IL LABORATORIO NELLE MALATTIE RENALI: IL LABORATORIO NELLE MALATTIE RENALI: proteine urinarie proteine urinarie

(1)

IL LABORATORIO NELLE MALATTIE RENALI:

proteine urinarie

(2)

Fisiologia del rene

(3)

1200 ml/min 540 ml cellule 660 ml plasma

70 mm Hg

1080 ml/min 540 ml cellule 540 ml plasma Acqua e sali

tendono ad uscire ma si oppongono la retropressione delle proteine e della capsula

= 35 mm Hg.

Circa 120 ml/min vengono filtrati

Fisiologia del rene

(4)

Le urine definitive sono il risultato Le urine definitive sono il risultato

dell’ultrafiltrazione glomerulare e dell’ultrafiltrazione glomerulare e

del riassorbimento tubulare

(5)

COSTITUENTI NORMALI DELLE URINE

Urea Creatinina Acido urico Aminoacidi Ammonio Creatina

Minerali (Na, Cl, K, P, S, Ca etc)

(6)

L’Uroscopia, osservazione ad occhio nudo dell’urina, rappresenta il più antico

esame clinico di cui si sia mantenuto il ricordo storico.

Da questa memoria storica si deve

partire per valorizzare l’osservazione

attenta ed intelligente degli studiosi del

passato.

(7)

Le prime informazioni sull’uroscopia Le prime informazioni sull’uroscopia

sono contenute nei papiri egiziani sono contenute nei papiri egiziani

L’aspetto dell’urina viene L’aspetto dell’urina viene

descritto come:

 _bianca _bianca

 _nebulosa _nebulosa

 _schiumosa _schiumosa

 _fangosa _fangosa

 _nera _nera

 _grassa _grassa

(8)

Pitagora

Pitagora (571-497 a.C.) (571-497 a.C.)

Sono tre i liquidi che Sono tre i liquidi che

costituiscono il corpo:

 _{Il sangue} _{Il sangue}

 I vapori (respiro) I vapori (respiro)

 _L’urina _L’urina

(9)

Nell’XI secolo Isacco Ebreo, figlio adottivo di Nell’XI secolo Isacco Ebreo, figlio adottivo di Salomone, re d’Arabia, medico del governatore Salomone, re d’Arabia, medico del governatore

della Tunisia, descrive le caratteristiche del della Tunisia, descrive le caratteristiche del contenitore ideale per l’osservazione dell’urina contenitore ideale per l’osservazione dell’urina

La Matula La Matula

“ “ ha la forma della vescica, è fatta di vetro ha la forma della vescica, è fatta di vetro bianco, sottile, chiaro, molto trasparente, bianco, sottile, chiaro, molto trasparente,

meglio se di cristallo o vetro di Venezia”

(10)

La Matula divenne presto il simbolo del La Matula divenne presto il simbolo del

medico nel Medioevo

(11)

Con la nascita della Biochimica, dal 1860, le Con la nascita della Biochimica, dal 1860, le

scuole di

scuole di Justus von Liebig Justus von Liebig (1803-1873) in (1803-1873) in Germania e di

Germania e di Claude Bernard Claude Bernard (1813-1878) in (1813-1878) in Francia, sviluppano l’esame chimico delle urine Francia, sviluppano l’esame chimico delle urine

nella diagnosi delle malattie.

(12)

Lo studio microscopico del sedimento viene Lo studio microscopico del sedimento viene

descritto da

descritto da Rayer Rayer (1793-1867). (1793-1867).

La ricerca dei microbi nelle urine da La ricerca dei microbi nelle urine da Weighert

Weighert nel 1871 e da nel 1871 e da Sédillot Sédillot nel 1878. nel 1878.

Lo studio dei batteri viene definito dai lavori Lo studio dei batteri viene definito dai lavori

di di Louis Pasteur Louis Pasteur (1822-1895) e del premio (1822-1895) e del premio Nobel

Nobel Robert Koch Robert Koch (1843-1910) (1843-1910)

(13)

(14)

E' un esame sottovalutato, tuttavia un corretto esame urine puo' fornire al nefrologo una quantità notevole di informazioni molto superiore, nella

maggior parte dei casi, ad esami più blasonati come la TAC o la risonanza.

“ l’esame delle urine (eseguito correttamente) è una biopsia liquida” (Bradley).

Perche' abbia il valore che merita l'esame urine

deve essere effettuato secondo canoni ben precisi:

esistono delle Linee Guida Internazionali

(15)

INDICAZIONI ALL’ESAME URINE INDICAZIONI ALL’ESAME URINE

 Infezioni vie urinarie Infezioni vie urinarie

 _Nefropatie _Nefropatie

 Uropatia ostruttiva Uropatia ostruttiva

 _Glicosuria _Glicosuria

 Diabete mellito ( pz selezionati) Diabete mellito ( pz selezionati)

 Disturbi metabolici (vomito, diarrea) Disturbi metabolici (vomito, diarrea)

 Nefrolitiasi Nefrolitiasi

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INFLUENZATO DA:

 INTENSI STRESS FISICI INTENSI STRESS FISICI

 CICLO MESTRUALE CICLO MESTRUALE

 TERAPIA IDROPINICA O DIURETICA TERAPIA IDROPINICA O DIURETICA

 _FEBBRE _FEBBRE

 ASSUNZIONE DI SOSTANZE RICCHE DI ASSUNZIONE DI SOSTANZE RICCHE DI VIT. C

VIT. C

 TERAPIA CON CEFALOSPORINE TERAPIA CON CEFALOSPORINE

 ASSUNZIONE DI ALIMENTI RICCHI DI ASSUNZIONE DI ALIMENTI RICCHI DI ARGININA

ARGININA

(17)

ESAME DELLE URINE:

QUALE CAMPIONE?

