Gentamicino poveikis raumeninės kilmės kamieninėms ląstelėms in vitro

1 Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

Medicinos akademija Medicinos fakultetas

Fiziologijos ir farmakologijos institutas

Lauryna Griniūtė

Gentamicino poveikis raumeninės kilmės kamieninėms ląstelėms in vitro

Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa – medicina

Darbo mokslinis vadovas: Doc. dr. Arvydas Ūsas

Kaunas, 2018

2

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

10.1. Aminoglikozidų grupės antibiotikai ... 11

10.2 Gentamicino toksiškumas ... 11

10.3 Gentamicino pažeistų klausos ir pusiausvyros organų bei inkstų regeneracija ... 12

10.4 Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės ... 13

10.5 Gentamicino poveikis kamieninėms ląstelėms ... 14

10.6 Askorbo rūgšties poveikis kamieninėms ląstelėms ... 14

TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 15

11.1 Kamieninių ląstelių kultivavimas ... 15

11.2 Ląstelių skaičiavimas... 15

11.3 Eksperimento modelis ... 16

11.4 Kamieninių ląstelių gyvybingumo vertinimas ... 17

11.5 Kamieninių ląstelių žūties būdo vertinimas ... 18

11.5.1 Tėkmės citometrija su aneksino V ir propidžio jodido dažų mišiniu ... 18

11.5.2 Kaspazių-3/7 imunocitochemija ... 19

11.6 Kamieninių ląstelių oksidacinio streso vertinimas ... 20

3

11.8 Statistinė duomenų analizė ... 21

REZULTATAI ... 22

12.1 Gentamicino poveikis žiurkės raumeninių kamieninių ląstelių gyvybingumui ... 22

12.2 Gentamicino sukeltas ląstelių žūties būdas ... 23

12.3 Kaspazių-3/7 aktyvumas ląsteles veikiant gentamicinu ... 25

12.4 Gentamicino poveikis ląstelių oksidaciniam stresui ... 26

12.5 Raumeninių kamieninių ląstelių diferenciacija ... 27

REZULTATŲ APTARIMAS ... 30

IŠVADOS ... 32

4

SANTRAUKA

Autorius: Lauryna Griniūtė

Darbo pavadinimas: Gentamicino poveikis raumeninės kilmės kamieninėms ląstelėms in vitro

Tyrimo tikslas: ištirti gentamicino (GM) toksinį poveikį raumeninėms kamieninėms ląstelėms (RKL)

ir įvertinti askorbo rūgšties (AR) apsauginio poveikio galimybes.

Uždaviniai: Nustatyti GM 500-1500 µg/ml koncentracijų poveikį RKL gyvybingumui, žūties būdui,

morfologijai ir oksidaciniam stresui bei nustatyti, ar išankstinis poveikis 100 µg/ml AR apsaugo ląsteles nuo toksinio GM poveikio.

Metodai: tyrime naudotos žiurkės RKL. GM poveikiui įvertinti ląstelės 48 val. veiktos 500-1500 µg/ml

GM. AR apsauginiam efektui įvertinti ląstelėms buvo taikytas išankstinis poveikis 100 µg/ml AR 24 val. Po 72 val. nuo tyrimo pradžios buvo vertinamas RKL gyvybingumas (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromido (MTT) spektrofotometrija), žūties būdas (Aneksino V ir propidžio jodido tėkmės citometrija, kaspazių-3/7 imunocitochemija ir fluorescencinė mikroskopija), oksidacinis stresas (2', 7'-dichlorofluoresceino diacetato (DCFH-DA) fluorometrija), morfologiniai pokyčiai (miogeninė diferenciacija įvertinta fluorescencinės mikroskopijos metodu naudojant monokloninį anti-desmino antikūną ir 4,6-diamino-2-fenilindolą (DAPI)).

Rezultatai: Eksperimentiniuose in vitro tyrimuose matoma tendencija, kad RKL gyvybingumas

sumažėjo jas veikiant 1500 µg/ml GM, o daugiausia apoptotinių ląstelių buvo jas veikiant 1000 ir 1500 µg/ml GM. Išankstinis poveikis 100 µg/ml AR toksinį poveikį sumažino. Kaspazėms-3/7 pozityvių ląstelių daugiausia buvo 500 µg/ml, 1000 µg/ml ir 1500 µg/ml GM veiktose ląstelėse, lyginant su niekuo neveikta kontrole, o išankstinis AR poveikis sumažino 500 ir 1000 µg/ml GM apoptotinį poveikį. Dėl mažų imčių statistinis patikimumas nenustatytas. AR ir (ar) GM taip pat neturėjo įtakos reaktyvių deguonies junginių susidarymui ląstelėse ir jų miogeninei diferenciacijai.

Išvados: 500-1500 µg/ml GM koncentracija neturi statistiškai patikimo poveikio RKL gyvybingumui,

proliferacijai, morfologijai ir oksidaciniam stresui. Išankstinis poveikis 100 µg/ml AR neturi statistiškai patikimo apsauginio poveikio RKL.

