Inkstų išemijos/reperfuzijos poveikio mitochondrijų funkcijoms tyrimas

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GIEDRĖ GERULYTĖ

Inkstų išemijos/reperfuzijos poveikio mitochondrijų funkcijoms tyrimas

Darbo vadovas prof., dr. Sonata Trumbeckaitė Konsultantas prof., dr. Rasa Banienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GIEDRĖ GERULYTĖ

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas ___________________ Data _____________________

Inkstų išemijos/reperfuzijos poveikio mitochondrijų funkcijoms tyrimas

Konsultantas Darbo vadovas

Rasa Banienė, ________ Sonata Trumbeckaitė, __________

Data ________________ Data ________________________

Recenzentas Darbą atliko

Vardas, pavardė, parašas Magistrantė

Giedrė Gerulytė, _________ Data ___________________ Data_________________

TURINYS

SANTRUMPOS ... 5

SANTRAUKA ... 6

SUMMARY ... 7

ĮVADAS ... 9

Darbo tikslas ir uţdaviniai ... 10

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11

1.1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos ... 11

1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra ... 13

1.3. Oksidacinis fosforilinimas ... 15

1.4. Išemija ir reperfuzija ... 16

1.5. Išemijos/reperfuzijos poveikis inkstų funkcijoms ... 17

1.6. Tyrimų, išemijos - reperfuzijos poveikiui inkstams įvertinti, apţvalga... 20

2. TYRIMO ATLIKIMO ETAPAI IR JŲ METODIKA ... 23

2.1. Terpės, reagentai, aparatūra, indai ir įrankiai ... 23

2.2. Inkstų išemijos sukėlimo modelis in vitro ... 24

2.3. Inkstų išemijos/reperfuzijos sukėlimo modelis in vivo ... 24

2.4. Mitochondrijų išskyrimas ... 24

2.5. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas, taikant biureto metodą ... 25

2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas poliarografiniu metodu ... 26

2.6.1. Poliarografo veikimo bendrieji principai ... 27

2.6.2. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas ... 28

2.7. Mitochondrijų I komplekso (NADH dehidrogenazės) aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu būdu ... 29

2.8. Statistinė duomenų analizė ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1. Išemijos in vitro poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams įvertinimas ... 31

3.2. Išemijos ir reperfuzijos in vivo poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams įvertinimas ... 35

3.3. Skirtingos trukmės išemijos poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui įvertinimas ... 39

5. IŠVADOS ... 43 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44

SANTRUMPOS

ADP – adenozino 5′ –difosfatas ATP – adenozino 5′ –trifosfatas DOX – natrio deoksicholatas

EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis

FAD – flavino adenino dinukleotido oksiduota forma FADH2 – flavino adenino dinukleotido redukuota forma

KKK – mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas KoQ – kofermentas Q (ubichinonas)

NAD– nikotinamido adenino dinukleotido oksiduota forma NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma ROS – aktyviosios deguonies formos

SANTRAUKA

G. Gerulytė. Inkstų išemijos/reperfuzijos poveikio mitochondrijų funkcijoms tyrimas: Magistro baigiamasis darbas/ Mokslinė vadovė prof., dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Šio darbo tikslas ištirti išemijos/reperfuzijos poveikį ţiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms. Pagrindiniai darbo uţdaviniai: 1) įvertinti išemijos (20, 40, 60 minučių) in vitro poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms; 2) įvertinti išemijos (60 minučių) ir reperfuzijos (30 minučių) in vivo poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms; 3) ištirti išemijos poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui.

Išemijos poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų funkcijų tyrimui buvo pasirinkti du eksperimentiniai modeliai, t.y. in vitro ir in vivo modelis. Mitochondrijas išskyrėme diferencinio centrifugavimo būdu, baltymą nustatėme biureto metodu. Išskirtų mitochondrijų kvėpavimo greitį vertinome poliarografiniu metodu. I komplekso aktyvumą nustatėme spektrofotometriniu būdu.

Rezultatai parodė, kad mitochondrijų paţaida išryškėja labai anksti - jau po 20 minučių, t.y. slopinamas maksimalus (ADP stimuliuotas) mitochondrijų kvėpavimo greitis tiek oksiduojant glutamatą/malatą, tiek sukcinatą. Ilginant išemijos trukmę, mitochondrijų paţaida didėjo. Išorinės mitochondrijų membranos paţaida taip pat didėjo ilginant išemijos trukmę. Tiek išemija (60 minučių), tiek reperfuzija (30 minučių) slopina mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje. 60 minučių išemija/30 minučių reperfuzija nepadidino mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo. Rezultatai rodo, jog išemijos poveikyje (60 minučių) mitochondrijos pasiţeidţia labiau nei išemijos/reperfuzijos poveikyje, atsistačius kraujotakai. Pastebėjome, kad ilginant išemijos trukmę, mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumas maţėja. Šie rezultatai patvirtina faktą, kad išemijos ir išemijos/reperfuzijos poveikyje paţeidţiamas I kompleksas, kuris ir sąlygoja glutamato/malato oksidacijos sulėtėjimą.

SUMMARY

G. Gerulytė. The effect of kidney ischemia/reperfusion on mitochondrial functions: Master‘s thesis/ Scientific supervisor prof., dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas.

The aim of this work is to explore the effect of ischemia/reperfusion on rat kidney mitochondrial function. The main objectives of this work are to: 1) evaluate the effect of ischemia (20, 40, 60 minutes) in vitro on kidney mitochondrial function; 2) evaluate the effect of ischemia (60 minutes) and reperfusion (30 minutes) in vivo on kidney mitochondrial function; 2) explore the effect of ischemia/reperfusion on kidney mitochondrial respiratory chain complex I activity.

We chose two experimental models of ischemia for investigation of its effects on rat kidney mitochondrial functions, i.e. in vitro and in vivo models. The mitochondria were isolated by a differential centrifugation method, while the protein was determined using biuret method. Mitochondrial respiration rate was measured polarographically. Complex I activity was evaluated spectrophotometrically.

The results showed that mitochondrial damage become apparent very early - after 20 minutes, i.e. the maximal (ADP- stimulated) mitochondrial respiration rate decreased with both, glutamate/malate and succinate. It is obvious that by increasing the duration of ischemia, the mitochondrial damage increased. The damage of mitochondrial outer membrane increased by increasing the duration of ischemia. We found that both, ischemia (60 minutes) and reperfusion (30 minutes) decreased the mitochondrial State 3 respiration rate. 60 minutes ischemia/30 minutes reperfusion had no effect on mitochondrial inner membrane permeability. The results showed that mitochondrial damage after ischemia (60 minutes) is more pronounced than after ischemia/reperfusion. By increasing the duration of ischemia, mitochondrial respiratory chain complex I activity decreases. These results confirm the fact that ischemia and ischemia/reperfusion decreases the mitochondrial complex I activity and leads to the decrease in glutamate/malate oxidation.

Padėka

Ypatingai dėkoju savo darbo vadovei prof., dr. Sonatai Trumbeckaitei uţ nuoširdţią pagalbą, patarimus ir kantrybę, rengiant baigiamąjį darbą. Taip pat esu dėkinga prof., dr. Rasai Banienei bei visam laboratorijos kolektyvui uţ pagalbą.

ĮVADAS

Terminas, išemija, reiškiantis nepakankamą kraujo pritekėjimą į audinius, pirmą kartą buvo pavartotas 19 amţiuje. Tiek gydytojai, tiek biomedicinos srities mokslininkai jau kurį laiką stengiasi geriau suprasti išemijos sukeltus audinių paţeidimus, jų atsiradimo mechanizmus. To pasekoje, supratimas apie molekulinius, ląstelinius, sisteminius pokyčius, įvykstančius išemijos metu, tapo kur kas didesnis. Nepaisant intensyvių tyrimų, suvokimas apie išemijos metu vykstančius procesus vis dar yra ribotas [50].

Inkstai yra labai jautrūs išemijai dėl ypač intensyvios kraujotakos [57]. Sustabdţius kraujo pritekėjimą (išemija) ir atstačius kraujotaką (reperfuzija), iškyla realus rizikos pavojus inkstų funkcinei būklei. Inkstų išeminis/reperfuzinis paţeidimas yra charakterizuojamas kaip patologinis pokytis, įvykstantis įvairių klinikinių situacijų metu, tokių kaip inkstų arterijos uţspaudimas inkstų vėţio operacijos metu, transplantacija, šokas [54]. Inkstų išeminė/reperfuzinė paţaida yra pagrindinė ūminio inkstų nepakankamumo prieţastis [54]. Ūminis inkstų nepakankamumas yra potencialiai gyvybei pavojinga būklė, siejama su didelio mirtingumo ir sergamumo rodikliais pasaulyje [54]. Kai kuriais atvejais gali išsivystyti lėtiniai inkstų susirgimai [54]. Reperfuzija, nors ir yra būtina audinių funkcinės būklės atsistatymui, pablogina audinių paţeidimą, sukeltą išemijos [54].