ES. CHIMICO-FISICO:

I CAMPIONE DEL MATTINO ES. MICROSCOPICO:

II CAMPIONE DEL MATTINO

(18)

ESAME DELLE URINE: COME ESAME DELLE URINE: COME

 LAVARE LE MANI E SCIACQUARE LAVARE LE MANI E SCIACQUARE

 LAVARE I GENITALI CON SAPONE LAVARE I GENITALI CON SAPONE

 SCIACQUARE ABBONDANTEMENTE CON SCIACQUARE ABBONDANTEMENTE CON ACQUA CORRENTE

ACQUA CORRENTE

 ASCIUGARE CON MATERIALE STERILE ASCIUGARE CON MATERIALE STERILE

 RACCOGLIERE IL MITTO INTERMEDIO RACCOGLIERE IL MITTO INTERMEDIO

 USARE RACCOGLITORE STERILE USARE RACCOGLITORE STERILE

(19)

(20)

ESAME DELLE URINE:

PARAMETRI FISICI PARAMETRI FISICI

 _ASPETTO _ASPETTO (Pus, Grassi, Batteri, Fosfati Urati amorfi) (Pus, Grassi, Batteri, Fosfati Urati amorfi)

 _COLORE _COLORE

 _ODORE _ODORE

 _DENSITA’ _DENSITA’

(21)

CO LO RE UR INE

(22)

Colore delle urine Colore delle urine

 Giallo intenso o arancione Giallo intenso o arancione : urobilina, bilirubina, farmaci. : urobilina, bilirubina, farmaci.

 Rosso o rossastro Rosso o rossastro : stati febbrili, ematuria, emoglobinuria, : stati febbrili, ematuria, emoglobinuria, mioglobinuria, porfiria, cardiopatia scompensata, farmaci mioglobinuria, porfiria, cardiopatia scompensata, farmaci antipiretici, alimenti (carota rossa), flussi mestruali.

antipiretici, alimenti (carota rossa), flussi mestruali.

 Verde o verdastro Verde o verdastro : itteri intensi (presenza di biliverdina), : itteri intensi (presenza di biliverdina), intossicazione da acido fenico, farmaci (sulfamidici,

intossicazione da acido fenico, farmaci (sulfamidici, resorcina, acido salicilico).

resorcina, acido salicilico).

 Scuro o nero Scuro o nero : emoglobinurie, melanuria, alcaptonuria (acido : emoglobinurie, melanuria, alcaptonuria (acido omogentisinico, metabolita della fenilalanina), porfirinuria omogentisinico, metabolita della fenilalanina), porfirinuria (porfiria, iperbilirubinemia essenziale).

(porfiria, iperbilirubinemia essenziale).

 Blu o azzurro Blu o azzurro : blu di metilene, azzurro d’indaco. : blu di metilene, azzurro d’indaco.

(23)

ODORE sui generis

• PUNGENTE

• DOLCE - FRUTTATO

• SCIROPPO D’ACERO

• DI TOPO

(24)

Odore delle urine subito dopo la Odore delle urine subito dopo la

minzione minzione

Odore sgradevole per la presenza di : Odore sgradevole per la presenza di :

 Germi che scindono l’urea Germi che scindono l’urea ( ( odore ammoniacale odore ammoniacale ) )

 Piuria da Escherichia Coli Piuria da Escherichia Coli ( ( idrogeno solforato idrogeno solforato ) )

 Neoplasie, Raccolte ematiche Neoplasie, Raccolte ematiche ( ( odore putrido odore putrido ) )

 Diabete,chetosi infanzia Diabete,chetosi infanzia ( ( odore fruttato,acre odore fruttato,acre ) )

 _Acetonuria _Acetonuria ₍ ₍ odore aromatico,rancido odore aromatico,rancido ) )

 Alimenti o medicamenti Alimenti o medicamenti ( ( odore particolare odore particolare ) )

(25)

DENSITA’

La densità (peso specifico) varia in rapporto alla

capacità del rene di mantenere l'omeostasi dei liquidi e degli elettroliti.

Essa aumenta nell’ipersecrezione di ADH, nel diabete mellito scompensato, nell’ipoperfusione renale, nella

glomerulonefrite, a causa di ostruzione delle vie urinarie ed in seguito ad assunzione di diuretici.

È diminuita nell'insufficienza renale cronica, nella tubulopatia renale, nel diabete insipido nefrogenico.

In condizioni fisiologiche il peso specifico (PS) varia da

1007 a 1030 ( normostenuria ); quando il PS è minore di

1007 si definiscono urine ipostenuriche o ipotoniche .

(26)

ESAME DELLE URINE:

PARAMETRI CHIMICI (I) PARAMETRI CHIMICI (I)

 _pH _pH

 _BILIRUBINA _BILIRUBINA

 UROBILINOGENO UROBILINOGENO

 _CHETONI _CHETONI

 _GLUCOSIO _GLUCOSIO

(27)

pH pH

Indicatore della qualità del campione v.n.4.5-8

Striscia reattiva

(rosso metile blu di bromotrimolo)

“Phmetro”

Colorimetro

(28)

In condizioni normali è acido (tra 4,5 e 7) In condizioni normali è acido (tra 4,5 e 7)

Variazioni verso l’

Variazioni verso l’ acidità acidità : :

 Nel digiuno per la produzione di Ac. fosforico dal Nel digiuno per la produzione di Ac. fosforico dal catabolismo delle proteine endogene

catabolismo delle proteine endogene

 Nelle diete ricche di proteine e grassi Nelle diete ricche di proteine e grassi

 Nell’esercizio muscolare intenso Nell’esercizio muscolare intenso

 Nella gotta, emopatie, uso di farmaci uricosurici (per Nella gotta, emopatie, uso di farmaci uricosurici (per l’eliminazione abnorme di urati)

l’eliminazione abnorme di urati)

 Nella somministrazione di farmaci acidificanti Nella somministrazione di farmaci acidificanti

(29)

Variazioni verso l’

Variazioni verso l’ alcalinità alcalinità : :

 Dopo il risveglio per aumento della ventilazione polmonare Dopo il risveglio per aumento della ventilazione polmonare

 Dopo i pasti per variazione della ventilazione Dopo i pasti per variazione della ventilazione

 Nelle diete vegetariane Nelle diete vegetariane

 Nell’alcalosi metabolica Nell’alcalosi metabolica

 Nella fosfaturia Nella fosfaturia

 Uso di farmaci alcalinizzanti Uso di farmaci alcalinizzanti

 Urine infette da germi ureasi-positivi che producono NH Urine infette da germi ureasi-positivi che producono NH

3₃

 Insufficienza renale cronica Insufficienza renale cronica

 Deficit tubulare primitivo (Sindrome di De Toni) Deficit tubulare primitivo (Sindrome di De Toni)

 Deficit tubulare secondario (Pielonefriti, trapianto di Deficit tubulare secondario (Pielonefriti, trapianto di rene)

rene)

(30)

BILIRUBINA BILIRUBINA

La bilirubina è una sostanza di colore giallo-rosso e rappresenta il prodotto di degradazione dell'emoglobina.

