Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, atsparumas antibiotikams

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTAS

Eglė Derliūnaitė

Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno,

atsparumas antibiotikams

Staphylococcus, segregated from mastitic milk of cows,

resistance to antibiotics

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

Darbo vadovas: dr. Raimundas Mockeliūnas

2 DARBAS ATLIKTAS UŢKREČIAMŲ LIGŲ KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, atsparumas antibiotikams“.

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

3 TURINYS SANTRAUKA ...4 SUMMARY ...5 SANTRUMPOS ...6 ĮVADAS ...7 1. LITERATŪROS APŢVALGA ...9

1.1. Karvių mastitas ir jo atsiradimą įtakojantys veiksniai ...9

1.2.Stafilokokai, jų morfologija, išskyrimas ir identifikavimas... 11

1.3.S. aureus ir kitų bakterijų vaidmuo karvių mastito patogenezeje ... 16

1.4.Antimikrobinių medžiagų naudojimas gydyti karvių mastitą ... 19

1.5.Antimikrobinį bakterijų atsparumą įtakojantys veiksniai ... 22

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 26

2.1 Tyrimo vieta ir objektai ... 26

2.2. S. aureus ir KN stafilokokų išskyrimas ... 27

2.3Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas ... 27

2.3.1.Diskų metodas ... 27

2.3.2.MSK metodas ... 29

2.4. Atsparumo antibiotikams genų nustatymas ... 29

3.TYRIMO REZULTATAI ... 32

4.REZULTATŲ APTARIMAS... 39

IŠVADOS ... 42

4 SANTRAUKA

Eglė Derliūnaitė

„ Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, atsparumas antibiotikams― Darbo vadovas: dr. Raimundas Mockeliūnas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Veterinarijos akademija. Veterinarijos fakultetas. Mikrobiologijos ir virusologijos institutas. Tilţės gatvė 18, Kaunas, Lietuva.

Darbą sudaro 48 puslapiai, pateikta 9 lentelės, 13 paveikslėlių, iš jų 3 grafikai, 1 darbo schema ir 65 literatūtos šaltiniai.

Darbo tikslas - ištirti Staphylococcus aureus ir KN Staphylococcus, išskirtų iš pieno, atsparumą antibiotikams, bei nustatyti atsparumą antibiotikams lemiančius genus.

Darbas atliktas LSMU Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Iš 110 karvių, sergančių mastitu nustatyta didelė stafilokokų rūšių įvairovė: S. aureus – 52 (47,3 %), o koaguliazei neigiamų 58 (52,7 %) stafilokokai. Tarp jų daugiausiai buvo S. chromogenes - 37,5 % atvejų ir S. warneri - 25 %s atvejų.

Antibiotikams atsparumo lygis panašus tarp KTS ir KNS padermių. 84,5 proc. KNS ir visos S. aureus padermės buvo atsparios penicilinui. Tarp stafilokokų vyravo padermės, kurios taip pat buvo atsparios tetraciklinui, eritromicinui, gentamicinui ir jautrios ciprofloksacinui bei sulfonamido ir trimetoprimo kombinacijai (SXT). Kiekybinio ir kokybinio jautrumo antibiotikams tyrimų rezultatai tarpusavyje koreliavo. Kiekybinis jautrumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimas parodė daugiau atsparių padermių.

S. aureus 100 proc. ir 75 proc. KNS padermių nustatyta betalaktamazes produkuojatis ir jų buvimą koduojantis blaZ genas. Taip pat daugeliui padermių nustatyta mecA genas. Devynios S. aureus ir penkios KNS padermės buvo nustatytos kaip meticilinui atsparios.

5 SUMMARY

Eglė Derliūnaitė

„Staphylococcus, segregated from mastitic milk of cows, resistance to antibiotics― Work supervisor: dr. Raimundas Mockeliūnas

Microbiology and virology institute of the Veterinary academy, Lithuanian University of Health Science. Tilţės str. 18, Kaunas, Lithuania.

Work consist of 47 sheets, presented in 9 tables, 12 pictures, 1 scheme of the work and 65 literary sources.

Objective of work – To investigate Staphylococcus aureus and coagulase negatyve Staphylococcus (CNS), segregated from milk, resistance to antibiotics and estimate genes determinated resistance to antibiotics.

Work was prepared in Microbiology and virology institute of the Veterinary academy, Lithuanian University of Health Science. From 110 mastitis sicked cows, were determinated big variety of staphylococcus species: S. aureus – 52 (47,3 %), and coagulase negative 58 (52,7 %) staphylococcus. In between mostly were determinated S. chromogenes - 37,5 % cases and S. warneri - 25 % cases.

Level of resistance to antibiotics similar between SPP and CNS specieses. 84,5 % of CNS and all S. aureus specieses were resistant to penicilin. Between staphilococcus dominated specieses, which were resistant to tetracykline, erythromycin, gentamicin too and susceptible to ciprofloxacin and sulfonamid with trimetoprim combination (SXT). Results of quantitative and qualitative investigations of resistance to antibiotics correlated. Quantitative investigation of resistance to antimicrobial substances evidenced more resistant species.

S. aureus 100 % and 75 % CNS specieses determinated betalactamas produced and their exposure coding blaZ gene. For major specieses detected mecA gene. Nine S. aureus and five CNS specieses were determinated resistanted to methicillin.

6 SANTRUMPOS

KNS – koaguliazei neigiami stafilokokai KTS – koaguliazei teigiami stafilokokai MDA – manito druskos agaras

SLS – somatinių ląstelių skaičius

MSK – minimali slopinanti koncentracija

MASA – meticilinui atsparus Staphylococcus aureus SCC – stafilokokinė chromosomų kasetė

PGR – polimerazės grandininės reakcijos P – penicilinas E – eritromicinas SXT – trimetoprimas/sulfametoksazolis CN – gentamicinas CIP – ciprofloksacinas FOX – cefoksitinas TE – tetraciklinas

7 ĮVADAS

Pastaruoju metu labai didelis dėmesys yra kreipiamas į pieno kokybę ir jo saugą ţmonėms. Pieno kokybė yra vertinama pagal jame esantį somatinių ląstelių skaičių, kuris didėja esant karvių tešmens uţdegimui – mastitui. Karvių mastitas – pieno ūkiuose paplitusi ir didelė problema, kurio atsiradimą sąlygoja mechaniniai, fizikiniai bei cheminiai veiksniai. Tačiau svarbiausią vaidmenį uţima mikroorganizmai, kurie patenka į tešmens kanalą per melţimo įrangą, ţaizdas, nešvarias rankas. Daţniausiai išskiriama subklinikinis ir klinikinis mastitas. Slaptasis mastitas yra nuo 15 iki 40 kartų daţniau paplitęs nei klinikinis. Jis paprastai prasideda prieš klinikinį, daug sunkiau aptinkamas ir yra visos bandos mastito sukėlėjų šaltinis (Klimienė ir kt., 2005). Apie klinikinio ir subklinikinio mastito pasireiškimo daţnį duomenys skiriasi.Uţdegimo laipsnis priklauso ir nuo sukėlėjo koncentracijos ir virulentiškumo (Aniulis, 2007). Dėl mastito sumaţėja pieno kokybė, produkcija, ūkininkai patiria dideles gydymo išlaidas, tenka anksti brokuoti karves.

Mastitu sergančių karvių piene yra išskiriama per 150 įvairių mikroorganizmų, tačiau pagrindinis karvių mastito sukelėjas yra Staphylococcus genties bakterijos. Pagrindinės stafilokokų rūšys mastitiniame piene vyrauja S. aureus, S.chromogenes, S. warneri, S.haemolyticus, S. capitis. . Tačiau daţniausiai nustatoma mišri mikroflora. Tyrėjų (Ramanauskienė ir kt., 2008) duomenimis, bandose, kur piene nustatomas didelis SLS, 79 proc. atvejų mastitą sukelia Staphylococcus ir Streptococcus genčių bakterijos. Stafilokokai gyvulininkystę plėtojančiose šalyse, sukelia 27–69 proc. karvių mastito (Klimienė ir kt., 2012).

Dauguma stafilokokų yra nepatogeniški, nedaugelis patogeninių stafilokokų gamina enterotoksinus, kuriais ţmonės apsinuodija. Pagrindinis vaidmuo apsinuodijimo maistu sukelėjams tarp stafilokokų tenka koagulazei teigiamiems stafilokokams (tame tarpe S. aureus). S. aureus yra identifikuojama gausiausiai ir jis laikomas patogeniškiausiu ţmonėms ir gyvūnams. Jis laikomas svarbiausiu plazmokoaguliaziškai teigiamu stafilokoku. Sukėlėjas labai greitai patenka į tešmens audinius. S. aureus gali formuoti sienelių neturinčius darinius ir antibiotikams tampa atsparūs, nes antibiotikai veikia butent sienelę. Be to stafilokokų genties bakterijos išskiria β – laktamazę, kuri skaido antibiotikų struktūroje esantį β – laktaminį ţiedą. Tokiu atveju antimikrobinės medţiagos inaktyvuojamos ir bakterijų sienelė lieka nepakitusi (P. Murray, 2005).

8

Karvių mastito gydymui naudojami antibiotikai. Daţniausiai naudojami tetraciklinai, beta laktamai, makrolidai,linkozamidai, cefalosporinai. Karvėms, sergančioms mastitu, gydyti sukurta ir daug kompleksinių preparatų, kurių sudėtyje yra daugiau kaip du antibiotikai. Tačiau šie preparatai sudaro palankias sąlygas vystytis atsparioms mikroorganizmų padermėms (Pol and Ruegg, 2007).