Inkstų išemija/reperfuzija sąlygoja biocheminių procesų vyksmą, kuris neigiamai veikia kiekvienos organelės, tame tarpe ir mitochondrijų, funkcijas bei struktūrą. To pasekoje, ir yra stebimas inkstų nepakankamumas, ląstelių ţūtis [51]. Tai yra aktuali šių dienų problema, kadangi ilgesnės trukmės išemija sukelia negrįţtamus audinių pakitimus. Lietuvos statistikos departamentas nurodo, kad 2012 metais nustatyti net 5,3 % ir 8,2 % nauji šlapimo pūslės ir inkstų vėţio atvejai moterims ir vyrams, atitinkamai [52]. Šie rezultatai tik įrodo būtinybę ieškoti būdų, kaip maksimaliai išsaugoti inkstų funkcinę būklę po įvairių chirurginių intervencijų. Inkstų išeminė paţaida gali lemti trumpalaikius ir ilgalaikius paciento sveikatos sutrikdymus. Nors inkstų paţeidimo pradţia neretai gali būti nuspėjama, pavyzdţiui, po operacijos, kuri gali sumaţinti kraujo pritekėjimą į inkstus, tačiau net ir tokiose situacijose, šiuolaikinė terapija nepajėgi apsaugoti nuo inkstų paţeidimo. Dėl šios prieţasties, intensyviai vykdoma medţiagų paieška, kurios gebėtų apsaugoti nuo inkstų paţaidos [8]. Tačiau naudojant įvairios išemijos/reperfuzijos trukmės modelius in vitro ir in vivo, pirmiausia būtina įvertinti išemijos/reperfuzijos poveikį inkstų mitochondrijų funkcijoms.

Darbo tikslas ir uţdaviniai

TIKSLAS:

Ištirti išemijos/reperfuzijos poveikį ţiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms.

UŢDAVINIAI:

1. Įvertinti išemijos (20, 40, 60 minučių) in vitro poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

2. Įvertinti išemijos (60 minučių) ir reperfuzijos (30 minučių) in vivo poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

3. Ištirti išemijos poveikį inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos

Mitochondrijos - organelės, aptinkamos visuose eukariotiniuose organizmuose [1]. Terminas „mitochondrija“ pirmą kartą buvo pasiūlytas 1902 metais, pastebėjus tam tikrą komponentą ląstelėse [9]. Mitochondrijų reikšmė yra akivaizdi visuose aerobiniuose organizmuose, nes net apie 98 % įkvėpiamo deguonies suvartoja mitochondrijos [26].

Gyvose ląstelėse šios organelės lėtai juda, taip keisdamos savo dydį ir formą [9]. Mitochondrijų dydis įvairuose audiniuose gali skirtis nuo 0,5 µm iki 10 µm. Jų skaičius vienoje ląstelėje gali būti nuo 1 iki > 1000 [6]. Ląstelėse, kurioms reikia minimalaus energijos kiekio, gali būti keli šimtai mitochondrijų, tuo tarpu ląstelėse, kurioms būdingas didelis energijos poreikis – keli tūkstančiai mitochondrijų [16]. Mitochondrijų išvaizda turi tam tikrus bruoţus, kurie neleidţia jų sumaišyti su kitais organoidais, analizuojant elektroninės mikroskopijos pagalba [9]. Elektroninės mikroskopijos tyrimai parodė, kad mitochondrijų morfologija gali būti labai nevienoda skirtinguose audiniuose. Šie vaizdai atskleidė, kad tipinė mitochondrija yra elipsės formos [6]. Mitochondrijos turi savo DNR, ribosomas, sugeba sintetinti baltymus. Mitochondrijos yra panašios į bakterijas keliais aspektais: jos turi dvigubą membraną, taip pat dvigrandę ţiedinę DNR ir dauginasi dalijantis branduoliams [6]. Ţmogaus mitochondrijų DNR susideda iš 37 genų [7].

Mitochondrijos yra atsakingos uţ daugelį funkcijų, tokių kaip Ca2+ _{homeostazė, ląstelių}

signalizacija [2], apoptozės aktyvacija, ląstelių mirtis [32]. Mitochondrijos dalyvauja ir kituose ląsteliniuose procesuose, tokiuose kaip lipidų modifikacijos, redokso balanso palaikymas [27]. Mitochondrijos yra svarbios ne tik oksidacinei ląstelės apykaitai, jos taip pat reguliuoja ląstelės ţūties - apoptozės arba nekrozės būdu – eigą [4]. Pagrindinė mitochondrijų funkcija yra gaminti energiją eukariotinių organizmų ląstelėse oksidacinio fosforilinimo būdu [1], paverčiant angliavandenių ir riebalų rūgščių cheminiuose ryšiuose sukauptą energiją ATP molekulėmis [14]. Gautą energiją ATP pavidalu ląstelės panaudoja judėjimui, dauginimuisi, įvairių junginių (hemo, lipidų, aminorūgščių) sintezei.

Kiekvieną mitochondriją supa dvi labai specifinės membranos, pasiţyminčios skirtingomis funkcijomis [39]. Kartu jos sukuria du atskirus mitochondrijų kompartmentus: matriksą ir daug siauresnę tarpmembraninę erdvę (1 pav.) [39]. Išorinė membrana yra pralaidi daugeliui metabolitų [3]. Šioje membranoje yra įsiterpę baltymai porinai [4], kurie suformuoja vandeninius kanalus per lipidų bisluoksnį [39]. Per šiuos kanalus gali laisvai difunduoti molekulės maţesnės kaip 5000 Da bei maţos baltymų molekulės [39]. Tokios molekulės patenka į tarpmembraninę erdvę, tačiau dauguma jų

neįveikia vidinės mitochondrijų membranos barjero [39]. Vidinės mitochondrijų membranos lipidų bisluoksnis yra sudarytas iš fosfolipidų kardiolipinų, turinčių 4 riebalų rūgštis, ir yra maţo membranos laidumo jonams, prieţastis [39]. Vidinę mitochondrijų membraną sudaro ir baltymai (daugiau kaip 70 proc.), kurie funkcionuoja kaip metabolitų nešikliai, kvėpavimo grandinės fermentiniai kompleksai ir dalyvauja oksidacinio fosforilinimo procese. Ši membrana yra selektyviai pralaidi [3] maţos molekulinės masės junginiams ir jonams, ji nelaidi H+

, Na+, K+, Cl- ATP, piruvatui, trikarboksirūgščių ciklo substratams ir kt. [4]. Vidinė membrana sudaro įlinkimus, kurie vadinami kristomis [3]. Šie įlinkimai labai padidina bendrą paviršiaus plotą [14]. Kristų skaičius, mitochondrijų fermentų tipai yra skirtingi įvairiems organams [39]. Pavyzdţiui, širdies raumens ląstelių mitochondrijų kristų skaičius yra tris kartus didesnis nei kepenyse [39]. Vidinė mitochondrijų membrana gaubia uţpildą (matriksą), kuriame esti Krebso ciklo, β oksidacijos fermentų [5]. Šie fermentai reguliuoja mechanizmus atsakingus uţ metabolitų ir nukleotidų pernašą per vidinę membraną [3]. Šioje mitochondrijų membranoje yra išsidėsčiusi ir kvėpavimo grandinė, ir ATP sintazė [4].

1 pav. Mitochondrijų struktūra [15]

Vidinė membrana Išorinė membrana DNR Matriksas Tarpmembraninė erdvė Kristos

1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra

Ţinduolių kvėpavimo grandinė susideda iš keturių stambiamolekulinių kompleksų, kurie katalizuoja elektronų bei protonų pernašą [6]. Šiuos kompleksus tarpusavyje sieja judrūs protonų ir elektronų nešikliai t.y. KoQ ir citochromas C [4]. Patys kompleksai yra sudaryti iš maţdaug 90 baltyminių komponentų [4], kurie išsidėstę vidinėje mitochondrijų membranoje [32]. Kompleksai egzistuoja dviejose formose: redukuotoje (labiau elektroneigiami), kai prijungia elektroną arba oksiduotoje (maţiau elektroneigiami), kai atiduoda elektroną [18]. Šie membrana apgaubti mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai susideda iš įvairių redokso centrų tokių kaip chinonai, flavinai, geleţies-sieros grupės, hemai ir vario jonai [13].

I-IV kompleksai, KoQ ir citochromas C suformuoja mitochondrijų kvėpavimo grandinę (I-IV) (2 pav.), kuri perduoda elektronus nuo redukuojančių ekvivalentų vandens molekulėms ir taip sukuria protonų gradientą per vidinę mitochondrijų membraną. Šį protonų gradientą panaudoja penktasis kompleksas ATP-azė (V), kuri dalyvauja ATP sintezėje [38].

I. NADH dehidrogenazės kompleksas arba NADH- ubichinono oksidoreduktazė. (I kompleksas). Tai yra flavoproteinas [4], kuris yra sudarytas iš 45 baltymų subvienetų. Nustatyta kad jo masė yra apie 1 mDa [32]. Į jo sudėtį įeina viena FMN molekulė, aštuoni - devyni Fe - S baltymai [4]. Eukariotų mitochondrijų pirmasis kompleksas – NADH dehidrogenazė turi L formos struktūrą, kurią sudaro hidrofobinė membraninė dalis ir hidrofilinė dalis, nukreipta į mitochondrijų matriksą. Hidrofilinė dalis turi visus redokso kofaktorius, kurie reikalingi I komplekso substrato kofermento NADH oksidacijai bei elektronų pernašai. Ilga, neţymiai susisukusi alfa- spiralinė membraninė dalis yra atsakinga uţ protonų pernašą [13].

II. Sukcinato dehidrogenazė arba sukcinato – ubichinono oksidoreduktazė (II kompleksas). II kompleksas yra 123 kDa fermentas. Kaip ir I kompleksas, lokalizuojasi vidinėje mitochondrijų membranoje ir turi FAD prostetinę grupę, taip pat Fe - S grupes [32]. Šis kompleksas iš kitų kvėpavimo grandinės kompleksų išsiskiria tuo, kad yra visiškai koduojamas branduolio DNR [32]. Antrajame komplekse, hidrofilinė dalis susideda iš 2 subvienetų, kurie yra sudaryti iš redokso kofaktorių [13].