E’il principale pigmento presente nella bile. In presenza di bilirubina le urine assumono colore marsala scuro.

Normalmente la bilirubina è presente nell’urina, in piccolissima quantità (0,02 mg/100ml).

Una sua presenza potrebbe essere causata da anemia emolitica, da anemia perniciosa, da avvelenamento da arsenico, fosforo e piombo, da carcinoma del pancreas, da calcoli delle vie biliari, da cirrosi epatica, da infiammazione delle vie biliari all’interno del fegato (colangite), da ittero ostruttivo, da epatite acuta virale, da malattia infettiva di breve durata e di gravità variabile,

provocata da un virus trasmesso dalle zanzare (febbre gialla), da

ipotermia, da malaria, da sepsi, da talassemia.

(31)

L’urobilina e l’urobilinogeno (pigmenti biliari) sono prodotti di trasformazione, per mezzo dei batteri intestinali.

Normalmente queste due sostanze non dovrebbero essere presenti nelle urine se non in piccolissima

quantità (0,5-2,5 mg nelle urine raccolte nell’arco delle 24 ore).

Il loro aumento indica epatopatie (virali, acute e

croniche, tossiche, cirrosi, neoplasie), anemia emolitica o un'ostruzione delle vie biliari.

Le urine con eccesso di urobilina presentano color giallo-marrone e non formano schiuma.

Un’assenza di pigmenti biliari si osserva negli itteri

ostruttivi completi.

(32)

I chetoni sono dei composti chimici, formati dalla

degradazione di altri composti chimici (acidi grassi) e ciò succede quando l’organismo non ha più una

quantità sufficiente di zuccheri.

Normalmente i chetoni sono assenti nell’urina.

Una loro presenza può essere determinata da

alterazione del metabolismo dei lipidi, da diabete

mellito di tipo I scompensato, da epatiti croniche, da gravidanza, da iponutrizione (sottonutrizione), da

esposizione al freddo, da stress, da vomito gravidico, dopo anestesia, da glicogenosi, da sforzi fisici

prolungati, da stati febbrili tossici, accompagnati da

vomito e diarrea nei bambini.

(33)

Normalmente nelle urine il glucoso deve essere assente.

Una sua presenza indica generalmente tubulopatie, glicosuria renale semplice, fruttosuria, galattosuria, lattosuria, pentosuria.

Un aumento del glucosio nelle urine, concomitante con un aumento della glicemia nel sangue, potrebbe essere indice di diabete mellito, acromegalia, sindrome di

Cushing, ipertiroidismo, feocromocitoma, pancreatite cronica avanzata, neoplasia pancreatica, fibrosi cistica avanzata, emocromatosi, asfissia, tumore o emorragia cerebrale (ipotalamo), ustioni estese, uremia, sepsi, insufficienza epatica grave, shock cardiogeno,

assunzione di corticosteroidi, ACTH, diuretici tiazidici,

estroprogestinici.

(34)

ESAME DELLE URINE:

PARAMETRI CHIMICI (II) PARAMETRI CHIMICI (II)

 PROTEINE (ALBUMINA) PROTEINE (ALBUMINA)

 _EMOGLOBINA _EMOGLOBINA

 ESTERASI LEUCOCITARIA ESTERASI LEUCOCITARIA

 _NITRITI _NITRITI

(35)

PROTEINE

Normalmente assenti.

La loro occasionale presenza potrebbe essere dovuta a diverse situazioni non preoccupanti come sforzi

fisici, malattie febbrili, colpi di calore.

Una loro presenza significativa può essere determinata da anemia, da amiloidosi, da

avvelenamento da arsenico, bismuto e mercurio, da cistite, da diabete mellito, da glomerulonefrite, da gotta, da gravidanza, da mieloma multiplo, da

pielonefrite, da sindrome nefrosica, da shock, da malattie vascolari (ipertensione, scompenso

cardiaco).

Buona specificità, scarsa sensibilità

(36)

Emoglobina

La presenza nelle urine di emoglobina in

soluzione, normalmente assente, può essere causata da: infarto renale, protesi valvolare cardiaca, farmaci (fenacetina, chinino,

arsenico, ecc.), trasfusioni di sangue di

gruppo incompatibile, ustioni estese, anemia emolitica autoimmune, emoglobinuria

parossistica notturna, favismo, malaria,

setticemia da Bacillus perfigens , Escherichia coli , CID ( coagulazione intravascolare

disseminata ).

(37)

La presenza di leucociti nelle urine, è rilevata dall’attività della

Esterasi Leucocitaria.

Campioni di urine non patologiche danno normalmente risultati negativi.

Il primo grado di positività corrisponde all'incirca alla presenza di 5-10 cellule/campo a forte ingrandimento in urine sedimentate.

L'attendibilità di questo test è unanimemente accettata, tuttavia nelle diverse pubblicazioni vengono riportati valori variabili di sensibilità e di specificità .

Falsi positivi si possono riscontrare nelle femmine per contaminazione del campione con secrezioni vaginali.

In presenza di Trichomonas, in genere accompagnato da

leucocituria, il viraggio cromatico è accentuato probabilmente a

causa di un'aumentata leucocitolisi.

(38)

La presenza di Nitriti nelle urine è indice di infezioni delle vie urinarie.

Il test si basa sulla capacità di alcuni batteri di ridurre i nitrati a nitriti.

La positività è indice di batteriuria (E. coli,

Proteus, Klebsiella, Pseudomonas, Stafilococco, Enterococco, ecc.).

La negatività non esclude un'infezione

(possibile infezione da germi che non riducono i

nitrati a nitriti).

(39)

Costituenti abnormi Costituenti abnormi



_Glucosio_Glucosio: diabete mellito, diabete renale (per difetto enzimatico nel : diabete mellito, diabete renale (per difetto enzimatico nel riassorbimento del glucosio a livello del tubulo prossimale), uso

riassorbimento del glucosio a livello del tubulo prossimale), uso protratto di steroidi.

protratto di steroidi.



