PICORNAVIRUS ( ) CALICIVIRUS( ) REOVIRUS ( ) CORONAVIRUS

CORONAVIRUS

REOVIRUS (

)

CALICIVIRUS (

) PICORNAVIRUS (

)

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014 Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella

Università degli Studi di Genova

Reovirus

Calicivirus Norovirus

CORONAVIRUS

Famiglia: Coronaviridae

Generi: Coronavirus & Torovirus

Dimensioni: virione sferico con diametro 80-220 nm Pericapside:

Involucro fosfolipidico con proiezioni distanziate (aculei o peplomeri) a forma di clava o di petalo (aspetto a “corona solare”)

Nucleocapside (genoma + monomeri di proteina N) Elicoidale - diametro 9-10 nm

Genoma:

RNA lineare a singolo filamento a polarità positiva (27-32 kb)

 È il più lungo di tutti gli RNA virali

 Replica con elevata frequenza di ricombinazioni

(Alta Variabilità Genetica)

Morfologia



Genoma costituito da singolo filamento di RNA a polarità positiva con un CAP al 5’ e un sito di poliadenilazione (PolyA) al 3’.



L’organizzazione genica è simile in tutti i coronavirus:



Una larga regione relativa a geni funzionali all’estremità 5’



Una sequenza di regioni codificanti le proteine strutturali (3’)

Morfologia -Genoma

Morfologia

 Proteina N (50-60 KDa): fosfoproteina nucleocapsidica fosforilata; stabilizza RNA.

 Glicoproteina S (E2,180-200 kDa) forma peplomeri favorisce attacco del virus e la fusione con membrana cellulare. Bersaglio degli Ab NT (principale Ag).

 Glicoproteina M di transmembrana (E1, 20-30 kDa);

incastonata nel doppio strato fosfolipidico dell’involucro, interagisce con il nucleocapside.

 Proteina E; piccola proteina dell’envelope (9-12KDa).

Interviene insieme ad gp M per stimolare gemmazione.

 Alcuni Virus hanno un’altra gp dell’envelope:

Emagglutinina Esterasi-HE (E3, 120-140 kDa) implicata nel processo di rilascio del virus.

aspetto a “corona solare” del Coranavirus



l virione è sensibile agli acidi, etere, essiccamento



Tropismo tissutale: cellule epiteliali del tratto respiratorio (cellule ciliate delle prime vie aeree) e del tratto gastrointestinale.



Il virus si replica ad una T° di 33-35°C.



Colture in vitro difficili: 229E può svilupparsi in fibroblasti (MRC5 e L132), OC43 si sviluppa bene in HRT18 (linea cellulare tumore rettale umano).



Specie-specifici: se ne conoscono 3 sierotipi con differenti spettri d’ospite (Uomo, Maiale, Cane, Gatto, Coniglio, Topo, Bovini,Tacchini, Polli).



Coronavirus sono sostanzialmente associati a sindromi respiratorie, sindromi enteriche , epatite, encefalite e, nei casi più gravi a patologia multiorgano.

Coronavirus - Caratteristiche

Classificazione

 Coronavirus umano NL63

 Coronavirus umano HKU1

 3 gruppi sulla base della sequenza nucleotidica.

 I gruppi I e II includono coronavirus di mammiferi, il gruppo III gli aviari.

Classificazione – SARS CoV

 I CoV sono noti da molti decenni come patogeni degli animali e dell’uomo ma a torto si è ritenuto che fossero patogeni secondari in medicina umana, responsabili di

patologie di scarso rilievo (10-20% raffreddori comuni, occasionali infezioni enteriche comuni nei bambini <12 anni; polmoniti nei lattanti e immunodepressi, altrimenti infezioni lievi, autolimitanti, non richiedono terapia)

 Negli anni 2002-2003 una forma di grave infezione respiratoria (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS) venne segnalata nelle regioni del sud della cina e si diffuse rapidamente in altri continenti (epidemia di polmonite atipica grave).

 L’agente responsabile della SARS venne identificato in un coronavirus umano sconosciuto prima di allora denominato SARS-Coronavirus (SARS-CoV)

 4 settimane per identificare, sequenziare il genoma e stabilire la filogenesi del virus.

 SARS-CoV che pure si differenzia geneticamente e biologicamente per alcuni aspetti dai tre gruppi noti, è stato assegnto al Gruppo II.

