800 aps/min greičiu. Supernatantas nupilamas, nusėdusios ląstelės suspenduojamos 1 ml augimo terpės švelniai pipetuojant. Ląstelių kultūra kiekybiškai įvertinama Tripano mėlio metodu. Eksperimentui naudojama 1 mln ląstelių ir 15 ml mėgintuvėlyje centrifuguojama 5 min, 800 aps/min greičiu. Terpė pašalinama, ant nusėdusių ląstelių užpilama 200 µl RPMI terpės be priedų. Terpė nucentrifuguojama 1000 aps/min greičiu ir ląstelės naudojamos mitochondrijų kvėpavimo tyrimams atlikti.

4.4 Cisplatinos ir hipertermijos poveikio kasos adenokarcinomos ląstelėms

(T3M4) in vitro modelis

Imituojant sąlygas, panašias į esančias žmogaus organizme, kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiai registruojami 37°C temperatūroje, mitochondrijų kvėpavimo terpėje MIR06, oksigrafo pagalba. Naudojant įvairius mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų substratus bei inhibitorius, išmatuojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis įvairiose mitochondrijų metabolinėse būsenose.

4.5 Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimas kasos (T3M4) vėžinėse

ląstelėse oksigrafiniu metodu

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greitis buvo matuojamas Neuromokslų institute, patologinių procesų farmakologinės reguliacijos ir vaistų metabolizmo tyrimų laboratorijoje. Šis tyrimas buvo atliekamas naudojant oksigrafą (Oroboros), matuojant kasos vėžinių ląstelių deguonies sunaudojimo greitį laiko bėgyje. Buvo tiriamos temperatūra (37°C, 40°C, 43°C) paveiktos ląstelės (be cisplatinos) ir temperatūra (37°C, 40°C, 43°C) paveiktos ląstelės (su cisplatina). Naudojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės substratus, bei mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų inhibitorius, buvo įvertinami mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai T3M4 linijų ląstelėse.

Analizė buvo atliekama uždarose oksigrafo kamerose, kuriose buvo palaikoma 37°C temperatūra. Vėžinėms ląstelėms kvėpuojant, jos naudoja deguonį, todėl kinta deguonies koncentracija matavimo terpėje. Taip pat kinta deguonies redukcija ant platinos elektrodo ir srovės stiprumas, einantis per tirpalą. Gautų kvėpavimo kreivių pokyčiai, vėžinėms ląstelėms naudojant deguonį, rodo srovės stiprumo pokytį. Iš to galima spręsti apie ląstelių sunaudoto deguonies koncentraciją laiko bėgyje. Žemiau pateiktuose paveikslėliuose matomos originalios kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo kreivės. 4 pav. pavaizduotos T3M4 ląstelių (37°C, be cisplatinos) mitochondrijų

(24)

kvėpavimo greičiai, o 5 pav. pavaizduotos T3M4 ląstelių (37°C su cisplatina) mitochondrijų kvėpavimo greičiai.

Pav. 4. Kasos vėžinių ląstelių, užaugintų normotermijos (37°C) sąlygomis, mitochondrijų kvėpavimo

greičio registravimo kreivė. Glu – 5mM glutamato, Mal – 2mM malato, Dig - 8µg/ml digitonino, ADP – 1mM adenozido difosfato, AMI – 2mM amitalio, Succ – 15mM sukcinato, Cyt c - 32µM citochromo c, CAT – 0,75µM karboksiatraktilozido, DNF – 0,3mM dinitrofenolio.

Pav. 5. Kasos vėžinių ląstelių užaugintų normotermijos (37°C) sąlygomis, paveiktų cisplatina (48µM),

mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo kreivė. Glu – 5mM glutamato, Mal – 2mM malato, Dig - 8µg/ml digitonino, ADP – 1mM adenozido difosfato, AMI – 2mM amitalio, Succ – 15mM sukcinato,

Cyt c - 32µM citochromo c, CAT – 0,75µM karboksiatraktilozido, DNF – 0,3mM dinitrofenolio.

