1.1. Funzioni del PDGF 1. INTRODUZIONE

1. INTRODUZIONE

1.1. Funzioni del PDGF

La famiglia del PDGF si compone di quattro ligandi, PDGFA-D. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine è stato identificato come prodotto di secrezione delle piastrine (Balk 1971; Busch et al. 1976) e come componente del siero responsabile della proliferazione delle cellule della muscolatura liscia arteriosa (Ross et al. 1974). In seguito, studi fatti in vitro o su organismi modello hanno dimostrato la sua espressione in una vasta gamma di tessuti e il suo coinvolgimento in una varietà di processi biologici tra cui la proliferazione, la migrazione cellulare, lo sviluppo e l'angiogenesi.

Il PDGF è sintetizzato da cellule endoteliali, monociti/macrofagi, cellule muscolari lisce, fibroblasti, citotrofoblasti della placenta, neuroni e alcune cellule gliali (Heldin e Westermark 1990; Raines et al. 1990; Raines e Ross 1993). Mentre l'espressione del PDGF nei megacariociti e neuroni (Sasahara et al. 1991; Yeh et al. 1991) appare essere costitutiva, l’espressione in altri tipi cellulari accompagna in genere la sua attivazione funzionale o mitogenica (Betsholtz 1993).

Essendo un fattore di crescita, il PDGF è un potente mitogeno perché è in grado di far proliferare le cellule del tessuto connettivo come cellule muscolari lisce, fibroblasti e cellule di origine neuroectodermica come le cellule gliali e le cellule staminali neurali di origine embrionale e adulta (Raines et al. 1990). Inoltre, è un fattore chemotattico, in quanto ha la capacità di richiamare determinate cellule a migrare verso precisi punti del tessuto (Grotendorst et al.1982; Siegbahn et al. 1990). Quindi, nel caso in cui il tessuto subisca un trauma quale una lacerazione, si forma un coagulo veicolato in cui le piastrine rilasciano PDGF. Quest’ultimo, grazie

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alle sue proprietà chemotattiche, richiama sia i macrofagi sia i fibroblasti che vengono spinti alla proliferazione in loco dal PDGF stesso; i fibroblasti andranno quindi a sostituire le cellule morte rigenerando così il tessuto. Il

PDGF è un fattore secreto per cui non solo ha un effetto autocrino sulle

cellule che lo producono, ma ha anche possibilità di effetti paracrini sulle altre cellule.

Il PDGF svolge altri ruoli nel differenziamento (Raff et al. 1989; Richardson et al. 1990) e nella regolazione della produzione di componenti della matrice extracellulare (Owen et al. 1982; Majack et al. 1985).

Per quanto riguarda il PDGF-B in particolare, è stato studiato il suo coinvolgimento nella cancerogenesi. Nelle neoplasie del Sistema Nervoso Centrale (SNC), in particolare i gliomi, si ha sovraespressione sia dei ligandi che dei recettori del fattore di crescita derivato dalle piastrine (Hermanson et al. 1992; Nister et al. 1988), e ciò fornisce una stimolazione autocrina e / o paracrini alla crescita tumorale (Hermansson et al. 1988).

Inizialmente il legame tra il PDGF-B e la formazione di tumori è stato dimostrato con la scoperta che l’oncogene v-sis del virus del sarcoma delle scimmie è un omologo retrovirale del gene cellulare che codifica per la catena C del PDGF (Doolittle et al. 1983; Waterfield et al. 1983). L’espressione del PDGF-B e del suo recettore è stata successivamente trovata in diversi tipi di tumore tra cui tumori del SNC, sarcomi, tumori delle cellule germinali, e carcinomi del sistema gastrointestinale.

Il “pathway” del PDGF-B è implicato nei gliomi, tumori delle cellule gliali di supporto (astrociti e oligodendrociti) nel sistema nervoso centrale. Il ruolo che gioca il PDGF nella tumorigenesi gliale si può capire dalle sue funzioni di trasduzione del segnale e regolazione nello sviluppo normale.

1.2. Caratteristiche e sistema di segnalazione del

PDGF-B

Il gene del PDGF-B (situato sul cromosoma 22) è composto da sette esoni separati da introni di dimensioni diverse. La maggior parte della proteina matura PDGF-B è codificata dagli esoni 4 e 5. I membri della famiglia del PDGF sono caratterizzati da un motivo di otto cisteine. La struttura terziaria del PDGF-B dipende dai ponti disolfuro intramolecolari, di cui quelli tra i residui di cisteina 1 e 6, così come 3 e 7, rispettivamente, sono necessari per la bioattività del PDGF-B (Giese et al. 1987; Sauer e Donoghue 1988; Ostman et al. 1992; Heldin et al. 1993).

L’mRNA del PDGF-B in seguito a splicing alternativo può presentare due forme diverse che differiscono nelle regioni non tradotte al 5'UTR e sono identificabili nello sviluppo del cervello di ratto (Sasahara et al. 1998).