Classificazione – SARS CoV

Country Cumulative number of case(s)

Number of deaths

Brazil 2 0

Canada 103 13

China 1432 64

China, Hong Kong Special

Administrative Region 1268 61

China, Taiwan 27 0

France 5 0

Germany 6 0

Indonesia 1 0

Italy 3 0

Japan 1 0

Kuwait 1 0

Malaysia 5 1

Philippines 1 0

Republic of Ireland 1 0

Romania 1 0

Singapore 162 13

South Africa 1 0

Spain 1 0

Sweden 1 0

Switzerland 1 0

Thailand 8 2

United Kingdom 6 0

United States 193 0

Viet Nam 63 5

Total 3293 159

Cumulative Number of Reported Cases of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)

From 1 Nov 2002 to 16 April 2003

I CASI DI SARS NEL MONDO

From 1 Nov 2002 to 31 July 2003:

Cumulative number of cases: 8096 Number of death: 774

Genesi di SARS-CoV

1. Virus umano non conosciuto precedentemente e improvvisamente diffuso grazie a nuove vie di trasmissione?.

2. Virus animale che ha improvvisamente acquisito la capacità di infettare l’uomo in virtù di mutazione genetica (salto di specie)?

3. Virus prodotto da una ricombinazione, avvenuta naturalmente, che ha generato un coronavirus nuovo, con capacità di infettare l’uomo e notevole potenziale patogeno?

Studi epidemiologia molecolare hanno accreditato Hp. 2 differenti SALTI DI SPECIE:

Co-V Pipistrello Co-V Zibetto Uomo – SARS-CoV

e altri animali selvatici e d’allevamento utilizzati nella

gastonomia cinese

Addetti alla macellazione e ristorazione sono stati tra i

primi ad infettarsi

Co-V molto simili dal punto di vista genetico

 Il ciclo di replicazione avviene nel citoplasma.

 La replicazione è molto lenta se confrontata con altri tipi di virus: 24 ore (il triplo del tempo dell’influenza: 6-8 ore).

 I Co-V legano R cellulari specifici che variano da un gruppo all’altro e spesso tra i membri dello stesso gruppo; generalmente si tratta di glicoproteine o glicani.

 Co-V Gruppo II legano Acido neuraminico.

 SARS-CoV lega specificamente la proteina hACE2 (Human Angiotensin Converting Enzyme 2), la stessa cui si lega NL-63 (Gruppo I) anche se la legano in regioni diverse.

 229E (Gruppo I) lega una metallo proteasi.

LA REPLICAZIONE VIRALE

 Adesione R specifici su membrana cellulare attraverso peplomeri (glicoproteine S).

 Penetrazione:

2 possibili vie di entrata (a seconda del ceppo virale)

1. Endocitosi

2. Fusione dell’involucro virale con membrana cellulare mediata da glicoproteina S.

LA REPLICAZIONE VIRALE

 Sintesi RNA polimerasi virale:

nel citoplasma, viene prima direttamente tradotto un tratto dell’RNA genomico(+) all’estremità 5’ (gene ORF1) che codifica per una RdRp (RNA polimerasi virale)

 Trascrizione:

RdRp avvia sintesi di un intermedio RNA – (minus strand).

RNA - usato come stampo per poi produrre sia le nuove copie dell’RNA genomico virale+ sia 5-7 RNA sub-genomici

[mRNA (+)] che saranno tradotti nelle proteine strutturali corrispondenti.

 Sintesi proteica:

→ proteina N sintesi nel citoplasma

→ HE, S, E, M sintesi nel rR.E. e inserite in membrana

 Formazione del nucleocapside proteina N e RNA genomico

virale+ assemblati nel citoplasma

→ formazione nucleocapside .

LA REPLICAZIONE VIRALE

 Assemblaggio e maturazione:

Formazione del compartimento di gemmazione ERGIC (ER-to-Golgi Intermediate Compartment):



ERGIC con proteine



Nucleocapside si lega a proteina M e grazie a intervento proteine E e

gemma nel lume (gemmazione

intracellulare).



Dal Golgi → vescicole

a parete liscia contenenti particelle virali mature

LA REPLICAZIONE VIRALE

vescicole Golgi migrano verso membrana cellulare e il virus viene rilasciato per esocitosi

 Risposta immune dell’ospite (risposta T osservata in infezioni sperimentali) ritenuta a lungo responsabile delle manifestazioni cliniche dell’infezione ma… → in animali privi di risposta cellulo mediata si esprime comunque patogenicità dei coronavirus.

