LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Indrė Falkauskienė
Skirtingų zearalenono ir kitų mikotoksinų koncentracijų, aptinkamų melžiamų karvių pašaruose, poveikis pieno kokybiniams rodikliams
Effects of different concentrations of zearalenone and other mycotoxins found in dairy cows on milk quality indicators
Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Violeta Baliukonienė Maisto saugos ir kokybės katedra
Kaunas, 2019
2
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Skirtingų zearalenono ir kitų mikotoksinų koncentracijų, aptinkamų melžiamų karvių pašaruose, poveikis pieno kokybiniams rodikliams“
1. Yra atliktas mano pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data)
Indrė Falkauskienė
(parašas)PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data)
Indrė Falkauskienė
(parašas)MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data)
doc. dr. Violeta Baliukonienė
(parašas)MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) _________________________________________________________________
2) _________________________________________________________________
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės –(iaus) vardas, pavardė) (parašas)
3
Turinys
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Pagrindiniai mikotoksinai aptinkami pieninių karvių pašaruose ... 11
1.1.1 Aflatoksinai... 11
1.1.2 Zearalenonas ... 12
1.1.3 Deoksinivalenolis ... 14
1.1.4 Ochratoksinai ... 14
1.2 Mikotoksinų įtaka galvijų fiziologiniams procesams ... 15
1.3 Mikotoksinų mažinimo būdai ... 17
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 19
2.1 Tyrimų objektas ... 19
2.2 Mikotoksinų nustatymas karvių pašaruose ir/ar pašarinėse žaliavose ... 20
2.3 Zearalenono nustatymas pieno mėginiuose ... 21
2.4 Statistinis duomenų įvertinimas ... 22
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
3.1 Mikotoksinų aptikimas pašarų mėginiuose ... 23
3.2 Pieno kokybiniai rodikliai ir mikotoksinų koncentracijos pašaruose ... 25
3.2.1 Pieno cheminės sudėties analizė ... 25
3.2.2 BBS, SLS pieno mėginiuose ir mikotoksinų koncentracijos pašaruose ... 30
3.3 Zearalenono koncentracija tirtuose pieno mėginiuose ... 35
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
IŠVADOS ... 39
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
1 priedas ... 45
4
SANTRAUKA
Skirtingų zearalenono ir kitų mikotoksinų koncentracijų, aptinkamų melžiamų karvių pašaruose, poveikis pieno kokybiniams rodikliams
Indrė Falkauskienė Magistro baigiamasis darbas
Mokslinis – tiriamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Mikotoksikologijos laboratorijoje. Tyrimai atlikti 2017 – 2019 metais. Pašarai tyrimams buvo imami iš Lietuvoje esančių pieninių karvių ūkių.
Pašaruose nustatytos mikotoksinų koncentracijos (aflatoksinas B
1, zearalenonas, deoksinivalenolas), o pieno mėginiuose nustatinėjome ZEA ir pieno sudėties ir kokybinius rodiklius (riebalai, baltymai, urėja, laktozės kiekis, pH, SLS, BBS). Pašarų mėginiuose mikotoksinų koncentracijos nustatytos plonasluoksnės chromatografijos (PLCh) metodu (Romer Labs methods). Piene ZEA nustatėme panaudodami ELISA testą RIDASCREEN® Zearalenon (R-Biopharm AG). Pieno kokybiniai rodikliai buvo analizuojami VĮ „Pieno tyrimai“ (Lietuva).
Darbo apimtis: 45 puslapiai, 16 paveikslėlių ir 4 lentelės.
Darbo tikslas: Nustatyti ir įvertinti kaip pašarai, užteršti skirtingomis zeralenono ir kitų mikotoksinų (aflatoksino B
1, deoksinivalenolio) koncentracijomis, įtakoja pieno kokybę.
Atlikus tyrimus nustatėme, kad žaliavose dažniausiai aptinkamas buvo ZEA, net 74,29 proc.
analizuojamų mėginių, kombinuotuose pašaruose - ZEA – 93,75 proc. Tiriamojo darbo metu nustatėme, kad žaliavose AFL B
1ir DON užterštumo procentas buvo vienodas – 54,29 proc.
Analizuojant nustatytas mikotoksinų koncentracijas, didžiausios ZEA ir AFL B
1koncentracijos nustatytos pašaruose paimtuose nuo šėrimo stalo (ZEA – 496,25 µg/kg; AFL B
1– 2,67 µg/kg). Didžiausia DON koncentracija nustatyta grūdinėse žaliavose – 250 µg/kg. Mažiausias mikotoksino DON koncentracijas nustatėme žoliniuose – aliejiniuose pašaruose (43,18±21,10 µg/kg), ZEA mažiausias koncentracijas nustatėme grūdinėse žaliavose (217,5± 55 µg/kg. AFL B
1mažiausias koncentracijas aptikome taip pat grūdinėse žaliavose (0,85±0,2 µg/kg).
Mūsų tyrimas parodė pieno BBS priklausomybę nuo mikotoksinų pašaruose, matomas ryšys,
kad didžiausi BBS kiekiai nustatyti tuose pieno mėginiuose, kuriuose buvo nustatytos didelės
mikotoksino ZEA koncentracijos pašaruose. BBS piene koreliacija su ZEA pašaruose nustatėme
vidutinę neigiamą (r=-0,413). Galima pastebėti ir tai, kad kuo didesnė ZEA koncentracija mėginyje
atitinkamai ir BBS kiekis išauga. Dėl to remiantis bandymu galime teigti, kad BBS proporcingai
5
aukštas, kai mėginyje nustatomas didelė ZEA. Apie 33 proc. mėginiuose AFL B1 koncentracija nustatyta didesnė kaip 5 µg/kg, o 66,7±0,1 proc. mėginiuose, kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B1, BBS kiekis buvo didesnis kaip 120±4 tūkst./ml. BBS koreliacija su AFL B
1– labai silpna teigiama (r=0,059).
Didžiausi SLS kiekiai pieno mėginiuose, nustatyti tuose ūkiuose, kuriuose buvo nustatytos didelės ZEA koncentracijos pašaruose. Galima pastebėti ir tai, kad kuo didesnė ZEA koncentracija pašaruose atitinkamai ir SLS kiekis piene nustatytas didesnis. Remiantis tyrimo rezultatais galimai SLS didėjimui turi įtakos nustatomas didesnis ZEA kiekis. SLS koreliacija su ZEA nustatėme labai stipri teigiama (r=0,902), su DON – stipri teigiama (r=0,801), o su AFL B
1–silpna teigiama (r=0,342). Remiantis tyrimais 66,6±0,1 proc. mėginių kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B
1, SLS kiekis buvo didesnis kaip 300 tūkst./ml. ZEA koreliacija su riebalų kiekiu – vidutinė teigiama (r=0,502), baltymų kiekiu – labai silpna teigiama (r=0,196), laktozės kiekiu – labai silpna teigiama (r=0,142). AFL B
1koreliacija su riebalų kiekiu – vidutinė neigiama (r= -0,431), baltymų kiekiu – labai silpna neigiama (r=-0,137), laktozės kiekiu – labai silpna teigiama (r=0,175).
Didesnis urėjos kiekis nustatomas tuose mėginiuose, kuriuose nustatomas didesnis ZEA kiekis. Kai ZEA koncentracija didesnė kaip 500 µg/kg, urėjos kiekis svyruoja nuo 20 mg/100 ml (ZEA kiekis 700 µg/kg) iki 30 mg/100 ml (ZEA kiekis 1000 µg/kg).
Tiriamasis darbas parodė, kad 16 proc. tiriamuose pieno mėginiuose aptikome ZEA.
Didžiausios ZEA koncentracijos pieno mėginiuose nustatytos 5 - ame ir 9 – ame ūkyje, atitinkamai 0,3 µg/l ir 0,4 µg/l. Mažiausia ZEA koncentracija pieno mėginyje nustatyta 4 – ajame mėginyje (0,08 µg/l). Koreliacija tarp ZEA koncentracijos nustatyto pašaruose nuo šėrimo stalo ir ZEA nustatyto pieno mėginiuose yra labai stipri neigiama ( r=-0,90).
Raktažodžiai: Mikotoksinai, pienas, karvės, biotransformacija.
6
SUMMARY
Effects of different concentrations of zearalenone and other mycotoxins found in dairy cows on milk quality indicators
Indrė Falkauskienė Master‘s Thesis
The research was conducted in Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Food Quality Control Cathedral, Mycotoxicology lab. Research was during a period between 2017 and 2019. Fodder for the research were taken from the cow farms that operates in Lithuania. The task was to establish amount of the mycotoxins in the fodder (Aflatoxin B1, zearalenone, deoxynivalenol). The milk examples were used to determine ZEA and other quality measures for fat, protein, urea, lactose, pH, SCC, BBS). The fodder samples were tested via PLCh (Romer Labs methods). The ZEA in the milk was measured via ELISA test, RIDASCREEN®
Zearalenone (R-Biopharm AG). The testing was conducted by VĮ „Pieno tyrimai“. (Lithuania).