La famiglia del PDGF si compone di quattro ligandi, PDGFA-D e due recettori, PDGFR e PDGFR , appartenenti alla superfamiglia di recettori tirosina chinasici la quale comprende anche i recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). I PDGF sono dimeri legati covalentemente da ponti disolfuro, sono secreti e legano i PDGFR. Tutti i ligandi PDGF (A-D) formano omodimeri, ma PDGF-A e PDGF-B possono anche formare un eterodimero funzionale (AB). PDGF-A e B sono secreti come ligandi attivi (Heldin e Westermark, 1999), mentre i ligandi C e D sono attivati dopo essere stati secreti in quanto richiedono la scissione del dominio CUB N-terminale che è costituito da regioni ripetute.

I recettori e C possono originare gli omo- ed etero-dimeri , C e CC che hanno proprietà di segnalazione distinte. Dal momento che le porzioni extracellulari dei recettori hanno solo il 31% di identità, i ligandi hanno diverse affinità per le differenti combinazioni dei recettori (Heldin e Westermark, 1999; Li et al. 2000; Bergsten et al. 2001; LaRochelle et al.

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2001): AA lega , CC e AB legano e C, BB lega tutti e tre tipi di recettori, e DD lega C e CC (Figura 1.1).

Fig. 1.1: Ligandi e recettori della famiglia del PDGF; le frecce indicano le loro

proprietà di dimerizzazione e la loro interazione con i recettori.

Ogni recettore ha cinque domini immunoglobulinici ripetuti nella porzione extracellulare di legame al ligando e un dominio tirosin chinasico nella regione citoplasmatica. Il legame del ligando provoca la dimerizzazione del recettore e l’avvio del processo di segnalazione intracellulare, attivando i domini tirosina chinasici, che autofosforilano diversi residui di tirosina nel dominio citoplasmatico del recettore. Questa forma attiva del recettore può quindi servire come sito d’attracco per i complessi multiproteici che hanno la funzione di attivare una moltitudine di cascate di segnalazione (Figura 1.2). Come già visto, gli esiti di questi eventi di segnalazione sono diversi e includono la proliferazione, la migrazione, la deposizione della matrice, la sopravvivenza e la transizione epitelio-mesenchimatica (Betsholtz et al. 2001). Questi “pathway” comprendono ad esempio la MAPK (mitogen-activated protein chinasi) che è una serina/treonina protein chinasi specifica che regola varie attività come la mitosi, il differenziamento, la proliferazione, la sopravvivenza e l’apoptosi delle cellule, il fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K), la chinasi della famiglia Src, fattori di trascrizione Stat, e la fosfolipasi CP (PLCP). Anche

se i due recettori attivano vie simili, il “pathway” specifico che è attivato e il grado in cui è attivato non sono identici (Heidaran et al. 1993). La sostituzione in vivo di una subunità del recettore di segnalazione intracellulare con l'altro (in modo tale da rendere tutti i domini intracellulari di un certo tipo) non ricapitola lo sviluppo normale (Klinghoffer et al. 2001). Questo suggerisce che ogni recettore ha una unica risposta di trasduzione del segnale dopo il legame con il ligando (Shih et al. 2006).

Molte delle vie di segnalazione attivate attraverso la via del PDGF sono state implicate nella gliomagenesi o nello sviluppo gliale. Anche se il PDGF può attivare questi “pathway”, la misura in cui la segnalazione del PDGF è responsabile o contribuisce alla loro attivazione nei tumori o tessuti normali è spesso non provata o non definitiva.

I mezzi con cui il PDGF attiva questi “pathway” avviene attraverso un meccanismo comune di reclutamento di componenti di segnalazione al recettore attivo. Sequenze specifiche, tra cui residui di tirosina fosforilati nel dominio intracellulare del PDGFR, fungono da siti di ancoraggio per proteine contenenti il dominio SH2. Due di queste proteine contenenti SH2 comprendono Shc e Grb2. Il complesso di Shc e Grb2 è in grado di reclutare Sos, un fattore di scambio che catalizza la sostituzione di GDP con GTP nella proteina Ras, un membro della famiglia delle proteine che legano i nucleotidi guanosinici (proteine G). Ras quindi, una volta impegnata con il GTP, può indurre dei segnali mitogenici attraverso la via MAPK, portando a segnali di proliferazione e sovraregolazione di geni target proliferativi. Inoltre il PDGFR può attivare un’altra via di segnalazione che coinvolge l’enzima PI3-chinasi, che presenta una subunità catalitica ed una subunità regolatrice. Questa chinasi è reclutata alla membrana attraverso il dominio SH2 della sua subunità regolatrice e, una volta attivata, fosforila e converte il lipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato, detto anche PIP2, in fosfatidilinositolo

3,4,5-trisfosfato (PIP3). PIP3 può poi agire e reclutare Akt, una serina chinasi, che ha diversi substrati target, tra cui bcl2, mTOR e fattori