Todėl daţnas ir nepagrįstas antibiotikų naudojimas sąlygoja antibiotikams atsparių mikroorganizmų vystymąsi. Lietuvoje karvių mastitą sukeliančių bakterijų įvairovė bei jų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimai atliekami jau senai. Šioje srityje dirbo ir dirba daug tyrėjų. Karvių mastitą sukeliančių bakterijų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms būklė ţinoma atskiruose tirtuose ūkiuose. Tačiau ji keičiasi. Bakterijų atsparumas antibiotikams įgaunamas per genų perdavimą arba mutacijas. Bakteriniam atsparumui nustatyti yra tiriamos išskirtos padermės minimali slopinanti koncentracija (MSK). S. aureus atsparumu pasiţymi, dėl savo genomo, kuriame aptinkami atsparūs antibiotikų veikimui genai pavyzdţiui, kaip mecA, blaZ genai (Malachowa, DeLeo, 2010; Olsen et al., 2006). Teigima (E. van Duijkeren, 2011), kad mecA genas gali būti perduodamas iš vienos stafilokokų rūšies – kitai. Dėl šio perdavimo ir kitos S. intermedius, S. pseudintermedius bei S. epidermidis rūšys geba įgyti atsparumą įvairioms antimikrobinėms medţiagoms. Todėl Staphylococcus genties bakterijų, išskirtų šalies pieno ūkiuose, tyrimai išlieka aktualūs, nes jų paplitimas ir savybės kinta.

Šiam darbui buvo tiriami mastitinio pieno mėginiai uţkrėsti Staphylococcus genties bakterijomis. Darbo metu buvo išskiriamos Staphylococcus genties bakterijos, nustatomas stafilokokų atsparumas atskiroms antimikrobinėms medţiagoms ar jų grupėms bei nustatoma stafilokokų atsparumo antibiotikams genai.

Tikslas: Tirti Staphylococcus aureus ir KN Staphylococcus, išskirtų iš pieno, atsparumą antibiotikams, bei nustatyti atsparumą antibiotikams lemiančius genus.

Uţdaviniai:

1. Nustatyti išskirtų stafilokokų rūšis

2. Nustatyti tiriamų stafilokokų padermių atsparumą antimikrobinėms medţiagoms Kirby-Bauer metodu

3. Nustatyti tiriamiems stafilokokams efektyvią antibiotikų koncentraciją (MSK) 4. Nustatyti stafilokokų atsparumo antibiotikams genus

9 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Karvių mastitas ir jo atsiradimą įtakojantys veiksniai

Mastitas – tešmens (pieno liaukos) uţdegimas yra daţniausiai pasitaikanti melţiamų karvių liga. Tešmens uţdegimai gali būti klinikiniai (pastebimi) ir subklinikiniai (slapti). Pagrindiniais poţymiais laikomi hipogalaktija, sumaţėjęs laktozės, baltymų, riebalų kiekis ir padidėjęs somatinių ląstelių skaičius piene, tešmens patinimas, paraudimas, skausmingumas. Sergant slaptuoju mastitu, kartais pastebima atrofija ar dalinė paţeisto tešmens ketvirčio induracija, spenio kanalo susiaurėjimas. Tačiau šie pakitimai pastebimi tik uţsitęsus slaptajam tešmens uţdegimui (Aniulis E., Japertas S. 2001). Melţiamos karvės tešmens uţdegimu – mastitu gali susirgti bet kuriuo metų laiku ir laktacijos laikotarpiu. Jį daţniausiai sukelia melţimo technologijos paţeidimai, blogos kokybės pašarai ir pakratai, nevisaverčiai racionai, netinkamos gyvulių laikymo sąlygos, vidaus organų ligos, netaisyklingos formos karvių tešmuo ir speniai. Dėl mastitų sumaţėja pieno gamyba ir pasikeičia jo sudėtis, pablogėja pieno dietinės ir technologinės savybės. Mastitas – pasaulinio masto problema, pieno ūkiuose sukelianti daug problemų. Dėl jo susilpnėja karvių imunitetas, sumaţėja produktyvumas, suprastėja pieno sudėties ir kokybės rodikliai. Dėl blogesnės pieno kokybės krenta jo vertė, gaunama maţiau pajamų, o kai kuriais atvejais pienas iš viso nesuperkamas.

1 pav. Karvė serganti mastitu.

Karvėms susirgus mastitu, ūkininkai nuostolius patiria dėl pablogėjusios pieno kokybės ir sumaţėjusio pieno kiekio, gydymo išlaidų, veterinarinių paslaugų kaštų ir ankstyvo karvių brokavimo.

10

JAV Nacionalinė mastito taryba suskaičiavo, kad išlaidos vienai karvei gydyti siekia 180 JAV dolerių per metus. Tyrimais nustatyta, kad iš karvės tešmens ketvirčio, sergančio mastitu, laktacijos periodu primelţiama apie 725 kg pieno maţiau negu iš nepaţeisto. Lietuvoje pagal kontroliuojamų karvių bandų produktyvumo apyskaitos duomenis, kontroliuojamose bandose karvių skaičius, kurių piene somatinių ląstelių kiekis svyruoja nuo 101 iki 400 tūkst./ml, sudarė 38,5 proc., nuo 501 iki 1 mln./ml, – 12,5 proc., o viršijančių 1 mln./ml – 14, 6 proc. Tai rodo, kad šalies pieno ūkiai dėl mastito patiria daug nuostolių. Skaičiuojama, kad dėl mastito Lietuvoje vidutiniškai iš karvės per laktaciją prarandama apie 650 kg pieno, t. y. apie 353 Lt iš vienos karvės, o visos šalies mastu – apie 130,9 mln. Lt. Nuostoliai dėl karvių sergamumo mastitu pieno gamintojams per metus siekia apie 261,8 mln. litų. Pienininkystės ūkiai daugiau nuostolių patiria dėl slaptojo negu dėl klinikinio mastito. Slaptasis mastitas yra nuo 15 iki 40 kartų daţniau paplitęs nei klinikinis. Jis paprastai prasideda prieš klinikinį, daug sunkiau aptinkamas ir yra visos bandos mastito sukėlėjų šaltinis (Klimienė ir kt., 2005). Apie klinikinio ir subklinikinio mastito pasireiškimo daţnį duomenys skiriasi. Yra duomenų, kad 22,8– 29,0% karvių bandose serga klinikiniu mastitu. Kiti tyrėjai nurodo, kad daug maţiau – 5–6%. Peeler et al., 2000 teigimu, slaptuoju mastitu karvės serga 20–50 kartų daţniau nei klinikiniu.

Mastitas turi įtakos ne tik pieno kiekiui, bet ir jo kokybei. Stiprėjant uţdegimui, cheminė pieno sudėtis panašėja į kraujo, nes sudėtinės dalys iš kraujo apytakos filtruojamos į pieno liauką. Pagrindinių sudedamųjų dalių kiekis pieno sausosiose medţiagose sumaţėja 5–15 proc. Labai pasikeičia riebalų sudėtis, padaugėja nesočiųjų didelės molekulinės masės riebalų rūgščių. Šie pokyčiai skatina lipolizę (riebalų skaidymą). Dėl to suprastėja pieno produktų kokybė. Uţdegimo paveiktame piene net 11–25 proc. maţiau bendrojo kazeino, o išrūginių baltymų daugiau negu įprasta. Be to, mastito paveiktame piene suaktyvėja baltymus skaidančių fermentų veikla: baltymai skaidomi ne tik pačiame tešmenyje, pamelţtame piene, bet ir iš jo pagamintuose produktuose. Karvei susirgus mastitu, piene pasikeičia mineralų ir mikroelementų kiekis. Tai lemia pieno perdirbimo savybes ir maistinę vertę. Pieno, turinčio daug somatinių ląstelių, nesuperka perdirbėjai, iš jo pagaminti produktai kenkia vartotojų sveikatai, todėl mastitai – ne tik ekonominė, bet ir socialinė problema (Rajala-Schultz et al., 1999). Nustatyta, kad sirgusių mastitu karvių reprodukcinis ciklas sutrinka, ilgėja servis periodas (Schrich et al., 2001). Mokslininkai teigia, jog karvės susirgimas mastitu priklauso nuo trijų veiksnių: karvės, aplinkos, mikroorganizmo. Nurodoma, kaip svarbi aplinka, t. y. kaip laikoma, kaip šeriama, melţiama (vakuumo dydis, pulsų skaičius), kokios klimatinės ir higieninės sąlygos. Mastito etiologijoje labai svarbu, koks mikroorganizmas kontaktuoja su karve, jo patogeniškumas ir kiekis.

11

Tešmens uţdegimas atsiranda dėl ţalingų išorinių ir vidinių veiksnių. Ligos prieţastys labai įvairios, tačiau jas galima suskirstyti į infekcines (patogeninių mikroorganizmų poveikis) ir neinfekcinės (aplinka, melţimo, šėrimo klaidos, traumos ir kt.). Daugelio mokslininkų darbuose karvių mastitas aprašomas kaip infekcinė liga. Mastitą gali sukelti daugiau kaip 150 skirtingų mikroorganizmų. Šie mikroorganizmai yra bakterijos, mikoplazmos, mielės, dumbliai ir retais atvejais – virusai. Pagrindinis sukėlėjo patekimo kelias į tešmenį yra galaktogeninis, per melţėjų rankas, pašluostes, melţimo įrangą. Uţdegimo laipsnis priklauso nuo sukėlėjo koncentracijos ir virulentiškumo (Aniulis, 2007). Uţdegimui būdingas liaukos audinio peraugimas jungiamuoju audiniu, paţeistų ketvirčių sumaţėjimas ir pieno cisternos gleivinės polipozinis sustorėjimas

Karvė suserga tešmens uţdegimu, mikroorganizmams patekus per spenio kanalą ir pradėjus daugintus tešmens viduje. Mastitą sukeliantys patogeniniai mikroorganizmai skirstomi į dvi grupes: uţkrečiamuosius ir aplinkos. Uţkrečiamieji mikroorganizmai – Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycopasma spp. Šie sukėlėjai plinta per nešvarias rankas, šluostes, melţimo indus, per nešvarius melţimo įrenginius, aparatus, pirmąsias pieno čiurkšles numelţiant gyvulių stovėjimo vietose. Aplinkos mikroorganizmai – Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus uberis – patenka per spenio kanalą iš aplinkos. Stafilokokai gyvulininkystę plėtojančiose šalyse, sukelia 27–69 proc. karvių mastito (Klimienė ir kt., 2012).