Mitochondrijų kvėpavimo terpės (MIR06) sudėtis: 0,5mM EGTA, 3mM MgCl2•6H2O, 60mM

K-laktobionatas, 20mM taurinas, 10mM KH2PO4, 20mM HEPES, 110mM sacharozė.

Norint nustatyti mitochondrijų funkciją, matuojamas oksiduojamų substratų deguonies sunaudojimas [52]. Oksigrafinis metodas naudojamas matuoti ATP kiekį bei deguonies sunaudojimą.

(25)

Oksigrafas sudarytas iš Klarko elektrodo, patalpinto į orui nepralaidžią kamerą. Norint apskaičiuoti suvartoto deguonies kiekį, ląstelės yra patalpinamos į kamerą, kurioje yra terpė su sumažintu deguonies kiekiu [52,53]. Ląstelių kvėpavimą galima matuoti naudojant substratus ląstelėse, po to, kai tapo pralaidūs veikiant digitoninui. Tai leidžia pamatuoti kvėpavimo koeficientą bei ADP/O koeficientą naudojant skirtingus substratus, tokius, kaip gliutamatas ir malatas, sukcinatas ir pan.

4.5.1 Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimo eiga

Ląstelės (1 mln) nucentrifuguojamos 1000 aps/min greičiu (5 minutes) ir suspenduojamos mitochondrijų kvėpavimo terpėje MIR06 (100µl). Tyrimas atliekamas, kuomet į kameras įpilta mitochondrijų kvėpavimo terpė sušyla iki 37°C. Į kameras taip pat įpilama mitochondrijų kvėpavimo substratų glutamato 25µl bei malato 15µl. Kadangi terpėje ląstelių dar nėra, deguonis nėra naudojamas. Kai ląstelės supilamos į kameras pastariosios sandariai užkemšamos specialiais kamščiais.

Pav. 6. Oroboros oksigrafas

Kameroje A patalpinamos kontrolinės ląstelės (vėžinės, tačiau nepaveiktos nei cisplatina, nei hipertermija), o kameroje B – tiriamosios (vėžinės, paveiktos cisplatinos ir/arba hipertermijos). Mikrošvirkštų pagalba sudėjus ląsteles į kameras, jos pradeda vartoti deguonį ir kvėpuoti, o elektrodas ima fiksuoti deguonies pasikeitimus laiko bėgyje. Tuomet pilama 8µg/ml digitonino, kuris padidina ląstelės sienelės pralaidumą ir po 5 minučių digitoninui suveikus ir nusistovėjus kvėpavimo greičiui fiksuojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis (antroji metabolinė būsena V0). Tada pridedame 1mM

(26)

ADP. Stebimas staigus kvėpavimo pagreitėjimas, nes mitochondrijos naudoja deguonį ir ADP, kad susintetintų ATP. Mitochondrijos pereina į trečiąją metabolinę būseną (VADP(Glu/Mal)). Po to pridedama

2mM amitalio, kuris slopina mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksą – mitochondrijų kvėpavimas užslopinamas. Pridėjus 15mM sukcinato, kuris yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės II komplekso substratas, matyti, kaip kvėpavimas vėl pagreitėja (didėja deguonies sunaudojimo greitis). Registruojama VADP (Succ) būsenos kvėpavimo greitis. Vėliau pridedama 32µM citochromo c.

Citochromo c testo dėka įvertinama išorinės mitochondrijų membranos pažaida. Jeigu pridėjus egzogeninio citochromo c, matomas mitochondrijų kvėpavimo stimuliavimas (kvėpavimo pagreitėjimas) (VADP+Cytc), tai reiškia, jog išorinė mitochondrijų membrana yra pažeista. Galimas

citochromo c praradimas dėl mitochondrijų išorinės membranos pažaidos. Jei kvėpavimas nėra stimuliuojamas, citochromo c trūkumo nėra, vadinasi išorinė mitochondrijų membrana nėra pažeista. Pridėjus ADP/ATP nešiklio inhibitoriaus 0,75µM karboksiatraktilozido, mitochondrijos pereina į ketvirtąją metabolinę būseną (VCAT). Karboksiatraktilozidas blokuoja ADP patekimą, ir tokiu būdu

slopinama ATP sintezė, dėl to mitochondrijų kvėpavimo greitis sumažėja. Galiausiai į kameras įdedama 0,3mM dinitrofenolio oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimui ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės aktyvumo įvertinimui.