Thesis consists of: 45 pages, 16 pictures, and 4 tables.
Aim of the thesis: To determine and evaluate how feed contaminated with different concentrations of zearalenone and other mycotoxins (Aflatoxin B
1, deoxynivalenol) influences milk quality.
According to our research, we found that the most common source of mycotoxin in raw materials was ZEA, as much as 74.29 %. And the most common mycotoxin found in compound feed was also ZEA - 93.75 %. During the research, we found that the percentage of AFL B
1and DON in the raw materials was the same - 54.29 %.
In the analysis of identified mycotoxin levels, the highest concentrations of ZEA and AFL B
1were determined from feed table (ZEA - 496.25 µg/kg; AFL B1 - 2.67 µg/kg). The highest DON concentration was found in grain raw materials – 250 µg/kg. The lowest concentrations of mycotoxin DON were found in herbaceous oilseeds (43.18 ± 21.10 µg/kg), the lowest concentrations of ZEA were found in grain raw materials (217.5 ± 55 µg/kg. AFL B
1minimum concentrations were also found in grain feedstock (0.85 ± 0.2 µg/ kg).
The link between TBC in milk dependency on mycotoxins in feed and the presence of the
highest levels of BBS in those milk samples with high concentrations of ZEA in feed is evident. It
can also be observed that the higher the ZEA concentration in the feed sample is, the higher
amount of TBC in milk follows. As a result, we can assume that the TBC is proportionally high
7
when a large amount of ZEA is detected in the sample. About 33 percent AFL B
1was found to be above 5 µg / kg in the samples and 66.7 ± 0.1% in samples with mycotoxin AFL B
1, the TBC content was greater than 120 ± 4 thsd./ml.
The highest levels of SCC were found in the milk samples with high ZEA concentrations in feed. It can also be observed that the higher the ZEA concentration in the feed sample is, the higher the amount of SCC in milk follows. Therefore, based on the test, we can say that the increase in SCC is influenced by the higher ZEA content. The SCC correlation with ZEA detected very strong positive (r=0,902), with DON - strong positive (r=0,801) and with AFL B
1weak positive (r=0,342).
According to the studies, 66.6 ± 0.1 % of the total number of samples containing mycotoxin AFL B
1were above 300 thsd. / ml.
ZEA correlation with milk fat – average positive (r=0,502), milk proteins – very weak positive (r=0,196), milk lactose - very weak positive (r=0,142). AFL B
1correlation with milk fat average negative (r= -0,431), milk proteins – very weak negative (r=-0,137), milk lactose - very weak positive (r=0,175). When the ZEA concentration is greater than 500 µg/kg, urea levels range from 20 mg/100 ml (ZEA content 700 µg/kg) to 30 mg/100 ml (ZEA content 1000 µg/kg).
Research has shown that 16 % ZEA mycotoxin was detected in the milk samples. The highest ZEA concentrations in milk samples were determined from farm 5 and 9, respectively 0.3 µg/l and 0.4 µg/l. The minimum ZEA concentration in the milk sample was determined in sample 4 (0.08 µg/l). Correlation with ZEA concentration detected in feed ZEA concentration in milk sample are very strong negative ( r=-0,90).
Key words: Mycotoxins, milk, cows, biotransformation.
8
SANTRUMPOS
AESCh –aukšto efektyvumo slėgio skysčių chromatografijos metodas
AFLB
1– Aflatoksinas B
1BBS – bendras bakterijų skaičius
BBU – Bendras bakterinis užterštumas
Didž. –didžiojo
DNR –Deoksiribonukleorūgštis
DON – deoksinivalenolas
IFA – imunofermentinė analizė
kt. – kiti
m. – metai
mg/ml – miligramai mililitre
OT – optinis tankis
OTA –ochratoksinas A
PLCh – plonasluoksnė chromatografija
ppb – milijardinė dalis (part per billion μg kg
-1)
SLS – somatinių ląstelių skaičius
TMR –pašaras nuo šėrimo tako
tūkst. – tūkstantis
UV – ultravioletiniai spinduliai
ZEA – zearalenonas
ŽŪIKVC – Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras
μg – mikrogramai
μl – mikrolitrai
9
ĮVADAS
Lietuvos žemės ūkio ministerija teigia, kad pieno ūkis yra viena svarbiausia Lietuvos žemės ūkio šaka, o pieno gamyba sudaro beveik penktadalį visos žemės ūkio produkcijos. Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro (ŽŪIKVC) duomenimis, pastaraisiais metais pienininkystės ūkių skaičius sumažėjo apie 12,2 proc. 2018 m. birželio mėnesį buvo registruoti 39 974 pienininkystės ūkiai, kuriuose laikoma 272 162 karvės (2017 m.– 45 508 ūkiai ir 284 711 karvių) [56,61,62].
Tačiau pagaminimo pieno kiekiai nemažėja. Tai rodo, kad primilžiai iš karvių tik didėja.
Tarptautinė pienininkystės federacija, analizuodama pienininkystės vaidmenį užtikrinant saugią ir tvarią mitybą, nurodė, kad šis sektorius prisidės prie pasaulio žmonių pamaitinimo. Jie teigia, kad siekiant išmaitinti 9 milijardus žmonių, būtina taikyti inovatyvų gyvulių šėrimą bei kitas technologijas. Norint tai užtikrinti būtina užtikrinti ir tinkamos kokybės pašarus, kad išgautume aukštos kokybės pieną [42,61,63].
Atsižvelgiant į Lietuvos klimatines sąlygas ir mokslinių tyrimų duomenis pastebėtina, kad galvijų mitybai naudojamo šieno ir siloso kokybė ne visuomet aukštos kokybės, ko pasekoje neretai neišvengiamas ir Fusarium, Penicillium, Aspergillus ar Cladosporium genčių įvairių rūšių grybų užkrėstumas. Daugelis ankščiau minėtų grybų sugeba gaminti antrinius grybų metabolitus – mikotoksinus (deoksinivalenolą, zearalenoną, ochratoksiną, T–2 toksiną, aflatoksinus, citochalaziną, ochratoksinus, patuliną, peritremą ir kt.), kurie gali sukelti mikotoksikozes [38,47].
Šiuo metu žinoma virš 400 mikotoksinų rūšių, o kiekvienos rūšies poveikis organizmui yra skirtingas. Dėl dažno nustatymo jie laikomi vienu iš svarbesnių gyvūnų sveikatos rizikos veiksnių [7,57].
Šeriant produkcijos gyvūnus pašarais, kurie užteršti sąlyginai nedidelėmis mikotoksinų koncentracijomis poveikis yra tyrinėtas mažai, dar mažiau tyrinėtas organizmo atsakas kai ilgą laiką šeriamos karvės pašarais, turinčiais žemus mikotoksinų lygius. Kokiomis dalimis organizmas akumuliuoja savyje. Neigiamas mikotoksinų poveikis gyvūno sveikatingumui nėra galutinai aiškus bei kokia dalis mikotoksinų metabolitų, praėję organizmo apsaugos barjerus, patenka į pieną.
Darbo tikslas: Nustatyti ir įvertinti, kaip pašarai, užteršti skirtingomis zearalenono ir kitų
mikotoksinų (aflatoksino B
1, deoksinivalenolio) koncentracijomis įtakoja pieno kokybę.
10
Darbo uždaviniai:
Įvertinti X ūkių pašarų taršą mikotoksinais (alfatoksinu B1, zearalenonu, deoksinivalenoliu);
Įvertinti X ūkiuose gaunamo pieno kokybę pagal kokybinius rodiklius bei jų koreliaciją su mikotoksinų kiekiais pašaruose;
Nustatyti, kaip koreliuoja zearalenono koncentracija pašaruose su piene.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pagrindiniai mikotoksinai aptinkami pieninių karvių pašaruose
Benchaar kartu su mokslininkais teigia, kad mikroskopiniai grybai yra klasė organizmų, kurie paplitę plačiausiai ir egzistuoja kaip saprofitai. Jų teigimu pašaruose dažniausiai paplitusios mikroskopinių grybų gentys, kurios produkuoja mikotoksinus - Fusarium, Alternaria, Penicillium ir Aspergillus [6].
Lietuvoje pagaminti pašarai, skirti žemės ūkio paskirties gyvūnams, gali būti užsikrėtę mikotoksinus gaminančiais mikroskopinius grybus ar pavojingomis bakterijomis. Ypatingai pavojingais pelėsiniais grybais laikomi tie, kurie sugeba išskirti nuodingus cheminius junginius – mikotoksinus. Tai natūralios kilmės laikomas mikroskopinių grybų medžiagų apykaitos produktas, pasižymintis toksiškumu kai patenka su pašaru ar įkvepiamas. Lietuvos žemės ūkio konsultavimo tarnybos nuomone Lietuvoje mikroorganizmų daromi nuostoliai gyvulininkystės sektoriui mažai tyrinėjami, o tokiose ES šalyse kaip Vokietija, Lenkija, Švedija ,Suomija, Danija, Prancūzija tokie tyrinėjimai laikomi prioritetiniais [39].