Mikroflora į tešmenį patenka per spenio kanalą, su krauju, spenių ir tešmens ţaizdeles, įtrūkimus, suţeidimus. Daţniausiai mikroorganizmai patenka per spenio kanalą, kadangi jais būna uţteršta tešmens oda. Taip pat jais būna uţteršti pakratai, į kuriuos mikrobai patenka iš lytinių organų (susilaikius nuovaloms, sergant endometritu), tešmens (kuomet numelţiamos pirmosios pieno čiurkšlės tiesiai ant grindų), pūlinių, ţaizdų. Didelės reikšmės turi melţimo aparatūros, pašluosčių ir vandens, naudojamo tešmens higienai, sanitarinė būklė, melţėjų rankų švara.

1.2. Stafilokokai, jų morfologija, išskyrimas ir identifikavimas

Stafilokokai – gramteigiamos, nejudrios, besporinės, rutilinės ~ 0,5-1,5µm skersmens bakterijos. Šie gramteigiamieji kokai, išsidėsto krūvelėmis, dalijasi nesistemingai per kelias plokštumas. Vynuogių kekės formos grandinė, atsiranda, kai rutulinė bakterija dalijasi įvairiomis kryptimis, o susidariusios naujos ląstelės ne išsisklaido, bet lieka sukibusios. Kai kurie stafilokokų biotipai turi kapsulę. Tai –

12

fakultatyviniai anaerobai. Stafilokokų citoplazminę membraną dengia ląstelės sienelė. Tepinėlyje stafilokokai išsidėsto primenančios vynuogių kekę (ţiūr. 2 pav.).

2 pav. Staphylococcus spp. mikroskopuojant

Chirurgas iš Škotijos, Aleksaderis Ogstonas, 1881 metais mikroskopo pagalba aptiko stafilokokus išskirtus iš ţaizdos ir pavadino juos „panašiais į vynuoges― (graikų k. staphyle) (Quinn et al., 2002). 1884 metais vokiečių mokslininkas Antonis Rosebanchas izoliavo stafilokokų kultūras. Viena jų pavadinta auksiniu stafilokoku (Staphylococcus aureus (toliau S. aureus), dėl auksinio kolonijų atspalvio.

Šiuo metu stafilokokų genčiai priskiriama 32 jų rūšys. Sukėlėjo rūšies nustatymas ir paplitimo mastas priklauso nuo diagnostikos metodų (Taponen et al., 2008). Daţniausiai sutinkamas - S. aureus yra patogeniškas ţmonėms ir gyvūnams, todėl laikomas svarbiausiu stafilokoku. Tačiau, atsiradus naujiems identifikavimo metodams, labai daţnai vardijamos kitos stafilokokų rūšys. Stafilokokai, kurie daţniausiai sukelia ligas ţmonėms yra S. epidermidis, S. haemolyticus ir S. saprophyticus, o S. simulans, S. chromogenes ir S. epidermidis – labiau paplitę galvijų mastito sukėlėjai.

Stafilokokai sukelia ligas ir dėl savo gebėjimo sintetinti ir išskirti toksinus ir fermentus. Daugumos fermentų bei toksinų gamybą apsprendţia plazmidės, kitų gamybą nulemia chromosomos (Jawetz et al., 2007). D. Floret (2001) teigimu, didţiausią įtaką ligų sukėlimui turi stafilokokų genties išskiriami fermentai – katalazė, koaguliazė, hialuronidazė, stafilokinazė, proteinazė, lipazė, bei atsparumą β – laktaminiams antibiotikams įtakojanti – β – laktamazė. Stafilokokų genties išskiriami virulentiškumo veiksniai nurodyti 1 lentelėje.

13

1 lentelė. Biologinės stafilokokų rūšies savybės (Devriese et al., 2005) Sukėlėjo biologinė savybė Staphylococcus spp. S. pseud intermedius

S. aureus S. intermedius S. hyicus S. schleiferi

Katalazė + + + + + Pigmento gamyba – + – – – Koaguliazė + + + ± – Hemolizė + + + – + Maltozė + + ± + – Sacharozė + + + + – DNR– azė + + ± + + Voges – Proskauer reakcija + + ± – +

Katalazė – fermentas vandenilio peroksidą skaidantis į vandenį ir deguonį. Koaguliazė – tai baltyminis fermentas. Patekęs į kraujo plazmą jis reaguoja su plazmos esterazėmis ir sukelia krešėjimo faktorių, tokių kaip protrombinas bei trombinas, aktyvaciją. Koaguliazė taip pat aktyvina fibrino nusėdimą ant stafilokokinių ląstelių, taip modifikuojamas fagocitų atpaţinimas bei ląstelių sunaikinimas (Jawetz et al., 2007). Pagal fermento koaguliazės skaidymą, stafilokokai skirstomi į plazmokoaguliaziškai teigiami (KTS) ir plazmokoaguliaziškai neigiami (KNS). KT stafilokokai – S. aureus, S. intermedius, S. schleiferi sub. coagulans. Daţniau nustatomi KNS atstovai: S. chromogenes, S. epidermidis, S. simulans, S. warneri, S. haemolyticus, S. sciuri, S. xylosus S. delphini, S. lutrae, o koaguliaziškai kintamas S. hyicus daţnai identifikuojamas kaip mastito etiologinis veiksnys.

P. Murray (2005) teigimu stafilokokų genties bakterijos išskiria β – laktamazę, kuri skaido antibiotikų struktūroje esantį β – laktaminį ţiedą. Tokiu atveju antimikrobinės medţiagos inaktyvuojamos ir bakterijų sienelė lieka nepakitusi.

Toksinai yra suskirstyti į enterotoksinus bei egzotoksinus. Dėl egzotoksinų produkcijos sukeliama odos nekrozė, eritrocitų hemolizė, leukocitų ţūtis ar net gyvūno mirtis. Eritrocitų hemolizei svarbus α toksinas – hemolizinas. Jis neigiamai veikia kraujagyslių lygiuosius raumenis. β – hemolizinas yra toksinis įvairioms organizmo ląstelėms, tarp jų ir raudoniesiems kraujo kūneliams. Leukocidinas sukelia baltųjų kraujo kūnelių ţūtį. Eksfoliatinis toksinas sukelia plikytos odos sindromą (Jawetz E., et al. 2007).

14

M. Dinges (2000) teigimu α hemolizinai veikia sukeldami eritrocitų hemolizę, odos nekrozę, bei neurotoksikozes. Išskirti α hemolizinai įterpiami į ląstelės – taikinio (eritrocitų) sienelę, formuoja cilindrinius haptamerus. Ląstelės taikinio sienelėje susiformuoja 1 – 2 nm skersmens poros. Pro šias poras difuzijos būdu šalinami ląstelės elementai.

3 pav. Stafilokokų kultūros sukelta hemolizė ant kraujo agaro

K. Futagava – Saito (2006) atlikęs tyrimus nustatė, kad 99,7 proc. išskirtų S. intermedius padermių sukelia eritrocitų hemolizę. Tuo tarpu M. Dinges (2000) ir kiti autoriai tyrę S. aureus padermes nustatė, kad 97 proc. visų S. aureus padermių sintetina δ – hemoliziną. δ – hemolizinas sukelia įvairių ţinduolių ląstelių lizę. Taip pat jo veikimas siejamas su nekrotiniais procesais organizme. δ – hemolizinas veikia per dvisluoksnę lipidinę ląstelės sienelę sudarydamas joje kanalus, pro kuriuos šalinamos ląstelės taikinio maistinės, bei struktūrinės medţiagos. Pirmiau iš ląstelės šalinamos maţos, vėliau didelės molekulinės masės struktūros (Dinges et al., 2000).

Panton – Valentine leukocidinas yra siejamas su tokiomis ţinduolių ligomis, kaip plaučių nekrozė, odos bei minkštųjų audinių infekcijos. Šis leukocidinas leukocitų sienelėse formuoja poras, taip sukeldamas jų lizę. S. Boyle – Vavra (2006) teigimu, Panton – Valentine leukocidinas, bei jo sintetinimas, padidina stafilokokų virulentiškumą bei didina išgyvenimo laiką ţinduolių organizme.

Stafilokokai, išskirti iš pacientų sergančių toksinio šoko sindromu, produkuoja toksinio šoko sindromo toksiną – 1 (TŠST – 1). Ţmonėms šis toksinas sukelia karščiavimą, odos bėrimus, šoką. Triušiams šis toksinas sukelia karščiavimą, tačiau odos bėrimų nepasitaiko (Gross et al., 2005).

S. aureus išskiriami enterotoksinai ţymimi A – Q raidėmis. Bent 5 iš jų yra būdingi visoms stafilokokų rūšims. Enterotoksinai yra termostabilūs – jų struktūra nepakinta veikiant juos aukštesne nei 100° C temperatūra 30 minučių. Stafilokokų padermės sintetinančios enterotoksinus sukelia maisto

15

intoksikacijas. Tam pagrįsti buvo atliktas tyrimas su beţdţionėmis, kurias maitino maistu, uţkrėstu enterotoksinu B. Joms buvo sukeltas vėmimas bei viduriavimas. Nustatyta, kad maisto intoksikacijas sukeliantis enterotoksinas veikia vėmimo centrą smegenyse (Jawetz et al., 2007). Maisto intoksikacijas sukeliantis enterotoksinas primatų organizme sukelia skrandţio bei viršutinės plonųjų ţarnų dalies gleivinės hiperemiją, leukocitų infiltraciją į ţarnų lamina propria. Dėl šių paţeidimų sukeliamas viduriavimas (Dinges et al., 2000).