5

SUMMARY

Author: Lauryna Griniūtė

Title: Gentamicin Effects on Muscle Derived Stem Cells in vitro

Aim of the study: to investigate the effect of gentamicin (GM) on muscle derived stem cells (RKL) and

assess the cytoprotective effect of ascorbic acid (AR).

Objectives: to determine the effects of 500-1500 μg/ml GM concentrations on RKL viability, cell death,

morphology, oxidative stress and determine if pre-treatment with 100 μg/ml of AR protects cells from toxic effects of GM.

Methods: to assess effects of GM on RKL, cells were treated with 500-1500 μg/ml of GM for 48 hours.

For AR protective properties evaluation, cells were pre-treated with 100 μg/ml of AR for 24 hours. After 72 hours from the beginning, the viability of RKL was measured by 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difluhenyltetrazolium bromide (MTT) spectrophotometry, cell death was evaluated by Anexin V and propidium iodide flow cytometry and Caspase-3/7 immuno-cytochemistry, oxidative stress was assessed by fluorometry of 2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), and morphological changes (myogenic differentiation) was evaluated by fluorescence microscopy using a monoclonal anti-desmin antibody and 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)).

Results:In vitro studies have shown a tendency of 1500 μg / ml of GM to decrease RKL viability,

moreover, 1000 and 1500 μg/ml of GM was associated with increased apoptotic cell count. AR prie-treatment reduced apoptotic cell count and improved cell viability. RKL treated with GM has more Caspase-3/7 positive cells compared to unaffected control, and pre-treatment of AR reduced apoptotic cell count of cells treated with 500 and 1000 μg/ml of GM. Unfortunately, statistical significance has not been established. AR and (or) GM also had no effect on the formation of reactive oxygen species in the cells and did not influenced miogenic differentiation.

Conclusion: The 500-1500 μg/ml concentration of GM did not have a statistically significant effect on

viability, cell death, morphology and oxidative stress of RKL. Pre-treatment with 100 μg/ml of AR had no statistically significant cytoprotective effect on RKL.

6

PADĖKA

Dėkoju magistrinio darbo vadovui docentui dr. Arvydui Ūsui už galimybę eksperimentuoti bei pagalbą ir patarimus rengiant šį darbą. Taip pat esu dėkinga doktorantei Laurai Martinkutei už pagalbą laboratorijoje bei dr. Linai Jankauskaitei už visokeriopą pagalbą, palaikymą ir pastabas, kurios leidžia tobulėti.

INTERESŲ KONFLIKTAS

7

SANTRUMPOS

DCFH-DA 2', 7'-dichlorofluoresceino diacetatas

DMEM Dulbeccomodifikuota Eagle terpė

DNR deoksiribonukleorūgštis

GM gentamicinas

G-SCF granuliocitų kolonijas stimuliuojančius faktorius

HGF hepatocitų augimo faktorius

IGF-1 į insuliną panašus augimo faktorius 1

MKL mezenchiminės kamieninės ląstelės

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

PI propidžio jodidas

PBS fosfatinis buferis

RKL raumeninės kamieninės ląstelės

RNR ribonukleorūgštis

ROS reaktyvūs deguonies junginiai

SCF kamieninių ląstelių faktorius

SDF-1 iš stromos ląstelių išskirtus faktorius

UV ultravioletinė šviesa

8

SĄVOKOS

Adipogeninis – riebalinės kilmės Apoptozė – programuota ląstelių žūtis Chondrogeninis – kremzlinės kilmės

Citoplazma – plazminės membranos ribojamas ląstelės turinys, kuriam nepriklauso ląstelės branduolys

Citozolis – skystoji citoplazmos dalis

Ląstelių diferenciacija – ląstelių struktūrinė ir funkcinė specializacija Miogeninis – raumeninės kilmės

Nefrotoksinis – pažeidžiantis inkstus Osteogeninis – kaulinės kilmės

Ototoksinis – pažeidžiantis klausos ir (ar) pusiausvyros organus ar nervą Proliferacija – ląstelių populiacijos augimas dalijimosi būdu

9

ĮVADAS

Gentamicinas – aminoglikozidų grupės antibiotikas, dažnai naudojamas klinikinėje praktikoje dėl savo plataus antimikrobinio poveikio ir nedidelės kainos [1]. Gentamicino vartojimą riboja nepageidaujamas toksinis poveikis klausos ir pusiausvyros organams bei inkstams – susikaupęs inkstų parenchimoje gali sukelti ūmų inkstų pažeidimą [2]. Taip pat su kraujo tėkme patekęs į vidinę ausį, gali negrįžtamai pažeisti klausą ir pusiausvyrą [3].

Sparčiai besivystanti regeneracinė medicina pateikia vis daugiau galimybių atkurti pažeistus audinius ir organus. Mokslininkų grupės dirba įvairiomis kryptimis siekdamos atrasti efektyviausią ir mažiausiai etinių problemų keliantį gydymo būdą, panaudojant kamienines ląsteles. Suaugusio organizmo kamieninės ląstelės, išskiriamos iš kaulų čiulpų, riebalų, raumenų ir daugelio kitų sričių bei organų pasižymi ne tik gebėjimu diferencijuoti į įvairius audinius, bet ir uždegimą moduliuojančiomis bei antiapoptotinėmis savybėmis [4]. Įrodyta, kad mezenchiminių kamieninių ląstelių injekcijos turi teigiamą poveikį gydant ūmų inkstų pažeidimą [5].