 Ruolo dell’effetto citopatico → citopaticità CoV varia in base a stipite virale e tipo cellula infetta: es. OC43 e 229E non causano un rilevante effetto citopatico, ma molti CoV sono in grado di sviluppare un’infezione litica.

 Meccanismi molecolari effetto citopatico di CoV approfonditi di recente, dimostrata:

 inibizione della trascrizione dei geni cellulari

 induzione apoptosi cellulare da parte proteina virale E

 Variazioni gravità sindrome clinica sulla base di differenze genetiche tra diversi stipiti virali: mutazioni puntiformi/piccole delezioni/inserzioni possono essere alla base di profonde modificazioni di tropismo e virulenza di singoli CoV.

 Mutazioni gene S o M sembrano essere correlate allo stabilirsi di infezioni persistenti.

Patogenesi

Risposta Immunitara



Ab neutralizzanti anti CoV presenti in soggetti pediatrici e adulti



Presenza Ab neutralizzanti non impedisce la reinfezione anche da parte di CoV dello stesso tipo, ma la gravità della sintomatologia clinica è notevolmente minore in presenza di un’immunità specifica.



In alcuni casi reinfezione può degenerare aggravando una patologia

polmonare cronica preesistente.

 Isolamento CoV è difficile e non diffusamente disponibile:

 difficile coltivazione CoV in vitro; sistema ottimale su coltura di tessuto tracheale.

 Eccezione per SARS-CoV che si coltiva bene → elevato cpe su cellule VERO

 Tecniche sierologiche hanno scarso impiego.

 Accertamenti si basano sulla ricerca nel materiale patologico (materiale fecale, essudato rino-faringeo) di :

 Ag specifici → TECNICHE IMMUNOENZIMATICHE o di IMMUNOFLUORESCENZA

 Sequenze nucleotidiche specifiche→ amplificazione molecolare (Real Time PCR).

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

REOVIRUS: ^ROTAVIRUS

 “Reovirus”= virus Respiratori Enterici Orfani ; 1951- isolamento da apparati respiratori e intestinali umani in assenza di associazioni patologiche nuove.

 Assente pericapside.

 Capside, formato da 6-10 polipeptidi diversi, costituito da strati concentrici.

 RNA a doppio filamento, lineare, segmentato.

 Famiglia: Reoviridae; divisa in generi in base alla struttura del capside, al numero dei segmenti genomici e alla natura dell’ospite.

 Generi: 15 generi di cui 5 infettano uomo e animali (altri infettano piante e pesci)

1. Orthoreovirus

2. Rotavirus

3. Orbivirus

4. Coltivirus

5. Seadornavirus

Reovirus - Caratteristiche Generali

Rotavirus - Caratteristiche

 Più importanti reovirus patogeni umani ma isolati anche in ≠ specie animali domestici/selvatici.

 NON specie specifici →Identificati nell’uomo stipiti virali correlati Ag a virus animali.

 Infettano enterociti maturi villi dell’intestino tenue → diarree neonatali uomo/animali.

 Infettività favorita da basse T° e da umidità elevata.

 Sono stabili a ph 3 e in quanto privi di envelope, resistono ai comuni disinfettanti quali etere, cloroformio e acidi .

 Coltivabili in vitro su linea cellulare MA-104 (cellule di rene fetale di scimmia).

 Condizione essenziale per replicazione in vitro del virus e per la comparsa dell’effetto citopatico è l’aggiunta di enzimi proteolitci (tripsina).

 Effetto citopatico si manifesta in 24-72 h ed è caratterizzato dalla comparsa di cellule rifrangenti che si distaccano dal monostrato e vanno incontro a lisi.

 Caratteristico aspetto a ruota

 Dimensioni: virione a simmetria icosaedrica, diametro 70 nm

 Capside: triplo strato proteine concentriche (VP).

 6 proteine strutturali (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 & VP7)

 6 proteine non strutturali (NSP1-6).

VP4 e VP7 formano lo strato più esterno

VP4 costituisce le spicole (proiezioni peduncolate) coinvolte nei meccanismi di adesione;

Target degli nAb e attività emoagglutinante.

VP7 (gp) principale target Ab neutralizzanti.

VP6 forma lo strato intermedio.

Core interno è formato da RNA +NSP+ VP2, VP1 e VP3

VP2 compone il terzo strato capsidico

VP1 e VP3 proteine enzimatiche con un ruolo cruciale nella replicazione.

Morfologia



In base all’antigene VP6, i rotavirus sono distinti in 7 gruppi (A-G).



Infezioni umane (gastroenteriche) sono causate da virus dei gruppi A, B e C.



