39 CAPITOLO IV
STUDIO SPERIMENTALE
Osteogenesi, osteo-induzione e osteo-conduzione rappresentano i tre elementi essenziali per la rigenerazione ossea insieme alla completa osteo-integrazione tra innesto osseo e osso lesionato. Un’ampia gamma di “impianti ossei alternativi” diversi per composizione, meccanismo d'azione e caratteristiche peculiari, è attualmente disponibile in commercio (Giannoudis et al., 2005). Un impianto osseo ideale dovrebbe essere: osteo-conduttivo, osteo-induttivo, biocompatibile, biodegradabile, strutturalmente simile all'osso, facile da utilizzare e relativamente economico (Giannoudis et al., 2005).
I continui progressi nel campo della terapia genica e dell'ingegneria tissutale hanno portato allo studio di fattori di crescita, di scaffolds biologici, nonché all'incorporazione di cellule staminali mesenchimali fino allo sviluppo di sostituti tissutali pronti per l'uso.
Una strategia comune nel campo dell’ingegneria tissutale prevede l’uso di matrici tridimensionali biodegradabili in materiale sintetico o naturale, comunemente denominate scaffolds, che forniscono alle cellule una struttura temporanea che può riprodurre le funzioni della matrice extracellulare dei tessuti biologici, agire come substrato per l’adesione cellulare, fornire supporto meccanico e guidare il tessuto durante la rigenerazione (Marler et al., 1998; Kim & Mooney, 1998). Scaffolds costituiti da una struttura micro/nanofibrosa hanno mostrato alcune caratteristiche che li rendono interessanti per l’applicazione nel campo dell’ingegneria tissutale, quali elevata porosità e area superficiale che possono favorire l’adesione, la migrazione e l’interazione cellulare, nonché il rilascio di fattori bioattivi (Chew et al., 2006). Le tecniche di elettrospinning e wetspinning stanno riscuotendo notevole successo nel campo dell’ingegneria tissutale grazie alla loro semplicità, basso costo, facilità di caricamento di fattori bioattivi nelle fibre e capacità di produrre strutture fibrose tridimensionali con diversa organizzazione e scala microstrutturale (We & Ramakrishna, 2006; Puppi et al., 2010b).
Diversi polimeri naturali, come collagene, chitosano o fibrinogeno, o sintetici, come (poli(ε-caprolactone) [PCL], acido poli(lattico-co-glicolico) [PLGA] o acido poli(L-lattico) [PLLA]), sono stati proposti in ingegneria tissutale (Puppi et al., 2010a; Puppi et al., 2010b; Engel et al., 2008). Il PCL è uno fra i polimeri sintetici maggiormente studiati nel campo della rigenerazione del tessuto osseo grazie alle sue proprietà di biocompatibilità e
40 biodegradabilità (approvato già da tempo dalla FDA viene impiegato per la produzione di suture riassorbibili utilizzate in chirurgia). Il PCL è un poliestere alifatico che in condizioni fisiologiche può essere degradato sia per via enzimatica sia per via idrolitica. Data la sua struttura semicristallina, presenta una degradazione molto lenta (circa 2 anni) in quanto l’alto grado di impaccamento delle catene polimeriche limita l’ingresso di fluidi nella struttura molecolare e quindi rallenta la degradazione del materiale (Pitt, 1990). Diversi studi hanno proposto il suo uso nel campo dell’ingegneria tissutale e la sua bassa velocità di degradazione suggerisce il suo impiego per la rigenerazione del tessuto osseo (Hutmacher, 2000; Savarino et al., 2007). In particolare l’inclusione di una fase ceramica bioattiva, ad es. nano particelle di idrossiapatite (HA), in matrici di PCL tridimensionali (scaffolds) è stata dimostrata migliorare le proprietà meccaniche e l’osteoconduttività del materiale, nonché favorire l’adesione e la proliferazione di cellule osteoblastiche in vitro, senza alterazioni a carico del fenotipo (Mondrinos et al., 2006; Lei et al., 2007; Fabbri et al., 2010).