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forkhead (le proteine FOX sono una famiglia di fattori di trascrizione che giocano un ruolo importante nella regolazione dell'espressione dei geni coinvolti nella crescita cellulare, proliferazione, differenziamento e longevità). L'attivazione di questa via aumenta la sopravvivenza e la crescita cellulare. Mediante “western blotting”, sono stati identificati i componenti attivati del “pathway” MAPK e Akt in campioni chirurgici di glioblastoma (Holland et al. 2000). Oltre alla proliferazione e all’aumento della sopravvivenza, queste vie possono anche regolare l'efficienza con cui vengono tradotti mRNA specifici all'interno della cellula (Rajasekhar et al. 2003). La regolazione di fattori di trascrizione specifici forkhead è stata trovata anch’essa coinvolta nella gliomagenesi (Seoane et al. 2004).

Le tirosin-chinasi della famiglia Src (SFK) sono un altro elemento di segnalazione di PDGFR e giocano un ruolo importante nella regolazione della trasduzione del segnale mediata dai recettori di membrana nel compartimento citoplasmatico. Queste chinasi contengono un dominio SH2 che si lega alla tirosina fosforilata nel recettore PDGF. Gli SFK sono enzimi che controllano la crescita, il differenziamento, la migrazione e la sopravvivenza cellulare. È stato inoltre dimostrato che la chinasi della famiglia Src, Fyn, è coinvolta nella differenziazione degli oligodendrociti attraverso la regolazione delle proteine che regolano Rho (Wolf et al. 2001).

Anche il “pathway” PLCP è attivato dal reclutamento e dalla fosforilazione di questo enzima a livello della membrana. Questo provoca la rottura di PIP2 in inositolo 1,4,5 trisfosfato e diacilglicerolo, che

mobilizza le riserve di calcio intracellulare. Nei gliomi, PLCP e la successiva attivazione della proteina chinasi C (PKC) sono stati collegati all’invasività e alla proliferazione (Khoshyomn et al. 1999; Da Rocha et al. 2002). I

PDGFR sono stati collegati all’attivazione delle Jak chinasi e la successiva

attivazione dei loro substrati, i fattori di trascrizione Stat (Vignais et al. 1996). La segnalazione Stat in risposta al “pathway” del fattore neurotrofico ciliare (CNTF) può promuovere il differenziamento degli astrociti gliali dalle cellule precursori neuronali (Bonni et al. 1997).

Quando si considera il “signaling” del PDGF, è importante distinguere la stimolazione del fattore di crescita a breve termine o transiente da quella cronica, persistente. È quest'ultima, la forma cronica di esposizione che più da vicino riguarda le condizioni in vivo della tumorigenesi gliale (Shih et al. 2006).

1.3. Ruolo del PDGF nello sviluppo embrionale

I PDGF svolgono ruoli cellulari distinti a stadi successivi di embriogenesi nei mammiferi. I PDGF sono mitogeni durante le prime fasi di sviluppo, guidano la proliferazione del mesenchima indifferenziato e di alcune popolazioni di cellule progenitrici (Betsholtz et al. 2001). Per esempio, la segnalazione del PDGFR è essenziale per la proliferazione delle cellule interstiziali nel testicolo embrionale precoce e nei reni, e per la proliferazione mesenchimale nell’intestino precoce, nella pelle e nello sviluppo del polmone (Karlsson et al. 2000; Li et al. 2000; Li e Hoyle et al. 2001; Brennan et al. 2003).

Durante le fasi seguenti di maturazione, la segnalazione del PDGF è coinvolta nel rimodellamento dei tessuti e differenziamento cellulare, e di

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eventi induttivi coinvolti nel “patterning” e morfogenesi. Nel topo e in

Drosophila, i PDGF dirigono anche la migrazione cellulare, sia a breve che

a lunga distanza dalle sorgenti del segnale.

Le informazioni sulle funzioni del PDGF in vivo si basano principalmente sul “pattern” di espressione dei ligandi e recettori del PDGF e attraverso l’analisi della loro perdita di funzione. Topi knockout per il

PDGF-B e PDGFR presentano glomeruli renali anormali, dilatazione del

cuore e dei vasi sanguigni, anemia, trombocitopenia, emorragie ed edema che portano a morte perinatale (Figura 1.3) (Levéen et al 1994; Soriano et al. 1994).

Fig. 1.3: Embrioni mutanti del PDGF-B. (A) Le tipiche caratteristiche esterne di un

embrione mutante a E18.5. Da notare l'aspetto emorragico ed edematoso. (B) Aspetto esterno di un embrione mutante a E19. (CH) Mutanti di PDGF-B (m) e controlli (c) a stadio E19. (C) Sanguinamento localizzato (frecce) sotto la pelle e nel grasso bruno di un embrione mutante E19. (D) Aspetto corrispondente di un embrione normale E19. (E) Organi addominali di un embrione di controllo E19 (c) e un mutante (m) . Notare le emorragie nel fegato e la dilatazione dei vasi sanguigni mesenterici (frecce). (F) Organi del torace e addominali di un embrione di controllo E19 (a sinistra) e un mutante (a destra); le frecce indicano il cuore. (G) Il fenotipo del rene di due coppie di reni mutanti (m) a stadio E19 a confronto con due coppie di reni di controllo (c). (H) Vesciche delle vie urinarie da due embrioni di controllo (c) e due mutanti (m) E19.