1.1.1 Aflatoksinai Šiuos toksinius junginius išskiria
Aspergillus flavus ir Aspergilus parasiticus. Pagrindiniai šios toksinų grupės mikotoksinais laikomi aflatoksinas B
1ir aflatoksinas B
2. Aflatoksinas G
1, G
2ir aflatoksinas M
1yra oksiduoti metabolitai iš aflatoksino B
1(1 pav.) [1,19].
Aflatoksinas M
1aptinkamas tik karvių piene, nes pašaruose dažniausiai randamas AFLB
1[1].
1 pav. Struktūrinės aflatoksinų B
1,G
1, M
1,B
2,G
2ir M
2formulės [59]
Yra žinoma, kad aflatoksinas B
1yra hepatotoksiškas, labiausiai pasižymi teratogeniniu
veikimu, imunotoksiniu, genotoksiniu. Aflatoksinai yra labai kenksmingi mutagenai ir
kancerogenai. Aflatoksinai gali iššaukti ūmius ir lėtinius poveikius gyvūnų organizmui, taip pat
slopinti imuninę sistemą ir sukelti vėžinius susirgimus organuose [41,49].
12
Aflatoksino M
1kiekis piene yra reglamentuojamas Europos Sjungos teisės aktais. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1881/2006 (su paskutiniais pakeitimais padarytais 2018 m. vasario 26 d.
Komisijos reglamentu (ES) 2018/290, OL 2018 L 55 p.27) nustatantis didžiausias leistinas tam tikrų teršalų maisto produktuose koncentracijas priedo 2 dalies 2.1.13 punkto reikalavimus, apibrėžia maksimalią leistiną normą žaliaviniame piene - 0,05 μg/kg [32].
Šio mikotoksino gamybai ir paplitimui didelę reikšmę turi gamtinės sąlygos, tokios kaip aukšta dirvožemio ar aplinkos temperatūra, mažas kritulių kiekis ir tankus augmenijos arealas. Toks aplinkos fonas skatina mikroskopinio grybo A. flavus augimą ir jo toksinų gamybą. Tokios gamtinės sąlygos taip pat turi įtakos, kad A. flavus mikromicetai lengviau pasiskirsto tam tikruose plotuose [58].
A. flavus ir A. parasiticus toksinus gali sintetinti ir sandėliavimo metu, tačiau tam turėtų būti palankios aplinkos sąlygos. Tinkamiausios sąlygos sandėliavimo metu – aukšta temperatūra (25
oC) ir aukštas drėgmės kiekis (daugiau kaip 85 proc.). Taip pat reikšmės turi ir kaip tinkamai sandėliavimo metu veikia insekticidiniai produktai ir deratizacija, kadangi labai svarbu užtikrinti vabzdžių ir graužikų aktyvumo nebuvimą. Hell ir kt. teigia, kad reikšmingiausi vabzdžiai yra drugiai: Mussidia nigrivenella, Stiphilus zeamais ir Carpophilus dimidiatus, kurie platina pelėsinių grybų sporas [15,21,22].
1.1.2 Zearalenonas Zearalenono molekulinė formulė:
C
18H
22O
5(2 pav.)
.Mikotoksinas yra Fusarium spp. išskiriamas metabolitas, kuris Oliver ir kt. teigimu yra stiprus estrogeninis antrinis metabolitas ir dėl savo struktūros gali sukelti estrogeninį atsaką gyvūnams [44, 24,25].
Šis mikotoksinas laikomas
rezoliucinės rūgšties laktonas plačiai aptinkamas daugelyje javų (kviečiai, miežiai, avižos) ir kukurūzuose.
2 pav. Stuktūrinė zearalenono formulė [53]
Estrogenai atlieka svarbų vaidmenį patogeninėse oraganizmo reakcijose, įskaitant ir vėžinius
sutrikimus reprodukcinėje sistemoje (kiaušidėse, gimdoje). Patologinių pakitimų aptinkama ir
virškinamojo trakto sistemoje, kaulų čiulpuose. Mokslininkų duomenimis ZEA poveikis įrodytas,
kad kenkia DNR [10,33,36,54].
13
Kouadio ir kt. (33) teigia, kad ZEA turi įtakos vaginitų atsiradimui, diarėjos ir pieno liaukos patologiniams pakitimams, ypač telyčioms [33].
Remiantis reglamentuojamu Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro įsakymu „Dėl žemės ūkio ministro 2003 m. birželio 4 d. įsakymo nr. 3d-225 „dėl produktų, skirtų gyvūnų mitybai, privalomųjų saugos reikalavimų techninio reglamento patvirtinimo ir žemės ūkio ministro 2001 m.
birželio 21 d. įsakymo nr. 206 „dėl privalomųjų prekinių pašarų saugos reikalavimų techninio reglamento patvirtinimo“ pripažinimo netekusių galios“ pakeitimo“ priede numatytomis maksimaliomis koncentracijomis, zearalenono pašaruose, žemiausios nustatytos pašaruose paršeliams ir jaunoms kiaulaitėms, dėl to galime daryti išvadas, kad ši gyvūnų rūšis ir jos amžiaus grupė yra jautriausios mikotoksino ZEA poveikiui. Kad kiaulės jautresnės mikotoksinui ZEA negu kitos gyvūnų rūšys teigia Arslanbas ir kt. (2). Lawley (34) kartu su mokslininkų grupės, o jų teigimu atspariausios gyvūnų rūšys ZEA laikomos galvijai, avys ir ožkos [2;34,35].
Zearalenonas laikomas termiškai stabilus ir net 120°C temperatūroje nėra suardomas. Dėl tokios aukštos eliminavimo temperatūros, manoma, kad šis mikotoksinas išlieka produktuose pagamintuose iš grūdinių žaliavų. Kadangi šis mikotoksinas aptinkamas ne tik grūduose, bet ir aliejinėse žaliavose (rapsai, saulėgrąžos) dėl to manoma, kad gali išlikti ir fermentiniuose procesuose – gaminant aliejų, ypatingai šalto spaudimo būdu [34].
Tiksliausios toksino koncentracijos nustatomos aukšto efektyvumo slėgio skysčių
chromatografijos metodu (AESCh) su UV detektoriumi. Taip pat yra taikomi IFA metodai, bet šie
yra mažiau jautrūs ir laikomi daugiau apžvalginiais metodais negu patvirtinamaisiais. Europos
Sąjungos šalyse reglamentuojama ZEA didžiausia leistina koncentracija grūduose – 100 μg/kg,
miltuose ir sėlenose skirtose tiesiogiai vartoti žmonių maistui ZEA didžiausia leistina koncentracija
– 75 μg/kg. Grūdinėse pašarinėse žaliavose didžiausia leistina koncentracija – 2 mg/kg, išskyrus
šalutiniuose kukurūzuosų produktuose, juose DLK – 3 mg/kg, pašaruose kiaulėms ir paršeliams
DLK – 0,1 mg/kg, pašaruose galvijams DLK – 0,5 mg/kg [34,35,62].
14
1.1.3 Deoksinivalenolas
Deoksinivalenolio molekulinė formulė C
15H
20O
6(3 pav.). Šis mikotoksinas turi vieną pirminę ir dvi antrines hidrokslio grupes [8].
Už šio mikotoksino paplitimą dažniausiai atsakingi Fusarium graminearum ir Fusarium culmorum mikromicetai. Šiems pelėsiniams grybams palankiausios sąlygos temperatūra ir drėgmė [20,29].
3 pav. Struktūrinė deoksinivalenolio formulė [52]
Aukštos šio mikotoksino koncentracijos nustatomos grūduose, šiauduose, kukurūzų silose, žolėje, taip pat šienainyje. Šio mikotoksino taip pat aptinkama ir produktuose, kurie skirti žmonių vartojimui: miltuose, duonoje, sausuose pusryčiuose, makaronuose ar net kūdikių pieno mišinėliuose [20,40,51].
Literatūroje nemažai duomenų, kad deoksinivalenoliu užterštų produktų ir žaliavų vartojimas sukelia mikotoksikozes tiek žemės ūkio gyvuliams, tiek ir žmonėms. Šis toksinis junginys gali iššaukti ūmius vėmimus, viduriavimus (ypatingai jaunikliams), pilvo skausmus, priesvorio mažėjimus, karščiavimus, galvos skausmus, neuroendokrininius ir imunologinius pokyčius ir kraujo apytakos sutrikimus [5,17,51].
1.1.4 Ochratoksinai Ochratoksino A molekulinė formulė
C
20H
18ClNO
6. Šį mikotoksiną gamina Penicilium ir Aspergillus genčių grybai [8].
Tai plačiai paplitęs mikotoksinas visame pasaulyje. Dažniausiai aptinkamas augalinės kilmės žaliavose ar iš jų pagamintuose produktuose (grūdai, kavos pupelės, vynas, prieskoniai). Mikotoksinas aptinkamas ir gyvūninės kilmės produktuose – kepenyse ar inkstuose [13, 45].