I polimeri a stella sono una classe di materiali sintetici costituiti da una struttura macromolecolare ramificata in cui tre o più catene polimeriche lineari sono legate ad una molecola centrale a basso peso molecolare. In genere, in soluzione e allo stato fuso, hanno una struttura molecolare compatta e presentano proprietà differenti rispetto ai corrispettivi polimeri lineari con stessa composizione monomerica e equivalente peso molecolare, come minore viscosità e miglior controllo della concentrazione dei gruppi terminali di catena. In questa attività di ricerca verrà impiegato un PCL a stella (*PCL), sviluppato dal gruppo del Prof. Ramani Narayan del Michigan Biotechnology Institute (Balakrishnan et al., 2004;
Balakrishnan et al., 2006), costituito da tre catene di PCL lineari attaccate ad un atomo di alluminio centrale.
In letteratura un difetto di dimensioni critiche o Critical Size Defect (CSD) viene definito come la perdita di sostanza ossea di dimensioni tali da non evolvere spontaneamente verso la guarigione durante tutta la vita dell’animale (Schmitz & Hollinger, 1986; Hollinger &
Kleinschmidt 1990). Il CSD può essere considerato anche come discontinuità in esito a condizioni di fallita osteogenesi riparativa quando il processo di guarigione ossea non riesce a colmare più del 10% della lunghezza della perdita di sostanza ossea totale creatasi (Schmitz & Hollinger, 1986).
41 Numerosi studi sperimentali condotti in vivo hanno scelto come modello sperimentale il modello cunicolo. Esso è riportato (An & Friedman, 1999a; Pearce et al., 2007) quale specie comunemente utilizzata per la conduzione di studi sperimentali per la valutazione di diversi tipi di materiali ossei per impianti. Il coniglio si presenta, infatti, di facile gestione e la sua taglia lo rende particolarmente adatto alla conduzione di diversi tipi di valutazione sul meccanismo di rigenerazione ossea. Sebbene esistano enormi differenze con le comuni specie da affezione (cane, gatto, grossi erbivori) e con l’uomo, sia per la conformazione anatomica, sia per la struttura istologica dell’osso (Wang et al., 1998), sia per il rimodellamento osseo (haversiano e corticale) cui esso va incontro (Castaneda et al., 2006), il modello cunicolo, e in particolare la razza New Zealand White, rappresenta un modello particolarmente diffuso in particolare per la valutazione della rigenerazione ossea in difetti critici a carico delle ossa lunghe (Hedberg et al., 2005; Bodde et al., 2008; Kasten et al., 2008; Liu et al., 2009; Niemeyer et al., 2010; Wang et al., 2010).
42 SCOPO DEL PROGETTO
In considerazione della crescente incidenza di lesioni ossee caratterizzate da grave perdita di sostanza che richiedono l’impiego di innesti ossei non sempre facilmente reperibili, è emersa, con sempre maggior insistenza, la necessità di allestire dei supporti tridimensionali in grado di promuovere e sostenere la rigenerazione ossea.
Il presente lavoro di ricerca si pone come obiettivo di valutare il possibile impiego di scaffolds tridimensionali micro/nano strutturati in *PCL nel processo di rigenerazione ossea su lesioni con grave perdita di sostanza.
Gli scaffolds a base di *PCL saranno allestiti con tecnica da wet-spinning (Puppi et al., 2011b) automatizzata in maniera da permettere l’allestimenti di strutture tridimensionali con morfologia simile al segmento osseo da trattare. Durante l’allestimento delle guide saranno ottimizzati i parametri del processo di produzione in correlazione con la morfologia della fibre ottenute.
Le capacità osteogenetiche, osteoinduttive e osteoconduttive degli impianti verranno quindi valutate mediante studio in vivo, su modello cunicolo, analizzando l’entità del processo rigenerativo attuato e la morfologia del tessuto neoformato in difetti ossei di dimensioni critiche.