Skaičiavimams naudotos formulės: citochromo c efektas ꞊ VADP(Succ)+cytc/VADP; mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas oksiduojant glutamatą bei malatą apskaičiuojamas taip: KKKGlu/Mal ꞊ V3/V0, o oksiduojant sukcinatą – KKKSucc ꞊ VADP(Succ)+cytc/VCAT.

Gauti duomenys apdorojami „Microsoft Offise Excel“ programa. Ląstelių kvėpavimo greitis išreiškiamas pmolO/s/1mln ląstelių.

4.6 Statistinė duomenų analizė

Statistinė analizė atliekama su „SigmaPlot“ programa. Atliekamas „Student-t“ testas ir pateikiami rezultatų vidurkiai su standartinėmis paklaidomis. Skirtumai statistiškai reikšmingi, jei p < 0,05. Pateikiami ne mažiau trijų eksperimentinių tyrimų vidurkiai su standartinėmis paklaidomis.

(27)

5. REZULTATAI

Atlikus tyrimą, įvertinta kokį poveikį cisplatina, hipertermija bei hiperterminė chemoterapija turi kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Cisplatinos ir hipertermijos poveikyje ištirti mitochondrijų kvėpavimo greičiai antroje, trečioje ir ketvirtoje (V0, V3, VCAT) metabolinėse

būsenose. Apskaičiuotas mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas bei cisplatinos ir hipertermijos poveikis išorinės mitochondrijų membranos pralaidumui (citochromo c efektas).

5.1 Cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių (T3M4) endogeniniam

kvėpavimui

Buvo įvertintas skirtingose temperatūrose užaugintų kasos vėžinių ląstelių, paveiktų ir nepaveiktų cisplatina, mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis. (Žr. Lentelė 1).

Lentelė 1. Cisplatinos ir hipertermijos poveikis endogeniniam kasos vėžinių ląstelių (T3M4) kvėpavimo greičiui Ląstelių tipas 37°C temp. 37°C temp. + cisplatina 40°C temp. 40°C temp. + cisplatina 43°C temp. 43°C temp. + cisplatina Endogeninio kvėpavimo greitis, pmol/s/1mln ląstelių 18,9±3,3 35,8±4,8 18,7±3,2 32,7±1,3 20,3±1,6 29,8±9,3

Lyginant 37°C temperatūroje užaugintų ląstelių mitochondrijų endogeninį kvėpavimą su 37°C temperatūroje užaugintų ir paveiktų cisplatina ląstelių mitochondrijų endogeniniu kvėpavimu, pastarasis padidėjo 1,89 karto. Lyginant 40°C temperatūroje užaugintas ląsteles su 40°C temperatūroje užaugintomis ir cisplatina paveiktomis ląstelėmis, endogeninis kvėpavimas padidėjo 1,74 karto, o 43°C temperatūroje užaugintų bei nepaveiktų ir paveiktų cisplatina, endogeninis kvėpavimas skyrėsi 1,47 karto.

Rezultatai rodo, jog cisplatina padidino endogeninio kvėpavimo greitį visose ląstelių grupėse. Todėl tolimesniuose eksperimentuose ištyrėme cisplatinos poveikį kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

5.2 Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui kasos vėžinėse

ląstelėse (T3M4)

Cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių linijoje T3M4 buvo vertintas normotermijos (37°C temperatūra) bei hipertermijos (40°C ir 43°C temperatūra) sąlygomis. Nustatyta, jog cisplatinos poveikyje (37°C temperatūroje) mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V0)

(28)

padidėjo 2,34 karto (p<0,05) lyginant su kontroline grupe (nepaveikta cisplatina) (Pav. 7). Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje oksiduojant glutamatą/malatą ir esant ADP, padidėjo 1,37 karto (p<0,05), o oksiduojant sukcinatą – padidėjo 1,72 karto. Po citochromo c pridėjimo, cisplatinos poveikyje mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 1,24 karto lyginant su kvėpavimo greičiu trečioje metabolinėje būsenoje, o tai rodo padidėjusį mitochondrijų išorinės membranos pralaidumą. Ketvirtojoje mitochondrijų metabolinėje būsenoje (VCAT) kvėpavimo greitis

pasikeitė taip pat statistiškai reikšmingai (p<0,05) lyginant su kontroline grupe – padidėjo net 2,64 karto, o pridėjus oksidacijos – fosforilinimo procesų skyriklio – dinitrofenolio - kvėpavimo greitis taip pat išliko didesnis nei atitinkamoje kontrolinėje grupėje 1,89 karto (p<0,05).