III. Citochromo bc1 kompleksas arba ubichinolio – citochromo c oksidoreduktazė (III kompleksas). Tai yra 13 kDa vandenyje tirpus proteinas, kuris atlieka svarbų vaidmenį apoptozės procese [32]. Šis kompleksas membranoje išssidėsto nesimetriškai: citochromas c1 ir neheminės geleţies Fe – S

– transmembraninis baltymas. III kompleksas katalizuoja KoQH2 oksidaciją iki KoQ ir citochromo

redukciją [4]. III kompleksas yra stabilus dimerinis fermentas [13].

IV. Citochromo c oksidazė (IV kompleksas). Tai yra galutinė oksidazė mitochondrijų elektronų transporto grandinėje [33]. Ţinduolių mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV kompleksas yra didelis fermentų kompleksas, sudarytas iš 13 subvienetų [33]. 3 katalitiniai subvienetai koduojami mitochondrijų genų, likusieji subvienetai yra koduojami branduolio genų [33]. Šį fermentą sudaro dvi hemo grupės (hemo a ir hemo a3) ir du Cu2+

centrai (Cu2+ A and Cu2+ B). [33] IV kompleksas katalizuoja molekulinio deguonies redukciją citochromu c - tai yra svarbiausia deguonies redukcijos vieta ląstelėje [4]. Šis fermentas redukuoja apie 90% ląstelės deguonies [4]. Šio fermento struktūra ir funkcija gali pakisti dėl įvairių patologijų, tokių kaip vėţys, neurodegeneraciniai sutrikimai, miokardo išemija/reperfuzija, diabetas ir kt [33].

V. ATP sintazė (V kompleksas). Tai yra fermentų kompleksas, kuris esti vidinėje mitochondrijų, chloroplastų ir eukariotinių bakterijų plazminėje membranoje [4]. Šis kompleksas susideda iš dviejų domenų. F0 domenas apima vidinę mitochondrijų membraną, o F1 domenas tarytum įkrenta

į mitochondrijų matriksą – suteikdamas šiam fermentui atitinkantį pavadinimą F0F1 ATPazė [32].

ATP sintazė yra atsakinga uţ galutinį ATP sintezės etapą oksidaciniame fosforilinime [32]. Šis kompleksas, panaudodamas kvėpavimo grandinės sukurtą elektrocheminį vandenilio jonų gradientą – susintetina ATP iš adenozino difosfato (ADP) ir fosfatinės grupės (Pn) [4]. V kompleksas katalizuoja grįţtamą fermentinę reakciją:

ADP+ Pn+nH+išor. ATP + H2O + nH+vid. [4]

V kompleksas ATP sintazė

2 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [40]

1.3. Oksidacinis fosforilinimas

Oksidacinis fosforilinimas vyksta dalyvaujant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksams (I-V) ir judriesiems nešikliams. Mitochondrijos energijos gamybai naudoja piruvatą (daţniausiai gliukozę ir kitus angliavandenius) ir riebiąsias rūgštis. Kai šie junginiai patenka į matriksą, jie paverčiami acetil – KoA, kuris naudojamas Krebso cikle, kaip tarpinis metabolitas [7]. NADH ir FADH2 molekulės susiformuoja glikolizės, riebalų rūgščių oksidacijos arba Krebso ciklo

metu.

NADH ir FADH2 molekulės yra oksiduojamos mitochondrijų kvėpavimo grandinėje [13].

NADH prisijungia prie didţiausio kvėpavimo grandinės komplekso t.y. NADH dehidrogenazės ir perduoda 2 elektronus flavino mononukleotido prostetinei grupei, kurią turi I komplekso hidrofilininė dalis. Šie elektronai pereina ţemyn hidrofiline ranka per Fe-S grupes ir pasiekia lipiduose tirpų KoQ [32]. II kompleksas turi Fe-S grupes, kurios padeda elektronams lengviau pasiekti KoQ. Šios Fe – S

I kompleksas NADH dehidrogenazė III kompleksas citochromo bc1 kompleksas IV kompleksas citochromo c oksidazė II kompleksas sukcinato dehidrogenzė V kompleksas – ATP sintazė Sukcinatas Fumaratas NADH NAD+ +H+ ADP + Pi ATP

grupės priima elektronus iš FADH2 ir perduoda juos judriajam nešikliui. Iš kitų kompleksų (I,III ir IV)

sukcinato dehidrogenazė išsiskiria tuo, kad neišstumia vandenilio jonų (H+

) iš mitochondrijų matrikso į tarpmembraninę erdvę [32]. Kai I ir II kompleksas perneša elektronus nuo NADH (I kompleksas) ir FADH2 (II kompleksas) ant KoQ [4], KoQ yra redukuojamas. Nuo šio momento, jis gali laisvai

difunduoti vidinėje mitochondrijų membranoje ir tokiu būdu atiduoti elektronus trečiajam kompleksui (citochromui bc1) [32]. KoQ elektronus taip pat gali gauti ir iš riebalų rūgščių, ir amino rūgščių oksidacijos [6]. Kitas kompleksas, gaunantis elektronus (su citochromo c pagalba) yra citochromo c oksidazė (IV kompleksas). Citochromas C vienu metu gali pernešti tik vieną elektroną citochromo c oksidazei. Šis kompleksas uţbaigia kvėpavimo grandinę [6].

Elektronams keliaujant per elektronų pernašos grandinę, jų laisvoji energija maţėja kartu su nuolat didėjančiu jų nešiklių redokso potecialu. [32]. Elektronų pernašos metu kvėpavimo grandine iš uţpildo į tarpmembraninę erdvę vyksta protonų pernaša per I, III ir IV kompleksus. Susidaro protonų koncentracijos gradientas ir elektros krūvių skirtumas vidinės mitochondrijų membranos abiejose pusėse, t.y. sukuriamas elektrocheminis H+

jonų gradientas. Gradientas susiformuoja tada, kai didesnė H+ jonų koncentracija viename kompartmente yra didesnė lyginant su kitu kompartmentu. Šis gradientas yra tam tikra energijos forma, kuri naudojama įvairiems procesams. Tačiau didţiausia jos dalis yra išeikvojama ATP sintezei [7].

Procesas, kai ATP sintazė susintetina ATP iš adenozino difosfato (ADP) ir fosfatinės grupės (Pn) ir yra vadinamas fosforilinimu [7]. F0 domeno transmembraninis protonų kanalas ir asimetriškas

stiebelis, kyšantis F1 domeno viduje suformuoja rotorių. F1 domeno stiebeliui būdinga besisukanti

simetrija ir tam tikri elementai, kurie sudaro tinkamas sritis ADP ir fosfato prijungimui. Kiekvienas rotoriaus posūkis pagamina 3 ATP molekules. Yra paskaičiuota, kad reikalingas protonų skaičius, norint pagaminti vieną ATP molekulę svyruoja nuo 2 iki 5 [32].

1.4. Išemija ir reperfuzija

Gyvybiškai svarbių organų išeminė paţaida stipriai įtakoja sergamumo ir mirtingumo rodiklių padidėjimą visame pasaulyje [21]. Išemija – tai sumaţėjęs kraujo pritekėjimas į audinius. Dėl to sumaţėja arba visiškai nutrūksta ląstelių aprūpinimas deguonimi ir substratais, taip pat sutrinka ir metabolitų pašalinimas iš ląstelės. Išemija daţniausiai kyla uţspaudus arteriją (operacijų metu arba susidarius trombui). Išemija gali būti grįţtama ir negrįţtama [21]. Negrįţtama išemija pasireiškia inkstų arteriją uţspaudus 30 – 45 min. [31]. Grįţtamos išemijos atveju paţeisti audiniai atsigaus,

negrįţtamos – ţus. Skiriama lėtinė išemija, kurios metu kraujo pritekėjimas sumaţėja iš lėto ir ūminė išemija, kurios metu kraujotaka nutrūksta staiga. Po ūmios inkstų išemijos, reperfuzija yra veiksmingiausias pasirinkimas, siekiant sumaţinti organų paţeidimą [21]. Reperfuzija - tai yra toks procesas, kai kraujotaka atstatoma (mechaninė kliūtis arba trombas pašalinamas) ir kraujo pritekėjimas į audinius tampa normalus. Nors reperfuzija prasideda nuo hiperemijos (daţnai netgi viršijamas normalus kraujo srautas), tačiau po to visada seka kraujo tėkmės sumaţėjimas [28]. Reperfuzijos metu išlieka tikimybė, kad pasireikš tam tikri audinių paţeidimai sąlygoti išemijos (deguonies stygius, padidėjusi Ca2+

koncentracija) arba reperfuzijos (padidėjusi aktyvių deguonies formų gamyba). Dėl reperfuzijos gali įvykti ir negrįţtama ląstelių ţūtis [21].