4 pav. Struktūrinė ochratoksino A formulė [43]
15
Ochratoksinai skirstomas į keturis tipus: A, B, C ir D. Dėl termostabilių savybių, kuriomis pasižymi A tipo toksinas jis nustatomas dažniausiai. Toksino inaktyvacijai reikalinga aukštesnė temperatūra nei 250
oC [12].
A tipas nustatomas dažniausiai ir pasižymi termostabiliomis savybėmis, kuriomis nepasižymi kitų tipų ochratoksinai, tai apsunkina toksino inaktyvaciją, nes reikalinga aukštesnė temperatūra nei 250
oC. Net nustačius toksino pėdsakus, jis gali sukelti lėtinės formos ochratoksikozę [23].
Daugiausiai ochratoksino A organizmas gauna vartodamas grūdus ir jų produktus. Šis mikotoksinas laikomas kancerogenu ir pasižymi imunotoksiniu veikimu. Tekste Cosyns (13) teigia, kad ochratoksinas A siejamas su inkstų veiklos nepakankamumu žmonėms ir neigiamu poveikiu imuninei sistemai. Mokslininkas taip pat teigia, kad OTA gali praeiti placentos barjerą ir sukelti vaisiaus apsigimimus [13,14,45].
1.2 Mikotoksinų įtaka galvijų fiziologiniams procesams
Išaugusi mikotoksinų koncentracija kombinuotuose ar visaverčiuose pašaruose, dažnas iššūkis norint nukenksminti, nes padidėja absorbcija gyvulio organizme. Teiginys yra paremtas bandymo rezultatais, kuris atliktas su melžiamomis karvėmis. Tekste Fink-Gremmels (15) teigė, kad pastebėjo sumažėjusius pieno primilžius, o pieninių karvių susirgimas infekcinėmis ligomis išaugo.
Mokslininkė taip pat pastebėjo padidėjusį apsinuodijimą silosuotais pašarais, kurie buvo kontaminuoti pelėsiais ir didelėmis deoksinivalenolio, zearalenono ir kitų mikotoksinų koncentracijomis. Fink-Gremmels (15) tiriamojo darbo metu buvo nustatyti žymūs metabolitų ir hormonų pasikeitimai karvių organizmuose, nes pereinamuoju laikotarpiu jos ypatingai jautrios padidėjusiems mikotoksinų kiekiams [15].
Mikotoksinų jautrumą gyvūnų organizme gali nulemti daug faktorių, tačiau vienas iš pagrindinių įvardijamas kaip pačio organizmo gebėjimas detoksikuoti šiuos junginius. Remiantis Lietuvos žemės ūkio ministro įsakymu dėl reglamentuojamų mikotoksinų kiekių pašaruose, mažiausi leidžiami maksimalūs kiekiai nustatyti pašarų papilduose ir visaverčiuose pašaruose skirtuose kiaulėms, nes jos pačios jautriausios mikotoksinams. Atrajotojai dėl savo prieskrandžių mikrofloros veiklos, laikomi vieni iš atspariausių mikotoksinams. Prieskrandžiuose galvijai sugeba skaidyti ir nukenksminti daugelį cheminių junginių tarp jų ir pelėsinių grybų antrinius metabolitus – mikotoksinus. Dėl to daugiakamerinius skrandžius turintys gyvūnai mažiau jautrūs mikotoksinų poveikiui, lyginant su vienkamerinę skrandžio sistemą turinčiais gyvūnais [ 15,37].
Tačiau Slovakijos mokslininkų (9) teigimu, dėl mikotoksinų skirtingos cheminės struktūros,
jie skaidomi ir šalinami nevienodai. Fumoniziniai skaidomi sunkiau, nei aflatoksinai, trichotecenai
16
ar ochratoksinai. Mokslininkai taip pat teigia, kad karvių organizmas nuolatos gaudamas mažesnes mikotoksinų koncentracijas, negu reglamentuojama, vystosi prieskrandžių acidozė, ketozė, priesvorio sumažėjimas, laminitų atsiradimas, SLS padidėjimas piene [9].
Skirtingų mikotoksinų ir jų derinių poveikis atrajotojų sveikatingumui yra nevienodas.
Upadhaya ir kt. (54) pateikia kitų mokslininkų atliktus tyrimus ir apibendrintus rezultatus (1 lentelė). Jis taip pat teigia, kad ne tik skirtingos mikotoksinų koncentracijos aptinkamos pašaruose ar skirtingos gyvūnų rūšys gali įtakoti skirtingus organizmo atsakus, bet ir skirtingų mikotoksinų deriniai gali turėti skirtingus poveikius į organizmą. Mikotoksinų užterštumas galvijų pašaruose dažniausiai būna kombinuotas – nustatoma ne vienas mikotoksinas o keli [16,54].
1 lentelė. Skirtingų mikotoksinų koncentracijų poveikis gyvūnams [55].
Mikotoksinas Koncentracija Mikotoksino poveikis organizmui
Literatūros šaltinis
Af latok sin ai
600 μg/kg
(kastruotiems buliukams ir pieniniams veršeliams)
Dienos priesvorio mažėjimas ir sutrikusi pašaro rezorbcija
Helferich et al., 1986
200-800 μg/kg (atrajotojams)
Didž. prieskrandžio
susitraukimų sumažėjimas Cook et al., 1986 2500 μg/kg
(pašare ėriukams
vyresniems kaip 21 diena)
Kepenų ir inkstų pakitimai ir
padidėjimai Fernandez et al.,
1997 10-108,5 μg/kg
(pašaruose galvijams) Dienos priesvorio mažėjimas ir sutrikusi pašaro rezorbcija
Choudary et al., 1998
2500 μg/kg
(pašare 5 mėn. amžiaus ėriukams)
Ženklus priesvorio
Sumažėjimas ir sumažėjęs ląstelinis imunitetas
Fernandez et al., 2000
Ochrat ok sin ai
390-540 μg/kg
miežiuose skirtuose 12 sav. amžiaus veršeliams)
Klinikiniai simptomai
nepastebėti Patterson et al.,
1981
2000-5000 μg/kg (avys)
Klinikiniai simptomai nepastebėti
Keisling et al., 1984
100-150 μg/kg
Ožkių rumen sultys (in vitro)
Ochratoksino po 6 val
inkubacijos neaptikta Liu et al., 2010
Z ear alenon as 385-1,925 μg/kg
(Pašaruose laktacijos metu)
Pieno primilžiams ir kokybiniams rodikliams pakitimo nenustatė
Shreeve et al., 1979
12000 μg/kg (Pašaruose avys)
Nustatomi neigiami reprodukcijos rodikliai
Dicostanzo et al., 1996
12000 μg/kg pašaruose (galvijai)
Klinikiniai simptomai
nepastebėti Seeling et al., 2006
17
Mikotoksinas Koncentracija Mikotoksino poveikis
organizmui
Literatūros šaltinis
De ok sin ival en oli s ir T -2 toksi n as
15600 μg/kg Pašaruose avims
Dienos priesvorio
sumažėjimas Harvey et al., 1986
10000-20000 μg/kg
(T-2 pašaruose veršeliams)
Papilių nekrozė ir opos tinklainyje
Cheeke et al., 1998a
3000-5000 μg/kg (pieniniai galvijai)
Sumažėjo IgA, albuminų ir globulinų kraujo serume
Korosteleva et al., 2007
Mikotoksinai lemia išaugusių susirgimų kiekius taip pat atsakingi už produkcijos sumažėjimą ir kūno svorio indeksą. Knicky (30) išskyrė mikotoksinų AFL, ZEA, DON ir OTA bendrą poveikį gyvūnams: [27,30]
Sutrikęs pašaro pasisavinamumas,
Gyvūnų galūnių žaizdos,
Endokrininės sistemos sutrikimas,
Reprodukciniai sutrikimai (embrioninis mirtingumas, abortai, servis periodo prailgėjimas, pieno kreivė, apsisėklinimo indeksas),
Nervinės sistemos sutrikimas (drebulys, nekordinuoti judesiai),
Imuninės sistemos silpnumas,
parenchiminių organų pakitimai,
gaišimas [30].
1.3 Mikotoksinų mažinimo būdai
Literatūros šaltiniuose vis plačiau nagrinėjami būdai, kaip detoksikuoti pašarus. Bakutis (3) išskiria, kad galimas detoksikavimas prieš šeriant gyvūnus ir gyvūnų šėrimo metu (2 lentelė).
Mokslininkas teigia, kad prieš šeriant gyvulius pašarais galimas valymas nuo piktžolių sėklų, pažeistų grybų ar kitų pašalinių priemaišų. Galimas ir grūdų terminis apdorojimas, veikimas ultravioletiniais spinduliais, poliravimas ar sijojimas [3].