Dauguma stafilokokų yra nepatogeniški, nedaugelis patogeninių stafilokokų gamina enterotoksinus, kuriais ţmonės apsinuodija. Pagrindinis vaidmuo apsinuodijimo maistu sukelėjams tarp stafilokokų tenka koagulazei teigiamiems stafilokokams (tame tarpe S. aureus), kurie gali augti 7–48°C temperatūroje, išlaiko kaitinimą 70°C temperatūroje 30 min., 80°C – 10 min. Stafilokokai gali daugintis ir gaminti toksinus įvairiose medţiagose, todėl ir apsinuodijama įvairiais maisto produktais. Daţniausiai apsinuodijama produktais, kuriuose gausu angliavandenių, nes kaip tik juose stafilokokai geriausiai vystosi. Stafilokokinės toksikozės yra daţnos, jomis suserga 60–90 proc. apsikrėtusių ţmonių. Stafilokokinę infekciją perduoda ţmonės, sergantys pūliniais, kurie patenka ant maisto produktų (per orą, rankas, inventorių). Apsinuodijimas pasireiškia praėjus 1–6 h po valgymo tipiškais virškinamojo trakto sutrikimo (gastroenterito) poţymiais: skrandţio, vidurių skausmais, vėmimu, viduriavimu. Liga praeina per 1–2 dienas. Stafilokokų intoksikacijų profilaktikai svarbu, kad maisto negamintų odos pūlinėmis ligomis ir angina sergantys ţmonės.

Mikrobiologijos laboratorijoje pagal laboratorinio darbo standartą (SDP 5.4.4.B.6 „Pagrindinių mastitą sukeliančių bakterijų nustatymas piene―), tiriamoji medţiaga sėjama į maitinamąjį sultinį. Mėgintuvėliai kultivuojami termostate 24 – 48 valandas 37ºC temperatūroje. Po kultivavimo tiriamoji medţiaga sėjama ant Manito druskos agaro (MDA) – selektyvios, diferencinės diagnostinės terpės. Petri lėkštelės kultivuojamos 24 valandas, 37°C temperatūroje. Jei mikroorganizmai fermentuoja manitą (S. aureus) terpės spalva pageltonuoja, jei nefermentuoja (S. intermedius) terpės spalva nekinta. Išaugusios pavienės kolonijos, savo savybėmis panašios į Staphylococcus spp. padermes persėjamos ant sojos triptono agaro. Kultivuojama 24 valandas, 37ºC temperatūroje. Ant sojos triptono agaro išaugusios pavienės kolonijos naudojamos tolimesniems tyrimams. Bakterijos daţomos sudėtiniu daţymo metodu – Gramo metodu, naudojant specialius daţų rinkinius. Stafilokokai nusidaţo gramteigiamai, t.y. raudona spalva. Mikroskopuojant matomas būdingas netaisyklingas ląstelių išsidėstymas – vynuogių kekės.

16

Identifikuoti Staphylococcus spp. nuo Streptococcus spp. genties atliekamas katalazės testas, naudojant 3 proc. vandenilio peroksidą (H2O2). Ant objektinio stiklelio uţlašinamas lašas 3 proc.

vandenilio peroksido ir bakteriologine kilpele uţnešama tiriamųjų mikroorganizmų kultūros, sumaišoma. Jei mikroorganizmas gamina fermentą katalazę vandenilio peroksidas skaidomas į vandenilį bei dujinį deguonį. Stafilokokai gamina fermentą katalazę, todėl šio testo metu susidaro dujos – reakcija teigiama. Streptokokai šio fermento negamina, todėl dujos nesusidaro – reakcija neigiama. Stafilokokų rūšies identifikavimui atliekami koaguliazės testai. Stafilokokai gali gaminti laisvąją bei surištąją koaguliazę: Laisvoji koaguliazė nustatoma koaguliazės testu atliekamu mėgintuvėlyje. Šio testo metu naudojama 0,5 ml triušio plazmos ir 2 lašai stafilokokų kultūros. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas ir kultivuojamas 2 – 4 valandas 37°C temperatūroje. Testas vertinamas kaip teigiamas, jei po kultivavimo plazma esanti mėgintuvėlyje sukietėjo arba buvo pusiau kieta. Neigiamai vertinamas testas – mėgintuvėlyje plazma liko nesukietėjusi. KTS laisvosios koaguliazės testas teigiamas, o KNS - neigiamas.

Surištoji koaguliazė nustatoma paviršiaus koaguliazės testu. Šio testo metu ant objektinio stiklelio uţlašinamas lašas triušio plazmos ir uţdedama tiriamosios kultūros. Testas teigiamas jei susiformavę fibrino krešuliai nusėda ant ląstelių paviršiaus ir tiriamieji mikroorganizmai sulimpa, vertinant testą po 1 – 2 minučių pastebimi dribsniai. Šiuo principu paremti greitieji lateksiniai testai. Stafilokokų rūšies nustatymui naudojami biocheminių testų eilutės, t.y. angliavandenių skaidymas.

1.3. S. aureus ir kitų bakterijų vaidmuo karvių mastito patogenezeje

Mastito etiologijoje svarbiausią vaidmenį vaidina biologinis veiksnys. Mastitą sukeliančios bakterijos skirstomos į patogenines ir sąlyginai patogenines. Mastitą daţniausiai sukelia S. aureus, S. agalactiae, S, dysgalactiae, S. uberis, E. faecalis, E. faecium, E. coli, pseudomonos, C. pyogenes, mikoplazmos, mieliniai grybeliai ir kt. Tačiau daţniausiai būna mišri mikroflora. Tyrėjų Ramanauskienė ir kt., 2008, duomenimis, bandose, kur piene nustatomas didelis SLS, 79 proc. atvejų mastitą sukelia Staphylococcus ir Streptococcus genčių bakterijos. Tyrėjai skirtingose šalyse, pateikia įvairius duomenis. Pitkälä et al., 2004, nustatė, kad 19,42% Suomijos karvių mastitų prieţastis yra S. aureus, 3,8% − KNS, 4,91% − S. uberis. Argentinoje atlikti tyrimai parodė, kad 20 % mastitų sukelia stafilokokai, o Danijoje apie 90% mastitų sukelia stafilokokai, streptokokai, koliforminės bakterijos.

17

Lenkijoje tyrimais nustatyta, kad rudenį 95,6% mastitų sukelia S. aureus, S. agalactiae, A. pyogenes, o ţiemojimo metu 63,3% etiologinis mastito faktorius yra S. aureus ir E. coli (Molenda et al., 2003).

Patogenai į pieno liauką patenka per spenio kanalą, kraują, limfą. Per kraują mikroorganizmai patenka iš lytinių organų, kai karvės serga endometritais. Nustatyta, jog karvės apie 48 – 50 % karvių po apsiveršiavimo sirgo endometritu ir mastitu kartu (Aniulis E., Japertas S. 2001). Apibendrinant karvių mastito prieţastis, pastebima, kad uţdegimas pasireikštų, būtinai turi saveikauti visi infekcinės grandinės elementai: karvė, jos aplinka ir patogeniniai mikroorganizmai.

Stafilokokai gyvulininkystę plėtojančiose šalyse, sukelia 27–69 proc. karvių mastito atvejų. Tai plazmokoaguliaziškai teigiami (KTS) ir plazmokoaguliaziškai neigiami (KNS) stafilokokai – S. chromogenes, S. epidermidis, S. simulans, S. intermedius, S. warneri, S. haemolyticus, S. sciuri, S. xylosus S. delphini, S. lutrae, S. schleiferi subs. coagulans ir koaguliaziškai kintamas S. hyicus. Sukėlėjo rūšies nustatymas ir masto paplitimas priklauso nuo diagnostikos metodų (Taponen et al., 2009).

Lietuvos karvių mastito sukėlėjai daţniausiai yra Staphylococcus genties bakterijos – net 58,6 proc. visų diagnozuotų mastito atvejų. Daţniausiai mastitiniame piene nustatomos stafilokokų rūšys yra S. aureus, S. epidermidis ir S. hyicus (Klimienė ir kt., 2005). I. Klimienės (2012) ir Rudejevienė, 2007, duomenimis, didţiausias tešmens susirgimo mastitu etiologinis veiksnys (59,7 proc.) buvo būtent S. aureus. Šis mastito sukėlėjas yra pagrindinis ir stabiliai nustatomas mastitu sergančių karvių piene. Šis patogenas yra virulentiškiausias, nes jo vos dešimties bakterijų pakanka, kad patektų į tešmenį, ir karvė jau gali susirgti tešmens uţdegimu. Sukėlėjas greitai įsiskverbia į tešmens audinius ir po šešių valandų jis jau randamas tešmens parenchimoje. Patekę į parenchimą nepalankiomis sąlygomis sukėlėjai sudaro mikropūlinukus. Nusilpus organizmui, iš šių inkapsuliuotų pūlinukų bakterijos vėl patenka į alveoles ir uţdegimas atsinaujina. Šis sukėlėjas gali formuoti sienelių neturinčius darinius (bakterijų L formas). Todėl auksiniai stafilokokai gali būti atsparūs antibiotikams, kurie veikia būtent ląstelės sienelę. Dėl šių ir kitų savybių, S. aureus yra patogeniškas ţmonėms ir gyvūnams, todėl laikomas svarbiausiu KTS. Pieno ūkyje persistuojantis S. aureus 3,2–63 proc. gali būti subklinikinio mastito prieţastis. Ūkiuose paplitusios vyraujančios padermės yra unikalios tik tai bandai (Ericsson Unnerstad ir kt., 2009). Prancūzijoje tirti slaptuoju mastitu sergančių karvių pieno bandiniai daţniausiai buvo infekuoti koaguliaziškai teigiamais stafilokokais (30,2 proc.) bei koaguliaziškai neigiamais stafilokokais (13,7 proc.) ir S. dysgalactiae (9,3 proc.) (Botrel et al., 2010). Lietuvoje probleminio, sunkiai gydomo mastito prieţastimi tapo ir kiti, anksčiau tik pavieniais atvejais nustatomi stafilokokai – S. hyicus (26,4

18

proc.), S. intermedius (5,4 proc.) bei KNS atstovas S. epidermidis (34,1 proc.). Mokslinėje literatūroje sutinkame analogišką patogenų rūšių kintamumą pienininkystę vystančiose uţsienio šalyse. Iš karvių mastitinio pieno daţniausiai išskiriami tie patys KTS atstovai, ir rezultatai gaunami panašūs, t. y. 82,1– 97,0 proc. S. aureus, 17,7–2,0 proc. S. hyicus ir 0,2–1 proc. S. intermedius (Capurro, 2009, Klimienė, 2012).