Išeminė – reperfuzinė ţala paveikia aerobinius audinius ir organus, tokius kaip širdis, smegenys, inkstai, kepenys, ţarnynas [19] t.y. bioenergijos trūkumas daţnai būna ţalingas ląstelių funkcijoms [32]. Šių organų ląstelėms energija gali būti tiekiama tik oksidacinio fosforolinimo būdu, anaerobinės glikolizės metu energijos tiekimas negalimas [19]. Audinių paţeidimas po tam tikro organo išemijos ir reperfuzijos apima įvairius biocheminius kelius, kurie gali vykti nepriklausomai arba sinergistiškai [34]. Mitochondrijos uţima svarbią poziciją ląstelių normalaus funkcionavimo procese, o ląstelių funkcionavimas daţnai atspindi mitochondrijų gyvybingumo laipsnį [32]. Sutrikusi mitochondrijų funkcija daţniausiai yra siejama su tam tikra patologija [32]. Daţnai pasitaikančios ligos, tokios kaip širdies infarktas ir insultas yra išemijos rezultatas. Kaip jau minėta, yra ţinomos įvairių organų išemijos. Tačiau mūsų tyrimas yra orientuotas į inkstų išemiją, kadangi inkstai yra ypač jautrūs išemijos sukeltai ţalai.

Inkstai gauna maţdaug ketvirtį širdies išstumiamo kraujo tūrio ir turi didelį kiekį mitochondrijų, kurių daugiausia susitelkę inkstų ţievės kanalėliuose [25]. Viena iš inkstų jautrumo išemijai prieţasčių yra ta, kad inkstų mikrokraujotaka yra labai sudėtinga, todėl jiems reikalingas didelis energijos kiekis. Šią energiją tiekia mitochondrijos oksidacinio fosforilinimo būdu [10], t.y jos turi pagaminti pakankamą kiekį ATP [25]. Mitochondrijos yra ypač jautrios deguonies stygiui [25]. Išemijos ir reperfuzijos metu įvyksta esminiai pokyčiai, kurie ir sąlygoja tolimesnius procesus ląstelėje.

1.5. Išemijos/reperfuzijos poveikis inkstų funkcijoms

Sumaţėjus deguonies kiekiui ląstelėje, sumaţėja ląstelinis kvėpavimas, kuris sukelia paţaidas. Šias paţaidas patiria beveik kiekviena ląstelės organelė [21]. Pirmieji išeminės paţaidos poţymiai –

dėl sumaţėjusio mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų I ir IV aktyvumo , susilpnėja elekronų pernaša ir sumaţėja energijos gamyba mitochondrijose t.y. ATP sintezė oksidacinio fosforilinimo būdu. Elektronų pernašos grandinės kompleksų aktyvumo sumaţėjimas taip pat lemia elektronų „nutekėjimą“ ir O2 redukciją elektronais, dėl ko seka aktyvių deguonies formų (ROS) susidarymas mitochondrijų kvėpavimo grandinės I ir III kompleksuose. Be to, elektronų pernašos grandinės sudėty yra daug baltymų, turinčių geleţies - sieros centrus. Šie baltymai išemijos metu išlaisvina dvivalentę geleţį, kuri gali būti svarbi aktyviųjų deguonies formų (ROS) susidaryme. Išemija paveikia mitochondrijų antioksidacinę sistemą: sumaţėja antioksidacinių fermentų aktyvumas, tokių kaip MnSOD10 ir/ar substratų, tokių kaip glutationas, kuris padaro ląsteles labiau jautrias oksidaciniam stresui reperfuzijos metu [11].

Dėl energijos trūkumo padidėja ląstelių membranų pralaidumas, kinta membranos įtampa mitochondrijose, sutrikdoma ląstelinių jonų homeostazė. Progresuojant išeminei paţaidai, sumaţėja citozolio pH dėl anaerobinės glikolizės, H+ _{jonų išėjimo iš paţeistų lizosomų. Beveik tuo pat metu,} sutrinka ląstelinė jonų homeostazė ir sąlygoja padidėjusią Na+ ir Ca2+ jonų koncentraciją citozolyje. Padidėjusi Na+

koncentracija gali sukelti osmosinį ląstelės brinkimą. Tai gali sąlygoti plazminės membranos paţeidimą. Mitochondrijų membranų pralaidumo padidėjimas įvyksta dėl to, kad mitochondrijų membrana praranda savo potencialą ir mitochondrijų matrikse kaupiasi Ca2+

jonai. Padidėjusi Ca2+

koncentracija, gali aktyvuoti fermentus - hidrolazes (ypač fosfolipazę A2) ir proteazes. Hidrolazės gali dar labiau apsunkinti išeminę ţalą [20]. Dėl ţalingai padidėjusios kalcio jonų koncentracijos suaktyvėja vandenilio peroksido generacija mitochondrijose, hidroksilo radikalų ir kitų aktyvių deguonies formų (ROS) gamyba. Kalcio jonų koncentracijos padidėjimas sukelia vidinės mitochondrijų membranos nespecifinio pralaidumo poros atsidarymą, dėl to mitochondrijos brinksta, iš mitochondrijų gali išeiti tirpūs mitochondrijų matrikso komponentai bei citochromas C [34].

Inkstų išemijos metu mitochondrijose stebimi lipidų pokyčiai: padidėja laisvųjų riebalų rūgščių, sumaţėja bendras fosfolipidų kiekis, padidėja fosfolipazių aktyvumas [12, 63]. Padidėjęs laisvųjų riebalų rūgščių kiekis gali veikti kaip skyrikliai ir tokiu būdu slopinti oksidacinį fosforilinimą [17]. Fosfolipidų degradacija gali būti lipidų peroksidacijos arba fosfolipazės veikimo, pasekmė. Veikiant fosfolipazei A2, laisvosios riebalų rūgštys ir lizofosfolipidai taip pat prisideda prie ląstelės membranos lipidų pakitimų. Be to, arachidono rūgštis (fosfolipidų skilimo produktas) naudojama uţdegiminių mediatorių – prostaglandinų bei leukotrienų sintezei. Susidaro vandenilio peroksidas (H2O2), kuris sukelia papildomą paţeidimą [34]. Fosfolipidų skilimo produktai gali veikti kaip detergentai, t.y. sukelti mitochondrijų membranų paţaidas. Po inkstų išemijos, stebimas fosfatidilglicerolio kiekio sumaţėjimas fosfolipidų frakcijoje, tačiau fosfatidilcholino ir

fosfatidiletanolamino santykis fosfolipidų frakcijoje nepakinta iki negrįţtamo išeminio paţeidimo etapo. Įrodyta, kad fosfatidilglicerolio kiekis mitochondrijų membranoje sumaţėja tik ankstyvame išemijos etape ir tik negrįţtamos išemijos fazės metu fosfatidilcholinas ir fosfatidiletanolaminas yra suskaidomi. Tai leidţia daryti prielaidą, kad šie reiškiniai įvyksta dėl mitochondrijų membranoje esančios fosfolipazės aktyvavimo [12]. Uţsitęsusi išeminė ţala sukelia ląstelių ţūtį [20].

Atstačius kraujotaką, reperfuzinė paţaida išsivysto per kelias valandas ar dienas po pirminės paţaidos. Regeneracijos procesai vyksta kartu su ląstelių apoptoze, autofagija ar nekroze: organo likimas priklauso nuo to, ar vyrauja ląstelių atsikūrimas ar ląstelių mirtis [28]. Staigus deguonies kiekio padidėjimas reperfuzijos metu sąlygoja audinių paţeidimą, tarpininkaujant deguonies laisviesiems radikalams arba aktyviosioms deguonies formoms (ROS) [34]. Manoma, kad staigus laisvųjų radikalų proverţis įvyksta netrukus po reperfuzijos. Šių radikalų pagrindinis šaltinis reperfuzijos metu yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentai. Redukuotas ubichinonas reaguoja su laisvu deguonimi ir gaunamas superoksidas, kuris metabolizuojamas į vandenilio peroksidą, dalyvaujant fermentui katalazei. Radikalai ląstelių ir mitochondrijų membranose paţeidţia nesočiųjų riebalų rūgščių dvigubus ryšius, tiolio grupes [28].

Mitochondrijos reguliuoja viduląstelinio kalcio koncentraciją, siekdamos apsisaugoti nuo kalcio pertekliaus [34]. Tačiau reperfuzijos metu dėl laisvųjų deguonies junginių (ROS) paţeidţiama tiek ląstelės, tiek mitochondrijų membrana ir tai sukelia kalcio jonų koncentracijos padidėjimą citozolyje ir mitochondrijų matrikse. Kalcis, dėl membranos depoliarizacijos, reperfuzijos metu, patenka į inkstų ląsteles, kurios nesugeba sujungti kalcio ir sumaţinti laisvo kalcio koncentracijos [34]. Citozolinio kalcio koncentracija yra reguliuojama didelio, vidun nukreipto kalcio gradiento per plazminę membraną. Viduląstelinio kalcio koncentracija paprastai būna 0,1 – 0,2 µM ribose, tuo tarpu ekstraląstelinio kalcio koncentracija yra maţdaug 10000 kartų didesnė [34]. Ląstelės turi tam tikrus membranų baltymus (kalcio kanalus), kurių pagalba gali reguliuoti kalcio patekimą. Ląstelė taip pat veikia ir per kitus mechanizmus, siekdama išlaikyti viduląstelinio kalcio koncentraciją. Plazminėje membranoje yra nuo ATP priklausomi kalcio siurbliai, kurie išstumia kalcį iš ląstelės. Šią plazminės membranos Ca2+ ATP-azę aktyvina viduląstelinis kalcį sujungiantis baltymas kalmodulinas, kuris padidina Ca2+ ATP-azės giminingumą kalciui [34]. Viduląstelinio kalcio kiekis gali būti reguliuojamas vykstant Na+ – Ca2+ mainams. Nors mitochondrijos yra laikomos svarbiais citozolinio kalcio reguliatoriais, akivaizdu, kad maţas mitochondrijų afinitetas elektrogeninio kalcio įsisavinimui riboja jų svarbą reguliuoti viduląstelio kalcio koncentraciją. [34]

Dėl reperfuzijos prasideda uţdegiminis atsakas, kurio metu dalyvauja makrofagai, endotelinės, parenchiminės ląstelės, neutrofilai, limfocitai, citokinai [20]. Pernelyg didelis aktyviųjų

deguonies formų (ROS) kiekis gali paţeisti baltymus, lipidus ir DNR, to pasekoje sutrinka mitochondrijų funkcija. Aktyvios deguonies formos (ROS) taip pat gali paveikti signalo perdavimo kelius, o tai gali sukelti ląstelių ţūtį [11].