2 lentelė. Pašarų detoksikavimo būdai prieš ir šėrimo metu [4]
Detoksikavimo laikas Detoksikavimo metodas
Pr ieš še rimą
Fizikiniai Mechaniniai
Apdorojimas karščiu
Cheminiai (amoniakas, kalciohidrochloridas)
18
Detoksikavimo laikas Detoksikavimo metodas
Biologiniai
Š ėr imo m etu
Absorbcija:
Aktyvuota anglis
Poveikis mikroorganizmams
Detoksikuojančių preparatų įterpimas
Kituose moksliniuose straipsniuose autoriai (18,50,52) teigia, kad norint sumažinti mikromicetų paplitimą būtina vykdyti geros žemės ūkio praktikos programą, o kontrolinės priemonės tam pasiekti išskiriamos:
Tinkamai vykdoma sėjomaina,
Tinkamas viršutinio humuso paruošimas,
Naudojimas javų veislių, kurios atsparios grybelinėms infekcijos,
Optimaliu laiku taikyta fungicidų infekcijos kontrolė,
Derliaus nuėmimas, tinkamos brandos ir drėgmės,
Nuolatinė sandėliuojamų žaliavų higieninė kontrolė [18,50,52].
Džiovinimas yra viena populiariausių priemonių grūdų išsaugojimui. Mažesnis nei 12 proc.
drėgmės kiekis grūduose ženkliai prisideda prie apsaugos nuo mikrobiologinio užterštumo. Esant didesnei drėgmei galimas pelėsių atsiradimas, kuris paspartina grūdų gedimą [50,60].
Mažinant mikotoksinų kiekį grūdinėse žaliavose naudojami 2 konservavimo būdai – fizikinis ir cheminis [60]. Fizikinis būdas, kai atliekamas greitas grūdų džiovinimas iki 12-13 proc. Cheminis konservavimo būdas kai apdorojami fungistatiniais preparatais, kurių pagrindinė veiklioji medžiaga propiono rūgštis [3,60].
Vis daugiau kalbama apie mikotoksinams eliminuoti iš maisto produktų ir pašarų taikomas
biologines detoksikacijas, kai išskiriama ir identifikuojama bakterijos ir mielės, kurios pasižymi
detoksikuojančiomis savybėmis. Bartkienė ir kt. (5) tekste pažymi, kad jau yra atrasta daugiau kaip
20 tokių bakterijų ir mielių [5,31].
19
2. TYRIMO METODIKAI IR MEDŽIAGA 2.1. Tyrimų objektas
Mokslinis – tiriamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Mikotoksikologijos laboratorijoje. Tyrimai atlikti 2017 – 2019 metais. Tiriamojo darbo metu iš skirtingų Lietuvos ūkių buvo paimti pieninių karvių pašarai ir /ar pašarinės žaliavos. Kartu buvo paimti pieno mėginiai iš kliniškai sveikų karvių.
Tiriamojo darbo metu iš skirtingų ūkių, buvo paimta 35 pašarinių žaliavų mėginiai ir 16 kombinuotųjų pašarų karvėms mėginių.
Pašarai ir pašarinės žaliavos buvo imamos vadovaujantis (LST EN ISO 6497:2002 Pašarai.
Mėginių ėmimas) taisyklėmis į polietileninius maišelius ir sandariai uždaromi. Pašarų mėginiai į Mikotoksikologijos laboratoriją buvo pristatomi per 24 val.
Paimtuose pašarų mėginiuose Mikotoksikologijos laboratorijoje nustatytos mikromicetų antrinių metabolitų – mikotoksinų (AFLB
1, ZEA, DON) koncentracijos.
Pieno mėginiai buvo paimami iš ūkių, kurių pašaruose buvo nustatytos ZEA koncentracijos.
Tokių ūkių tiriamojo darbo metu nustatėme 11. Pieno mėginiai paimti iš 5 ūkių. Mėginius atrinkome iš kliniškai sveikų karvių. Pienas aseptiškai buvo imamas į sterilius mėgintuvėlius melžimo pradžioje numelžus pirmąsias pieno čiurkšles, pagal pieno mėginių ėmimo taisykles (LST EN ISO 707:1999+P:2008 Pienas ir pieno produktai. Mėginių ėmimo taisyklės).
Kokybiniams pieno rodikliams, mėginiai buvo pristatomi per 24 val į UAB „Pieno tyrimai“
(iki 2018 gruodžio 31 d. buvusi VĮ „Pieno tyrimai“), nuo pieno mėginio paėmimo iš ūkio. Pieno mėginiuose nustatyta: riebalai (proc.), baltymai (proc.), laktozės (proc.), urėja (mg/100 ml), somatinių ląstelių skaičių (SLS)(tūkst./ml), bendrą bakterijų skaičių (BBS)(tūkst./ml).
ZEA koncentracijos piene buvo nustatytos LSMU VA Mikotoksikologijos laboratorijoje, komerciniu IFA rinkiniu „RIDASCREEN
®Zearalenon“ (gamintojas – R-Biopharm AG, Vokietija).
Pieno mėginiai Mikotoksikologijos laboratorijoje iki tyrimo pradžios buvo laikomi -18
oC.
20
*pašaras paimtas nuo šėrimo tako
5 pav. Mokslinio – tiriamojo darbo tyrimo schema
2.2. Mikotoksinų nustatymas karvių pašaruose ir/ar pašarinėse žaliavose
Mikotoksinų koncentracijos nustatytos plonasluoksnės chromatografijos (PLCh) metodu.
Tiriamojo darbo metu buvo analizuojami aflatoksino B
1, zearalenono, deoksinivalenolio mikotoksinų kiekiai pagal patvirtintas Romer Labs. Inc. (Austrija) metodikas. Mėginio paruošimo pradžioje jie buvo išdžiovinami ir sumalami malūnu. Tyrimui atrenkama smulkiausia mėginio dalis.
Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 25 gramai analizuojamojo mėginio pridedama 100 ml
acetonitrilo ir vandens mišinio santykiu 84:16 ir 60 min ekstraguota. Kitas mikotoksinų nustatymo
etapas – mėginio ekstrakto perfiltravimas per celiuliozinį filtrą. Toliau atliekamas mėginio valymas,
nustatinėjant ZEA ir AFL B
1mikotoksinų kiekius, ekstrakto valymui panaudotos MycoSep
®226
valymo kolonėlės (gamintojas – Romer Labs. Inc., Austrija). Toliau atlikome mėginio garinimą, kai
2 ml išvalyto ekstrakto perkėlėme į mėgintuvėlį ir išgarinome, panaudodami Romer® Evap sistemą.
21
Ekstrakto nuosėdos buvo ištirpintos 300 µl tolueno ir acetonitrilo mišinyje, santykis mišinio 97:3.
Toliau užpildėme specialius mikrošvirkštus. Esant 60°C temperatūrai, Romer Labs PSCh autospoteriu ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (gamintojas – Romer Labs. Inc., Austrija) su specialiais mikrošvirkštais užnešama AFL B
1(2 µg/ml acetonitrilo) (gamintojas – Romer Labs.
Inc., Austrija) ar ZEA (100 µg/ml acetonitrilo) (gamintojas – Romer Labs. Inc., Austrija) standartų 10, 20, 40, 80 µl ir 80 µl mėginio. Rezultatų išryškinimui silicio gelio plokštelė įmerkiama į chloroformo ir acetono mišinio, santykiu 9:1, vonelę. Laikoma, kol tirpalas pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Toliau atliekama plokštelės džiovinimas ore (kambario temperatūroje). Toksinų koncentracijos įvertinamos ultravioletinių spindulių (UV) fone. AFL B
1švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,45, ZEA švyti žaliai, kai Rf ≈ 0,9. Mikotoksino koncentracijos perskaičiuojamos į µg/kg. Nes PSCh plokštelės kiekvienas toksinas tiriamajame mėginyje matomas ng, mėginio ekvivalentas 0,15 g. ppb=X÷0,15, kur ppb – toksino koncentracija mėginyje (µg/kg); X – mikotoksino koncentracija ant plokštelės ng; 0,15 – mėginio ekvivalentas (0,15 g). Aptikimo riba – ZEA – 10 ppb; AFL B
1– 1 ppb.
Nustatant DON kiekį mėginiuose PSCh metodu, mėginių paruošimas vienodas, kaip nustatant ZEA ir AFL B
1. Tik mėginio ekstrakto valymui naudojome MultiSep
®216 valymo kolonėle (gamintojas – Romer Labs. Inc., Austrija). 13 ml išvalyto ekstrakto išgarinta Romer® Evap sistema.
Toliau ekstrakto nuosėdos tirpinamos 320 µl tolueno ir acetonitrilo mišinyje, santykis mišinio 97:3.
Į specialius mikrošvirkštus pritraukus 10, 20, 40, 80 µl DON standartų (100 µg/ml acetonitrilo) (gamintojas – Romer Labs. Inc., Austrija) ir 80 µl tiriamo mėginio, PSCh autospoteriu standartai ir tiriamieji mėginiai užnešami ant silicio gelio chromatografinės plokštelės (gamintojas –Romer Labs. Inc., Austrija) 60°C temperatūroje. Rezultatų išryškinimui DON plokštelė įmerkiama į tolueno ir acetono mišinio vonelę (mišinio santykis 1:2). DON plokštelė apipurškiama 15 proc.
aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė taip pat džiovinama ore (kambario temperatūroje).