Urobilina_Urobilina: negli itteri primitivi e secondari: negli itteri primitivi e secondari



_Emoglobina_Emoglobina: anemie emolitiche, favismo, emoglobinurie parossistiche : anemie emolitiche, favismo, emoglobinurie parossistiche (notturna, a frigore)

(notturna, a frigore)



Esterasi leucocitariaEsterasi leucocitaria: leucociti, infezione (500 n/ul urino-coltura : leucociti, infezione (500 n/ul urino-coltura per T.I.)

per T.I.)



_Proteine_Proteine > 150 mg/dl> 150 mg/dl

(40)

SEDIMENTO …

… TI AMO

(41)

IL MICROSCOPIO PER I IL MICROSCOPIO PER I

SEDIMENTI URINARI SEDIMENTI URINARI

* Basso ingrandimento (160x) Basso ingrandimento (160x)

* Alto ingrandimento (400x) Alto ingrandimento (400x)

* Contrasto di fase Contrasto di fase

* Luce polarizzata per casi Luce polarizzata per casi selezionati

selezionati

(42)

GLI ELEMENTI GLI ELEMENTI

DEL SEDIMENTO DEL SEDIMENTO

URINARIO

(43)

GLI ELEMENTI DEL SEDIMENTO GLI ELEMENTI DEL SEDIMENTO

URINARIO URINARIO

 _Cellule _Cellule

 _Lipidi _Lipidi

 _Cilindri _Cilindri

 _Cristalli _Cristalli

 Micro-organismi Micro-organismi

 Contaminanti Contaminanti

(44)

ERYTHROCYTES ERYTHROCYTES

 A frequent finding A frequent finding

(53% of samples in our lab) (53% of samples in our lab)

 Two main types: Two main types:

glomerular and non glomerular

(45)

GLOMERULAR OR DYSMORPHIC ERYTHROCYTES

(46)

NON GLOMERULAR OR ISOMORPHIC ERYTHROCYTES

(47)

LEUKOCYTES LEUKOCYTES

Types Types

Source Source

Clinical meaning Clinical meaning

More often PMNs (but also More often PMNs (but also

eosinophils and lymphocytes) eosinophils and lymphocytes)

For PMNs, any segment of For PMNs, any segment of

the urinary tract the urinary tract

(without forgetting genital (without forgetting genital

contamination) contamination)

Inflammation of whatever Inflammation of whatever

cause including immunological cause including immunological

disorders (eg, glomerular disorders (eg, glomerular

diseases)

(48)

POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES

(49)

TUBULAR CELLS TUBULAR CELLS

Acute tubular Acute tubular

necrosis necrosis

Clinical

Clinical Acute interstitial Acute interstitial

meaning

meaning nephritis _nephritis Glomerular Glomerular

diseases

diseases (especially (especially

proliferative types) proliferative types)

(50)

DISTAL TUBULAR CELL

(51)

TRANSITIONAL CELLS TRANSITIONAL CELLS

Source

Source Uroepithelium Uroepithelium Appearance

Appearance Variable according to Variable according to the layer(s) of the

the layer(s) of the

uroepithelium from which uroepithelium from which

the cells exfoliate the cells exfoliate Clinical

Clinical Superficial cells: Superficial cells:

meaning

meaning Mild uroepithelial lesions Mild uroepithelial lesions Deep cells:

Deep cells:

Severe uroepithelial lesions

(52)

SUPERFICIAL TRANSITIONAL CELLS

(53)

CASTS CASTS

Formation

Formation Distal tubules Distal tubules and collecting and collecting

ducts ducts

Matrix

Matrix Tamm-Horsfall Tamm-Horsfall glycoprotein

glycoprotein

Different

Different Different clinical Different clinical

types

types meanings meanings

(54)

CLASSIFICATION OF CASTS CLASSIFICATION OF CASTS

 _Hyaline _Hyaline

 Hyaline-granular Hyaline-granular

 Granular _Granular

 Waxy (cerei) Waxy (cerei)

 Fatty (lipidici) Fatty (lipidici)

 Cellular (erythrocytic, leukocytic,epithelial) Cellular (erythrocytic, leukocytic,epithelial)

 Containing crystals Containing crystals

 Containing microorganisms Containing microorganisms

 _Pigmented _Pigmented

 _Mixed _Mixed

(55)

CLINICAL MEANING OF CASTS CLINICAL MEANING OF CASTS

 CASTS COME FROM THE CASTS COME FROM THE KIDNEYS

KIDNEYS

 WHATEVER PARTICLE IS WHATEVER PARTICLE IS CONTAINED IN A CAST CONTAINED IN A CAST

IS OF RENAL ORIGIN

(56)

HAEMOGLOBIN CAST

(57)

LEUKOCYTE CAST

(58)

Cilindro ematico

Cilindro epiteliale

(59)

Cilindro ialino

Cilindro granuloso

(60)

COMMON CRYSTALS COMMON CRYSTALS

 _{Uric acid} _{Uric acid}

 Calcium oxalate (mono- and bi-hydrated) Calcium oxalate (mono- and bi-hydrated)

 Calcium phosphate Calcium phosphate

 Triple phosphate Triple phosphate

 Amorphous urates and phospahtes Amorphous urates and phospahtes

(61)

PATHOLOGICAL CRYSTALS PATHOLOGICAL CRYSTALS

  CHOLESTEROL CHOLESTEROL   CYSTINE _CYSTINE

  LEUCINE LEUCINE   _TYROSINE _TYROSINE

  2,8 -DI-HYDROXYADENINE 2,8 -DI-HYDROXYADENINE

(62)

CHOLESTEROL

(63)

CYSTINE

(64)

Negli ultimi anni si tende ad introdurre l’automazione anche nell’esame delle urine ed in particolare nella valutazione del sedimento urinario.