Pav. 7. Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams 37°C temperatūroje kasos vėžinėse ląstelėse. V0 (Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje, įdėjus glutamato, malato bei digitonino. VADP –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje pridėjus 1mM ADP. VADP (Succ) – mitochondrijų

kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2mM amitalio bei 15mM sukcinato. VADP (Succ) + Cyt c –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 32µM citochromo c. VCAT – mitochondrijų

kvėpavimo greitis ketvirtojoje metabolinėje būsenoje pridėjus 0,75µM karboksiatraktilozido. VDNF – mitochondrijų

kvėpavimo greitis ketvirtojoje metabolinėje būsenoje pridėjus 0,3mM dinitrofenolio. * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Vo (Glu/mal) VADP(Glu/mal) VADP (Succ) VADP (Succ)+Cyt c VATR VDNF p m ol/ S /1m ln ląste li ų 37°C 37°C + cisplatina V_{ADP (Glu/Mal)}

(29)

Įvertintas cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientui. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas oksiduojant glutamatą bei malatą sumažėjo 40%, o oksiduojant sukcinatą sumažėjo 25% (Pav. 8). Norint įvertinti išorinės mitochondrijų membranos pralaidumą atliekamas citochromo c testas. Citochromo c efektas (lyginant kontrolines ląsteles su paveiktomis cisplatina) cisplatinos poveikyje padidėjo 15%. Tai rodo mitochondrijų išorinės membranos pralaidumo padidėjimą, ląsteles paveikus cisplatina, dėl galimos mitochondrijų išorinės membranos pažaidos ir citochromo c netekimo cisplatinos poveikyje.

Pav. 8. Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams ir citochromo c efektui 37°C temperatūroje kasos vėžinėse ląstelėse. RCI (Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo koeficientas oksiduojant glutamatą bei

malatą. RCI (Succ) - mitochondrijų kvėpavimo koeficientas oksiduojant sukcinatą.Cyt c efektas – citochromo c efektas.

Pakėlus temperatūrą iki 40°C nustatytas cisplatinos efektas išliko, t.y. kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) nustatytas 2,25 karto (p<0,05) didesnis lyginant su kontroline

grupe (be cisplatinos) (Pav. 9). Tai rodo oksidacijos – fosforilinimo procesų atskyrimą ir vidinės membranos pralaidumo padidėjimą. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje (VADP) oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą buvo – 1,42 karto ir 1,54 kartų didesnis, (p<0,05)

lyginant su kontroline grupe. Pridėjus citochromo c, kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis taip pat išliko 1,7 karto didesnis (p<0,05). Mitochondrijų kvėpavimo ketvirtoje metabolinėje būsenoje (VCAT), užslopinus ADP patekimą į mitochondrijas karboksiatraktizolidu, kvėpavimo greitis

stimuliuojamas statistiškai reikšmingai (p<0,05) – cisplatinos poveikyje padidėjo 3,21 karto ir 1,76 karto (p<0,05) lyginant su kontroline grupe, išliko didesnis pridėjus dinitrofenolio.

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

RCI (Glu/Mal) RCI (Succ) Cyt c efektas

R C I/ C it ochrom o c ef ek tas (k art ai s) 37°C 37°C + cisplatina

(30)

Pav. 9. Cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiui 40°C temperatūroje. V0(Glu/Mal)

– mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje, įdėjus glutamato, malato bei digitonino. VADP –

kvėpavimo greitis ketvirtojoje metabolinėje būsenoje pridėjus 0,3mM dinitrofenolio.