In questi topi si osservano diverse anomalie anatomiche e istologiche: i capillari glomerulari del rene non si formano, a quanto pare a causa di assenza di cellule del mesangio. Invece, più anse di capillari non ramificate riempiono lo spazio glomerulare. Numerosi vasi mancano o non sono completamente coperti da cellule murali (Levéen et al. 1994; Soriano et al. 1994). Di conseguenza, le cellule endoteliali iperproliferano e danno luogo a capillari dilatati, ectopici che sono instabili, iperpermeabili e vulnerabili alla degenerazione o regressione (Lindahl et al. 1997a; Hellström et al. 2001; Enge et al. 2002). Anche il cuore e alcune grandi arterie si dilatano in embrioni in fase avanzata. Lo status ematologico degli embrioni morti per emorragia prima di nascere comprende eritroblastosi, anemia macrocitica, e trombocitopenia. Questi risultati hanno portato alla conclusione che il PDGF-B ha un ruolo cruciale in vivo nella creazione di alcune funzioni renali e nello sviluppo vascolare.

L’espressione di PDGF-B e PDGFR nelle cellule del mesangio dei glomeruli renali suggerisce un ruolo della coppia ligando-recettore in questo sito (Abboud et al. 1987; Shultz et al. 1988; Silver et al. 1989). La glomerulonefrite, che spesso coinvolge una vasta proliferazione delle cellule del mesangio, può essere associata ad aumentata espressione di

PDGF-B e PDGFR nei glomeruli (Fellstrom et al. 1989; Iida et al. 1991).

Nel sistema vascolare, il PDGF-B è espresso dalle cellule endoteliali e

PDGFR è espresso dalle cellule muscolari lisce vascolari e sui periciti, le

cellule che circondano e sostengono lo sviluppo dei vasi. In un modello murino di neovascolarizzazione, l'iperespressione di PDGF-B stimola l’espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), e insieme collaborano nella formazione di nuovi vasi sanguigni stabili, favorendo la proliferazione delle cellule endoteliali vascolari e reclutando i periciti ai neovasi (Levéen et al. 1994; Soriano et al. 1994; Lindahl et al. 1997a; Benjamin et al. 1998; Heldin et al. 1999; Hellström et al. 2001; Guo et al. 2003). Quando questa rete di segnalazione paracrina è interrotta, le cellule di sostegno non sono reclutate ai vasi e le cellule endoteliali proliferano in maniera non regolata e questo causa una

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formazione scorretta dei vasi e l’emorragia. Ciò indica che il PDGF può essere importante nella angiogenesi nei tessuti adulti (Cao et al. 2003; Guo et al. 2003), che è un processo complesso ed essenziale per la crescita, l’invasione e la metastasi maligna di vari tumori.

Studi recenti hanno visto il ruolo angiogenico del PDGF-B anche in neoplasie ematologiche tra cui il mieloma multiplo (Tsirakis et al. 2011).

Sono stati condotti altri studi sui topi con “knockout” condizionale che alterano l'attività del PDGF senza causare una mortalità precoce. Anche la retina è particolarmente sensibile alle mutazioni nel dominio del PDGFR : topi mutanti (che sopravvivono fino all'età adulta) mostrano la retinopatia proliferativa (Freyberger et al. 2000). Ciò può derivare da una sovraespressione del PDGF negli astrociti o da una carenza del PDGF nell'endotelio vascolare; entrambi si traducono in una carenza di periciti (Fruttiger et al. 1996; Klinghoffer et al. 2001; Enge et al. 2002; Forsberg Nilsson et al. 2003).

1.4. Ruolo del PDGF nello sviluppo del SNC

Il signaling del PDGF esercita funzioni multiple anche durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale. Il profilo di espressione del PDGF nel SNC durante lo sviluppo embrionale è stato analizzato sia in topo che in Xenopus laevis (Shih et al. 2006).

Il PDGF-B è distribuito nei neuroni in diverse regioni del sistema nervoso centrale dell'embrione e dell'adulto (Sasahara et al. 1992). L'espressione più forte si registra nelle fibre del nervo olfattivo e rimane a un livello elevato nel sistema olfattivo adulto. Poiché i neuroni sensoriali primari del sistema olfattivo conservano la capacità di rigenerarsi nell’adulto, questo risultato è in accordo con il ruolo suggerito dal PDGF come fattore neurotrofico.

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Le cellule di Schwann, le cellule mielinizzanti del sistema nervoso periferico, esprimono il recettore PDGF e rispondono al PDGF-B con una maggiore proliferazione in vitro (Davis et al. 1990, Eccleston et al. 1990).