Di questi, i rotavirus di gruppo A sono diffusi agenti di gastroenterite acuta nei



Rotavirus del gruppo A distinti in base alle proteine capside esterno (VP7-VP4)

 15 tipi G (da glicoproteina, in base al composizione chimica di VP7)

 25 tipi P

(da proteasi-sensibile, in relazione a una proprietà di VP4).



10 tipi G e 11 P infettano l’uomo, gli altri varie specie animali.

Classificazione- proteine capside



A causa di tale duplice caratterizzazione antigenica, i ceppi di rotavirus sono definiti con una classifi cazione binaria GnP[n].



Esistono ≠ combinazioni G-P:

infezioni umane causate da 5 ceppi:

G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8].

 Sono continuamente prodotte nuove

combinazioni G-P per il frequente

riassortimento genomico, che si realizza in corso di infezione doppia di una

stessa cellula.



Il riassortimento si realizza nell’ambito dei ceppi di gruppo A e può coinvolgere

o ceppi umani e animali.

Classificazione – proteine capside

 Genoma costituito da 11 segmenti di RNA bicatenario (dsRNA).

 Ogni segmento codifica per una proteina (strutturale-VP o non strutturale-NSP), eccetto il segmento 11, che codifica per due proteine non strutturali.

 Distinzione dei ceppi (A-B-C) di rotavirus può essere effettuata dopo estrazione dell’RNA genomico virale e separazione

elettroforetica su gel degli 11 segmenti in relazione al loro differente

peso molecolare.

Classificazione - genoma

Fig. a lato: Struttura e organizzazione genomica di un Rotavirus

 Distinzione dei ceppi di rotavirus può essere effettuata dopo estrazione dell’RNA genomico virale e separazione elettroforetica su gel di poliacrilamide (staining con ethidium bromide o silver nitrate) degli 11 segmenti in relazione al loro differente peso molecolare (→ 4 gruppi).

 I pattern elettroforetici vengono definiti elettroferotipi

e sono differenti

nell’ambito di ciascun gruppo (A, B e C).

 Caratteristico profilo di migrazione degli 11 segmenti può essere utilizzato per caratterizzare i rotavirus

in feci e colture cellulari.

Classificazione - Genoma

Elettroforesi di Rotavirus Umani Frammenti più veloci

Frammenti più lenti

~667 bp

~3302 bp

 Rotavirus infettano in primo luogo gli enterociti maturi delle porzioni intermedia e superiore dei villi del tenue.

 Proteine del capside esterno (VP7 e VP4) entrambe coinvolte nella fase iniziale del ciclo replicativo virale (legame al R e penetrazione).

 Sembra che esistano differenti R cellulari, uno dei quali costituito da acido sialico.

 Osservazione sperimentale: Rotavirus moltiplicano in colture di cellule in vitro solo con accorgimenti come aggiunta di tripsina al mezzo di coltura (difficile coltivazione).

 Pretrattamento proteolitico con tripsina importante per l’infettività virale → il taglio di VP4 in due porzioni (VP5 e VP8) facilita la penetrazione del virus nella cellula.

Replicazione: attacco e penetrazione del

virus nella cellula ospite



I virioni di rotavirus sono attivati da proteasi:

nel tratto GI avviene la proteolisi del capside più esterno (taglio di VP4 in VP5 e VP8) che rende il virus infettivo e stimola la produzione di particelle subvirali intermedie/infettive (ISVP)



ISVP si lega alla cellula, penetra al suo interno per endocitosi.



Particelle virali sono trasportate nei lisosomi, ove si realizza un denudamento parziale: virus perde capside esterno ma l’RNA virale rimane sempre rivestito (capside interno).

Replicazione: attacco e penetrazione del

virus nella cellula ospite

 Nel citoplasma: produzione mRNA mediata da una RNA polimerasi-RNA dipendente (RdRp) composta dal complesso VP1-VP3 (enzimi del capside interno).

 Filamento(-) del dsRNA virale usato come stampo da RdRp per la produzione di un filamento (+) che funge da mRNA .

 Capping e poliadenilazione: enzimi contenuti nel core del virione attaccano il 5’

“cap” metil-guanosina (*G) e il poli A al 3’ (AAA) dell’mRNA → mRNA maturo.

Replicazione: sintesi mRNA e produzione

dei trascritti virali

 I trascritti virali degli 11 segmenti (mRNA) sono tradotti in proteine:

 Nel citoplasma: sintetizzate/accumulate VP1, VP2, VP3,VP6 + alcune proteine non strutturali → utilizzate per montaggio del doppio capside: si formano particelle subvirali.