Paskelbtoje literatūroje nėra duomenų, kokį poveikį, esant ūmiam inkstų pažeidimui, inkstų parenchimoje susikaupęs gentamicinas turi raumeninės kilmės kamieninėms ląstelėms, migravusioms į pažeidimo vietą. Kad ląstelės turėtų poveikį, svarbu, kad jos išliktų gyvybingos ir neprarastų kamieninėms ląstelėms būdingų savybių, todėl šiame darbe vertiname didelių gentamicino koncentracijų poveikį raumeninių kamieninių ląstelių gyvybingumui, proliferacijai bei miogeninei diferenciacijai. Siekdami apsaugoti ląsteles nuo galimai žalojančio antibiotiko poveikio, ieškome potencialios apsaugančios medžiagos, kuria paveikus ląsteles dar iki suleidimo į organizmą, jos taptų atsparesnės pažeidimui.

10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: ištirti gentamicino toksinį poveikį raumeninėms kamieninėms ląstelėms ir įvertinti

askorbo rūgšties apsauginio poveikio galimybes.

Hipotezė: askorbo rūgštis apsaugo raumenines kamienines ląsteles nuo žalojančio gentamicino

poveikio.

Uždaviniai:

1. Nustatyti gentamicino 500-1500 µg/ml koncentracijų poveikį raumeninių kamieninių ląstelių gyvybingumui, žūties būdui, morfologijai ir oksidaciniam stresui;

2. Nustatyti, ar išankstinis poveikis 100 µg/ml askorbo rūgštimi apsaugo ląsteles nuo toksinio gentamicino poveikio.

11

LITERATŪROS APŽVALGA

10.1. Aminoglikozidų grupės antibiotikai

Aminoglikozidų grupės antibiotikai yra plataus spektro antibiotikai, pasižymintis baktericidinėmis savybėmis prieš Gram-teigiamas, Gram-neigiamas bakterijas, mikobakterijas ir pirmuonis. Šių antibiotikų veikimo mechanizmas paremtas mikroorganizmų citoplazmos baltymų gamybos slopinimu. Aminoglikozidų grupės antibiotikai jungiasi prie mikroorganizmuose esančių 30S ribosomų subvienetų ir sutrikdo genetinio kodo nuskaitymą, dėl to nesusidaro mikroorganizmui reikalingi baltymai ir jis žūva. Žinomiausi šios grupės atstovai yra išskirti iš Streptomyces spp. (streptomicinas, neomicinas, tobramicinas), Micromonospora spp. (gentamicin) ar sintezuoti in vitro (netilmicinas, amikacinas, arbekacinas, izepamicinas) [6]. Aminoglikozidų grupės antibiotikai naudojami kai kurioms chirurginėms, pilvo organų, lyties ir šlapimo organų infekcijoms, pneumonijai, infekciniam endokarditui, sepsiui gydyti. Šie vaistai dažniausiai vartojami derinyje su kitais antibiotikais, o dėl galimo toksiškumo, ilgalaikio (>48 val.) vartojimo indikacijos yra apribotos [7]. Nepaisant aminoglikozidų toksiškumo inkstams, klausos ir pusiausvyros sistemoms, šie vaistai vis dar išlieka vieni dažniausiai skiriamų antibiotikų dėl efektyvių antimikrobinių savybių ir mažos kainos [1,8].

10.2 Gentamicino toksiškumas

Vienas dažniausiai vartojamų aminoglikozidų – gentamicinas [9]. Šis vaistas kaupiasi inkstų žievėje, artimųjų kanalėlių epitelio ląstelėse, ir sukelia ūmų inkstų pažeidimą (ŪIP). Į ląstelės vidų gentamicinas patenka receptorinės endocitozės būdu per megalino-kubilino komplekso receptorius ir kaupiasi lizosomose, taip pat su lizosomomis retrogradiniu būdu gali patekti į Goldžio kompleksą ir endoplazminį tinklą. Didelės gentamicino koncentracijos sukelia fosfolipidozę, organelių membranos tampa nestabilios ir gentamicinas patenka į citozolį [10]. Manoma, kad pagrindinis pažaidos mechanizmas yra susijęs su reaktyvių deguonies junginių (ROS) gamyba, kurie geba pažeisti daugelį ląstelėse esančių molekulių (baltymų, lipidų, nukleino rūgščių), būtinų ląstelės funkcionavimui. Citozolyje esantis gentamicinas tiesiogiai ir netiesiogiai veikia mitochondrijas ir sutrikdo ląstelinį

12 kvėpavimą, adenozintrifosfato (ATP) gamybą, skatina ROS susidarymą ir paleidžia apoptozės mechanizmą [11].