Il PDGF-A si trova espresso nei neuroni a partire da E15 e continua ad essere espresso nelle fasi adulte, anche il PDGF-B è espresso nei neuroni, ma in maniera più limitata (Yeh et al. 1991; Sasahara et al. 1991). I

PDGF-A e PDGFR sono presenti durante l'embriogenesi, con ruoli

essenziali in molti contesti, tra cui il sistema nervoso centrale, la cresta neurale e lo sviluppo degli organi (Leveen et al. 1994;. Soriano et al. 1994; Soriano et al. 1997; Fruttiger et al.1999; Gnessi et al. 2000; Karlsson et al. 2000). In particolare PDGF-A e PDGFR sono responsabili della proliferazione, della sopravvivenza, della migrazione e del differenziamento delle cellule progenitrici gliali, durante lo sviluppo degli oligodendrociti. Nel sistema nervoso centrale dei mammiferi gli oligodendrociti depositano uno strato isolante di mielina intorno alle proiezioni neuronali; queste guaine mieliniche sono essenziali nel facilitare la neurotrasmissione. Gli oligodendrociti differenziano dopo la nascita dalle cellule progenitrici che esprimono PDGFR (O2A). Linee di topo knockout

PDGF-A e PDGFR mostrano difetti nella mielinizzazione del SNC, a causa

di difetti di migrazione, di sopravvivenza e differenziazione di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) (Baron et al. 2002; Calver et al. 1998; Fruttiger et al. 1999; Klinghoffer et al. 2002) e sviluppano un fenotipo di tremore muscolare (Fruttiger et al. 1999). I contributi di diverse vie di segnalazione all’attività del PDGFR nella regolazione dello sviluppo della linea degli oligodendrociti sono stati analizzati in vitro ed in vivo mediante la delezione mirata di residui critici di tirosina nel dominio intracellulare che legano particolari componenti di segnalazione. Si è osservato che l'attivazione di entrambe le vie di segnalazione Src e PI3K sono necessarie per una corretta mielinizzazione del SNC (Klinghoffer et al. 2002). Questa giustapposizione di espressione dei ligandi nei neuroni e dei recettori nelle cellule gliali suggerisce che i neuroni sono in grado di fornire i fattori trofici di crescita necessari alle cellule precursori gliali.

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Studi in Xenopus hanno portato alla conclusione che la segnalazione del PDGF è implicata nella gastrulazione e nella chiusura del tubo neurale (Ataliotis et al. 1995). La gastrulazione comporta una serie di complessi e coordinati movimenti cellulari che danno origine al piano del corpo in tutti i vertebrati. In Xenopus laevis, questo processo inizia con l'involuzione di cellule sul lato dorsale dell'embrione. Al fine di valutare il ruolo di PDGF-A durante la gastrulazione di Xenopus, è stato generato un mutante dominante negativo del suo recettore, PDGFR , per interrompere la segnalazione del PDGF-A nell'embrione ed è stato dimostrato che è il

PDGF è necessario per un corretta gastrulazione.

1.5. Ruolo del PDGF-B nei gliomi

Come Uhrbom e colleghi (1998) hanno dimostrato per primi, la sovraespressione in vivo del PDGF-B in cellule staminali neurali di topo neonatale induce un’efficiente formazione di gliomi (Figura 1.4).

13 Fig. 1.4: Trasduzione del PDGF-B di precursori neurali neonatali utilizzando il

sistema aviario retrovirale RCA-tva.

I gliomi sono classificati in base alle loro caratteristiche istopatologiche (determinate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità) e all'espressione dei marcatori di diversi linee gliali, in diversi gruppi di cui i più rilevanti sono astrocitomi, oligodendrogliomi, oligoastrocitomi e tumori ependimali. Il glioblastoma è la forma più maligna ed è comunemente considerato come il più alto grado di astrocitoma (Furnari et al. 2007; Louis et al. 2001), anche se la presenza di forme oligodendrogliali di IV grado è sempre più rilevata (Louis et al. 2007). I gliomi sono ulteriormente suddivisi in classi da I-IV gradi con il IV grado che è il più maligno (Louis et al. 2007). Ma la classificazione istopatologica dei gliomi è indebolita dal fatto che non tiene in debita considerazione i risultati recenti della biologia dello sviluppo che mostrano che la barriera tra linee cellulari neurali e gliali non è rigida come si pensava in precedenza. La diversità dei gliomi è rispecchiata dal numero di vie di segnalazione diverse che giocano un ruolo nella generazione di questi tumori (Furnari et al. 2007; Shih et al. 2006). I tumori al cervello permangono all'interno del sistema nervoso

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centrale e molto raramente metastatizzano, a differenza di altri tumori maligni solidi.