 Nel reticolo endoplasmatico: sintetizzate glicoproteine VP7 e NSP4 ed inserite in membrana R.E.

Replicazione: sintesi mRNA e produzione

dei trascritti virali

 Filamenti(+) sintetizzati da RdRp utilizzati anche per la sintesi dei filamenti complementari che costituiranno il nuovo genoma (11 segmenti).

 Filamenti(+) inclusi nella formazione delle particelle subvirali e RdRp li usa come stampo per sintetizzare il filamento(-) complementare, originando un genoma segmentato di dsRNA, avvolto in una particella a doppio strato.

Replicazione: sintesi del genoma virale

 La fase successiva è rappresentata dalla maturazione delle particelle subvirali per aggiunta delle proteine capsidiche dello strato esterno (VP4 e VP7).

 I capsidi aggregano “agganciandosi” sulla proteina NSP4 all’esterno del R.E.

---> gemmando all’interno acquisiscono le proteine del capside esterno (VP7/VP4?) e un pericapside (transitoria acquisizione di envelope).

Replicazione: maturazione

 Il virus perde poi il pericapside e abbandona la cellula in seguito a lisi cellulare.

 La morte cellulare è preceduta dal blocco della sintesi proteica e del DNA cellulare.

 Le proteine non strutturali sono coinvolte nella morte cellulare, causando alterazioni delle membrane cellulari.

Replicazione: rilascio del virus

Patogenesi

 Trasmessi per via fecale-orale.

 Infezione avviene principalmente mediante contatto con individui infetti, ma può essere trasmessa attraverso acqua, cibo o per contaminazione ambientale.

 Una volta ingerito, il virus, resistente all’acidità gastrica, raggiunge l’intestino tenue, infetta gli enterociti maturi delle porzioni intermedia e superiore dei villi del tenue

→ diarrea.

 Un soggetto infetto elimina n°particelle virali > 1012/ gr di feci.

 È sufficiente una bassa dose infettante (< 100 particelle virali)

Patogenesi

1. “Switch-off” cellulare al fine di produrre progenie virale → morte cellulare è preceduta dal blocco della sintesi proteica e del DNA cellulare.

2. Necrosi degli enterociti maturi infettati concorre alla sintomatologia riducendo la digestione e l’assorbimento di nutrienti → accumulo di lattosio e di altri disaccaridi nel lume intestinale → aumento della pressione osmotica → richiamo di acqua.

3. Ripopolazione dei villi da parte cellule a livello delle cripte → appiattimento dei villi e iperplasia delle cripte → cellule immature delle cripte sono secretorie pertanto la rapida rigenerazione delle cellule criptiche concorre alla diarrea acquosa.

4. Le proteine non strutturali sono coinvolte nella morte cellulare causando alterazioni delle membrane cellulari: NSP4 ha un ruolo patogenetico (enterotossina virale)

→ probabilmente aumenta la [Ca++] intracellulare → Hp che NSP4 interagisca con un R cellulare dell’epitelio intestinale stimolando un segnale di traduzione Ca- dipendente che aumenta la permeabilità della membrana plasmatica al Cl e potenzia la secrezione di Cl → induzione diarrea secretoria.

Risposta Immunitaria

 L’infezione primaria induce memoria immunologica specifica delle cellule B e T : questa non è sufficiente a prevenire una reinfezione, ma riduce la gravità delle

infezioni contratte negli anni successivi (→forma più lieve o decorrenza asintomatica).

 L’infezione da rotavirus induce sia una risposta immune omotipica che eterotipica → infezione associata ad un sierotipo induce generalmente protezione anche verso gli altri sierotipi.

 Ripetuta esposizione al virus in età pediatrica contribuisce a consolidare l’immunità verso l’infezione e giustifica la rarità delle manifestazioni cliniche dell’infezione nell’adolescente e nell’adulto.

 La presentazione clinica aspecifica dell’infezione ed il contesto epidemiologico difficilmente orientano la diagnosi di gastroenterite da rotavirus → esami di

laboratorio indispensabili per la diagnosi eziologia, quando le condizioni cliniche la rendono necessaria.

 La diagnosi viene comunemente effettuata ricercando Ag specifici del rotavirus in campioni fecali con tecniche immunoenzimatiche (ELISA) o tecniche di agglutinazione al lattice.