Literatūros duomenimis, gentamicino sukeltas ŪIP pasireiškia 5-25 % pacientų, priklausomai nuo į tyrimus įtrauktų pacientų atrankos kriterijų [12]. ŪIP rizikos veiksniai yra vyresnis amžius, lėtinės inkstų, kepenų ligos, diabetas, hipotenzija, hipoalbuminemija, kartu vartojami kiti nefrotoksiški vaistai, gydymo aminoglikozidais trukmė, vartojimas kelis kartus per parą [12,13]. Toksinis poveikis inkstams dažnai būna grįžtamas, jį galima sumažinti antibiotiko dozę koreguojant pagal kraujo plazmoje esančią koncentraciją bei sutrumpinus gydymo trukmę [14].

Ototoksinis gentamicino poveikis pasireiškia neurosensoriniu klausos susilpnėjimu, kuris dažnai pasireiškia kurtumu aukšto dažnio garsams, taip pat yra susijęs su ūžesio ausyse ir/ar galvoje atsiradimu. Vestibulotoksinis poveikis yra dažnesnis ir pasireiškia kūno padėties nestabilumu ar, rečiau, galvos svaigimu [8]. Kitaip nei nefrotoksiškumas, ototoksinis poveikis dažniausiai yra negrįžtamas ir nepriklauso nuo gydymo režimo, dozavimo ar vaisto koncentracijos kraujo serume [15]. Yra nustatytas ryšys tarp mitochondrijų genų mutacijos ir rizikos pasireikšti aminoglikozidų sukeltam ototoksiškumui – 1555A>G ir 1494C>T mutacijos MTRNR1 gene palengvina aminoglikozidų susijungimą su ribosomos 12S subvienetu ir taip sutrikdoma baltymų sintezė mitochondrijoje [16]. Pagrindinis klausos ir pusiausvyros organo ląstelių žūtį lemiantis faktorius, kaip ir inkstuose, yra ROS gamyba ir apoptozę skatinantys veiksniai [17].

10.3 Gentamicino pažeistų klausos ir pusiausvyros organų bei inkstų

regeneracija

Esant negrįžtamam klausos, pusiausvyros organų ar inkstų pažeidimui, šiuo metu taikomi gydymo būdai yra mažai veiksmingi. Besivystančios audinių inžinerijos ir regeneracinės medicinos technologijos yra potencialus būdas atkurti nukentėjusio organo funkciją ir išvengti neįgalumo.

Tyrimai su mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis (MKL) įrodė jų efektyvumą gydant ūmų inkstų pažeidimą. MKL gali būti išskiriamos iš suaugusio organizmo kaulų čiulpų, riebalinio audinio ar naujagimio virkštelės kraujo, vaisiaus dangalų [18]. Suleistos į veną, MKL kraujyje atpažįsta pažeisto audinio į kraują išskiriamus citokinus, chemokinus (tokius kaip chemokinas (CC motifas) ligandas 5 (CCL5), makrofagų išskiriamas chemokinas (MDC) ir kt.), augimo faktorius (pavyzdžiui, kamieninių ląstelių faktorius (SCF), granuliocitų kolonijas stimuliuojančius faktorius (G-SCF), iš

13 stromos ląstelių išskirtus faktorius (SDF-1)) ir migruoja į pažeidimo vietą [19]. Anksčiau buvo manoma, kad MKL, patekusios į pažeidimo vietą geba diferencijuoti į inkstų parenchimos ląsteles, tačiau dabar sukaupta nemažai įrodymų, kad MKL, atkeliavusios į pažeidimo vietą, veikia parakrininės sekrecijos būdu [4]. MKL išskiria augimo faktorius, citokinus, polipeptidus ir kitas medžiagas, padedančias pažeistam audiniui regeneruoti. MKL gaminami peptidai skatina epitelio proliferaciją, moduliuoja uždegimą, skatina angiogenezę; į insuliną panašus augimo faktorius 1 (IGF-1) ir hepatocitų augimo faktorius (HGF) gerina inkstų kraujotaką ir apsaugo juos nuo išemijos [18]. Neseniai atrastos mikropūslelės (angl. microvesicles), pagamintos MKL ir išskiriamos parakrininiu būdu, pažeistoms ląstelėms perneša informacinę ribonukleorūgštį (RNR), mikro-RNR ar baltymus, kurie gali paskatinti ląstelę apsaugančių medžiagų gamybą [20]. Kaip jau minėta anksčiau, pagrindinis gentamicino pažaidos inkstų ir klausos ląstelėms mechanizmas yra oksidacinis stresas. Įrodyta, kad MKL turi priešuždegiminių, antiapoptotinių ir oksidacinį stresą mažinančių savybių [21]. Šios kamieninių ląstelių savybės padeda regeneruoti pažeistus audinius.

10.4 Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės

Suaugusio žmogaus skeleto raumenys sudaro apie 40-50 % kūno masės, o raumeninio audinio gabalėlį galima paimti nedidelės invazinės procedūros – raumens biopsijos, kuri gali būti atliekama ambulatoriškai, metu, todėl, manoma, tai gali būti potencialus šaltinis autologinei terapijai [22,23]. Be to, raumeninės kamieninės ląstelės (RKL) yra nesunkiai išskiriamos ir kultivuojamos. Biopsijos metu paimtas raumens gabalėlis mechaniškai smulkinamas, virškinamas fermentų pagalba, centrifuguojamas ir gautos ląstelės išsėjamos į specialius kolagenu dengtus indus, kur jos prikimba prie dugno, o kamieninių ląstelių kultūra išgryninama ilgesnio kultivavimo metu (greitai prikimbančios ląstelės daugiausia yra fibroblastai, raumeninės kamieninės ląstelės prikimba ir pradeda augti vėliau – apie penktą parą po išskyrimo) [24,25].