Ilgą laiką buvo manoma, kad kiti stafilokokai kaip tešmens patogenai nereikšmingi, ir jų sukelto mastito epidemiologija nebuvo detaliai studijuota. Buvo teigta, kad KNS yra spenio odos oportunistai, kurie paprastai gyvena ant tešmens odos. Tačiau pastaraisiais metais atlikti tyrimai poţiūrį pakeitė. Ericsson Unnerstad et al., 2009, S. Pyörälä 2009 tyrime nurodo, kad S. aureus sukelto mastito Europos šalyse maţėja, o svarbiais tampa kiti mastito sukėlėjai. Vien tik 16 KNS rūšių atstovų yra galvijų mastito prieţastis, o anot T. L. Bannerman ir S. J. Peacock (2007) - 30 KNS rūšių ir kai kurios iš jų yra pripaţintos kaip potencialūs patogenai ir ţmonėms, ir gyvūnams. Stafilokokai S. epidermidis, S. haemolyticus ir S. saprophyticus, S. simulans, S. chromogenes ir S. epidermidis – paplitę galvijų mastito sukėlėjai. Šių mikroorganizmų sukelto uţdegimo metu somatinių ląstelių piene padaugėja 2–3 kartus. KNS – S. epidermidis yra svarbus Lietuvos karvių mastito etiologijoje (20,4 proc. tarp visų nustatytų patogenų). Šis patogenas vyrauja tarp kitų analizuojamų stafilokokų. Per trejus tyrimo metus maţėjo nustatomų S. aureus, o S. epidermidis kiekis išliko stabilus. Kad šis sukėlėjas daţnas ir kitose šalyse, nustatė ir S. Taponen su grupe mokslininkų (2009), kurių tyrimai parodė, kad 60 proc. mastito prieţastis – S. epidermidis. Daţnai bandose S. epidermidis persistuoja trumpai, o kitose nustatomas kaip vyraujantis patogenas. Ilgai persistuodami bandoje KNS būna patogeniškesni ir sukelia mastitą su ryškiais klinikiniais poţymiais (Klimienė ir kt., 2012).

KNS sukeltas mastitas yra daţniau subklinikinis. Telyčios ir pirmaveršės karvės yra imlesnės KNS. Tyrėjų paskelbti duomenys labai įvairūs. Suomijoje KNS buvo išskirti iš 50 proc., Norvegijoje – iš 14 proc., Vokietijoje – iš 35 proc., JAV – iš 24 proc. mastitinio pieno mėginių (Pyöräla, Taponen, 2009). Pateikti skaičiai skiriasi net tik skirtingose šalyse, bet įvairuoja ir skirtinguose ūkiuose. Lietuvoje atlikti tyrimai parodė, kad KNS vaidmuo mastito etiologijoje kinta gana drastiškai, nuo 2,86 proc. iki 58,15 proc. Tačiau mūsų šalyje atliktų tyrimų metu KNS nebuvo identifikuoti iki rūšies. Dėl gausios rūšinės įvairovės ir jos kaitos reikalingi ne tik rutininiai laboratoriniai tyrimai atliekant gyvūnų ligų diagnostiką, bet ir nuolatiniai moksliniai tyrimai nustatant vyraujančius mastito etiologinius agentus, jų biologinių savybių kintamumą. Lietuvoje trūksta tyrimo duomenų, apie kitų stafilokokų rūšių sukeliamo karvių mastito daţnumą. Identifikavimas iki rūšies yra brangus tyrimas. Mokslininkai

19

rekomenduoja KNS rūšių genotipavimą (Sampimon et al., 2009). Tai patvirtino Ruţausko M. ir kt tyrimas 2014, kuriame nustatyta, kad biocheminiai komerciniai stafilokokų identifikavimo testai nepatikimi, nes jų gebėjimas identifikuoti stafilokokų rūšį, lyginant su PGR metodu, buvo tik 60-87 proc.

1.4. Antimikrobinių medţiagų naudojimas gydyti karvių mastitą

Antibiotikai (gr. Anti – prieš, bios – gyvybė) – tai chemoterapinės mikroorganizmų gaminamos arba gyvulinės, augalinės kilmės medţiagos, kurių nedidelė koncentracija slopina pasirinktinai tam tikrų organizmų augimą, dauginimąsį ar net uţmuša juos. Tai etiotropiniai vaistai, jie veikia ligos prieţastį – infekcinės ligos sukelėją. Egzistuoja daugiau nei penkiolika skirtingų klasių antibiotikų ir jie skiriasi savo chemine struktūra ir poveikiu bakterijoms. Antibiotikai svarbūs šiuolaikiniame ţemės ūkyje. Plačiausiai naudojami pramoninėje kiaulininkystėje, paukštininkystėje ir galvijininkystėje. Pienininkystės ūkiuose antibiotikai naudojami daţniausiai veršelių susirgimams ir karvių mastitui gydyti. Įvardijami kaip daţni aminoglikozidai, cefalosporinai, makrolidai, linkozamidai, beta laktamai, jų junginys su beta laktamazės inhibitoriumi. Pagal Lietuvos Veterinarinių vaistų registro duomenis, mūsų gyvulininkystėje naudojami tetraciklinai, beta laktamai, cefalosporinai, makrolidai, linkozamidai, aminoglokozidai ir kiti antimikrobiniai vaistai injekcinių tirpalų ar peroraliniam naudojimui skirtų formų pavidalu (http://vetlt1.vet.lt/vr/). Vieni iš daţniausių yra vaistiniai preparatai su beta laktamais. Intramaminiuose preparatuose penicilinų ir cefalosporinų ţenkliai daugiau. Uţsienio autoriai nurodo, kad beta laktaminiai antibiotikai išlieka svarbiausia gydomąja priemone gyvulininkystėje. Vien tik penicilinas vartojamas 31 – 66 % ūkių ir jis naudojamas daugiau kaip 80 % mastito gydymo atvejų (Tenhagen B. A. et al. (2006); Roesch M., (2006). Karvėms, sergančioms mastitu, gydyti sukurta daug kompleksinių preparatų, kurių sudėtyje yra daugiau kaip du antibiotikai. Kombinuotas gydymas taikomas norint sustiprinti antimikrobinį poveikį, taip pat sumaţinti toksiško antibiotiko dozę. Tačiau šie preparatai sudaro palankias sąlygas vystytis atsparioms mikroorganizmų padermėms (Pol and Ruegg, 2007).

20

2 lentelė. Rekomendacijos gydant antimikrobinėmis medţiagomis klinikinį mastitą sukeltą skirtingų patogeninių mikroorganizmų (Pyörälä S. 2009)

S. Malik (2005) teigimu stafilokokams svarbiausia ir didţiausia įtaką daro β – laktaminių antimikrobinių medţiagų grupė. Šios grupės medţiagos veikia baktericidiškai, prisijungdamos prie gram teigiamų bakterijų sienelės baltymų ir sukeldamos ląstelės sienelės lizę. Proteinus rišantis baltymas yra normalus gram teigiamų ląstelių sienelės struktūrinis elementas. Prie jo normaliomis

Mikro-organizmas Rūšis Pasirinktina vaistnė medţiaga Alternatyva Komentarai Strepto-kokai S. agalactiae S. dysgalactiae S. uberis Enterococci spp. Penicilinas G Remiantis jautrumo testo rezultatais Rekomenduotinas IMM gydymas. Gydymo prognozė bloga Stafilo-kokai S. aureus KNS Penicilinas G Kloksacilinas Makrolidai Linkozamidai S.aureus sukelto mastito prognozė bloga. Kloksacilinas gali būti pasirenkamas meticilinui atsparumo atveju. Koliformai E. coli Klebsiella spp. Fluorochino-lonai Cefalospori-nai Antimikrobinų medţiagų panaudojimas būtinas sunkesniais atvejais ir po apsivešiavimo periodu.

21

sąlygomis jungiasi β – laktaminai antibiotikai, tokie kaip penicilinas, meticilinas, vankomicinas bei cefalosporinai. Visi šie antimikrobiniai medţiagos savo cheminėje struktūroje turi β – laktaminį ţiedą. Prisijungę β – laktaminai antibiotikai sukelia bakterijų (stafilokokų ir kitų gram teigiamų bakterijų) sienelės struktūros pakitimus, dėl kurių ląstelė lizuojama, bakterija ţūsta (Murray P., et al. 2005).