 I kit disponibili in commercio hanno un’alta sensibilità e specificità, e soprattutto semplicità e rapidità di esecuzione alla portata di qualsiasi laboratorio.

 Il ceppo coinvolto può essere ulteriormente caratterizzato tramite saggi molecolari, ma si tratta di analisi che non vengono effettuate comunemente.

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

CALICIVIRUS: ^NOROVIRUS

Famiglia: Caliciviridae

Generi: Norovirus, Sapovirus, Lagovirus & Vesivirus Norovirus: particelle rotondeggianti di 27 nm

Sapovirus: virioni sferici di 31-35 nm, con 32 tipiche depressioni a forma di coppa sulla superficie del capside (da cui “calicivirus”).

Pericapside assente (virus nudi)

Capside: icosaedrico, costituito da proteina strutturale VP1.

VP1 è polifunzionale: riconoscimento R, specificità d’ospite, assemblaggio capside e immunogenicità.

VP1 → subunità P1 e P2 che protrudono all’esterno subunità S (da shell), che riveste genoma.

Porzione centrale di P2 media maggior parte interazioni virus/cellule e mostra le maggiori divergenze Ag.

Esiste anche proteina strutturale VP2 che stabilizza la struttura.

Morfologia

 RNA lineare a singolo filamento a polarità positiva

 circa 7600 nucleotidi e poliadenilato in 3’

 Norovirus: organizzato in tre ordini di lettura (Open Reading Frames, ORF).

 ORF 1 → proteine non strutturali, tra cui la RNA polimerasi-RNAdipendente

 ORF2 → proteina strutturale VP1 (capside)

 ORF3 → proteina strutturale VP2 (regola espressione VP1/stabilizza struttura).

 Sapovirus: genoma contiene, salvo rare eccezioni, due ORF.

 ORF1 → codifica sia per le proteine non strutturali sia per quelle del capside

 ORF2 → codifica per una proteina strutturale minore a funzione non nota

Morfologia - Genoma

Caratteristiche



Norovirus legano R su cellule epitelio delle mucose del tratto digerente, respiratorio e genitourinario.

 Diffusi agenti di gastroenterite acuta, epidemica ed endemica, che coinvolge

soggetti di tutte le età.



Virus ad altissima variabilità genetica, dovuta a ≠ meccanismi:



elevato tasso di mutazioni puntiformi



predisposizione agli errori della RNA polimerasi-RNA dipendente



frequenti eventi di ricombinazione intra e inter-genogruppo, nell’ambito di ciascuno dei due generi.



Variabilità genetica è correlata a una spiccata eterogeneità antigenica.

 Eterogeneità Ag molto > di quella di altri virus a RNA+

(es. enterovirus).

 Letteratura: ceppo responsabile di un’infezione cronica in un paziente

trapiantato, in un anno modificava 32 aa della proteina capsidica.

 I calicivirus umani non sono tuttora coltivabili in vitro, a differenza dei ceppi animali

→ studi su replicazione fatti su volontari umani infettati e calicivirus animali.

 Tuttavia, il genoma di alcuni norovirus e sapovirus è stato clonato e sequenziato.

 Il confronto delle sequenze nucleotidiche codificanti per la proteina del capside e la RNApolimerasi-RNAdipendente di norovirus e sapovirus ha consentito di classificare i membri dei due generi in 5 genogruppi (da GGI a GGV) e di differenziare i norovirus in 30 genotipi e i sapovirus in 9 genotipi.

Classificazione

 Il ciclo di replicazione avviene nel citoplasma.

 Per norovirus è noto che la subunità P2 del capside virale lega combinazione di 2 o 3 Ag cellulari ≠: AB0, H e di Lewis (marcatori dei gruppi ematici).

 Ag sono oligosaccaridi legati a proteine/lipidi espressi su eritrociti o anche cellule del tratto gastrointestinale o liberi nella saliva, nel latte e in secrezioni mucose.

 Questa complessità di legame antirecettore/recettore spiega la difficoltà di adattamento dei norovirus alla crescita in vitro.

 Ceppi di ≠ genogruppi di norovirus legano ≠ combinazioni antigeniche.

 Non sono ancora stati identificati R virali e gli antirecettori cellulari dei sapovirus.

 Il virus penetra nella cellula per endocitosi.

Replicazione: attacco e penetrazione del

virus nella cellula ospite

 Calicivirus si replicano in sede citoplasmatica associati a membrane intracellulari.

 Nella cellula si riscontrano 2 tipi di RNA:

 RNA genomico: codifica per proteine non strutturali (RNApolimerasi-RNA dipendente (RdRp), l’elicasi e la proteasi).