Obiettivi dell’automazione

• ridurre la variabilità analitica

• ridurre l’ errore pre-analitico ed analitico

• selezionare i campioni patologici da esaminare al microscopio

• refertare in tempo reale i campioni negativi

• aumentare il livello qualitativo

• ridurre il personale dedicato

(65)

Strumento analisi chimico-fisica

Sistema di Gestione

Sistema UF100 (citofluorimetro)

HOST Dasilab Delphi

(66)

Citofluorimetro (UF-100) Citofluorimetro (UF-100)

L’UF-100 analizza campioni di urina “nativa” “nativa”

Identifica e conta gli elementi figurati presenti

nell'urina utilizzando i principi della citofluorimetria e dell’ impedenziometria

Seleziona i campioni patologici

Studia le popolazioni cellulari tramite grafici:

• distribuzione volumetrica RBC (f. glomerulari e non)

• distribuzione volumetrica WBC (neutrofili e linfociti)

(67)

Scattergram UF 100

Scattergram

teorico

(68)

Negativo

(69)

Positivo congruente

(70)

Incongruente

(71)

SEDIMENTO

Con questo tipo di organizzazione, in cui i campioni negativi o congruenti sia per la chimica che per la citofluorimetria vengono validati in automatico, il numero dei sedimenti da controllare si riduce al 10- 15% dei campioni totali, permettendo una maggiore accuratezza nella lettura dei vetrini.

Ognuno degli elementi ha significato clinico:

• emazie (presenti nel 50% dei campioni) = ematuria.

• leucociti di solito polimorfonucleati,sono indice di inf.

batterica, ma se linfociti: infezione virale o rigetto

• cilindri mucoproteina di Tamm-Horsfall, in genere indicano patologia del nefrone specie quelli c ellulari

• cristalli patologici : leucina, colesterolo, tirosina, cistina.

(72)

E’ utile esaminare la morfologia dei GR tramite un esame del sedimento per distinguere l’ematuria di tipo GLOMERULARE dall’ematuria di tipo NON GLOMERULARE.

I GR urinari, in caso di origine glomerulare, presentano particolari deformazioni morfologiche delle membrane cellulari (dismorfici).

E’ proprio per questo “dismorfismo” è importante per la discriminazione fra ematuria di origine nefrotica (emazie dismorfiche) e post-nefrotica (emazie isomorfiche).

Tale test è basato sulla valutazione della morfologia delle emazie in contrasto di fase a fresco del sedimento.

L’ematuria è glomerulare se sono dismorfici almeno l’80% dei GR.

Tuttavia limiti di questo test rimangono la soggettività di

valutazione, la presenza di forme dubbie e il cut-off.

(73)

(74)

Definizione Definizione

Per proteinuria si intende la Per proteinuria si intende la

eliminazione di proteine eliminazione di proteine attraverso il rene, per un attraverso il rene, per un

processo

processo fisiologico o fisiologico o patologico

patologico

(75)

PROTEINE URINARIE - Proteinuria PROTEINE URINARIE - Proteinuria

Concentrazione normale

Concentrazione normale : : <0,12g/24ore <0,12g/24ore

Origine Origine : :

La proteina principale è l’

La proteina principale è l’ albumina albumina (< 30 mg/ (< 30 mg/ L L ) ) La La proteinuria patologica proteinuria patologica è > 1 è > 1 5 5 0 mg/24 0 mg/24 h h

Il quadro proteico è molto variabile.

Plasmatica Plasmatica

Renale e tissutale

(76)

(77)

3. Secrezione nel 3. Secrezione nel tratto ascendente tratto ascendente dell’ansa di Henle dell’ansa di Henle della mucoproteina della mucoproteina di Tamm-Horsfall di Tamm-Horsfall

(78)

Fisiologia del nefrone e proteine Fisiologia del nefrone e proteine

Secrezione tubulare (Tamm-

Horsfall protein)

Urina definitiva con 1/3 di albumina e 2/3 di globuline Riassorbimento

tubulare

albumina transferrina

immunoglobuline

microproteine Filtrazione

glomerulare albumina transferrina immunoglobuline microproteine

microproteine

(79)

Riassorbimento tubulare Riassorbimento tubulare

 Le proteine a basso peso molecolare, < 67kDa, sono basso peso molecolare, < 67kDa, sono riassorbite

riassorbite nel tubulo (endocitosi attiva).

 99% delle proteine che sono filtrate dal glomerulo, sono

riassorbite nel tubulo.

(80)

Proteinuria Proteinuria

a) Fisiologica

a) Fisiologica fino a 150 mg/die fino a 150 mg/die

b) Patologica

b) Patologica > 150 mg/die > 150 mg/die

(81)

Proteinuria Fisiologica Proteinuria Fisiologica

A) Albumina 10-15 mg A) Albumina 10-15 mg

B) Proteina di Tamm-Horsfall

(82)

Proteina di Tamm-Horsfall Proteina di Tamm-Horsfall

 Mucoproteina di origine renale Mucoproteina di origine renale

tratto ascendente dell’ansa di Henle tratto ascendente dell’ansa di Henle

 Importante nella formazione dei Importante nella formazione dei cilindri urinari cilindri urinari

 Attività antibatterica Attività antibatterica

(83)

Proteinuria Patologica:

a) Transitoria a) Transitoria

b) Intermittente b) Intermittente

c) Persistente

(84)

Proteinuria Persistente Proteinuria Persistente

 A) Pre-renale A) Pre-renale

 _{B) Renale} _{B) Renale}

 C) Post-renale C) Post-renale

(85)

> 67 kDa

< 67 kDa

Proteinuria pre-renale o da Proteinuria pre-renale o da

sovraccarico sovraccarico

Elevata Elevata

concentrazione concentrazione

nel siero di nel siero di proteine a basso proteine a basso PM che filtrate PM che filtrate liberamente dal liberamente dal

glomerulo glomerulo superano superano

la capacità di la capacità di riassorbimento riassorbimento

tubulare tubulare

Proteinuria a Proteinuria a glomerulo integro glomerulo integro

+ proteinuria + proteinuria

tubulare

(86)

Proteinuria pre-renale Proteinuria pre-renale

o o

da sovraccarico da sovraccarico

Mioglobinuria Emoglobinuria

Lisozimuria Catene leggere

libere monoclonali, Ig complete

Alcune Cause Alcune Cause

 CLLM CLLM , , nelle gammopatie monoclonali nelle gammopatie monoclonali

 lisozima lisozima , , in leucemie mieloidi acute in leucemie mieloidi acute

 emoglobina emoglobina , , nella emolisi, quando nella emolisi, quando l’aptoglobina è saturata

l’aptoglobina è saturata

 mioglobina, mioglobina, nella rabdomiolisi nella rabdomiolisi

(87)