Įvertintas cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas oksiduojant glutamatą ir malatą sumažėjo 38,6% dėl vidinės mitochondrijų membranos pralaidumo padidėjimo. Tai rodo ATP sintezės slopinimą. Oksiduojant sukcinatą mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas sumažėjo 49% (p<0,05) (Pav.10). Atliktas citochromo c testas parodė, jog citochromo c efektas cisplatinos poveikyje taip pat, nors ir nežymiai padidėjo – 11%. Taigi, cisplatinos poveikyje stebima tendencija išorinės membranos pralaidumo didėjimui.

* * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Vo (Glu/mal) VADP(Glu/mal) VADP (Succ) VADP (Succ)+Cyt c VATR VDNF max pm ol/S /1m ln ląste lių 40°C 40°C + cisplatina

(31)

Pav. 10. Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams 40°C temperatūroje kasos vėžinėse ląstelėse. RCI (Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo koeficientas oksiduojant glutamatą bei malatą. RCI ( Succ) - mitochondrijų

kvėpavimo koeficientas oksiduojant sukcinatą. Cyt c efektas – citochromo c efektas.

Pakėlus temperatūrą iki 43°C, cisplatina taip pat atskyrė oksidacijos ir fosforilinimo procesus. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) padidėjo 1,85 karto lyginant su kontroline

grupe (nepaveikta cisplatina) (Pav.11). Oksiduojant glutamatą/malatą trečioje mitochondrijų kvėpavimo metabolinėje būsenoje (esant ADP) mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo 1,54 karto didesnis nei kontrolinėje grupėje. Oksiduojant sukcinatą, mitochondrijų kvėpavimo greitis taip pat išliko 1,78 karto didesnis. Įvertinus mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtojoje metabolinėje būsenoje (VCAT) stebimas mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas 1,64 karto (p<0,05), o pridėjus

dinitrofenolio mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 1,89 karto, lyginant su kontroline grupe. * 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

R C I/ C it ochrom o c ef ek tas (k art ai s) 40°C 40°C+cisplatina

(32)

Pav. 11. Cisplatinos poveikis kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiui 43°C temperatūroje. V0(Glu/Mal)

– mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje, įdėjus glutamato, malato bei digitonino. VADP –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 32mM citochromo c. VCAT – mitochondrijų

43°C temperatūroje, cisplatinos poveikyje, kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (pav. 12) oksiduojant glutamatą bei malatą sumažėjo 18,59 %, o oksiduojant sukcinatą nesikeitė, lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis. 43° temperatūroje citochromo c efektas panašus tiek kontrolinėse, tiek cisplatina paveiktose kasos vėžinėse ląstelėse.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

Vo (Glu/mal) VADP(Glu/mal) VADP (Succ) VADP (Succ)+Cyt c VATR VDNF max p m ol /S /1 m ln lą ste li ų 43°C 43°C + cisplatina

(33)

Pav. 12. Cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams 43°C temperatūroje kasos vėžinėse ląstelėse. RCI (Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo koeficientas oksiduojant glutamatą bei malatą. RCI ( Succ) - mitochondrijų

kvėpavimo koeficientas oksiduojant sukcinatą. Cyt c efektas – citochromo c efektas.

5.3 Hipertermijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams kasos vėžinėse

ląstelėse (T3M4)

Tolimesniuose eksperimentuose ištirtas hipertermijos (40°C, 43°C) poveikis kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičiams (Pav. 13). Įvertinus gautus rezultatus, paaiškėjo, jog hipertermija neturi poveikio kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams nei antroje, nei trečioje ar ketvirtoje metabolinėse būsenose. Atsižvelgus į gautus rezultatus, galima daryti išvadą, jog hipertermija kasos vėžinių ląstelių (T3M4) bioenergetinės funkcijos neveikia. Taigi, hipertermija neturi poveikio nei mitochondrijų vidinės, nei išorinės membranos pralaidumui kasos vėžinėse ląstelėse. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

RCI/Cito chro m o c ef ek tas (k a rt a is ) 43°C 43°C+cisplatina

(34)

13 pav. Kasos vėžinių ląstelių (T3M4) kvėpavimo greičiai 37°C, 40°C ir 43°C temperatūroje. V0 (Glu/Mal) –

mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje, įdėjus glutamato, malato bei digitonino. VADP –

Taip pat įvertinti mitochondrijų kvėpavimo koeficientai ir citochromo c efektas hipertermijos poveikyje (Pav. 14). Gauti rezultatai parodė, jog hipertermija neturėjo įtakos mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams, bei išorinės mitochondrijų membranos pralaidumui (citochromo c testas).