1.6. Tyrimų, išemijos - reperfuzijos poveikiui inkstams įvertinti, apţvalga

Išemijos ir reperfuzijos poveikiu inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiui domimasi jau senai. Ankstesnių tyrimų metu nustatyta, kad iki 10 minučių nestebimas joks kvėpavimo greičio pokytis. Po 30 minučių išemijos, jis sumaţėja 34 %, o po 60 minučių išemijos sumaţėja net 70 %. Palyginimui, mitochondrijų kvėpavimo greitis smegenų audinyje sumaţėja 78 % jau po 10 minučių išemijos [53].

Išemija ir reperfuzija sukelia ultrastruktūrinius mitochondrijų pokyčius. Pirmieji pokyčiai buvo pastebėti po 60 minučių išemijos/60 minučių reperfuzijos. Mitochondrijos atsiskyrė nuo ląstelės membranos įlinkimų, kai kurios įgijo apvalią formą, sutrumpėjo. Mitochondrijos buvo šiek tiek pabrinkusios ir pasiskirsčiusios visoje citoplazmoje. Po 120 minučių reperfuzijos, stebimas ţymus mitochondrijų pabrinkimas, šiek tiek suardytos kristos. Po 180 minučių reperfuzijos, buvo paţeista kai kurių mitochondijų išorinė ir vidinė membrana. Po 240 minučių reperfuzijos, mitochondrijos atrodė dar labiau pabrinkusios ir įgijo įvairesnes formas. Pastebėtas mitochondrijų matrikso nuotėkis į citoplazmą ir abiejų membranų plyšimas. Tyrėjai taip pat nustatė, kad ilgėjant reperfuzijos trukmei, sukcinato dehidrogenazės veikimo intensyvumas nemaţėja [30]. Kita mokslininkų grupė skelbia, kad mitochondrijų membranos potencialas po 45 minučių išemijos/1 h reperfuzijos sumaţėjo 46 %, o po 45 minučių išemijos/48 h reperfuzijos sumaţėjo 58 %, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis [29]. Kito tyrimo metu buvo vertinami mitochondrijų membranos takumo pokyčiai, pritaikius fluorescencinę poliarizaciją. Remdamiesi šio tyrimo rezultatais, mokslininkai padarė išvadą, kad 60 minučių trukmės išemija sukelia negrįţtamą ţalą mitochondrijų membranoms [66].

Tyrimų dėka nustatyta priklausomybė tarp mitochondrijų kvėpavimo, membranų pabrinkimo ir inkstų išemijos paţeidimo laipsnio [65]. Rezultatai atskleidė, kad mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje ir kvėpavimo kontrolės koeficientas ţymiai sumaţėja po 20, 40, 60, 80 minučių trukmės išemijos - stebima tiesinė priklausomybė su inkstų paţaida. Tuo tarpu, mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje ir mitochondrijų pabrinkimas nepasiţymėjo tiesine priklausomybe su inkstų paţaida. Tyrėjai padarė išsvadą, kad nuo deguonies priklausomų ląstelių anoksinė paţaida yra dominuojantis paţeidimas išeminėje fazėje. Tai prasideda sumaţėjusia

mitochondrijų energijos gamyba. Dėl energijos trūkumo, atsiranda ţalingi pakitimai: sutrikdoma jonų homeostazė, hidrolazių aktyvacija, aktyviųjų deguonies formų susidarymas ir padidėja membranos pralaidumas [65].

Kaspazių aktyvumas itin domino mokslininkus, kadangi tai yra svarbus apoptozės ţymuo, esant išeminei/reperfuzinei paţaidai [64]. Rezultatai atskleidė, kad po 45 minučių išemijos/15 minučių reperfuzijos, kaspazių-3 aktyvumas siekė apie 3 nmol/min/mg. Po 45 minučių išemijos/6 h reperfuzijos jis padidėjo 3,6 karto, tuo tarpu po 45 minučių išemijos/24 h reperfuzijos kaspazių-3 aktyvumas padidėjo 73 %, lyginant su kontrole [67]. Kito atlikto tyrimo metu, buvo vertinamas ne tik kaspazių-3, bet ir kaspazių-9 aktyvumas po 45 minučių išemijos/24 h reperfuzijos. Nustatyta, kad šios trukmės išemijos/reperfuzijos poveikyje 3 aktyvumas siekė apie 2,8 nmol/min/mg, tuo tarpu kaspazių-9 aktyvumas buvo 2,4 nmol/min/mg [63].

Aktyviųjų deguonies formų kiekio pokyčiai išemijos/reperfuzijos metu taip pat aktualūs tyrėjams. Nustatyta, kad po 45 minučių išemijos/1 h reperfuzijos aktyviųjų deguonies formų kiekis padidėjo net 93 %, kai tuo tarpu po 45 minučių išemijos/48 h reperfuzijos jų kiekis buvo du kartus didesnis nei kontrolėje [29]. Kito tyrimo metu, aktyviųjų deguonies formų aptikimui buvo panaudota fluorescencinė analizė. Po 45 minučių išemijos, inkstų audinys pasiţymėjo ryškia fluorescencija. Tuo tarpu, kontrolinės grupės inkstų audinys visiškai nefluorescavo. Gautieji vaizdai dar kartą patvirtino [68], kad išeminė/reperfuzinė paţaida padidina mitochondrijų aktyviųjų deguonies formų gamybą [29]. Daugelio tyrimų metu yra vertinamas antioksidantinių fermentų aktyvumas bei malondialdehido kiekis esant išeminei/reperfuzinei paţaidai. Nurodoma, kad po 45 minučių išemijos/24 h reperfuzijos, katalazės, superoksido dismutazės aktyvumas sumaţėja 83 % ir 77 %, atitinkamai, o malondialdehido kiekis padidėja net šešis kartus, lyginant su kontroline grupe [24]. Po 60 minučių išemijos/24 h reperfuzijos stebimas katalazės, superoksido dismutazės statistiškai reikšmingas aktyvumo sumaţėjimas 24 % ir 15 %, atitinkamai. Malondialdehido kiekis padidėja 53 % [62]. Palyginimui, po 72 h išemijos, sumaţėja superoksido dismutazės, glutationo peroksidazės, katalazės aktyvumas 31 % , 16 % ir 46 %, atitinkamai, o malondialdehido kiekis padidėja net 48 %, lyginant su kontroline grupe [69]. Po 45 minučių išemijos/60 minučių reperfuzijos malondialdehido kiekis padidėja 66 %. [70], tuo tarpu po 45 minučių išemijos/6 h reperfuzijos malondialdehido kiekis padidėja 68 %, lyginant su kontrole [71].

Dar vienas tyrimas buvo atliktas, siekiant įvertinti mitochondrijų kvėpavimo greitį ir kalcio kaupimosi dėsningumus, esant išeminiam inkstų paţeidimui. Ţiurkėms buvo sukeliama 45 minučių išemija ir 1 h, 3-4 h, 24 h reperfuzija, atitinkamai. Po 45 minučių išemijos, mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, kvėpavimo kontrolės koeficientas sumaţėjo 62 % ir 57 %,

atitinkamai, lyginant su kontrole. Po 1 h reperfuzijos, tie patys parametrai padidėjo 55 % ir 2 %, atitinkamai, lyginant su 45 minučių išemine grupe. Nepaisant šių rezultatų, mitochondrijų kvėpavimas po 1 h reperfuzijos, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis, išliko sumaţėjęs. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje sumaţėjo 18 %, kvėpavimo kontrolės koeficientas 17 %, lyginant su kontrole. Po 3-4 h reperfuzijos, gauti duomenys beveik nesiskyrė nuo 1 h reperfuzijos rezultatų. Tačiau kvėpavimo kontrolės koeficientas, nors ir buvo maţesnis 21 % nei kontrolinės grupės, išliko didesnis 45 % negu esant 45 minučių išemijai. Po 24 h reperfuzijos, mitochondrijų kvėpavimas trečioje metabolinėje būsenoje ir kvėpavimo kontrolės koeficientas sumaţėjo 57 % ir 51 %. Manoma, kad šie kvėpavimo defektai galėjo atsirasti dėl mitochondrinio kalcio kaupimosi, tiek in vivo, tiek in vitro sąlygomis [58]. Po 1 h reperfuzijos, kalcio kiekis buvo didesnis 75 %, o po 3-4 h reperfuzijos 81 %, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Po 24 h reperfuzijos, mitochondrinio kalcio kiekis tapo net 3,5 karto statistiškai reikšmingai didesnis lyginant su kontrole [58].