La trasduzione del PDGF-B in cellule progenitrici gliali della sostanza bianca del proencefalo adulto produce rapidamente glioblastomi con caratteristiche di oligodendroglioma, e lo stesso succede se progenitori di oligodendrociti derivati dalla sostanza bianca sono trasdotti ex vivo, e in seguito sottoposti a trapianto intracranico, confermando la capacità di questa specifica popolazione di cellule di essere trasformata dal PDGF-B (Assanah et al. 2006) (Figura 1.5).

Fig. 1.5: Trasduzione PDGF-B/GFP di progenitori della sostanza bianca e la

perfusione continuo del PDGF-A intraventricolare del cervello adulto.

Complessivamente, questi dati mostrano che i gliomi che derivano come conseguenza di una segnalazione aberrante del PDGF-B da diversi precursori neurali mostrano invariabilmente caratteristiche oligodendrogliali mentre mancano di caratteristiche di astrociti (Assanah et al. 2006; Dai et al. 2001; Jackson et al. 2006).

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Almeno due spiegazioni non mutualmente esclusive, tuttavia, possono spiegare queste osservazioni. In primo luogo, alterazioni del “pathway” del

PDGF-B possono rappresentare un evento secondario durante la

progressione di almeno alcuni astrocitomi. In questo scenario, nonostante l’incapacità della sovraespressione del PDGF-B a trasformare gli astrociti o dare luogo a astrocitomi da cellule staminali neurali adulte, la segnalazione aumentata del PDGF-B può ancora rappresentare una lesione molecolare secondaria vantaggiosa per gliomi astrocitari già avviati. Tuttavia, è anche possibile che alcuni gliomi classificati come astrocitomi rappresentino in realtà tumori oligodendrogliali a causa di un’errata classificazione. Tali errori possono derivare dalla natura piuttosto inaffidabile delle valutazioni istopatologiche e dalla presenza di abbondanti astrociti reattivi infiltrati.

Oligodendrogliomi di topo composti da cellule tumorali marcate con fluorescenza forniscono un forte argomento a favore della seconda possibilità (Assanah et al. 2006; Calzolari et al. 2008; Appolloni et al. 2009). Cellule con caratteristiche astrocitiche spesso rappresentano una frazione rilevante delle cellule all'interno del tumore, eppure la capacità di visualizzare le cellule tumorali singole chiarisce che questi sono solo astrociti reclutati / attivati. Dunque, una possibile errata identificazione di alcuni gliomi come astrocitomi ha contribuito alla discrepanza tra le osservazioni fatte nell’uomo e nel modello murino di tumori cerebrali.

16 Fig. 1.6: Trasduzione in utero di progenitori neurali telencefalici con vettori

retrovirali PDGF-B/GFP (Calzolari et al. 2008; Appolloni et al. 2009)

Sono stati condotti esperimenti più recenti su una popolazione costituita da cellule progenitrici multipotenti, cioè le cellule della glia radiale del telencefalo embrionale. Questo è stato ottenuto mediante iniezioni in utero di vettori retrovirali che esprimono PDGF-B (Figura 1.6). Sorprendentemente, nonostante si trattasse di una popolazione di progenitori altamente eterogenea, capace di dare origine a tutti i tipi di cellule del SNC (Malatesta 2008), questo approccio ha portato alla formazione di oligodendrogliomi puri, come dimostrato da analisi di “microarray”. Questa analisi ha mostrato un profilo di espressione genica sorprendentemente uniforme tra i gliomi indotti dal PDGF-B e ha rivelato una minima somiglianza con precursori degli oligodendrociti (OPC) se confrontato con quello di un ampio insieme di tipi di cellule neurali. Anche se suggestivi, questi dati non forniscono la prova sulla capacità del

PDGF-B di decidere il destino delle cellule. Questo aspetto è stato studiato

direttamente in vitro su progenitori neurali multipotenti in coltura, a seguito di trasduzione clonale con un vettore retrovirale esprimente il

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neuronale e gliale, ma in seguito alla trasduzione danno origine a OPC con maggiore frequenza rispetto alle colture trasdotte con vettori retrovirali di controllo.

Complessivamente, questi dati suggeriscono che la modulazione del destino dei precursori neurali può essere un rilevante processo nel corso dell’iniziazione del glioma da parte del PDGF-B.

In diversi tumori, la segnalazione del PDGF-B sostiene la crescita del tumore, almeno in parte, promuovendo la creazione e il mantenimento intratumorale di una rete di vasi sanguigni e reclutando componenti cellulari stromali (Dong et al. 2004; Lokker et al. 2002; Pietras et al. 2008; Shih et al. 2004). Inoltre, le cellule del glioma di solito mostrano una straordinaria attività infiltrativa, una caratteristica fedelmente riprodotta in modelli murini di gliomagenesi indotta dal PDGF-B, dove le cellule che sovraesprimono PDGF-B migrano estesamente attraverso il cervello in un modo che ricorda l'attività migratoria di cellule progenitrici neurali (Assanah et al. 2006; Calzolari et al. 2008; Appolloni et al. 2009). Infatti, recenti osservazioni hanno suggerito che le cellule del glioma sfruttano il macchinario molecolare utilizzato dai normali progenitori neurali (Beadle et al. 2008; Cayre et al. 2009).