14 pav. Kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kontrolės koeficientai 37°C, 40°C ir 43°C temperatūroje. RCI

(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo koeficientas oksiduojant glutamalą bei malatą. RCI ( Succ) - mitochondrijų kvėpavimo

koeficientas oksiduojant sukcinatą. Cyt c efektas – citochromo c efektas. 0 10 20 30 40 50 60

Vo (Glu/mal) VADP(Glu/mal) VADP (Succ) VADP (Succ)+Cyt c VATR VDNF max p m ol/ S /1m ln ląste li ų 37°C 40°C 43°C

V_{ADP (Glu/Mal)} V_{ADP (Succ)} VADP (Succ) + Cyt c V_CAT V_DNF

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

R C I/ C it ochrom o c ef ek tas (k art ai s) 37°C 40°C 43°C

(35)

5.4 Hipertermijos ir cisplatinos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams

kasos vėžinėse ląstelėse (T3M4)

Šio tyrimo metu buvo įvertintas chemoterapinio vaisto cisplatinos ir hipertermijos derinio poveikis kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičiams (žr. lentelė 2). Cisplatinos ir hipertermijos (40°C, 43°C) poveikyje mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V0) buvo akivaizdžiai stimuliuojamas, lyginant su kontroline (cisplatina nepaveiktomis

ląstelėmis) grupe 2,34 karto (p<0,05), 2,33 karto (p<0,05) ir 1,6 karto atitinkamai. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (VADP(Glu/Mal)) taip pat reikšmingai padidėjo – 37,5%

(p<0,05), 42,8% (p<0,05) ir 46,6% (p<0,05) lyginant kontrolę su tiriamosiomis grupėmis. Oksiduojant sukcinatą, mitochondrijų kvėpavimo greitis taip pat suintensyvėjo, tačiau tai nebuvo statistiškai reikšmingas pokytis. Į terpę įdėjus karboksiatraktilozido, kuris užslopina ADP patekimą į mitochondrijas ir mitochondrijoms perėjus į ketvirtą metabolinę būseną, mitochondrijų kvėpavimo greičiai vėl akivaizdžiai skyrėsi. Palyginus kontrolinę grupę su hipertermija ir cisplatina paveiktomis grupėmis, kvėpavimo greičiai skyrėsi 2,64 karto (p<0,05), 2,91 karto (p<0,05) ir 1,66 karto, t.y. stebimas oksidacijos – fosforilinimo procesų atskyrimas. Po dinitrofenolio įdėjimo mitochondrijų kvėpavimo greičiai taip pat buvo statistiškai reikšmingai stimuliuojami – 89,3% (p<0,05), 81,8% (p<0,05) bei 96% lyginant tiriamąsias grupes su kontroline grupe.

Lentelė 2. Kontrolinių ir paveiktų hipertermine chemoterapija kasos vėžinių ląstelių (T3M4) mitochondrijų kvėpavimo greičiai.

Ląstelių tipas 37°C 37°C + cisplatina 40°C + cisplatina 43°C + cisplatina

Vo (Glu/mal) 8,8±1,10 20,6±3,77* 20,5±2,03* 14,05±1,95 VADP(Glu/mal) 29,7±0,63 40,83±2,6* 42,4±2,65* 43,55±5,25* VADP (Succ) 41,5±4,47 71,2±13,59 67,1±8,76 78,5±28,55 VADP (Succ)+Cyt c 40,2±4,23 78,9±11,95* 73,9±6,31* 78,7±31,30 VCAT 15,0±0,35 39,6±2,89* 43,7±3,52* 24,95±5,45 VDNF 48,23±4,06 91,3±13,88* 87,7±10,95* 94,6±38,80