 RNA subgenomico: codifica per le proteine strutturali.

 Questa strategia (tipica dei virus ssRNA+) viene utilizzata per ottenere una separazione temporale delle fasi precoci e tardiva della replicazione:

 fase precoce: RNA+ virale funziona da mRNA e tradotto in una poliproteina, poi processata nelle varie proteine non strutturali: elicasi, proteasi e RdRp.

 RdRp si attiva a formare filamento complementare a ssRNA+→ intermedio RNA(-) su cui si sintetizza mRNA (+) subgenomico.

 Nella fase tardiva dall’mRNA (+) subgenomico si ottengono direttamente, per sintesi ribosomiale, le proteine strutturali capsidiche.

Replicazione: sintesi mRNA e produzione dei

trascritti virali

 La replicazione del genoma avviene attraverso un intermedio a polarità negativa.

 RdRp si attiva a formare filamenti complementari RNA(-)

 Da questo intermedio a polarità negativa si sintetizzano gli mRNA(+) subgenomici, ma si formano anche molecole di RNA (+) genomico, della stessa dimensione dell'RNA(-) stampo (NON di dimensioni ridotte), che risultano quindi essere identiche al genoma virale e sono utilizzate nell'assemblaggio dei virioni.

 La fase di maturazione si realizza nel citoplasma e la liberazione dei nuovi virioni si ha per lisi cellulare.

Replicazione: replicazione genoma,

assemblaggio e maturazione

 Si trasmettono per via oro-fecale, sia indirettamente (esposizione ad acqua o cibo contaminato) sia direttamente (contatto con persone infette).

 Non noti i precisi meccanismi del vomito e della diarrea ma studi effettuati sui R dei norovirus rivestono ruolo determinante nella comprensione dei meccanismi patogenetici.

 Per accedere alle cellule verso le quali hanno tropismo devono superare diverse barriere: norovirus sopravvive nella saliva e nello stomaco.

 Secrezione salivare: gli oligosaccaridi componenti l’antigene H esibiscono una bassa affinità per l’antirecettore virale e non hanno capacità di neutralizzare il virus.

 Ambiente acido dello stomaco non danneggia il virus, che raggiunge l’intestino tenue, ove si replica attivamente.

 Diarrea è associata a transitorio malassorbimento carboidrati/grassi e a mancata attività di enzimi.

Patogenesi

Risposta Immunitaria



Studi condotti su volontari indicano che l’immunità anti-calicivirus è di breve durata e che la risposta immune nei confronti di un ceppo non fornisce

buona protezione dall’infezione con ceppi eterologhi.



Vi è, generalmente, una limitata cross-reattività tra genotipi di uno stesso genogruppo e una scarsissima reattività nei confronti di ceppi di

genogruppo differente.



La protezione è pertanto omologa e l’immunità non superiore a 6 mesi.



La produzione di IgA salivari specifiche in corso di infezione da norovirus è

stata correlata a una protezione contro manifestazioni più gravi.



La diagnosi delle calicivirosi, al contrario di quanto accade per altre malattie virali, si avvale esclusivamente di metodi diretti volti cioè ad identificare il patogeno, o parti di esso, nei campioni (feci-vomito).



Non esistendo linee cellulari sulle quali era possibile coltivare il virus,

l’osservazione al microscopio elettronico era uno dei mezzi d’elezione per la diagnosi → oggi poco usata e sostituita con saggi immunoenzimatici e saggi di agglutinazione per rilevamento di Ag virali.



Approccio diagnostico più sensibile è la PCR (Real Time).

ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

PICORNAVIRUS: ^RHINOVIRUS

Picornavirus

N.B. recentemente (2008) aggiunto il genere Parechovirus per Echovirus 22 e 23 notevolmente diversi dagli altri

Famiglia: Picornaviridae

Pericapside assente (virus nudi) Dimensioni: piccoli, da 25 a 30 nm

Capside: simmetria icosaedrica (20 facce, 12 vertici)

Caratteristiche generali

Caratteristiche generali

 Studi di cristallografia a raggi X hanno evidenziato presenza di una stretta depressione della struttura capsidica, profonda 25 Å, che corre intorno ai 12 vertici, denominata “canyon”.

 All’interno del “canyon”, che non permette l’ingresso di molecole anticorpali, avviene l’interazione della VP4

con R cellulare specifico.

 Genoma: RNA a singolo filamento a polarità positiva → ssRNA(+).