Lietuvoje karvių mastitą sukeliančių bakterijų įvairovė bei jų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimai atliekami jau senai. Šioje srityje dirbo ir dirba daug tyrėjų. Karvių mastitą sukeliančių bakterijų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms būklė ţinoma atskiruose tirtuose ūkiuose. Paskelbti duomenys labai skiriasi, kinta priklausomai nuo ūkio dydţio, jame taikomos gydymo metodikos, gyvulininkystės vadybos, sezono, darbuotojų kvalifikacijos. J. Rudejevienė su bendradarbiais (2011) publikacijoje teigia, kad mūsų šalyje cefaleksinas ar cefaleksino derinys su ampicilinu tinkami gydyti mastitą, kurį sukėlė streptokokai, tačiau preparatai neveikė S. aureus sąlygoto susirgimo, o cefaleksinas su ampicilinu praktiškai neveiksmingi gydant KNS sąlygotą mastitą. Todėl rekomenduojami aminoglikozidai. Atsparioms S.aureus padermių sukeltoms infekcijoms gydyti paprastai intramamiškai skiriamas kloksicilinas. Teigiama (Ramanauskienė ir kt., 2008), kad veiksmingiausi yra antibiotikų deriniai, pavyzdţiui, karves, sergančias stafilokokų sukeltu tešmens uţdegimu, rekomenduoja gydyti amoksicilino ir klavulaninės rūgšties, kloksacilino, penicilino ir novobiocino preparatais arba cefalosporinais.

Analizuojant Veterinarinių vaistų registro duomenis (toliau Registras), nustatyta, kad vidutiniškai per metus Registre yra apie 190-200 antimikrobinių preparatų, kurių sudėtyje yra: tetraciklinai, amfenikoliai, beta laktamai, cefalosporinai, sulfanilamidai ir trimetoprimas, makrolidai, linkozamidai, aminoglikozidai, chinolonai, polimiksinai. Taip pat įvairių antimikrobinių medţiagų deriniai, tame tarpe ir su beta laktamais. Cefalosporinai su kitais beta laktamais (19,7 %.) rinkoje cirkuliuoja daţniausiai. Nemaţą dalį vaistinių grupių pasiskirstyme uţima tetraciklinai ir sulfanilamidai su trimetoprimu. Pagal Registro duomenis registruotuose intramaminiuose preparatuose yra antimikrobinės medţiagos: betalaktamai, cefalosporinai, deriniai antimikrobinių medţiagų su beta laktamais, deriniai su cefalosporinais. Daţniausi intramaminiuose preparatuose cefalasporinai su kitais beta laktamais (52 %) bei jų deriniai su kitais antimikrobiniais vaistais (32 %).

Kitose šalyse duomenys kitokie. Skandinavijos šalyse penicilinas yra suvartotas kaip svarbiausias antibiotikas gydant karvių mastitą. Ir ţenklaus atsparumo šiose šalyse neregistruojama, nes nustatyta grieţta antimikrobinių medţiagų naudojimo tvarka. C. Greko (2009) aprašo, kad cefalosporinai yra

22

plačiai naudojami laktuojančių ir uţtrūkusių karvių tešmenų sanavimui daugelyje šalių. Toks naudojimas gali turėti poveikį bakterijų atsparumui. Jeigu gydytos karvės, prieš pasibaigiant karencijos laikotarpiui, pienu yra girdomi veršeliai, pastarųjų ţarnyno mikroflora paţeidţiama. Daugelyje šalių apribota antros, trečios, ketvirtos kartos cefalosporinų naudojimas, leidţiama tik sunkiais atvejais. Cefalosporinų naudojimas būtų racionalus tik septinio mastito atveju ar gydant sunkų koliforminių bakterijų sukeltą mastitą. Kiek ir kaip naudojami cefalosporinai ES šalyse C. Greko teigimu, sunku pasakyti, nes ataskaitose jie „paslepiami― po beta laktamų skiltimi arba nenurodoma karta. Grieţti apribojimai taikomi cefalosporinus naudojant gyvuliams Vokietijoje, Olandijoje, Suomijoje.

1.5. Antimikrobinį bakterijų atsparumą įtakojantys veiksniai

Mikrobiologinis atsparumas, atskirų bakterijų padermių savybė toleruoti didelių koncentracijų antibiotikus, lyginant su įprastinėmis tos rūšies bakterijų padermėmis, kurios daţnai tiems antibiotikams yra jautrios. Atsparumas įgaunamas per genų perdavimą arba mutacijas. Mikrobiologiniam atsparumui nustatyti yra ištiriamos tiriamosios padermės MSK (minimali slopinanti koncentracija) ir ji lyginama su „laukinių―, t.y. įprastai jautrių tos rūšies bakterijų MSK rodiklių reikšmėmis. Atsparia laikoma tokia padermė, kuriai reikalinga didesnė MSK nei nustatyta laukinių padermių jautrumo riba. Įgytas atsparumas vienam arba keliems antibakteriniams vaistams yra savybė, būdinga tam tikrai padermei, pasikeitus jos genomui. Vienas iš genų pokyčių 22abia22e yra susijęs su mikroorganizmų tam tikrų genų bakterijos chromosomoje mutacijomis, dėl kurių atakuojamojo geno produktas nustoja buvęs to antibiotiko „taikiniu―. Taip atsitinka arba dėl „taikinio― baltymo struktūros pokyčio, arba dėl to, kad „taikinio― antibiotikas nepasiekia. Kitas genų pokyčių variantas susijęs su tuo, kad atsparumą vienam ar keliems antibiotikams mikroorganizmas įgyja, kai jame atsiranda papildomų genų, daţniausia R plazmidţių (atsakinga uţ atsparumą daugeliui antibiotikų) (Lasinskaitė – Čerkašina et al., 2003). Be to, kai kurie stafilokokai 22abia22et22 išskiria medţiagas (fermentus), kurios trukdo antibiotikams juos sunaikinti.

Stafilokokai, vadovaujantis jų jautrumu antibiotikams, skirstomi į 2 grupes: beta laktamazes negaminančius ir beta laktamazes gaminančius. Beta laktamazes gaminantys stafilokokai jautrūs tik oksacilino grupės penicilinams (oksacilinui, kloksacilinui), o kitiems penicilinams, jeigu jie naudojami kartu su beta laktamazių inhibitoriais: klavulano rūgštimi, tazobaktamu. Oksacilinui atsparūs

23

stafilokokai nejautrūs aminoglikozidams, makrolidams, tetraciklinams, nitrofuranams, trimetroprimui, sulfanilamidams.

Stafilokokinių infekcijų gydymas tampa sudėtingas dėl didėjančio stafilokokų atsparumo antibiotikams, meticilinui atsparaus S. aureus (MASA) infekcijų daţnio didėjimo, maţėjančio naujų antibiotikų atradimo, ilgėjančio jau rezistentiškų mikroorganizmų išgyvenamumo ir plitimo antibiotikų pripildytoje aplinkoje. Didėjant bakterijų atsparumui antibiotikams, empiriniam gydymui naudojami vis platesnio spektro, brangūs antibiotikai, kurių gausus naudojimas dar labiau skatina bakterijų atsparumą. Atsiranda bakterijų, atsparių beveik visiems antibiotikams.

Mikroorganizmų atsparumo vystymosi antibiotikams skirtumai šalyse atspindi antibiotikų naudojimo tvarką, politiką. Tačiau, pagal K. Schröter (2003) sunku nustatyti santykį tarp mastito patogenų atsparumo ir antibiotikų naudojimo intensyvumo gyvulininkystėje, nes svarbu dar ir antimikrobinių vaistų vartojimo mąstas medicinoje, gyvūnų gydyme, profilaktikoje ir augimo stimuliavime. Gyvūnų sveikatos instituto duomenimis, Europos Sąjungoje ir Šveicarijoje 5 460 000 kg antibiotikų sunaudojama ţmonių medicinoje, 3 465 000 kg gyvūnų gydymui ir 1 575 000 kg gyvūnų augimui gerinti. Skaičiuojama, kad antibiotikų dozė ţmogui – 241 mg/kg, o gyvūnams – 54 mg/kg. Tuo tarpu Danijoje, Suomijoje, Airijoje, Švedijoje – atitinkamai 6 – 24 mg/kg, o Ispanijoje, Graikojoje, Jungtinėje karalystėje – 103 – 148 mg/kg. Šie skačiai rodo šalyse vykdomą antimikrobinių medţiagų vartojimo politiką.

Veterinarinės medicinos tyrėjų duomenys apie patogenų atsparumą antimikrobinėms medţiagoms, įvairuojantys ir priklauso nuo šalies, kur tyrimas buvo įvykdytas. Pavyzdţiui, T. W. Bennendsgaard ir al. (2006) Skandinavijos šalyse nustatė, kad 4-12 % S. aureus, identifikuotų iš karvės mastito buvo atsparūs penicilinui. Išaugęs S. aureus atsparumas penicilinui buvo nustatytas Argentinoje, Lenkijoje, Palestinoje, Suomijoje (Pitkälä, 2004; Ghaleb, 2006; Malinowski et al., 2008). Teigiama, kad 3% Prancūzijoje, 46% Jungtinėje Karalystėje identifikuotų S. aureus atsparūs penicilinui. Manoma, kad Europoje apie 32 % karvių mastito sukėlėjų yra atsparūs penicilinui. Apie atsparumą oksacilinui paskelbta Prancūzijoje ir Ispanijoje. Patogeninių bakterijų atsparumo didėjimas antibiotikams kelia grėsmę antibakterinio gydymo sėkmei. Atsparūs antibiotikams mikroorganizmai plinta gyvūnų bandose, jų sukeliamos ligos yra sunkiai gydomos. Atsparumą lemia paveldimumas arba 23abia23et23e mutacijos. Pavienės 23abia23et23e mutacijos atsakingos uţ ląstelės sienelės baltymų, prie kurių jungiasi antimikrobiniai medţiagos, nebuvimą. Serijinių mutacijų metu susidaro nauji baltymai ar fermentai (Malik S. et al., 2005). S. aureus atsparumu pasiţymi, dėl savo genomo, kuriame

24

aptinkami atsparūs antibiotikų veikimui genai pavyzdţiui, kaip mecA, blaZ genai (Malachowa, DeLeo, 2010; Olsen et al., 2006). B. Strommenger (2006) teigimu, kai kurios S. aureus, padermės dėl 24abia24et24e mutacijos įgyja mecA geną, kuris nulemia proteinus rišančio baltymo aktyvumo (gebėjimo prisijungti β – laktaminius antimikrobinius medţiagas) maţėjimą. MecA geną stafilokokai perneša vadinamoje stafilokokinėje 24abia24et24e kasetėje (SCCmec). E. van Duijkeren (2011) teigimu mecA genas gali būti perduodamas iš vienos stafilokokų rūšies – kitai. Dėl šio perdavimo ir kitos S. intermedius, S. pseudintermedius bei S. epidermidis rūšys geba įgyti atsparumą įvairioms antimikrobinėms medţiagoms.