Proteinuria renale Proteinuria renale

 Proteinuria glomerulare Proteinuria glomerulare selettiva selettiva Alb,Trf Alb,Trf

non selettiva non selettiva IgG IgG

 Proteinuria tubulare Proteinuria tubulare alfa1 microglobulina alfa1 microglobulina

beta2microglobulina beta2microglobulina

retinol binding protein retinol binding protein

 Proteinuria mista Proteinuria mista

(88)

Proteinuria glomerulare Proteinuria glomerulare

Albumina Transferrina

Immunoglobuline Selettiva

Non selettiva

(89)

Danno glomerulare Danno glomerulare

< 67 kDa

> 67 kDa

 L’albumina e le L’albumina e le proteine a peso proteine a peso

molecolare > 67 kDa molecolare > 67 kDa vengono trovate nelle vengono trovate nelle

urine.

 Il più frequente negli adulti e nei bambini, in generale associata ad un aumento della

proteinuria (> 1 g/24h)

Cause Cause

 diabete diabete

 malattie infettive malattie infettive (epatite B, varicella, (epatite B, varicella,

sifilide, sifilide,

mononucleosi,…) mononucleosi,…)

 malattie sistemiche malattie sistemiche (autoimmuni, tumori) (autoimmuni, tumori)

 intossicazioni intossicazioni (sali (sali d’oro, farmaci,…)

d’oro, farmaci,…)

(90)

> 67 kDa

< 67 kDa

Danno tubulare Danno tubulare

< 67 kDa

> 67 kDa

 L’albumina (<30%) e le L’albumina (<30%) e le proteine a PM < 67 kDa proteine a PM < 67 kDa ( (   1-microglobulina, RBP, 1-microglobulina, RBP, beta2-microglobulina)

beta2-microglobulina)

passano nelle urine.

 Di solito transitorio e Di solito transitorio e sotto i 0.5 g/die

sotto i 0.5 g/die

Cause Cause

 primaria primaria (sindrome di (sindrome di Fanconi, sindrome di Fanconi, sindrome di Bartler)

Bartler)

 malattie metaboliche malattie metaboliche (diabete, ossalosi) (diabete, ossalosi)

 gammopatie monoclonali gammopatie monoclonali (mieloma, Waldenström) (mieloma, Waldenström)

 farmaci farmaci

(amminoglicosidi) (amminoglicosidi)

 intossicazioni intossicazioni (metalli (metalli

pesanti, amminosidi)

(91)

Proteinuria Proteinuria

tubulare tubulare

Alfa1-Microglobulina

(92)

Albumina Albumina

marker di filtrazione glomerulare marker di filtrazione glomerulare

(proteinuria glomerulare selettiva) (proteinuria glomerulare selettiva) IgG IgG

marker di filtrazione glomerulare marker di filtrazione glomerulare, indica una perdita della selettivita di carica

(proteinuria glomerulare non selettiva) (proteinuria glomerulare non selettiva)

  1-Microglobulina 1-Microglobulina

marker di riassorbimento tubulare marker di riassorbimento tubulare

(proteinuria tubulare) (proteinuria tubulare)   2-Macroglobulina 2-Macroglobulina

marker di ematuria post-renale

(proteinuria post-renale)

(93)

Albuminuria Albuminuria

 forte carica negativa: non attraversa la membrana forte carica negativa: non attraversa la membrana glomerulare finchè la selettività di carica è intatta glomerulare finchè la selettività di carica è intatta

 _“ _“ microalbuminuria” = Paucialbuminuria primo microalbuminuria” = Paucialbuminuria primo

segnale di nefropatia diabetica segnale di nefropatia diabetica

 proteina di 67 kD proteina di 67 kD

 la proteinuria glomerulare selettiva è lo la proteinuria glomerulare selettiva è lo

stadio più precoce della nefropatia stadio più precoce della nefropatia

(94)

Immunoglobulina Immunoglobulina G G

proteina di 150 kD - elevato peso molecolare proteina di 150 kD - elevato peso molecolare marker di proteinuria glomerulare non-selettiva marker di proteinuria glomerulare non-selettiva

può attraversare la membrana glomerulare solo può attraversare la membrana glomerulare solo

quando la selettività della membrana quando la selettività della membrana

glomerulare è totalmente compromessa glomerulare è totalmente compromessa glomerulopatia selettiva :

glomerulopatia selettiva : Alb Alb   , IgG , IgG   glomerulopatia non-selettive : Alb

glomerulopatia non-selettive : Alb   , IgG , IgG   la proteinuria glomerulare non-selettiva si la proteinuria glomerulare non-selettiva si

sviluppa con il progredire della malattia

(95)

  ₁ ₁ -Microglobulina -Microglobulina

proteina di 33 kD - basso peso molecolare proteina di 33 kD - basso peso molecolare

liberamente filtrata dal glomerulo liberamente filtrata dal glomerulo riassorbita per riassorbita per più del 99% nel tubulo prossimale

più del 99% nel tubulo prossimale

aumenta nell’urina in caso di nefropatie tubulo aumenta nell’urina in caso di nefropatie tubulo interstiziali

interstiziali

es.. pielonefriti, nefriti interstiziali es.. pielonefriti, nefriti interstiziali

nefropatie da analgesici nefropatie da agenti nefropatie da analgesici nefropatie da agenti

tossici (Cd,Pb,Hg) tossici (Cd,Pb,Hg)

rabdomiolisi, malaria tropica rabdomiolisi, malaria tropica

rene da mieloma rene da mieloma

nella proteinuria nefrotica (> 3,000 mg Alb / mg nella proteinuria nefrotica (> 3,000 mg Alb / mg

Crea) la concomitante proteinuria tubulare è causata Crea) la concomitante proteinuria tubulare è causata

da sovraccarico della capacità di riassorbimento del da sovraccarico della capacità di riassorbimento del

tubulo

(96)