Toksino koncentracija įvertinama pakaitinus plokštelę 150°C temperatūroje 5 min. ultravioletinių spindulių (UV) fone (360 nm). DON švyti mėlynai, kai Rf ≈ 0,5. Toksino koncentracija tiriamajame mėginyje nustatinėjama – ng, mėginio ekvivalentas 0,2 g. ppb=X÷0,2, kur ppb – toksino koncentracija mėginyje (µg/kg); X – mikotoksino koncentracija ant plokštelės ng; 0,2 – mėginio ekvivalentas (0,2 g). Aptikimo riba – DON – 10 ppb.
2.3. Zearalenono nustatymas pieno mėginiuose
Zearalenoną pieno mėginiuose nustatinėjome IFA komerciniu rinkiniu „RIDASCREEN
®Zearalenon“ (gamintojas – R-Biopharm AG, Vokietija). Atlikdami tyrimą vadovavomės gamintojo
metodika. Pieno mėginiai valomi buvo naudojant C18 valymo kolonėles. Metodo principas yra
22
antigenų-antikūnų reakcija. Inkubuojami mikroplokštelės šulinėliai (duobutės) yra padengtos specifiniais antikūnais prieš zearalenoną. Jie sudaro imuninį kompleksą su mikroplokštelės duobutėse esančiu zearalenono fermentų antigenu. Toliau fermentinis konjuguotas zearalenonas jungiasi prie zearalenono antikūnų, ir bet koks nesurištas fermentų konjugatas pašalinamas plovimo etape. Po paskutinio mikroplokštelės duobučių plovimo naudojamas STOP tirpalas, kuris stabdo reakciją. Rezultatai buvo nuskaitomi spektrofotometru 450 nm šviesos bangos ilgio filtru absorbcijos būdu. Rezultatas gautas lyginant mėginio optinius tankius (OT) su žinomų koncentracijų OT vidurkiu. Aptikimo riba – 0,080 µg/L.
2.4. Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimų duomenys įvertinti naudojant kompiuterinę programą ,,Microsoft Office Excel 2007“.
Buvo apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai (x), vidurkio paklaida (mx), standartinis
nuokrypis (δ) ir variacijos koeficientas % (Cv). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (p)
nustatytas pagal Stjudentą. Duomenys laikomi patikimais kai p< 0,01 ir p< 0,05.
23
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Mikotoksinų aptikimas pašarų mėginiuose
Analizuojant nustatytus mikotoksinų kiekius didžiausios ZEA ir AFL B
1koncentracijos nustatytos pašaruose paimtuose nuo šėrimo tako (TMR) (6 pav.) (ZEA – 496,25 µg/kg; AFL B
1– 2,67 µg/kg) . Didžiausia DON koncentracija nustatyta grūdinėse žaliavose – 250 µg/kg.
Mažiausias mikotoksino DON koncentracijas nustatėme žoliniuose – aliejiniuose pašaruose (43,18±21,10 µg/kg), ZEA mažiausias koncentracijas nustatėme grūdinėse žaliavose (217,5± 55 µg/kg. AFL B
1mažiausias koncentracijas aptikome taip pat grūdinėse žaliavose (0,85±0,2 µg/kg).
Didžiausios AFL B
1koncentracijos nustatytos tuose pašaruose, kuriuose buvo nustatytos ir ZEA koncentracijos didžiausios.
Vertinant koncentracijų skirtumus matyti, kad pašaruose paimtuose nuo šėrimo tako (6 pav.) nustatytas AFL B
1kiekis yra 59,1 proc. didesnis lyginant su AFL B
1kiekiu nustatytu žoliniuose – aliejiniuose pašaruose, 68,2 proc. didesnė koncentracija nustatyta, lyginant su grūdinėmis žaliavomis ir 36 proc. didesnė koncentracija lyginant su silosuotais pašarais.
Lyginant ZEA koncentracijų skirtumus matyti, kad pašaruose paimtuose nuo šėrimo tako nustatytas ZEA kiekis yra 43 proc. didesnis, lyginant su ZEA kiekiu nustatytu žoliniuose – aliejiniuose pašaruose, 56,2 proc. didesnė koncentracija nustatyta lyginant su grūdinėmis žaliavomis ir 7,7 proc. didesnė koncentracija lyginant su silosuotais pašarais.
Lyginant DON kiekių skirtumus matyti, kad pašaruose atrinktuose nuo šėrimo stalo nustatytas DON kiekis yra 33,9 proc. didesnis lyginant su DON kiekiu nustatytu žoliniuose – aliejiniuose pašaruose, 73,9 proc. mažesnė koncentracija nustatyta lyginant su grūdinėmis žaliavomis ir 34 proc.
mažesnė koncentracija lyginant su silosuotais pašarais.
24
6 pav. ZEA, DON, AFL B
1koncentracijos skirtingose pašarų grupėse
Analizuojant ištirtus pašarų mėginius nustatėme (7 pav.), kad iš analizuojamų žaliavų bandymo metu daugiau kaip pusėje (54,29 proc.) nustatėme AFL B
1, net 74,29 proc. žaliavų mėginių buvo užteršti ZEA ir 54,29 proc. žaliavų buvo užterštos DON.
Lyginant tirtų mikotoksinų koncentracijas kombinuotųjų pašarų užterštumą mikotoksinais (7 pav.), nustatyta, kad 26,96 proc. AFL B
1daugiau užteršti pašarai, lyginant su žaliavomis. ZEA nustatymas kombinuotuosiuose pašaruose buvo 19,46 proc. didesnis, lyginat su žaliavose nustatytu ZEA procentu, o DON kombinuotuose pašaruose nustatėme 8,21 proc. daugiau, lyginant su žaliavose nustatytu DON.
Žaliavose dažniausiai buvo aptinkamas ZEA, net 74,29 proc. analizuojamų mėginių. Kaip ir žaliavose, kombinuotuose pašaruose dažniausiai buvo aptinkamas taip pat ZEA – 93,75 proc. tirtų kombinuotųjų pašarų mėginių buvo rasti ZEA pėdsakai.
Žaliavose AFL B
1nustatyta 33,1±0,1 proc. mažiau, lyginant su AFL B
1koncentracija, kuri buvo nustatyta kombinuotuose pašaruose. ZEA žaliavose nustatyta 20,7±0,1 proc. mažiau, lyginant su ZEA koncentracija, kuri buvo nustatyta kombinuotuose pašaruose. DON žaliavose nustatyta 13,1±0,1 proc. taip pat mažiau, lyginant su DON koncentracija, kuri buvo nustatyta kombinuotuose pašaruose.
Tiriamojo darbo metu žaliavose nustatyto AFL B
1ir DON užterštumo procentas buvo
vienodas – 54,29 proc.
25
7 pav. Mikotoksinų aptikimo procentas tirtose žaliavose ir kombinuotuose pašaruose
3.2 Pieno kokybiniai rodikliai ir mikotoksinų koncentracijos pašaruose 3.2 .1 Pieno cheminės sudėties analizė
Iš ūkių buvo atrenkami pieno mėginiai, kuriuose nustatinėjome pieno cheminius rodiklius, kurie pateikti 3 lentelėje. Didžiasias riebalų kiekis 8 -ame ūkyje (4,52±0,24 proc.), baltymų kiekis nustatyta 5 -ame ūkyje (3,48±0,08 proc.), laktozės kiekis nustatytas 6- ame ir 7 -ame ūkiuose (po 4,67±0,15 proc.), urėjos kiekis 1 –ame ūkyje (30±2,5 mg/100ml), o pH 2 - ame ir 3 – ame ūkuose (6,79).
Mažiausias riebalų kiekis 2 – ame ir 3 -ame ūkyje (po 3,7±0,21 proc.), baltymų kiekis nustatyta 12 -ame ūkyje (2,99±0,07 proc.), laktozės kiekis nustatytas 12 -ame ūkyje (4,2±0,03 proc.), urėjos kiekis 2 –ame ir 3 - ame ūkiuose (8±2,2 mg/100ml), o pH 6 - ame ir 7 – ame ūkuose (6,72).
3 lentelė. Pieno mėginių paimtų iš ūkių cheminiai rodikliai
Ūkis Riebalų
kiekis, proc.
Baltymų kiekis, proc.
Laktozės kiekis, proc.