Meticilinas – β – laktaminis antimikrobinis preparatas. Stafilokokinėms infekcijoms gydyti buvo pradėtas naudoti jau 1959 metais, kuomet atsirado ir išplito penicilinui atsparios S. aureus padermės. 1961 metais Jungtinėje Karalystėje pasirodė pirmieji pranešimai apie meticilinui atsparias S. aureus padermes (MASA). Vėliau apie MASA padermes straipsniai pasirodė ir kitose Europos šalyse, Japonijoje, Jungtinėse Amerikos Valstijose (Enright et al., 2002). Dauguma KTS įgyja atsparumą meticilinui. C. Liu (2003) teigimu 1997 metais literatūroje pasirodė pirmieji straipsniai apie vankomicinui atsparias S. aureus padermes išskiriamas ţmonių medicinoje (http://www.oie.int. Prieiga per 24abia24et). Meticilinui atsparios S. aureus (MASA) bakterijas nuolat arba laikinai gali platinti sveiki ţmonės ir gyvūnai. S. aureus atsparumo antibiotikams laipsnis yra 24abia įvairus. Moksliniuose pranešimuose skelbiama, kad platus antimikrobinių priemonių vartojimas infekcijų prevencijai gyvulininkystėje yra pagrindinis MASA plitimo veiksnys. MASA paplitę tarp gyvūnų, jų randama ir gyvūninės kilmės maiste, tad problema išlieka MASA randamo klono CC 398, kuris aptinkamas melţiamose karvėse, kiaulėse, veršeliuose, viščiukuose broileriuose. Europos maisto saugos tarnyba informavo ES nares rinkti duomenis ir stebėti situaciją (http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_loc). Europos maisto saugos tarnybos Biologinio pavojaus vertinimo ekspertų grupė paţymėjo, kad nėra įrodymų, kad ţmonėms, kurie valgo arba tvarko meticilinui atspariomis S. aureus bakterijomis uţterštą maistą, būtų didesnė rizika tapti slaptais šios bakterinės infekcijos platintojais arba uţsikrėsti šiomis bakterijomis. Ţmonėms, kurie turi tiesioginius kontaktus su gyvais gyvūnais, ypač gyvūnų laikytojams, veterinarijos gydytojams ir jų šeimų nariams, nustatyta didesnė meticilinui atsparių S. aureus bakterinės infekcijos rizika negu kitiems gyventojams. Produkcijos gyvūnai platina meticilinui atsparių S. aureus bakterijų CC398 padermę, kuri kelia maţesnę grėsmę visuomenės sveikatai negu kitos ligoninėse pacientams nustatomos meticilinui atsparių S. aureus bakterijų patogeninės padermės. Meticilinui atsparių S. aureus bakterijų CC398 padermė, kurią platina produkcijos gyvūnai, didesnį

25

pavojų kelia gyvūnų laikytojams, veterinarijos gydytojams ir jų šeimų nariams. Meticilinui atsparių S. aureus bakterijų rizika ţmonių sveikatai priklauso nuo infekcinės dozės ir ţmonių jautrumo šiai infekcijai. Jautriausi šiai infekcijai yra ţmonės, kurie turi imuninės sistemos nepakankamumą.

26 2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

2.1. Tyrimo vieta ir objektai

Karvių, sergančių mastitu, pienas pristatytas iš įvairių šalies rajonų, skirtingo dydţio karvių bandų įvairiu metų laiku. Sergančių klinikiniu ir subklinikiniu mastitu ar turinčių didelį SLS karvių pienas iš paţeistų tešmens ketvirčių po melţimo aseptiškai imtas į sterilius indelius. Bandiniai pristatyti į VĮ „Pieno tyrimai―. Pirminiai bakteriologiniai tyrimai, nustatant atsparius antimikrobinėms medţiagoms stafilokokus, atlikti VĮ „Pieno tyrimai― Mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje. Kiekybiniai atsparumo antibiotikams, biocheminiai identifikavimo iki rūšies ir genetiniai tyrimai tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute, Mikrobiologinių tyrimų labaratorijoje. Darbas atliktas pagal sekančią shemą:

Buvo tirta 214 pieno bandinių, kurie buvo paimti iš įvairių dydţių fermų, skirtingų rajonų. Staphylococus spp. išskyrimas (110vnt.)

KN Staphylococus (58vnt.) Staphylococus aureus (52vnt.)

Atsparumo antibiotikams nustatymas diskų metodu (110vnt)

MIC nustatymas (16vnt)

27 2.2. S. aureus ir KN stafilokokų išskyrimas

Mėginiai mikrobiologiniams tyrimams buvo sėti į Petri lėkšteles su kraujo agaru CBA & S.B. (E&O Laboratories Limited, Škotija) ir selektyvų Manito druskos agarą (Liofilchem, Italija). Uţsėtos lėkštelės 1-2 paras kultivuojamos termostate +37O_{C temperatūroje. Mikroorganizmų morfologijai iš}

kultūrų paruošti tepinėliai buvo daţomi Gramo metodu ir stebėti pro mikroskopą. Išaugusios stafilokokų kultūros vertintos panaudojant 3% vandenilio peroksido tirpalą ir nustatant katalazės gamybą, bei priklausymą gram teigiamiems mikroorganizmams panaudotas 3% KOH tirpalas. Stafilokokų grupių nustatymui taip pat naudotas plazmos koaguliazės testas, o auksinių stafilokokų identifikacijai dar naudotas ir latekso agliutinacijos reakcija, naudojant latekso agliutinacinius serumus (―Microgen‖, Jungtinė Karalystė). Rūšiai identifikuoti taip pat naudotos greitosios identifikavimo sistemos RapiID STAPHYLUS System (―Microgen‖, Jungtinė Karalystė).

2.3. Atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimas 2.3.1. Diskų metodas

Kokybiniam bakterijų jautrumui antibiotikams nustatyti buvo panaudotas Kirby-Bauer metodas (Clinical Laboratory Standards Institute, JAV) pagal CLSI rekomendacijas (NCCLS, 2014). Išaugusios stafilokokų kolonijos kilpele nuimtos nuo agaro paviršiaus ir sumaišytos su fiziologiniu tirpalu, iki kol pasiekia 0,5 Mac Farland vieneto optinį tankį ir uţsėti ant Petri lėkštelės. Tyrimui naudota vienos serijos kieta terpė Mueller Hinton Agar (Liofilchem, Italija), antibiotikų rūšys, parinktos pagal EUCAST rekomendacijas. Diskų dispenseriu (Oxoid, JK) antibiotikų diskai uţdedami ant MH terpės (3 pav.) ir kultivuojama termostate 35-37O C temparatūroje, apie 16-18val. Vertinimas atliktas pagal

28

7 pav. Antibiotikograma ant Mueller Hinton Agar terpės

klinikines ribines atsparumo reikšmes (Eucast, 2014). Matuota skaidrių (jautrumo) zonų skersmuo milimetrais (7 pav.).

3 lentelė. Tyrimams naudotos antimikrobinės medţiagos, jų koncentracijos diskuose ir stafilokokų atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm)

Antimikrobinė medţiaga

Koncentracija

diske, μg

(arba IU)

Klinikinė reikšmė (EUCAST), sterili zona

Jautri, ≥ mm Vidut. jautri, mm

Atspari, 

mm

Penicilinas G 1IU 26 netaikoma 26

Cefoksitinas* 30 22 netaikoma 22 Ciprofloksacinas 5 20 netaikoma 20 Eritromicinas 15 21 18-20 18 Gentamicinas 10 18 netaikoma 18 Tetraciklinas 30 22 19-21 19 Sulfametoksazolis/trimetoprimas 25 17 14-16 14

* Atsparumo meticilinui markeris 6 pav. Atliekama antibiotikograma

29 2.3.2. MSK metodas

Kiekybinis jautrumo testas atliktas su Diagnostic Systems plokštelėmis - „Sensititre― (firma TREK) (8 pav.). Tyrimas atliktas aparatu ARIS 2X (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė) (9 pav). Tyrimai atlikti vadovaujantis gamintojo aprašytomis metodikomis ir vadovaujantis CLSI standartu. Antibiotikų rūšys parinktos tokios, kurios daţnai naudojamos klinikinėje praktikoje prieš atitinkamus ligų sukėlėjus ir turi lūţio tašką (clinical break-point). Rezultatai buvo verinami kaip „jautri padermė―, „ atspari padermė― arba „vidutiniškai jautri padermė―.