Raumenyse randamos kelių rūšių ląstelės su skirtingomis diferenciacijos galimybėmis: satelitinės ląstelės diferencijuoja į raumeninį audinį, raumenų šoninės populiacijos ląstelės, išskirtos tėkmės citometrijos rūšiavimo metodu, turi gebėjimą diferencijuoti miogenine ir hematopoetine linkme, mioendotelinės ląstelės – miogenine, osteogenine, kardiogenine, chondrogenine linkme, mezangioblastai – miogenine (įskaitant ir lygiuosius raumenis), adipogenine, osteogenine, kardiogenine linkme, pericitai – miogenine, osteogenine, kardiogenine, chondrogenine linkme. Didžiausiomis diferenciacijos galimybėmis pasižymi RKL, randamos raumeninių skaidulų periferijoje, gaudžiai

14 susijusios su kraujagyslėmis [26]. RKL pasižymi multipotentine geba – gali diferencijuoti miogenine, osteogenine, chondrogenine, adipogenine, hematopoetine linkme [27]. Taip pat yra duomenų, kad RKL gali diferencijuoti į astrocitus ir neuronus [28,29]. In vivo tyrimai su žiurkėmis parodė, kad RKL sėkmingai pagerino gentamicino pažeistų inkstų regeneraciją [30].

10.5 Gentamicino poveikis kamieninėms ląstelėms

Nors RKL gali būti naudojamos gentamicinu pažeistų inkstų regeneracijai, nėra pakankamai duomenų apie GM poveikį šioms kamieninėms ląstelėms. Tyrime su MKL, išskirtomis iš žmogaus trabekulinio kaulo, nustatyta, kad didesnė nei 75 µg/ml gentamicino koncentracija slopino ląstelių proliferaciją ir osteogenezę [31]. Kitame tyrime su MKL iš žmogaus kaulų čiulpų nustatyta, kad gentamicino 0-200 µg/ml koncentracijos neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui, bet ≥100 µg/ml statistiškai reikšmingai slopino ląstelių proliferaciją ir osteochondrogenezę [32]. Iš arklio kaulų čiulpų išskirtų MKL inkubacija, esant terapinėms gentamicino koncentracijoms, per 45 min. sukėlė >95 % ląstelių žūtį [33].

10.6 Askorbo rūgšties poveikis kamieninėms ląstelėms

Askorbo rūgštis (AR) yra natūralus vandenyje tirpus vitaminas (vitaminas C). AR pasižymi redukuojančiomis ir antioksidacinėmis savybėmis, kai kuriose biocheminėse reakcijose veikia kaip kofermentas [34]. Pastebėta, kad nedidelės AR koncentracijos skatina kamieninių ląstelių proliferaciją ir apsaugo nuo apoptozės [35,36]. Šios savybės galėtų būti labai naudingos apsaugant kamienines ląsteles nuo žalingo gentamicino poveikio.

15

TYRIMO METODIKA IR METODAI

11.1 Kamieninių ląstelių kultivavimas

Tyrime naudotos RKL, išskirtos iš 2-5 sav. amžiaus žiurkių galinių galūnių blauzdos raumenų, augančios adherentiškai, monosluoksniu, kolagenu padengtuose 25-150 cm2 _{flakonuose, proliferacinėje}

terpėje 37o_{C temperatūroje drėkinamame inkubatoriuje, 5 % CO}

2 atmosferos sąlygomis.

Flakonų dengimui naudojamas I tipo kolagenas prieš naudojimą buvo šildomas 37 o_{C vandens}

vonelėje, reikiamas kiekis dedamas į dengiamą indą (flakoną ar plokštelės šulinėlius), 5-7 val. laikomas laminare, vėliau kolagenas iš indų pašalintas ir jie palikti džiūti per naktį. Kolagenu padengti indai sterilizuoti ultravioletinėje (UV) šviesoje 2 val.

Kultivavimui naudojama proliferacinė terpė pagaminta iš DMEM (angl. Dulbecco′s Modified

Eagle′s Medium; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, JAV), praturtinus ją galvijų vaisiaus serumu (10 %), arklio

serumu (10 %), viščiuko embriono ekstraktu (0,5 %) ir antibiotikų (penicilino ir streptomicino) mišiniu (1 %).

Kas 72 val. ląstelės buvo plaunamos fosfatiniu buferiu (PBS) ir keičiama proliferacinė terpė. Ląstelių tankiui flakone pasiekus 80 %, ląstelės buvo retinamos – tarpląsteliniai ryšiai suardyti tripsino tirpalu – pašalinus terpę ir nuplovus ląsteles PBS be magnio ir kalcio druskų, 1-3 ml. tripsino tirpalo uždėta ant ląstelių ir inkubuota 2 min. 37o_{C temperatūroje. Ląstelių monosluoksnio disociacija buvo}

vertinama šviesiniu mikroskopu: ląstelės suapvalėjusios ir plaukioja. Tripsinas neutralizuotas pridėjus dvigubą kiekį proliferacinės terpės. Gauta ląstelių suspensija centrifuguota 930 x g 5 min. 4 o_C

temperatūroje. Pašalinus supernatantą, nusėdusios ląstelės homogenizuotos nauja proliferacine terpe, suskaičiuotos ir išsėtos į naujus kolagenu dengtus indus.