  ₂ ₂ -Macroglobulina -Macroglobulina

 proteina di 720 kD - Peso molecolare molto proteina di 720 kD - Peso molecolare molto elevato

elevato

 non può attraversare la membrana glomerulare non può attraversare la membrana glomerulare neanche in caso di proteinuria nefrotica

neanche in caso di proteinuria nefrotica

 indice di emoragia del tratto urogenitale indice di emoragia del tratto urogenitale

 marker di ematuria post-renale marker di ematuria post-renale

 la determinazione concomitante di IgG e Alb la determinazione concomitante di IgG e Alb

permette la differenziazione tra ematuria renale e permette la differenziazione tra ematuria renale e

post-renale post-renale

 l’aumento dei rapporti  l’aumento dei rapporti  2M/Alb e IgG/Alb è 2M/Alb e IgG/Alb è

un indice di ematuria post- renale un indice di ematuria post- renale es. emorragia dovuta a

es. emorragia dovuta a tumore alla prostata o tumore alla prostata o alla vescica, cistiti, prostatiti

alla vescica, cistiti, prostatiti

(97)

Catene leggere libere Catene leggere libere

  e e  

Catene leggere libere = proteine di 25-50 kD - Catene leggere libere = proteine di 25-50 kD -

basso peso molecolare basso peso molecolare

liberamente filtrate dal glomerulo, riassorbite dal liberamente filtrate dal glomerulo, riassorbite dal

tubulo tubulo

pre-renale / proteinuria da overflow in caso di aumentata pre-renale / proteinuria da overflow in caso di aumentata

sintesi nelle gammapatie, supera la capacità di sintesi nelle gammapatie, supera la capacità di

riassorbimento del tubulo riassorbimento del tubulo

eccesso di produzione di catene leggere rispetto alle eccesso di produzione di catene leggere rispetto alle

catene pesanti delle Ig; molto aumentata nelle catene pesanti delle Ig; molto aumentata nelle

gammapatie gammapatie

marker tumorale

(98)

> 67 kDa

< 67 kDa

Proteinuria mista Proteinuria mista

Unisce le caratteristiche della proteinuria

glomerulare a quelle della proteinuria tubulare.

Si tratta di solito di casi di danno primitivamente glomerulare, nei quali il sovraccarico di proteine da riassorbire portato a livello tubulare determina secondariamente la

comparsa di un danno anche a carico dei meccanismi di

riassorbimento dei tubuli

stessi.

(99)

Classificazione clinica Classificazione clinica

 Patologie associate alle catene Patologie associate alle catene leggere libere monoclonali

leggere libere monoclonali

 Patologie a carico del rene Patologie a carico del rene

 Patologie della vescica e Patologie della vescica e prostata

prostata

(100)

ASPETTI INTERPRETATIVI ASPETTI INTERPRETATIVI

Elettroforesi Proteine Urinarie

(101)

Interesse diagnostico dell’elettroforesi delle Interesse diagnostico dell’elettroforesi delle

proteine urinarie proteine urinarie

 Ricerca e caratterizzazione di proteine ad alto e/o Ricerca e caratterizzazione di proteine ad alto e/o basso peso molecolare per la definizione del

basso peso molecolare per la definizione del danno danno renale

renale (pre-renale, glomerulare, tubulare, post-renale). (pre-renale, glomerulare, tubulare, post-renale).

 Ricerca e tipizzazione delle catene leggere libere Ricerca e tipizzazione delle catene leggere libere monoclonali nelle urine o

monoclonali nelle urine o proteina di Bence Jones proteina di Bence Jones e e delle Componenti Monoclonali intere (valutazione dello delle Componenti Monoclonali intere (valutazione dello stadio di avanzamento di una gammapatia monoclonale, stadio di avanzamento di una gammapatia monoclonale,

prevenzione di problemi legati all’azione nefrotossica prevenzione di problemi legati all’azione nefrotossica

della PBJ).

(102)

POSIZIONE DELLE DIFFERENTI FRAZIONI SU POSIZIONE DELLE DIFFERENTI FRAZIONI SU

HYDRAGEL 7 HR or 15 HR.

PROTEINE DI ORIGINE TUBULARE E PROTEINE DI ORIGINE TUBULARE E

GLOMERULARE GLOMERULARE

1-microglobulin

1-antitrypsin Orosomucoid Transferrin

 -globulins Albumin

Haptoglobin RBP

2-microglobulin

Cystatin (post gamma) or lysozyme

(103)

Elettroforesi ad alta risoluzione Elettroforesi ad alta risoluzione

6 e 7 proteinuria fisiologica

(104)

Valutazione della proteinuria su gel SDS-AGE

(105)

> 67 kDa

> 67 kDa < 67 < 67 kDa kDa

Fisiologia del Fisiologia del

nefrone nefrone

Riassorbimento Riassorbimento

tubulare

tubulare SDS SDS

Principio Interpretazione Principio Interpretazione

+

-

Filtrazione Filtrazione glomerulare glomerulare

Controllo di massa molecolare Controllo di massa molecolare

14 14 26 26

67 67 150 150

Markers Markers

tubulari tubulari

(MW < 67 (MW < 67

kDa)kDa)

Markers Markers glomerulari glomerulari

(MW> 67 kDa) (MW> 67 kDa)

Albumin Albumin

aa (kDa)

(kDa)

Elettroforesi su gel SDS-agarosio

(106)

Danno glomerulare Danno glomerulare

albumin

< 67 kDa

> 67 kDa

serum

< 67 kDa

> 67 kDa

(107)

Danno tubulare Danno tubulare

> 67

kDa < 67

kDa

albumin

< 67 kDa

> 67 kDa

Sér

(108)

Danno misto Danno misto

> 67

kDa < 67

kDa

albumin

< 67 kDa

> 67 kDa

(109)

Ricerca e tipizzazione della proteina di Bence Jones

(110)

IgG IgA IgM

IgD IgE

Classi di Immunoglobuline

Gli anticorpi o immunoglobuline (Ig)sono una classe di glicoproteine del siero, il cui ruolo nella risposta

immunitaria specifica è di enorme importanza.

(111)

La proliferazione di un clone linfocitario B (cellule

linfonodali) o di una plasmacellula (midollo osseo), dà luogo alla formazione di componenti monoclonali intere (CM) e di proteine di Bence-Jones (PBJ).