2. TYRIMO ATLIKIMO ETAPAI IR JŲ METODIKA

Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Neuromokslų institute, Biochemijos laboratorijoje. Tyrimai buvo vykdomi laikantis geros laboratorinių praktikos su gyvūnais taisyklių (leidimo, atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0217). Suaugusioms Wistar veislės ţiurkių patelėms buvo taikomos standartinės laboratorinės sąlygos, kuriose jos aklimatizavosi prieš eksperimentą. Taip pat buvo sudarytos visos sąlygos gyvūnams laisvai pasiekti maistą ir vandenį, palaikomas natūralus dienos ir nakties ciklas.

2.1. Terpės, reagentai, aparatūra, indai ir įrankiai

Naudojamos terpės ir reagentai:

1) Izoliavimo terpė (pH 7,3, privesta su KOH 0-4 ºC ), kurios gamybai buvo naudojama sacharozė 250 mM; EDTA 1 mM; tris – HCl 10 mM.

2) Matavimo terpė (pH 7,2 privesta su KOH 37 °C), kurios gamybai buvo naudojamas KCl 150 mM; tris - HCl 10 mM; KH2PO4 5mM; MgCl2×6H2O 1mM.

3) 0,9 % KCl tirpalas, kurio gamybai buvo naudojamas KCl 1,8 g; bidistiliuotas vanduo iki 200 ml.

4) Natrio deoksicholato tirpalas (DOX), kurio gamybai buvo naudojamas Na deoksicholatas 0,33 g; bidistiliuotas vanduo iki 100 ml.

5) Biureto reagentas, kurio gamybai buvo naudojamas 10 % NaOH tirpalas; 1 % vario sulfato (CuSO4) tirpalas; K, Na – tartratas 12 g; bidistiliuotas vanduo iki 1000 ml.

Naudojama aparatūra:

Homogenizatorius Sartorius, centrifugavimo mašina, termostatas, spektrofotometras, oksigrafas, kompiuteris.

Naudojami indai ir įrankiai:

Mikrošvirkštai, medicininės ţirklutės, pincetai, vienkartinės pirštinės, Petri lėkštelės, filtrinis popierius, graduotos stiklinėlės, plastikiniai indai terpėms laikyti, ledo vonia, automatinės pipetės, mėgintuvėliai, kiuvetės, svarstyklės.

2.2. Inkstų išemijos sukėlimo modelis in vitro

Inkstų išemija in vitro sukeliama autolizės būdu. Iš uţmušto gyvūno išimami inkstai. Vienas inkstas dedamas į 0-4 C 0,9  KCl tirpalą atšaldymui. Kitas inkstas praplaunamas 37 C 0,9  KCl tirpalu ir perkeliame į kamerą, prisotintą KCl garais (37 C). Praėjus numatytam laikotarpiui (20, 40 ar 60 minučių), išimame iš kameros ir dedame į 0-4 C 0,9  KCl tirpalą. Kai inkstas atšala, iš jo ruošiamos mitochondrijos, taip pat kaip ir kontrolinės.

2.3. Inkstų išemijos/reperfuzijos sukėlimo modelis in vivo

Gyvūnas yra prislopinamas CO2 dujomis, intraperitonealiai suleidţiamas pentobarbitalis ir

ketaminas į raumenis, 20 mg/kg ir 100 mg/kg, atitinkamai. Gyvūnui atliekama vidurinė laparatomija. Išemija sukeliama inkstų arteriją laikinai uţspaudţiant (60 minučių) mikrochirurginio klipso pagalba. Reperfuzijos metu (30 minučių) kraujotaka yra atstatoma ir išimami inkstai.

2.4. Mitochondrijų išskyrimas

1. Ţiurkės inkstai plaunami stiklinėlėse su 0,9 % 0-4 °C temperatūros KCl tirpalu kelis kartus. Tada inkstas išimamas ir nuo jo atsargiai nukarpomi riebalai, inkstas perkerpamas per pusę. 2. Organas perkeliamas į kitą stiklinėlę su švariu 0,9 % KCl tirpalu, praplauname.

3. Inkstus dedame į švarią stiklinėlę ir smulkiname, naudodamiesi ţirklutėmis. Indą būtina laikyti ant ledo. Kai inkstas gerai susmulkintas, pripilame izoliavimo terpės iki 25 ml.

4. Sukarpytas inkstas perkeliamas į homogenizatorių ir pripilame izoliavimo terpės iki 35 ml. Homogenizuojame Sortorium homogenizatoriaus pagalba (3 kartus nuleidţiant iki dugno) ir perpilame į švarų plastmasinį indelį, tinkamą centrifugavimui. Jei trūksta, pripilame izoliavimo terpės iki 35 ml .

5. Indelį dedame į centrifugą. Centrifuguojame (5 min, 750 aps.), esant 3–4 °C temperatūrai. 6. Po centrifugavimo, mėgintuvėlio apačioje lieka sunkesnės dalys (ląstelių nuolauţos,

branduoliai), o mitochondrijos lieka viršutinėje dalyje – skystyje (supernatantas). Supernatantą košiame per dvigubą marlės sluoksnį į kitą centrifugavimui skirtą indelį. Stengiamasi nenupilti nuosėdų.

7. Centrifuguojame (10 min, 6800 aps.), esant 3–4 °C temperatūrai.

8. Po centrifugavimo, supernatantas nupilamas, nuosėdose lieka mitochondrijos. Šios nuosėdos suspenduojamos pipetės pagalba t.y. imama apie 250 µl izoliavimo terpės ir atsargiai suspenduojama. Kai turinys tampa vienalytis, surenkamas ir perkeliamas į Eppendorfo mėgintuvėlį su dangteliu. Šis įstatomas į indą su ledais. Mėgintuvėlis visą tyrimo laiką turi būti laikomas ledo vonioje, šaltai.

2.5. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas, taikant biureto metodą

Biureto metodas yra paprastas ir greitas fotometrinis metodas baltymų kiekio įvertinimui [35]. Biureto reakcija yra pagrįsta vario jonų komplekso susidarymu su baltymais stipriai šarminiuose tirpaluose, dalyvaujant baltymų amidinėms jungtims arba peptidiniams ryšiams [45]. Biureto reakcijos rezultatų baltymų sudėtis neįtakoja, tačiau grynumas gali ţymiai įtakoti biureto reakcijos rezultatus [35]. Pagrindinis šio metodo trūkumas yra sąlyginai maţas jautrumas [45].

Esant vienai aminorūgščiai arba dipeptidams - biureto reakcija nevyksta. Tripeptidai, didesni polipeptidai arba baltymai yra tinkami biureto reakcijai atlikti. Šiai reakcijai vykti reikia ne vienos, o bent kelių peptidinių jungčių [37] t.y. ši reakcija gali būti taikoma įvairiems junginiams, kurių molekulėse yra bent dvi –CO-NH- grupės. Jos gali būti susijungusios vienu iš šių būdų: tiesiogiai ((H2N-CO-CO-NH2), per azoto atomą (biureto reakcijos atveju) arba per anglies atomą (pavyzdţiui,

proteinų hidrolizės produktai) [45].

Biureto reakcijos metu - susiformuoja mėlynos spalvos vario jonų kompleksas su baltymu šarminėje aplinkoje (3 pav.) Peptidai, kurie turi 3 ar daugiau aminorūgščių liekanų suformuoja šviesiai mėlyną – violetinį chelatinį kompleksą su vario jonais šarminėje aplinkoje, kurios sudėtyje yra natrio kalio tartrato [37]. Spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas baltymų koncentracijai mitochondrijų suspensijoje ir vertinamas spektrofotometriniu būdu [46].

3 pav. Mėlynos spalvos biureto kompleksas [55]

Darbo eiga:

1) Biureto reakcijai atlikti ruošiame baltymo tirpalą: imame 25 µl paruoštos mitochondrijų suspensijos, 0,975 ml DOX ir 4 ml biureto reagento.

2) Ruošiame kontrolinį tirpalą, imant 1 ml DOX ir 4 ml Biureto reagento.

3) Kontrolinis ir baltymo tirpalas dedami į mėgintuvėlių laikiklį ir laikomi 30 min. termosate, esant 37 °C temperatūrai.

4) Praėjus minėtam laikui, matuojama šviesos absorbcija, naudojantis spektrofotometru (bangos ilgis 536 nm). Lyginamasis tirpalas – pagamintas kontrolinis tirpalas.

5) Baltyminio tirpalo absorbciją matuojame 3 kartus. Iš gautų duomenų išvedame vidurkį, kurį naudosime tolimesniems skaičiavimams.

2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas poliarografiniu metodu

Mitochondrijų kvėpavimo greitis registruotas poliarografiškai, naudojant Klarko tipo elektrodą ir BioMed poliarografinę sistemą su kompiuterine programa. Poliarografinis deguonies suvartojimo tyrimas yra klasikinis metodas mitochondrijų kvėpavimo greičiui įvertinti ir charakterizuoti [38]. Poliarografinio tyrimo tikslumas ir atsikartojamumas labai priklauso nuo kokybiško mitochondrijų išskyrimo [38]. Visi tyrimo metu naudojami reagentai turi būti ruošiami naujai [38]. ADP kiekvieno tyrimo metu turi būti naudojamas ką tik paruoštas. Kvėpavimo buferiai

gali būti ruošiami ir saugojami tolesniems tyrimams. Poliarografo prieţiūra ir kalibravimas, pagal gamintojo nurodytas rekomendacijas, taip pat gali įtakoti rezultatus [38].