11.2 Ląstelių skaičiavimas

Disocijuotos ląstelės dažytos tripano mėliu, įvertintas jų gyvybingumas, ir suskaičiuotas jų kiekis Neubauerio kameroje. Iš terpės ir ląstelių mišinio paimta 15 µl ir sumaišyta su 15 µl 0,4 % tripano mėlio tirpalu (paruoštu PBS). Neubauerio kameros užpildytos po 10 µl ląstelių ir tripano mėlio mišinio. Šis metodas yra pagrįstas dažo patekimu į negyvas ląsteles – jos dažosi mėlyna spalva, o gyvos ląstelės

16 išlieka nenusidažiusios. Gyvos ląstelės skaičiuotos keturiuose didžiuosiuose kameros kvadratuose (A-D), įskaičiuojant ląsteles, esančias ant viršutinės ir kairiosios kvadrato kraštinės, ir neįskaičiuojant ląstelių, esančių ant apatinės ir dešiniosios kvadrato kraštinės (1 pav.).

1 pav. Neubauerio kameros tinklelis. A, B, C, D – kvadratai, kuriuose buvo skaičiuojamos ląstelės.

Punktyrine linija pažymėtos kvadrato kraštinės, ant kurių esančios ląstelės nebuvo įskaičiuotos.

Ląstelių koncentracija apskaičiuota pagal formulę:

𝑙ą𝑠𝑡𝑒𝑙𝑖ų 𝑘𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑗𝑎 = 𝑙ą𝑠𝑡𝑒𝑙𝑖ų 𝑠𝑘𝑎𝑖č𝑖𝑢𝑠 𝑘𝑎𝑚𝑒𝑟𝑜𝑗𝑒 × 10 000 𝑘𝑣𝑎𝑑𝑟𝑎𝑡ų 𝑠𝑘𝑎𝑖č𝑖𝑢𝑠 × 𝑠𝑘𝑖𝑒𝑑𝑖𝑚𝑜 𝑠𝑎𝑛𝑡𝑦𝑘𝑖𝑠

11.3 Eksperimento modelis

Tiriamosios medžiagos: naudotas GM paruoštas distiliuotame vandenyje (50 mg/ml) (Life Technologies, Karlsbadas, JAV), AR milteliai prieš kiekvieną eksperimentą buvo sveriami ir tirpinami distiliuotame vandenyje (11 mM), vėliau šios medžiagos buvo skiedžiamos proliferacinėje terpėje ir gaunama galutinė tiriamoji koncentracija: AR 100 µg/ml, GM – 500-1500 µg/ml.

Atliekant eksperimentus su gentamicinu (GM) ir L-askorbo rūgštimi (AR), buvo sukurtas specialus protokolas, paremtas „išankstinio poveikio“ (angl. pre-treatment) principu. Prieš tyrimą ląstelės išsėjamos 3 tūkst. ląstelių/cm2 _{tankiu į specialias 6, 12, 24, 48 arba 96-ių šulinėlių kolagenu}

dengtas plokšteles ir paliekamos 24 val. inkubatoriuje (37 o_{C temp., 5 % CO}

2) kol prikibs prie šulinėlio

17 Visos ląstelės suskirstytos į tiriamąsias ir kontrolines grupes:

o kontrolinė grupė: niekuo neveiktos ląstelės, visą tyrimo laikotarpį augusios proliferacinėje terpėje;

o GM grupė: ląstelės 48 val. veiktos 500-1500 µg/ml GM koncentracijomis; o AR grupė: ląstelės 24 val. veiktos 100 µg/ml AR koncentracija;

o AR+GM grupė: ląstelės, kurios pirmąsias 24 tyrimo valandas buvo veikiamos 100 µg/ml AR, vėliau pašalinus AR, kitas 48 val. buvo veikiamos 500-1500 µg/ml GM (2 pav.).

2 pav. eksperimento modelis

Po AR pašalinimo, prieš paveikiant ląsteles GM, jos buvo plaunamos fosfatiniu buferiu, kad medžiagos nesusimaišytų. Siekiant sukurti vienodas sąlygas, tokiu pačiu režimu buvo plaunamos visos ląstelės, įskaitant ir kontrolines.

Po 72 val. nuo eksperimento pradžios, buvo atliekami tiriamųjų medžiagų poveikio (proliferacijos, gyvybingumo, morfologijos, oksidacinio streso) įvertinimai.

11.4 Kamieninių ląstelių gyvybingumo vertinimas

Raumeninių kamieninių ląstelių gyvybingumas vertintas MTT metodu. Šis metodas paremtas metaboliškai aktyvių ląstelių mitochondrijų fermentų gebėjimu vandenyje tirpią geltonos spalvos tetrazolio bromido (MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) druską paversti vandenyje netirpiais violetinės spalvos formazano kristalais.