La proteina di BJ è il nome che viene dato alle catene leggere libere monoclonali

(CLLM), rilevabili nelle urine .

In un individuo normale, vengono prodotte 30-60 mg/l/die

di CLLM.

(112)

La La proteina di BJ proteina di BJ compare compare quando la loro quando la loro sovrapproduzione aumenta al punto da saturare la sovrapproduzione aumenta al punto da saturare la capacità di riassorbimento e metabolizzazione del capacità di riassorbimento e metabolizzazione del tubulo.

tubulo.

Concetti introduttivi Concetti introduttivi

CM e PBJ nelle urine sono sempre di origine sierica.

La La componente monoclonale intera componente monoclonale intera appare quando il appare quando il glomerulo

glomerulo è danneggiato al punto tale da lasciare è danneggiato al punto tale da lasciare passare proteine di grossa taglia (proteinuria passare proteine di grossa taglia (proteinuria glomerulare).

glomerulare).

(113)

Produzione ed escrezione della PBJ nelle urine Produzione ed escrezione della PBJ nelle urine

Le plasmacellule normali producono un leggero eccesso di catene Le plasmacellule normali producono un leggero eccesso di catene

leggere.

Questo squilibrio è enfatizzato nei neoplasmi delle cellule B (mieloma Questo squilibrio è enfatizzato nei neoplasmi delle cellule B (mieloma

multiplo e micromolecolare).

Grazie alle loro dimensioni ridotte, le CLLM sono capaci di passare Grazie alle loro dimensioni ridotte, le CLLM sono capaci di passare

attraverso il

attraverso il glomerulo. glomerulo.

Quando il meccanismo di riassorbimento tubulare viene saturato, le Quando il meccanismo di riassorbimento tubulare viene saturato, le

PBJ sono escrete nelle urine.

La massa molecolare della PBJ è piuttosto variabile:

- PBJ monomerica: 22 kDa;

- dimero: 44 kDa;

- gradi di polimerizzazione più elevati;

- frammenti di 5-18 kDa.

(114)

Siero Urine

Le componenti monoclonali e le proteine di Bence Jones rinvenute

nelle urine sono di origine sierica

(115)

Le plasmacellule normali producono un leggero eccesso di catene leggere che vengono filtrate attraverso il glomerulo e riassorbito dal tubulo.

Quando il meccanismo di riassorbimento tubulare viene saturato, le PBJ sono escrete nelle urine.

L’eccesso di CLLM nel tubulo distale è causa di precipitazione delle stesse come cilindri, con conseguente distruzione dei nefroni.

> concentrazioni di catene leggere libere sono filtrate dai restanti nefroni portando ad un accelerato danno renale con ulteriore aumento delle CLLM seriche

mentre paradossalmente diminuirà la loro eliminazione

con le urine a causa del suddetto danno renale.

(116)

Malattie associate a BJP Malattie associate a BJP Malattie associate a BJP Malattie associate a BJP

Mieloma multiplo Mieloma multiplo

Macroglobulinemia di Waldestrom Macroglobulinemia di Waldestrom

Amiloidosi Amiloidosi

Malattia da deposizioni di catene leggere Malattia da deposizioni di catene leggere Linfomi

Leucemie linfatiche croniche

(117)

La presenza di PBJ è associata anche a:

•Gammopatie monoclonali a significato incerto (MGUS)

(118)

La PBJ è spesso di per sé nefrotossica per

tossicità diretta delle catene leggere; infatti la loro precipitazione nel lume dei tubuli e la loro deposizione nelle strutture renali, provoca

proteinuria, nefrosi, disfunzioni tubulari, IRA, IRC, calcolosi urinaria.

Per la ricerca e la determinazione qualitativa della PBJ si usa la tipizzazione immunologica (Immunofissazione) in elettroforesi, che

permettere la verifica delle due caratteristiche

essenziali (Libere-Monoclonali).

(119)

Perché è importante diagnosticare Perché è importante diagnosticare

la presenza di PBJ?

La presenza di PBJ è un indicatore La presenza di PBJ è un indicatore

prognostico negativo della prognostico negativo della

progressione del mieloma.

La PBJ è spesso di per sé La PBJ è spesso di per sé

nefrotossica.

(120)

Soggetti con gammapatia Soggetti con gammapatia

monoclonale sierica: al monoclonale sierica: al

riscontro e ad ogni riscontro e ad ogni successivo controllo successivo controllo

Sospetto clinico o laboratoristico Sospetto clinico o laboratoristico

(es. ipogammaglobulinemia non (es. ipogammaglobulinemia non attesa in soggetto adulto) di attesa in soggetto adulto) di

malattia da catene leggere malattia da catene leggere Sospetto clinico di amiloidosi o di Sospetto clinico di amiloidosi o di malattia da deposizione di catene malattia da deposizione di catene

leggere leggere

La proteina di Bence Jones: indicazioni

(121)

Immunofissazione Immunofissazione

Tecnica immunologica per la rivelazione e Tecnica immunologica per la rivelazione e

la tipizzazione delle componenti

monoclonali in un siero o in un’urina

(122)

Proteina di Bence Jones:

Procedura proposta per

Procedura proposta per Ricerca e Tipizzazione Ricerca e Tipizzazione

Secondo campione del mattino.

(anti k e l totali + catena pesante del siero + anti k e l libere -

IFE

SIMeL).

Sensibilità richiesta: 10mg/L.

(123)

IF: CM completa IF: PBJ

HR: banda omogenea in zona gamma

(124)

Tipizzazione della PBJ su Hydragel Bence Jones

(125)

Immunofissazione urinaria Immunofissazione urinaria

1. CM completa 1. CM completa

+ PBJ + PBJ

3. CM completa 3. CM completa + PBJ polim.

+ PBJ polim.

2. PBJ 2. PBJ

4. Ig poli

(126)

Campione 1: proteinuria di B-J di tipo kappa Campione 2: proteinuria di B-J di tipo lambda

Presenza di proteina di Bence Jones Presenza di proteina di Bence Jones

(K o Lambda)

IL LABORATORIO NELLE MALATTIE RENALI: IL LABORATORIO NELLE MALATTIE RENALI: proteine urinarie proteine urinarie