 Replicazione: citoplasmatica

 Il genoma (infettivo) è costituito da 7200 nucleotidi, è poliadenilato all'estremo 3' e possiede una piccola proteina (Virion Protein genomic -VPg) legata covalentemente all'estremo 5' al posto del caratteristico CAP degli mRNA eucariotici.

 VPg non necessaria per per la traduzione del genoma ma per sua replicazione.

Caratteristiche generali - Genoma

Caratteristiche Rhinovirus

 Molti simili a enterovirus nella composizione proteica, nella struttura del virione e nel ciclo replicativo→ per questo riclassificati e non costituiscono più genere a sé stante.

 Tuttavia, alcune importanti proprietà fisico-chimiche li differenziano da tutti gli altri picornavirus:

 Sensibili all’esposizione ad ambiente acido (pH < 5); quindi non sono in grado di infettare la mucosa intestinale (come invece fanno gli enterovirus).

 Crescono generalmente meglio a temperature di 33-35 °C piuttosto che a 37°C;

questo spiega il tropismo per le prime vie aeree (moltiplicazione a livello del tratto respiratorio superiore).

 Rhinovirus dal greco Reno= naso → optimum di temperatura di incubazione 33°C e pH 7 (temperatura delle cavità nasali).

 Recentemente è stata dimostrata capacità di replicarsi in cellule epitelio bronchiale.

Classificazione e Caratteristiche Rhinovirus

 I Rhinovirus comprendono più di 130 sierotipi/genotipi che infettano l’uomo causando il cosiddetto “raffreddore comune”

(30% dei raffreddori) e altre affezioni respiratorie.

 In base al tipo di recettore cellulare, si distinguono:

 100 genotipi di rinovirus che utilizzano una proteina di membrana di tipo 1,

InterCellular Adhesion Molecole 1

(ICAM-1, CD54), della superfamiglia delle Ig.

 12 genotipi che utilizzano lipoproteine di membrana a bassa densità, Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR).

 altri che utilizzano un R non ancora identificato.

ICAM-1 are

glycoproteins that are anchored in the membrane which they span once.

Their extracellular regions, to which the picornavirus binds, 5 immunoglobulin-like domains, with

immunoglobulin-like folds.

The virus binds to the N-terminal domain.

ICAM-1 is protrudes deep into the canyon.

 Ciclo replicativo virale ha inizio con l’interazione specifica R cellulare - anti R virale che permette l’ingresso e la liberazione del genoma nel citoplasma della cellula ospite.

 Picornavirus possono o meno essere endocitati ma comunque inducono la formazione di pori.

 Rhinovirus: internalizzazione del virione avviene per endocitosi mediata da R;

la scapsidazione è favorita dalla progressiva acidificazione endosomiale (pH 6.5→4.5)

 Poliovirus invece può penetrare per traslocazione diretta dell’RNA attraverso pori.

Replicazione: attacco e penetrazione del

virus nella cellula ospite

1. Interazione dei picornavirus con R cellulari.

2.Genoma iniettato attraverso virione e membrana cellulare oppure (2’) virione endocitato e genoma rilasciato.

3.Genoma è utilizzato come mRNA per la sintesi proteica. Una grossa poliproteina tradotta dal genoma del virione.

4.Poliproteina scissa per via proteolitica in proteine singole, compresa la RdRp.

5.RdRp produce filamento (−) dal genoma e lo replica in tanti RNA+ genomici virali.

(VPg) si attacca con legame covalente all’estremità 5 ’ del genoma virale.

6.Proteine strutturali si associano in struttura capsidica, viene inserito il genoma e i virioni sono rilasciati al momento della lisi cellulare.

Replicazione

Patogenesi

 Trasmessi via aerosol di goccioline respiratorie e da superfici contaminate, tra cui il contatto diretto da persona a persona.

 Si replicano nelle mucose nasali, in modo più o meno intenso a seconda della carica virale d’inoculo, con una breve incubazione (1-4 giorni) che precede la

sintomatologia tipica del raffreddore comune.

 Sintomatologia dovuta non tanto a lisi virus-indotta delle cellule dell’epitelio del nasofaringe quanto al rilascio di mediatori di flogosi: le cellule infettate rilasciano

bradichinina, istamina ed interleuchine che sono responsabili del naso che cola.

 L’immunità è tipo specifica e dura qualche anno.

CORONAVIRUS

REOVIRUS (

)

CALICIVIRUS (

) PICORNAVIRUS (

)

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014 Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella

Università degli Studi di Genova