18 Paskutiniąją eksperimento dieną, į šulinėlius, kuriuose buvo auginamos eksperimentinės ląstelės, pridėta 20 µl MTT (atitinka 10 % viso šulinėlio tūrio) ir inkubuota 4 val. 37 o_{C temp., 5 % CO}

2

ląstelių auginimo inkubatoriuje. Praėjus inkubacijos laikui, susidarę formazano kristalai ištirpinti specialiu tirpikliu. Susidariusio spalvoto junginio absorbcija matuota spektrofotometru 570 nm ilgio bangomis, fono absorbcija matuota 690 nm ilgio bangomis.

11.5 Kamieninių ląstelių žūties būdo vertinimas

11.5.1 Tėkmės citometrija su aneksino V ir propidžio jodido dažų mišiniu

Metodas paremtas aneksino V geba jungtis prie fosfatidilserino, kuris prasidėjus ląstelės apoptozei persikelia iš vidinio plazminės membranos sluoksnio į išorinį. Aneksinui V prisijungus prie fosfatidilserino, junginys tampa fluorescentinis ir gali būti nustatomas tėkmės citometrijos metodu. Propidžio jodidas (PI) patenka tik į negyvas ląsteles, kurių membranoje yra atsiradusios poros, ir jungiasi prie ląstelės DNR. Taigi, gyvos ląstelės nenusidažo nei aneksinu V, nei PI, ankstyvos apoptotinės ląstelės nusidažo tik aneksinu V, o vėlyvos apoptotinės nusidažo ir aneksinu V, ir PI (3 pav.).

Tyrimo dieną 6 šulinėlių plokštelėse augančios ląstelės buvo tripsinizuotos, centrifuguotos ir suspenduotos 500 µl rišančiame buferyje. Pridėjus 5 µl aneksino V inkubuota 15 min. tamsoje, kambario temperatūroje, po to pridėta 5 µl PI ir inkubuota dar 5 min. Fluorescencijos matavimai atlikti BD AccuriTM C6 tėkmės citometru (Accuri Cytometers Inc., An Arboras, JAV). Duomenys analizuoti programa BD AccuriTM C6 software (Accuri Cytometers Inc., An Arboras, JAV).

19

3 pav. ląstelių nusidažymas Aneksinu V ir (arba) PI (kairėje paveikslėlio dalyje). Ląstelių

pasiskirstymas pagal nusidažymą Aneksinu V ir (arba) PI tėkmės citometrijos metu (dešinėje paveikslėlio dalyje) – kairiajame apatiniame kvadrante yra atvaizduotos gyvos ląstelės, kurios nenusidažė nei Aneksinu V, nei PI, dešiniajame apatiniame kvadrante yra ankstyvos apoptotinės ląstelės, kurios nusidažė tik Aneksinu V, o dešiniajame viršutiniame kvadrante matomos vėlyvos apoptotinės ląstelės, kurios nusidažė ir Aneksinu V, ir PI [37].

11.5.2 Kaspazių-3/7 imunocitochemija

Kaspazės yra ląstelėse esantys fermentai, atsakingi už programuotos ląstelės žūties procesus – ląstelėse esančių komponentų suskaidymą, minimaliai veikiant aplinkines ląsteles. Aktyvių kaspazių nustatymas ląstelėse leidžia anksti identifikuoti prasidėjusią apoptozę.

Paskutiniąją eksperimento dieną, ląstelės, augančios 48 šulinėlių plokštelėje, dažytos CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection (Life technologies, Karlsbadas, JAV) reagentu. Pašalinus auginimo terpę ir nuplovus ląsteles PBS, jos fiksuotos 10 % formaldehido tirpalu ir inkubuotos 5 min. 4oC šaldytuve. Po fiksavimo, mėginiai dažyti pagal gamintojo rekomenduojamą protokolą: į kiekvieną šulinėlį pridėta po 1 µl CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection reagento, inkubuota 25 min. 37 o_C

temperatūroje, po to į kiekvieną šulinėlį pridėta po 1 µl 1mM SYTOX® AADvanced™ dead cell dažo ir inkubuota dar 5 min. 37 oC temperatūroje. Ląstelėse esančios kaspazės identifikuotos imunofluorescenciniu mikroskopu – nusidažiusios ląstelės švytėjo žalia spalva. Žaliai nusidažiusios ląstelės skaičiuotos šulinėlio trijuose nepriklausomuose regėjimo laukuose 400x didinimu imunofluorescencinės mikroskopijos metu.

20

11.6 Kamieninių ląstelių oksidacinio streso vertinimas

Oksidacinis stresas vertintas nustatant ROS ląstelėse. Fluorogeninis 2', 7'-dichlorofluoresceino diacetato (DCFH-DA) dažas matuoja hidroksilo, peroksilo ir kitas ROS, esančias ląstelės viduje. Patekęs į ląstelę, DCFH-DA yra deacetilinamas į nefluorescuojantį junginį, kuris ROS gali būti oksiduojamas į stipriai fluorescuojantį 2', 7'-dichlorofluoresceiną (DCF).