Urėja,
mg/100 ml pH
1 4±0,25 3,34±0,18 4,58±0,1 30±2,5 6,65±0,12
2 3,7±0,21 3,25±0,14 4,46±0,2 8±2,2 6,79±0,14
3 3,7±0,21 3,25±0,12 4,46±0,14 8±2,2 6,79±0,09
4 4,21±0,09 3,31±0,15 4,56±0,08 23±2,4 6,67±0,05
5 4,11±0,15 3,48±0,08 4,55±0,03 12±1,8 6,64±0,06
6 3,77±0,38 3,31±0,24 4,67±0,15 18±3,1 6,62±0,01
7 3,77±0,29 3,31±0,09 4,67±0,2 15±2,5 6,62±0,09
8 4,52±0,24 3,38±0,11 4,49±0,07 25±2,2 6,71±0,05
9 4,4±0,8 3,32±0,10 4,58±0,06 24±4,1 6,63±0,05
26
Ūkis Riebalų
kiekis, proc.
Baltymų kiekis, proc.
Laktozės kiekis, proc.
Urėja,
mg/100 ml pH
10 4,47±0,42 3,42±0,06 4,49±0,11 20±3,7 6,68±0,06
11 4,2±0,31 3,4±0,02 4,56±0,17 12±2,1 6,67±0,04
12 4,24±0,22 2,99±0,07 4,2±0,03 9±1,9 6,7±0,07
mediana 4,155 3,315 4,555 16,5 6,67
min 3,7 2,99 4,2 8 6,62
max 4,52 3,48 4,67 30 6,79
vidurkis 4,09±0,12 3,31±0,16 4,52±0,2 17±0,21 6,68±0,3
standartinis nuokrypis
0,30 0,12 0,12 7,43 0,06
Lyginant riebalų, baltymų ir laktozės kiekių kitimus pieno mėginiuose su ZEA koncentracija pašaruose (8 pav.) ženklių kitimų nepastebėjome. Pieno mėginiuose analizuojant pieno riebalų procento kitimą mėginiuose, kuriuose ZEA koncentracija didesnė kaip 500 µg/kg, vidutinis riebalų kiekis proc. – 4,32±0,3 proc. (p<0,5), vidutinis baltymų kiekis proc. 3,35±0,03 proc. (p<0,05) ir vidutinis laktozės kiekis pieno mėginiuose, kuriuose ZEA koncentracija pašaruose didesnė kaip 500 µg/kg yra 4,54±0,04 proc. (p<0,05).
Vertinant pieno mėginiuose kokybinius rodiklius iš ūkių kurių pašaruose ZEA kiekis nustatytas mažiau kaip 500 µg/kg, rodikliai yra panašūs. Vidutinis riebalų kiekis proc. pieno mėginiuose – 3,9±0,4 proc. (p<0,5), arba 0,42 proc. mažesnis lyginant su pieno riebalų kiekio procentu, kai ūkio pašaruose ZEA kiekis daugiau kaip 500 µg/kg. Vidutinis baltymų kiekio proc.
3,28±0,03 proc. (p<0,05) arba 0,07 proc. mažesnis lyginant su baltymų kiekio procentu, kai ūkio pašaruose ZEA kiekis daugiau kaip 500 µg/kg.
Vidutinis pieno laktozės kiekis, kai ūkių pašaruose ZEA koncentracija mažesnė kaip 500 µg/kg yra 4,51±0,04 proc. (p<0,05) arba 0,03 proc. (p<0,05) mažesnis lyginant su pieno laktozės kiekio procentu, kai ūkių pašaruose ZEA kiekis daugiau kaip 500 µg/kg.
Dėl tokių nedidelių skirtumų tarp pieno kokybinių rodiklių, kai pašaruose nustatoma iki 500 µg/kg ir nuo 500 µg/kg ZEA kiekis manome, kad pagal šį rodiklį – mikotoksino ZEA kiekį nustatytas pašaruose, pieno riebalų, baltymų ir laktozės kiekių kitimui įtakos neturėjo.
Nustatyta, kad ZEA koncentracijos pašaruose koreliacija su riebalų kiekiu piene – vidutinė
teigiama (r=0,502), baltymų kiekiu – labai silpna teigiama (r=0,196), laktozės kiekiu – labai silpna
teigiama (r=0,142).
27
8 pav. Riebalų, baltymų ir laktozės kiekių (proc.) piene palyginimas su ZEA (µg/kg)
pašaruose
Vertinat riebalų kiekio proc. kitimą tuose mėginiuose, kuriuose DON buvo nustatytas (7 pašarų mėginiuose iš 12), vidutinis riebalų kiekis proc. – 4,22±0,28 proc. (p<0,5), vidutinis riebalų kiekis procentais, pašarų mėginiuose, kuriuose DON nebuvo nustatytas – 0,31 proc. mažesnis.
Analizuojant vidutinį pieno baltymų kiekį proc. mėginiuose, iš ūkių kurių pašaruose DON nustatėme (9 pav.), vidutinis pieno baltymų kiekis proc. – 3,29 proc., o lyginant su pašarų mėginiais iš ūkių, kai DON nenustatėme pieno baltymų kiekis buvo 0,06 proc. didesnis.
Vidutinis pieno laktozės kiekis mėginiuose, surinktuose iš ūkių, kurių pašaruose nustatėme DON – 4,48 proc., o pašarų mėginiuose, kuriuose DON neaptikome pieno laktozės kiekis 0,1 proc.
didesnis.
DON koreliacija su riebalų kiekiu – vidutinė teigiama (r=0,534), baltymų kiekiu – labai silpna
teigiama (r=0,107), laktozės kiekiu – labai silpna neigiama (r=-0,053).
28
9 pav. Riebalų, baltymų ir laktozės kiekių (proc.) piene palyginimas su DON (µg/kg)
pašaruose
Vertinat pieno riebalų kiekio kitimą mėginiuose (10 pav.), kurie atrinkti iš ūkių, kurių pašaruose nustatyta AFL B
1, vidutinis pieno riebalų kiekis. – 4,02±0,3 proc. (p<0,5), vidutinis pieno riebalų kiekis procentas. kai ūkiuose atrinktuose pašaruose AFL B
1nebuvo nustatytas – 0,27 proc.
didesnis.
Analizuojant vidutinį pieno baltymų kiekį mėginiuose, atrinktuose iš ūkių, kurių pašaro mėginiuose AFL B
1buvo aptikta, nustatėme, kad vidutinis pieno baltymų kiekis – 3,29 proc., o lyginant su pieno mėginiais, atrinktais iš ūkių, kurių pašaruose AFL B
1nenustatėme pieno baltymų kiekis buvo 0,08 proc. didesnis.
Vidutinis pieno laktozės kiekis mėginiuose, iš ūkių kurių pašaruose nustatėme AFL B
1– 4,52 proc., o pieno mėginiuose, iš ūkių kurių pašaruose AFL B
1neaptikome laktozės kiekis 0,02 proc.
(p<0,05) didesnis.
AFL B
1koreliacija su riebalų kiekiu – vidutinė neigiama (r= -0,431), baltymų kiekiu – labai
silpna neigiama (r=-0,137), laktozės kiekiu – labai silpna teigiama (r=0,175).
29
10 pav. Riebalų, baltymų ir laktozės kiekių (proc.) piene palyginimas su AFL B
1(µg/kg) pašaruose
Analizuojant urėjos ir pH kiekius pieno mėginiuose su ZEA, DON ir AFL B
1kiekiais pašaruose (11 pav.) pastebime, kad didesnis pieno urėjos kiekis nustatomas mėginiuose iš tų ūkių, kurių pašaruose nustatomas didesnis ZEA kiekis. Kai ZEA koncentracija pašaruose didesnė kaip 500 µg/kg, pieno urėjos kiekis svyruoja nuo 20 mg/100 ml (ZEA kiekis pašaruose 700 µg/kg) iki 30 mg/100 ml (ZEA kiekis pašaruose 1000 µg/kg).
Vertinant vidutinį ZEA kiekį pašarų mėginiuose, kuriuose nustatyta daugiau kaip 500 µg/kg - 772±25 µg/kg, pieno urėjos vidutinis kiekis – 24,4 mg/100 ml, o urėjos kiekis pieno mėginiuose, kurie buvo atrinkti iš karvių, kurių pašaruose vidutinis ZEA kiekis – 190 µg/kg (mediana – 170 µg/kg ), pieno urėjos kiekis – 11,7 mg/100 ml.
Stebint kaip kito pH kiekis pieno mėginiuose matyti pH kiekis tuose mėginiuose, kuriuose ZEA koncentracija pašarų mėginiuose nustatyta didesnė kaip 500 µg/kg – pH kiekis 6,66±0,01 (p<0,05), o pieno mėginiuose, kurie atrinkti iš ūkių, kurių pašaruose ZEA nustatytas mažiau kaip 500 µg/kg – pH kiekis 0,03 didesnis lyginant su pH kiekiu pieno mėginiuose, kurie atrinkti iš ūkių kurių pašaruose ZEA daugiau kaip 500 µg/kg.
AFL B
1koreliacija su urėja – labai silpna teigiama (r= 0,133), pH - – labai silpna neigiama (r= -0,01).
ZEA koreliacija su urėja – stipri teigiama (r= 0,865), pH – silpna neigiama (r= -0,244).