2.6.1. Poliarografo veikimo bendrieji principai

Poliarografas yra naudojamas mitochondrijų kvėpavimo greičiui registruoti biocheminiuose tirpaluose [42]. Matavimo sistemą sudaro šios pagrindinės dalys (4 pav.): 1) deguonies koncentracijos poliarografinis jutiklis 2) analitinis blokas 3) maitinimo blokas 4) kompiuteris [42].

4 pav. Matavimo sistemos, mitochondrijų kvėpavimo greičiui įvertinti, struktūrinė schema [42]

Sukalibravus poliarografą, matavimo terpė, naudojantis pipete, yra įvedama į kiuvetę. Vėliau, per kapiliarinę skylutę, mikrošvirkšto pagalba yra įvedami substratai, mitochondrijos, ADP, citochromas C ir kiti priedai. [38]. Kaip matome (4 pav.), kiuvetėje yra deguonies koncentracijos jutiklis, kuris reaguoja į deguonies kiekio pokyčius. Kiuvetės dugne yra įtaisyta besisukanti magnetinė maišyklė, kuri nuolat maišo joje esantį turinį. Termostatas palaiko pastovią, kiuvetėje esančio turinio, temperatūrą. Analoginis blokas yra sujungtas su kiuvete. Jis reaguoja į dedamus priedus ir verčia analoginį signalą skaitmeniniu, kuris yra siunčiamas į kompiuterį. Kompiuterio ekrane matoma kreivė, kurioje yra matomi mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai, pridėjus atitinkamą priedą.

2.6.2. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas

Mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčius, atsispindinčius kreivėse, būtina sugebėti tinkamai vertinti ir analizuoti, nes nuo to gali priklausyti gautų rezultatų tikslumas ir teisingumas. Abscisių ašyje yra ţymimas laikas (s), tuo tarpu ordinačių ašyje ţymimas deguonies kiekis kiuvetėje. Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreiškiamas nmolO/min vienam mg mitochondrijų baltymo.

5 pav. Tipinė kvėpavimo greičio registravimo kreivė [38]

Siekiant geriau suprasti šią kreivę (5 pav.), pateikiamas išsamus jos paaiškinimas. Deguonies koncentracija uţdaroje kiuvetėje yra nuolat stebima, o efektai, pridėjus tam tikrus priedus, registruojami [38]. Antroji mitochondrijų metabolinė būsena (V2)) yra stebima tada, kai į kiuvetę su

izotonine matavimo terpe įvedami substratai (glutamatas 5 mM /malatas 5 mM arba sukcinatas 15 mM, esant amitaliui 2 mM) ir apskaičiuotas mitochondrijų suspensijos kiekis (0,5 mg/ml). Šioje terpėje yra ištirpusio deguonies ir neorganinių fostatų, tačiau nėra ADP ir kvėpavimo grandinės substratų [41]. Šios būsenos metu mitochondrijų kvėpavimo greitis paprastai yra nedidelis. Maţą mitochondrijų kvėpavimo greitį apsprendţia vidinės membranos laidumas protonams. Kreivei nusitovėjus, pridedame 1 mM ADP, stebimas staigus šuolis. Mitochondrijos pereina į trečiają metabolinę būseną (VADP).

Trečioji kvėpavimo būsena - tai yra maksimalus mitochondrijų kvėpavimo greitis esant ADP ir substratų pertekliui. Oksidacinis fosforilinimas vyksta pilnu pajėgumu, mitochondrijos intensyviai kvėpuoja. Siekdami įvertinti išorinės mitochondrijų membranos paţeidimą, pridedame citochromo C

V2 Mitochondrijos ir substratai VADP VADP +cyt c VAtr De gu on ies k on ce n tr ac ij a, n m ol O V2 Mitochondrijos ir substratai VADP VADP + cyt c VAtr

32 µm. Jei šioje būsenoje, stebimas ţymus mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas, galima įtarti mitochondrijų išorinės membranos paţeidimą. Mitochondrijos, kurių išorinė membrana yra sveika, yra nepralaidţios išoriniam citochromui C. Šie paţeidimai gali atsirasti per ilgo homogenizavimo proceso metu, taip pat dėl išemijos poveikio. Pridėjus inhibitoriaus atraktilozido 0,12 mM, trečioji mitochondrijų metabolinė būsena pereina į ketvirtąja (VAtr). Atraktilozidas, yra ADP/ATP

nešiklio inhibitorius, kuris blokuoja ADP patekimą. Dėl šios prieţasties, kreivėje stebimas staigus mitochondrijų kvėpavimo greičio sumaţėjimas.

Labai svarbus rodiklis, kuris gali būti apskaičiuojamas ţinant mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje (V2) ir trečioje (VADP) metabolinėje būsenoje, yra kvėpavimo kontrolės koeficientas.

Kvėpavimo kontrolės koeficientas parodo mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo pajėgumą t.y. gebėjimą sintetinti ATP molekules.

Kvėpavimo kontrolės koeficientas yra apskaičiuojamas pagal šią formulę:

2 , var , var V V ADP nesant greitis tojimo su Deguonies ADP esant greitis tojimo su Deguonies KKK   ADP , [43]

Kuo didesnė šio koeficiento reikšmė, tuo geresnė išskirtų mitochondrijų funkcinė būklė. Šio koeficiento sumaţėjimas signalizuoja apie reikšmingus oksidacinio fosforilinimo mechanizmo sutrikimus [43].

2.7. Mitochondrijų I komplekso (NADH dehidrogenazės) aktyvumo įvertinimas

spektrofotometriniu būdu

Kvėpavimo grandinės fermentų spektrofotometrinė analizė yra klasikinis metodas mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui įvertinti [38]. Tai yra greitas, patogus ir gana daţnai naudojamas metodas [49]. Siekiant įvertinti mitochondrijų I komplekso aktyvumą, pradţioje būtina suardyti mitochondrijų membranas, tam kad viduje esantys fermentai išsilaisvintų [38]. Tai yra atliekama inkstų mitochondrijų suspensiją keletą kartų staigiai atšaldant ir atšildant [47]. Vėliau ši suspensija tiriama spektrofotometru, esant 340 nm bangos ilgiui [49]. Esminis kriterijus, į kurį kreipiamas dėmesys, yra NADH koncentracijos maţėjimo greitis. Pagal koncentracijos maţėjimo greitį, galima spręsti apie I komplekso aktyvumą. Į matavimo buferį (KH

dedamas kofermentas Q (100 μM), antimicinas A (1 μg/mL), suardytos inkstų mitochondrijos (0,07 mg/mL). Reakcija pradeda vykti pridėjus NADH (0,1 mM) [56]. Galiausiai yra pridedama 10 μM rotenono, kuris slopina I kompleksą, ir yra registruojamas rotenonui jautrus greitis. Specifinis I komplekso aktyvumas yra išreiškiamas nmol/min/mg mitochondrijų baltymo [48]. I komplekso aktyvumas (rotenonui jautrus) yra apskaičiuojamas pagal šią formulę:

, 106      m V t A aktyvumas 

kur ΔA – šviesos sugerties pokytis; Δt – laiko pokytis; ε – molinis sugerties koeficientas (ε

340 = 6,22

mM-1cm-1); V – tiriamojo tirpalo tūris (1 mL); m – mitochondrijų baltymo kiekis 0,07 mg).

2.8. Statistinė duomenų analizė

Rezultatų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Skirtumai tarp vidurkių statistiškai reikšmingi, jei p < 0,05. Statistinė analizė buvo atliekama naudojant SigmaPlot programą.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Atlikus nuoseklų ir sisteminį tyrimą, gauti rezultatai, rodantys skirtingos trukmės išemijos poveikį mitochondrijų funkcijoms. Tyrimo metu vertinome šiuos parametrus: mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje (V2), trečioje (VADP), ketvirtoje (VAtr) metabolinėse būsenose. Mitochondrijų

funkcinei kokybei įvertinti buvo apskaičiuotas mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK). Išorinės membranos paţeidimą nustatėme pagal citochromo C efektą. Taip pat įvertinome išemijos sukeltą mitochondrijų vidinės membranos paţaidos laipsnį. Išemijos poveikį mitochondrijų kvėpavimui ištyrėme oksiduojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso substratą glutamatą/malatą (NAD- specifinis) ir II komplekso substratą sukcinatą (FAD- specifinis).

3.1. Išemijos in vitro poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams

įvertinimas

Siekdami atrinkti sąlygas išemijos modeliui (37°C) in vivo, eksperimentiniu keliu parinkome skirtingą išemijos trukmę – 20, 40, 60 minučių. Šis in vivo išemijos modelis buvo pritaikytas tolimesniuose tyrimuose, kurių metu buvo ieškoma biologiškai aktyvių medţiagų, gebančių apsaugoti mitochondrijas nuo išeminės paţaidos.

6 pav. yra pateikti tyrimų rezultatai, mitochondrijoms oksiduojant kvėpavimo grandinės I komplekso substratą glutamatą/malatą. Rezultatai parodė, kad mitochondrijų paţaida išryškėja labai anksti - jau po 20 minučių. ADP stimuliuotas mitochondrijų kvėpavimo greitis (VADP) statistiškai

patikimai (lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis) slopinamas net 52 %. Po 40 minučių išemijos šis greitis statistiškai reikšmingai slopinamas dar labiau, t.y. 62 %, lyginant su kontroline grupe. Didţiausias mitochondrijų kvėpavimo greičio sumaţėjimas nustatytas po 60 minučių išemijos (76 %). Mitochondrijų kvėpavimo greitis nei antroje (V2), nei ketvirtoje (VAtr) metabolinėse būsenose

skirtingos trukmės išemijos metu, oksiduojant glutamatą/malatą, statistiškai reikšmingai nesikeitė. Citochromas C neţymiai (7-11 %), nors ir statistiškai nereikšmingai, padidino mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje (VADP), tačiau neatstatė mitochondrijų kvėpavimo

greičio iki kontrolinio lygio. Taigi viena iš mitochondrijų kvėpavimo sulėtėjimo, trečioje metabolinėje būsenoje, prieţasčių gali būti mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso paţaida.