2.4. Atsparumo antibiotikams genų nustatymas

Atsparios bent vienos klasės antibiotikui padermės tiriant MSK metodu buvo paruoštos molekuliniams tyrimams. Genominei DNR išskirti keletas bakterijų kolonijų augančių standţioje terpėje buvo resuspenduojama 200 µl dejonizuoto vandens. Suspensija buvo virinama 5 minutes termostatinėje purtyklėje (TS-100C Biosan, Latvija), o po to centrifuguojama 10 000 aps/min. Supernatantas buvo nutraukiamas ir polimerazinė ciklinė reakcija vykdyta automatiniame termocikleryje (BOECO TC-PRO, Vokietija). DNR sintezė vykdyta 30 ciklų, kuriuos sudare: DNR denatūracija, pradmenų prilipinimas, DNR sintezė. PGR produktai analizuoti 1,5% agaroziname gelyje. 8 pav. Diagnostic Systems plokštelės – „Sensititre―

30

10 pav. PGR tyrimo rezultatas agarozės gelyje

PGR metodu nustatyta beta laktamams, tetraciklinams, makrolidams atsparumą lemiantys genai: mecA, blaZ, tet(K), tet(M), aph3, erm(A), erm(C), msrA/B. Oligonukleotidinių pradmenų seka, kaitinimo temperatūra, masės dydis pateikti 4 lentelėje.

4 lentelė. Tyrime naudoti oligonukleotidų pradmenys

Pradmuo Seka (5' - 3') Masė, bp

ir t (ºC) Genas Šaltinis mecA1 GGGATCATAGCGTCATTATT C 527 (61) mecA CRL-AR mecA2 AACGATTGTGACACGATAGC C blaZ1 CAGTTCACATGCCAAAGAG

772 (50) blaZ Schnellmann et al., 2006

blaZ2 TACACTCTTGGCGGTTTC

tetM1 GTTAAATAGTGTTCTTGGAG

656 (45) tetM Aerestrup et al., 2000

31

Tyrimo rezultatai ir statistiniai duomenys apskaičiuoti kompiuterine programa ―R 1.8.1‖ (http://www.r-project.org/). Skirtumo tarp grupių patikimumo kriterijai nustatyti, jei p<0,05.

tetK1 TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC

718 (55) tetK Aerestrup et al., 2000

tetK2 GCAAACTCATTCCAGAAGCA

aph3-IIF CCGCTGCGTAAAAGATAC

609 (57)

aph(3')-IIIa Perreten et al., 2005 aph3-IIR GTCATACCACTTGTCCGC

ermA1 AAGCGGTAAAACCCCTCTGA

G _{442 (53) ermA Jensen et al., 2002}

ermA2 TCAAAGCCTGTCGGAATTGG

ermC1 ATCTTTGAAATCGGCTCAGG

295 (48) ermC Jensen et al., 2002

ermC2 CAAACCCGTATTCCACGATT

msrAB1 GCAAATGGTGTAGGTAAGACAACT

350 (55) msrA/B Thumu et al., 2012 msrAB2 ATCATGTGATGTAAACAAAAT

32 3. TYRIMO REZULTATAI

Iš 214 karvių, sergančių mastitu, bandinių išskirta 110 stafilokokų, t. y. S. aureus – 52, koaguliazei neigiamų – 58. Vyravo stafilokokų genties (52,7 proc.) patogenai, kurie yra koaguliazei neigiami. Išskirtų ir identifikuotų Staphylococcus spp. rūšių įvairovė pateikta 11 paveiksle. Iš pieno daţniausiai išskyrėme S. chromogenes (37,5 %) ir S. warneri (25 %). S. haemolyticus ir S. capitis ss capitis kiekiai buvo identiški. Labiausiai literatūroje aprašomas mastito etiologinis veiksnys – S. aureus nustatyta labai daţnai, t.y. 47,3 proc. visų identifikuotų stafilokokų rūšių.

11 pav.Išskirtų KNS (n=16) pasiskirstymas pagal rūšis, proc.

Analizuojant mastitą sukėlusių stafilokokų jautrumo antibiotikams duomenis, daugiausiai tyrime atsparių padermių buvo beta laktamų klasės atstovui – penicilinui (12 ir 13 pav.).

Daugiausia iš visų išskirtų Staphylococcus spp. izoliatų buvo jautrūs ciprofloksacinui (99 proc.) bei sulfonamido ir trimetoprimo kombinacijai (SXT) (p<0,05), nei kitoms tyrime analizuojamoms antimikrobinėms medţiagamos (12 pav.). Taip pat patikimų statistinių skirtumų tarp rūšių nenustatėme (p>0,05). KNS tyrime buvo patikimai (p<0,05) atsparūs beta laktamų klasės antibiotikui penicilinui (84,5 proc.), tetraciklinui (24,16 proc.) ir aminoglikozidų klasės antibiotikui gentamicinui.

6,2 25 12,5 37,5 6,2 12,5 S. hominis S. warneri S. capitis ss capitis S. chromogenes S. epidermidis S. haemolyticus

33

12 pav. KNS jautrumas/atsparumas antimikrobinėms medţiagoms

Tyrime S. aureus padermės buvo atsparesnės penicilinui (100 proc.) (p<0,05),gentamicinui (38,5 proc), tetraciklinui (24,16 proc.) ir makrolidų klasės antibiotikui eritromicinui (13,4 proc.) (13 pav.). Kokybinio tyrimo metu iš pieno bandinių išskirtas septynios S. aureus padermes buvo atsparios cefoksitinui, t.y dvigubai daugiau nei KNS.

13 pav.S. aureus (n=52) atsparumas/jautrumas antibiotikams procentais 0 20 40 60 80 100

Jautrios paderm4s, proc. Atsparios paderm4s, proc.

KNS atsparumas/jautrumas antibiotikams

Jautrios paderm4s Atsparios paderm4s

S. aureus atsparumas/jautrumas antibiotikams

34

Tyrimo duomenimis (12 ir 13 pav.) tarp stafilokokų vyravo padermės, kurios buvo atsparios penicilinui G ir tetraciklinui, be to, didesnė dalis šių padermių buvo atsparios ir makrolidų klasės antibiotikui eritromicinui. Kai kurios stafilokokų padermės, kurios buvo atsparios meticilinui (tyrime - cefoksitinui) fenotipiškai buvo atsparios ir kitų klasių antibiotikams.

5 lentelėje - molekuliniams tyrimams atrinktų stafilokokų padermių jautrumas kelioms antimikrobinių medţiagų klasėms. Daugiaatsparios padermės yra tokios, kurios yra atsparios ne maţiau nei 3 antibiotikų klasių medţiagoms, tai tokių stafilokokų, išskirtų iš pieno bandinių padermių nustatyta 8,9 proc.

5 lentelė. Antibiotikų jautrumas/atsparumas keliems ir daugiau antibiotikams Antibiotikų skaičius 2 3 4 5 6≤ S. aureus (n=52)R (atsparūs) 15 7 4 2 KN stafilokokai (n=58)R (atsparūs) 7 5 1 1 2

Kiekybinio atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrime (6 ir 7 lentelės) penicilinui atsparios buvo 83 proc. S. aureus ir 87,5 proc. KNS padermių. 63 proc. S.aureus padermių buvo atsparios eritromicinui ir 37 proc. gentamicinui. KNS pusė padermių buvo atsparios eritromicinui ir jautrios arba vidutiniškai atsparios gentamicinui.

35

6 lentelė. Iš pieno išskirtų S. aureus kiekybinis atsparumas antimikrobinėms medţiagoms (%), n=16

Antibiotikai Padermių atsparumas antibiotikams, MSK mg/ml

0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 Ampicilinas¹ 25 6,25 9,4 25 25 6,25 Ceftriaksonas¹ 87,5 12,5 Ciprofloksacinas 75 6,25 18,75 Klindamicinas 62,5 12,5 12,5 6,25 6,25 Daptomicinas 87,5 12,5 Eritromicinas 37,5 12,5 50 Gatifloksacinas¹ 93,75 6,25 Gentamicinas¹ 75 18,7 6,25 Levofloksacinas 68,7 12,5 12,5 6,25 Linezolidas 62,5* 25 12,5 Oxacilinas+2%NaCl 12,5 12,5 50 6,25 18,75 Penicilinas 25 25 25 18,75 6,25 Kvinupristinas/dalfopristinas 18,75 50 25 6,25 Rifampinas 100 Tetraciklinas 25 12,5 25 12,5 25 Trimetoprimas/sulfametoksazolis 75 25 Vankomicinas 100 Paaiškinimai: ţalias langelis-jautru; mėlynas langelis-vidutiniškai jautru; rausvas langelis-atsparu.

36

7 lentelė. Iš pieno išskirtų Staphylococcus spp. kiekybinis atsparumas antimikrobinėms medţiagoms (%), n=16

Antibiotikai Padermių atsparumas antibiotikams, MSK mg/ml

0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 Ampicilinas¹ 12,5* 43,7 18,7 12,5 6,3 6,3 Ceftriaksonas¹ 81,2* 18,8 Ciprofloksacinas 75* 6,2 18,8** Klindamicinas 56,3* 6,2 12,5 6,2 18,8** Daptomicinas 93,7* 6,3 Eritromicinas 37,5* 12,5 50** Gatifloksacinas¹ 81,3* 12,5 6,3 Gentamicinas¹ 75* 18,7 6,2 Levofloksacinas 68,7* 12,5 12,5 6,3** Linezolidas 62,5* 25 12,5 Oxacilinas+2%NaCl 50* 12,5 12,5 6,3 18,7** Penicilinas 12,5* 25 25 12,5 6,3 18,7** Kvinupristinas/dalfopristinas 18,7* 50 25 6,3 Rifampinas 100* Tetraciklinas 25* 12,5 6,3 6,3 50** Trimetoprimas/sulfametoksazolis 87,5* 12,5** Vankomicinas 100* Paaiškinimai: ţalias langelis-jautru; mėlynas langelis-vidutiniškai jautru; rausvas langelis-atsparu.

1_{-CLSI standartas}

*-maţiau arba lygu nurodytai koncentracijai **-daugiau arba lygu nei nurodyta koncentracija