30
DON koreliacija su urėja – vidutinė teigiama (r= 0,524), pH – labai silpna neigiama (r= - 0,075).
11 pav. Urėjos (mg/100 ml) ir pH kiekių piene palyginimas su ZEA, DON ir AFL B
1(µg/kg) pašaruose
3.2.2 BBS, SLS pieno mėginiuose ir mikotoksinų koncentracijos pašaruose
Pieno mėginiuose buvo nustatyta pieno kokybiniai rodikliai (BBS ir SLS), kurie pateikti 4 lentelėje. Didžiasias bendras bakterijų skaičius nustatytas 1 – ame ūkyje (320±33 tūkst./ml.), o somatinių ląstelių skaičius nustatytas 9 – ame ūkyje (891±64 tūkst./ml).
Mažiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas 11 – ame ūkyje (80±4,3 tūkst./ml.), o somatinių ląstelių skaičius nustatytas 5 – ame ūkyje (217±14 tūkst./ml).
4 lentelė. BBS ir SLS kiekiai pieno mėginiuose paimtuose iš ūkių
Ūkis Bendras bakterijų
skaičius (BBS), tūkst./ml
Somatinių ląstelių skaičius (SLS), tūkst./ml
1 320±33 814±25
2 120±15 351±19
3 201±15 320±23
4 261±26 650±34
5 90±5,4 217±14
6 120±9,4 340±27
7 84±7,4 340±27
8 187±14 378±25
9 221±26 891±64
31
Analizuojant bendro bakterijų skaičiaus koreliaciją su ZEA ir DON (12 pav.) matome, kad didžiausias bendras bakterijų skaičius nustatytas 1– ajame mėginyje (320±40 tūkst./ml), 4 –ajame mėginyje (261± 26 tūkst./ml) ir 9 – ajame mėginyje ( 221±18 tūkst./ml). Mažiausi BBS kiekiai nustatyti 11 –ajame ir 12 – ajame mėginyje (atitinkamai 80±5 tūkst./ml ir 92±11 tūkst./ml).
Iš paveikslėlio (12 pav.) taip pat matyti, kad DON buvo nustatytas 58 proc. analizuojamų pašaro mėginių.
Vertinant BBS ryšį nuo mikotoksinų koncentracijos pašaruose matomas ryšys, kad didžiausi BBS kiekiai nustatyti tuose mėginiuose, kuriuose buvo nustatytos didelės mikotoksino ZEA koncentracijos. Galima pastebėti ir tai, kad kuo didesnė ZEA koncentracija pašarų mėginyje atitinkamai ir BBS kiekis pieno mėginiuose išauga.
BBS koreliacija su ZEA nustatėme vidutinę neigiamą (r=-0,413), su DON - silpna neigiamą (r=-0,362).
Vertinant BBS ir DON koncentracijas pašaruose pastebima – neigiama, nes iš paveikslėlio (12 pav.) galima pastebėti, kad nebūtinai nustatyta didesnė DON koncentracija mėginyje turi įtakos didesnei BBS (1 mėginyje – DON nustatyta 100±12 µg/kg, o BBS 320±13 tūkst./ml, 10 mėginyje – DON nustatyta 250±20 µg/kg, o BBS 204±11 tūkst./ml).
10 204±24 850±51
11 80±4,3 250±11
12 92±4,2 350±13
mediana 153,5 350,5
min 80 217
max 320 891
vidurkis 165±18 479,25±27
standartinis nuokrypis
78,89 248,01
32
12 pav. Bendro bakterijų skaičiaus (BBS) (tūkst./ml)piene palyginimas su ZEA (µg/kg) ir DON (µg/kg) pašaruose
Analizuojant BBS koreliaciją su AFL B
1(13 pav.) galima pastebėti, kad priklausomybė yra dalinė, nes 1 –ame, 3 – ame, ir 9 – ame mėginiuose nustačius aukštesnę AFL B
1koncentraciją, randamas ir didesnis BBS kiekis (1 –ame AFL B
15±0,01 µg/kg, BBS 320±25 tūkst./ml , 3 – ame AFL B
15±0,01 µg/kg BBS – 201±9 tūkst./ml, ir 9 – ame AFL B
15±0,01 µg/kg, BBS – 221±18 tūkst./ml), bet 6 – ame mėginyje AFL B
1koncentracija randama didelė, o BBS kiekis ganėtinai nedidelis (AFL B1 6±0,02 µg/kg BBS – 120±4 tūkst./ml), o 8 – ame pieno mėginyje BBS kiekis nustatytas 187±5 tūkst./ml, o AFL B1 tik 1±0,001 µg/kg.
Atkreiptinas dėmesys ir į tai, kad 33 proc. mėginiuose AFL B1 koncentracija nustatyta didesnė kaip 5 µg/kg, o 66,7±0,1 proc. mėginiuose, kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B1, BBS kiekis buvo didesnis kaip 120±4 tūkst./ml.
Galima pastebėti, kad 33,3 proc. mėginių, kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B
1BBS kiekis buvo didesnis kaip 200 tūkst./ml,
BBS koreliacija su su AFL B
1– labai silpna teigiama (r=0,059).
33
13 pav. Bendro bakterijų skaičiaus (BBS) (tūkst./ml) piene palyginimas su AFL B
1(µg/kg) pašaruose
Stebėdami, kaip somatinių ląstelių skaičius (SLS) kito mikotoksinių ZEA ir DON fone (14 pav.), pastebėjome, kad didžiausias somatinių ląstelių skaičius nustatytas 1 – ajame mėginyje 814±82 tūkst./ml), 4 –ajame mėginyje (650± 56 tūkst./ml), 9 – ajame mėginyje ( 891±85 tūkst./ml) ir 10 – ajame mėginyje ( 850±83 tūkst./ml). Mažiausi SLS kiekiai nustatyti 5 –ajame ir 11 – ajame mėginyje (atitinkamai 217±14 tūkst./ml ir 250±18 tūkst./ml).
Vertinant SLS koreliaciją nuo mikotoksinų matomas ryšys, kad didžiausi SLS kiekiai, kaip ir BBS nustatyti tuose mėginiuose, kuriuose buvo nustatytos didelės mikotoksino ZEA koncentracijos. Galima pastebėti ir tai, kad kuo didesnė ZEA koncentracija mėginyje atitinkamai ir SLS kiekis nustatytas didesnis. Dėl to remiantis bandymu galime teigti, kad SLS didėjimui turi įtakos nustatomas didesnis ZEA kiekis.
Vertinant SLS ir DON priklausomybę nepastebimas ryšys, nes iš paveikslėlio (14 pav.) galima pastebėti, kad nustatyta didesnė DON koncentracija mėginyje aiškios reikšmės SLS didėjimui neturi (1 mėginyje – DON nustatyta 100±12 µg/kg, o SLS 814±82 tūkst./ml, 12 mėginyje – DON nustatyta 50±4 µg/kg, o SLS 350±11 tūkst./ml).
Paveikslėlyje taip pat galima matyti, kad mėginiuose, kuriuose ZEA buvo nustatytas daugiau
kaip 600 µg/kg, kartu su DON kurio buvo nustatyta daugiau kaip 100 µg/kg, pieno 1 –ame, 9 – ame
34
ir 10 – ame mėginiuose SLS skaičius nustatytas daugiau kaip 2 kartus viršijantis SLS normas piene ( norma iki 400 tūkst./ml), o 4 –ame mėginyje SLS skaičius nustatytą normą viršija daugiau kaip 1,6 karto.
SLS koreliacija su ZEA nustatėme labai stipri teigiama (r=0,902), su DON – stipri teigiama (r=0,801).
14 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus (SLS) (tūkst./ml) piene palyginimas su ZEA (µg/kg) ir DON (µg/kg) pašaruose
Stebėdami pieno mėginiuose SLS ir mikotoksino AFL B
1(15 pav.) matome, kad 4 –ame, 10 – ame ir 11 –ame mėginyje nebuvo nustatytas AFL B
1,tačiau SLS 4 –ame ir 10 – ame mėginyje yra didesnis kaip 600 tūkst./ml. Dėl to negalima teigti, kad tokį aukštą SLS skaičių šiuose mėginiuose įtakojo mikotoksinas AFL B
1.Įdomu tai, kad 33 proc. mėginiuose AFL B
1koncentracija nustatyta didesnė kaip 5 µg/kg, o 25 proc. mėginių, kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B
1, SLS kiekis buvo didesnis kaip 400 tūkst./ml.
Remiantis tyrimais 66,6±0,1 proc. mėginių, kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B
1, SLS kiekis buvo didesnis kaip 300 tūkst./ml., 11,1±0,1 proc. mėginių kuriuose buvo nustatytas mikotoksinas AFL B
1, SLS kiekis buvo didesnis kaip 200 tūkst./ml. ir 25 proc. mėginių buvo, kuriuose AFL B
1nenustatėme, o SLS vidutinis skaičius buvo 583,3±65 tūkst./ml.
SLS koreliacija su AFL B
1–silpna teigiama (r=0,342).
35