6 pav. Išemijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams, oksiduojant substratą

glutamatą/malatą

V2 – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 4,9 mM

glutamato ir 4.9 mM malato. VADP – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje,

pridėjus 1 mM ADP. V

ADP + Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje,

pridėjus 32 μM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido.

* – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe, # – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 minučių išemija, p<0,05; n = 4–6.

Tiriant išemijos poveikį mitochondrijų kvėpavimo grandinės II komplekso sukcinato oksidacijai (7 pav.), nustatytas mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje sulėtėjimas. Po 20, 40 ir 60 minučių išemijos mitochondrijų kvėpavimo greitis sumaţėjo 44 %, 56 % ir 55 %, atitinkamai, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Be to, stebimas ryškus mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje padidėjimas pridėjus citochromo C. Po 20 minučių išemijos jis padidėja 32 %, o po 40 minučių ir 60 minučių išemijos, atitinkamai 81 % ir 80 %. Tai rodo akivaizdų mitochondrijų išorinės membranos paţeidimą (ir citochromo C praradimą) išemijos metu. Citochromo C efektas didėja, ilgėjant išemijos trukmei. Tai ypač išryškėja oksiduojant sukcinatą. Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, po 60 minučių išemijos, padidėjo 12 %, nors šis skirtumas ir nebuvo patikimas. Mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje (įdėjus ADP/ATP nešiklio inhibitoriaus) ir esant terpėje citochromo C, išemijos poveikyje buvo 45 % - 55 % didesnis nei kontrolėje. Taigi išemijos metu stebimas išorinės mitochondrijų membranos pralaidumo padidėjimas.

k vė p avim o gr eit is , n m olO /m in /m g * * * * * *, # *, #

7 pav. Išemijos poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams, oksiduojant substratą

sukcinatą

V2 – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 15 mM

sukcinato. VADP – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM

ADP. V

ADP + Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 32 μM

citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12

mM atraktilozido.

* – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe, # – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 minučių išemija, ** – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 40 minučių išemija, p<0,05; n = 4–6.

Kadangi išemijos metu širdies, kepenų ir kitų organų mitochondrijose stebima išorinės membranos paţaida [58], ištyrėme inkstų mitochondrijų išorinės membranos paţaidos laipsnį. Tam pritaikėme klasikinį citochromo C testą. Jei mitochondrijų membrana yra nepaţeista, ji yra nepralaidi citochromui C [23]. Paţeidus ją (įvairių patologinių procesų metu), citochromas C gali išeiti iš mitochondrijų. Pridėjus į terpę egzogeninio citochromo C, jis dalyvauja mitochondrijų kvėpavimo grandinėje kaip elektronų nešiklis, todėl mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėja. Kaip substratą naudojant glutamatą/malatą, citochromo C pridėjimas, mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje padidino 9 % -13 % (1 lentelė). Oksiduojant sukcinatą, pastebėtas statistiškai reikšmingas kvėpavimo stimuliavimas lyginant ne tik su kontrole, bet ir trumpesnės išemijos grupėmis. Po 20 minučių išemijos, inkstų audinyje yra mitochondrijų su paţeista išorine membrana. Po 40 minučių išemijos, išorinės mitochondrijų membranos pralaidumas padidėjo net 81 % lyginant su kontrole, o po 60 minučių net 85 %. Citochromo C efektas didėjo ilginant išemijos trukmę. Duomenys rodo, kad oksiduojant FAD– specifinį substratą sukcinatą, stebimas didesnis mitochondrijų vidinės membranos paţeidimas nei oksiduojant NAD- specifinį substratą glutamatą/malatą. Tai patvirtina ir

k vė p avim o gr eit is , n m olO /m in /m g * * * * * * *, # *, #

ankstesni mokslininkų darbai [22]. Įvertinant išorinės membranos paţaidą ir citochromo C išėjimą, galime teigti, kad tyrimus geriau atlikti su sukcinatu.

1 lentelė. Išemijos poveikis mitochondrijų išorinės membranos pralaidumui (citochromo c efektas)

Citochromo C efektas Glu+Mal Succ Kontrolinė grupė 0.98 ± 0.02 1.08 ± 0.04 20 minučių išemija 1.07 ± 0.04 1.33±0.06*,** 40 minučių išemija 1.12 ± 0.06 1.89±0.24*,# 60 minučių išemija 1.11 ±0.17 1.85±0.13*,#

* – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe, # – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 minučių išemija, ** – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 40 minučių išemija, p<0,05; n = 4–6. Duomenys palyginti naudojant SigmaPlot programą.

Citochromo c efektas (kartais) apskaičiuotas pagal mitochondrijų kvėpavimo greičio (V

ADP)

padidėjimą (kartais) pridėjus į terpę egzogeninio citochromo c, t.y. citochromo c efektas = V

ADP+cyt c/VADP

Tyrimų metu taip pat vertinome ne tik kontrolinių, bet ir išemijos paţeistų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą (KKK). Tai yra svarbus rodiklis, pagal kurį galima spręsti apie mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesų apjungimą [44], mitochondrijų funkcinę būklę.

Išemijos (20, 40, 60 minučių) poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientui, pateiktas 2 lentelėje. Oksiduojant glutamatą/malatą, mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas po 20 minučių išemijos statistiškai reikšmingai sumaţėjo net 57 % (t.y. 2,3 karto) lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis (nuo 4,64 ± 0,62 kontrolinėse mitochondrijose iki 1,98 ± 0,25). Prailginus išemijos trukmę (iki 40 ir 60 minučių), kvėpavimo kontrolės koeficientai sumaţėjo 70 % ir 76 %, atitinkamai. Substratu naudojant sukcinatą, mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas sumaţėja statistiškai reikšmingai t.y. 43 %, 55 %, 60 % (po 20, 40, 60 minučių išemijos, atitinkamai), lyginant su kontrole. Svarbu paminėti, jog akivaizdi mitochondrijų paţaida stebima jau po 20 minučių išemijos t.y. ankstyvosios išemijos metu. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficiento pokyčiai yra dėl maksimalaus (t.y. VADP) kvėpavimo greičio sulėtejimo, kuris gali būti dėl kvėpavimo grandinės

arba fosforilinimo posistemės paţaidų. Akivaizdu, jog ilginant išemijos trukmę, mitochondrijų paţaida didėja. Taigi, eksperimentiniai duomenys rodo, kad išemijai jautriausias oksidacinio fosforilinimo greitis. Šio greičio sumaţėjimas rodo oksidacinio fosforilinimo sistemos paţaidą, kuri gali būti dėl mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentų, išorinės membranos pralaidumo padidėjimo.

2 lentelė. Išemijos poveikis inkstų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams

Kvėpavimo kontrolės koeficientas

Glu+Mal Succ Kontrolinė grupė 4.64 ± 0.62 2.70 ± 0.21 20 minučių išemija 1.98 ± 0.25* 1.55 ±0.05* 40 minučių išemija 1.41 ± 0.12* 1.22 ±0.03*,# 60 minučių išemija 1.12 ± 0.12*,# _{1.09 ±0.03*,}# ,** * – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe,

# – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 20 minučių išemija, ** – statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su 40 minučių išemija, p<0,05; n = 4–6.

3.2. Išemijos ir reperfuzijos in vivo poveikio ţiurkės inkstų mitochondrijų

kvėpavimo greičiams įvertinimas

Siekdami įvertinti išemijos ir reperfuzijos poveikį ţiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiui, pasirinkome tam tikrą išemijos/reperfuzijos in vivo modelį. Pritaikius šį modelį, inkstų išemijos trukmė buvo 60 minučių, po kurios sekė 30 minučių reperfuzija

Mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai, oksiduojant substratą glutamatą/malatą, pateikti 8 pav. Inkstų audinių mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, patyrus tiek 60 minučių išemiją, tiek 30 minučių reperfuziją buvo panašus kaip ir kontrolinėse mitochondrijose. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje po 60 minučių išemijos sumaţėjo net 71 % lyginant su kontroline grupe. Po 30 minučių reperfuzijos, padidėjo statistiškai reikšmingai (64 %) lyginant su 60 minučių išemija, tačiau nepasiekė kontrolinių mitochondrijų kvėpavimo greičio. Citochromo C pridėjimas nesukėlė jokių reikšmingų pokyčių kontrolinėje grupėje. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana yra nepaţeista. Tačiau po 60 minučių išemijos, citochromo C efektas padidėja statistiškai reikšmingai t.y. net 41 %. Iš to galime spręsti apie neigiamą išemijos poveikį išorinės membranos pralaidumui ir mitochondrijų kvėpavimo greičiui. Mitochondrijų kvėpavimas ketvirtoje metabolinėje būsenoje (t.y. po atraktilozido pridėjimo) nepadidėjo nei po 60 minučių išemijos, nei po 60 minučių išemijos/30 minučių reperfuzijos, lyginant su kontrole. Tai rodo, kad šis modelis neturi poveikio mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo padidėjimui.