I gliomi di alto grado indotti dal PDGF-B dipendono strettamente da esso e non sono più capaci di propagare i tumori in vivo dopo la perdita della sua sovraespressione (Calzolari et al. 2008). In vitro, queste cellule presentano l’inibizione da contatto, mentre le cellule che sovraesprimono il

PDGF–B formano foci massicci di cellule (Assanah et al. 2006; Calzolari et

al. 2008). Inoltre, la perdita della sovraespressione del PDGF-B altera il potenziale infiltrativo delle cellule del glioma, che diventano incapaci di infiltrarsi nel cervello dopo il trapianto intracranico.

Tuttavia, la ri-espressione del PDGF-B ristabilisce prontamente il potenziale oncogeno di queste cellule, e questo è associato al ristabilimento della formazione dei foci in vitro e dell’infiltrazione in vivo. Ciò indica che il ruolo centrale che la segnalazione del PDGF-B gioca nella

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regolazione del potenziale oncogeno di cellule trasformate con il PDGF può incidere sulla proliferazione del tumore e la migrazione.

La natura incurabile dei gliomi è in parte il risultato della loro scarsa accessibilità ai trattamenti chirurgici e farmacologici, ma è per lo più una conseguenza della loro attività infiltrante, che rende quasi impossibile la completa resezione chirurgica.

Sembra quindi probabile che la segnalazione del PDGF-B nel tumore al cervello sia rilevante per l'espansione e la sopravvivenza del tumore, stimoli la proliferazione e, indirettamente, la promozione dei nutrienti da fornire alla massa tumorale (di Tomaso et al. 2009).

Infine, studi sui ligandi PDGF-C e D, hanno dimostrato che anche loro sono espressi nei gliomi (Lokker et al. 2002). In particolare, si ha la loro espressione in linee cellulari tumorali che in precedenza non avevano rilevato PDGF-A o B, indicando che il “pathway” del PDGF può essere coinvolto in una percentuale maggiore di casi di quelli precedentemente riconosciuti.

1.6. La cresta neurale cranica e il ruolo del PDGF

L'attivazione dei recettori del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) provoca risposte cellulari quali la proliferazione e la migrazione. Gli studi su organismi modello hanno dimostrato che questa famiglia di recettori (PDGFR e PDGFR ) è richiesta in molte popolazioni di cellule mesenchimali e migratorie durante lo sviluppo embrionale. Una di queste popolazioni di cellule migratorie è la cresta neurale, che forma le ossa craniche e il mesenchima della testa, i neuroni dei gangli simpatici, i melanociti e la muscolatura liscia. Nonostante ci sia espressione del

PDGFR nelle cellule della cresta neurale (NCC) craniche migratorie (Smith

et al. 2010), il PDGFR sembra essere il recettore del PDGF coinvolto nello sviluppo delle NCC. Questa dipendenza dalla segnalazione di PDGFR può

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verificarsi perché i ligandi che sono espressi principalmente nelle NCC cranici sono PDGF-A e PDGF-C. Tuttavia, diversi studi suggeriscono che il

PDGFR possa giocare un ruolo minore nello sviluppo di tessuti derivati

dalle NCC craniche.

Un ruolo di supporto per la segnalazione del PDGFR nello sviluppo delle NCC craniche è stato inoltre suggerito quando sono stati generati mutanti ipomorfi di segnalazione di PDGFR e PDGFR . In questo studio, si è constatato che una mutazione ipomorfa in PDGFR non mostra l'intera gamma di fenotipi delle NCC normalmente associati con embrioni nulli

PDGFR . Solo quando gli embrioni hanno anche espresso un allele simile

ipomorfo PDGFR sono state osservate significative anomalie cranio-facciali ( Klinghoffer et al. 2002).

Ancora oggi però il meccanismo d'azione del PDGF nella cresta neurale rimane controverso.

La cresta neurale cranica è una popolazione di cellule pluripotenti altamente specializzata presente nello sviluppo embrionale di tutti i vertebrati che si origina al confine tra la piastra neurale e l’ectoderma e successivamente va incontro ad un processo di transizione epitelio-mesenchimatica che conferisce alle cellule l’abilità a migrare. Le cellule della cresta neurale, che hanno inizialmente le caratteristiche di cellule epiteliali, quando iniziano la migrazione, si trasformano in cellule di tipo mesenchimatico, smettono di essere legate alle cellule adiacenti e migrano fuori dalla lamina epiteliale. La cresta neurale cranica quindi costituisce un ottimo sistema modello per studiare questi eventi di motilità cellulare in vivo in quanto vanno incontro a questo processo di trasformazione epitelio-mesenchimatica spesso ricapitolata in molti tumori e ad un estensivo processo di migrazione. Durante questo lasso di tempo, le NCC vanno incontro ad una serie di modificazioni citoscheletriche e morfologiche che permettono loro di lasciare il neuroepitelio. In concomitanza dei suddetti cambiamenti, esse diventano capaci di migrare grazie all’acquisizione di specifici recettori cellulari, metalloproteinasi e molecole d’adesione che permettono di rispondere alle interazioni

cellula-20

cellula e ai segnali che l’ambiente circostante invia per influenzare il “pathway” migratorio.

Quando le NCC arrivano a destinazione, si aggregano durante l’ultima fase di differenziamento. Questa successione di eventi è orchestrata da una complessa rete di attività geniche che coinvolge vari “pathways” di segnalazione (es: Wnt, bone morphogenetic proteins (BMP), fibroblast growth factors (FGFs) e molti fattori di trascrizione.

Sono stati identificati vari geni in grado di conferire un’identità alla cresta neurale. Tra questi si annoverano Sox9, Sox10, FoxD3, Snail2/Slug, c-Myc e AP2 che sono fattori di trascrizione espressi nelle NCC premigratorie o durante la migrazione (Meulemans and Bronner-Fraser 2005).

Studi morfologici e di “fate mapping” mostrano che le NCC craniche migrano dalla regione dorsale del tubo neurale ventralmente a livello delle tasche faringee lungo tre “streams”: mandibolare, ioideo e branchiale. Le cellule del primo “stream” originano dal mesencefalo e dai primi due rombomeri del romboencefalo e migrano attorno all’occhio e nella prima tasca faringea dove differenzieranno nella cartilagine di Meckel, nel quadrato e nella cartilagine suboculare. Inoltre partecipano alla formazione del nervo trigemino, ai tessuti connettivi della faccia, al mesenchima e agli strati coroidei dell’occhio e alla cornea. Le cellule che invece migrano più tardivamente, le creste ioidee, originano dal quarto rombomero e migrano nella seconda tasca faringea differenziandosi nella cartilagine del ceratoiale e contribuendo alla formazione dei gangli VII e VIII mantenendosi vicine al sistema nervoso centrale in via di sviluppo (Hensey and Gautier, 1998).

Infine lo “stream” branchiale è costituito da cellule del sesto e settimo rombomero che migrano nella terza e quarta tasca faringea differenziandosi nelle cartilagini del cestello branchiale (Figura 1.7).

Nonostante le popolazioni di NCC vengano specificate precocemente, le NCC che raggiungono i propri bersagli sono ancora pluripotenti. Il loro destino definitivo viene specificato più tardivamente a seconda della loro

collocazione all’interno tra il momento in cui destino definitivo.

Le NCC craniche

craniofacciali e contribuiscono testa ed alla formazione

particolare, durante l dell’adesione cellulare dell’adesione alla m 1997). Fig. 1.7: Rappresentazione neurale (NCC) cefalica in Et, etmoide; M, cartilagine branchiale.

o dell’embrione. Esiste infatti una correlazione le cellule migrano a partire dal tubo

differenzieranno quindi dando origine ribuiscono alla formazione della m

ione dei gangli dei nervi cranici ( a migrazione delle NCC si osserva

re al neuroepitelio e un corrispondente atrice extracellulare (Bronner-Fraser

tazione schematica della migrazione delle

Xenopus laevis e rispettivi derivati craniofacciali.

gine di Meckel; Q, quadrato; So, sub

orrelazione diretta o neurale ed il loro ine alle cartilagini muscolatura della (Noden 1983). In

una diminuzione ondente aumento ser 1994; Perris

e cellule della cresta facciali. C, ceratoiale;

1.7. Xenopus lae

Fin dalla fine dell’ottocento, studi volti a capire i

vertebrati sono stati animali come modello

sviluppo di tutti i vertebrati base dell’embriogenesi mammiferi. Come sistema l’anuro africano Xenopus laevis organismo sono molteplici: quantità di uova p embrionale; e possibilità funzione mediante m rispettivamente di (morpholino), mRNA gene di interesse.

Fig. 1.8: Schema dei

1998)

us laevis come sistema modello

meccanismi alla base dello sviluppo condotti negli anfibi. La scelta o sperimentale si è basata sul fatto

tebrati sono alquanto simili e perciò si degli anfibi sono validi per tutti i stema modello è stato scelto nel n

opus laevis (Figura 1.8). I vantaggi

olteplici: sviluppo esterno degli e prodotte da un’unica femmina;

lità di effetture esperimenti di perdita icroiniezione nell’embrione a stadio

specifici oligonucleotidi antisenso codificanti per proteine mutanti o d

i principali stadi di sviluppo di Xenopus laevis

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odello

mentali, molti degli po embrionale dei di queste specie che le modalità di ò i meccanismi di vertebrati, fino ai nostro laboratorio offerti da questo embrioni; grande rapido sviluppo ita e guadagno di o di 2 o 4 cellule, senso modificati delete e mRNA del