Po 24 val. nuo tyrimo pradžios, pasibaigus numatytam AR poveikiui, ląstelės nuplautos fosfatiniu buferiu ir į kiekvieną 96 šulinėlių plokštelės šulinėlį pridėta po 100 µl DCFH-DA dažo (25 µM), paruošto dejonizuoto vandens, fosfatinio buferio ir galvijų vaisiaus serumo mišinyje. Ląstelės su dažu inkubuotos 45 minutes 37 o_{C temp., 5 % CO}

2 ląstelių auginimo inkubatoriuje. Praėjus inkubacijos

laikui, ląstelės nuplautos fosfatinio buferio ir dejonizuoto vandens mišiniu, ir uždėjus tiriamąsias medžiagas pagal tyrimo protokolą, eksperimentas buvo tęsiamas toliau. Kontrolinių ląstelių grupes sudarė teigiamos kontrolės grupė – niekuo neveiktos ląstelės, ir neigiamos kontrolės grupė, kurios ląstelės veiktos 100 µM vandenilio peroksidu. Paskutinę tyrimo dieną (po 72 val. nuo tyrimo pradžios) fluorescencija matuota fluorometru: sužadinimo bangos ilgis – 485 nm, emisijos bangos ilgis – 535 nm.

11.7 Kamieninių ląstelių morfologinių pokyčių vertinimas

Svarbu įvertinti, ar GM ir AR neturi įtakos kamieninių ląstelių gebėjimui diferencijuoti. Šiame tyrime vertinome RKL gebėjimą diferencijuoti miogenine linkme. Tam tikslui buvo pagaminta miogeninė terpė, susidedanti iš DMEM, 2 % galvijų vaisiaus serumo ir 1 % penicilino-streptomicino mišinio. Ląstelės buvo auginamos įprastomis tyrimo sąlygomis 48 šulinėlių plokštelėje, pagal planą jas veikiant AR arba GM (2 pav.). Pasibaigus poveikio tyrimui, visos tiriamosios medžiagos buvo pašalintos ir ląstelės du kartus nuplautos PBS. Po to ląstelės dvi savaites augintos miogeninėje terpėje inkubatoriuje, keičiant ją kas tris dienas. Po dviejų savaičių ląstelės fiksuotos 10 % formaldehido tirpalu. Miogeninė diferenciacija įvertinta fluorescencinės mikroskopijos metodu naudojant pelės monokloninį anti-desmino antikūną, kuris žaliai nudažė citozolyje esantį desminą. Ląstelių branduoliai dažyti 4,6-diamino-2-fenilindolu (DAPI).

21

11.8 Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Excel 2016 (Microsoft Co., Jungtinės Amerikos Valstijos) ir IBM SPSS Statistics (International Business Machines Corporation, JAV) 23.0 versijos statistinį duomenų analizės paketą. Kiekybiniai požymiai aprašyti pateikiant vidurkį ir standartinį nuokrypį. Esant mažoms imtims, dėl kurių kiekybiniai kintamieji netenkino normaliojo skirstinio sąlygų, reikšmės tarp dviejų nepriklausomų grupių lygintos taikant Mano-Vitnio kriterijų. Skirtumas tarp dviejų grupių laikytas statistiškai reikšmingu, kai apskaičiuota p reikšmė buvo mažesnė už pasirinktą reikšmingumo lygį (α=0,05).

22

REZULTATAI

12.1

Gentamicino poveikis žiurkės raumeninių kamieninių ląstelių gyvybingumui

Kamienines ląsteles naudojant regeneracijos skatinimui, labai svarbu, kad jos išliktų gyvybingos. Wang Y. ir kt. atliktoje meta-analizėje teigiama, kad geresnių inkstų regeneracijos rezultatų pasiekiama injekuojant ląsteles vėliau nei 1 diena po ŪIP išsivystymo [38]. Taigi, ląstelės, migravusios į inkstus, tikėtina, bus paveiktos juose susikaupusio gentamicino.

Atlikus MTT tyrimą nustatyta, kad AR ir 500 µg/ml GM gyvybingumą didino, 1000 µg/ml GM poveikis gyvybingumui buvo panašus į kontrolinį (niekuo neveiktų ląstelių), o 1500 µg/ml GM gyvybingumą sumažino apie 30 %, lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis. Išankstinis poveikis AR apsaugojo ląsteles nuo toksinio GM poveikio, kai ląstelės buvo veikiamos 1500 µg/ml GM – šių ląstelių gyvybingumas buvo didesnis nei veiktų tik GM, bet panašus į kontrolinių ląstelių (4 pav.). Nors kartotiniuose tyrimuose ši tendencija išlieka, tačiau dėl mažos imties (n=3), statistinis patikimumas nenustatytas.

4 pav. ląstelių gyvybingumas skirtingose grupėse. Raudona linija žymi kontrolę (niekuo

neveiktų ląstelių gyvybingumą).

AR - askorbo rūgštis (100 µg/ml) GM – gentamicinas (500-1500 µg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 L ąstelių gy vy bin gumas ly ginant su kontrole (% ) Tiriamosios grupės p=0,2 p=0,7 p=0,1 p=0,1 p=0,4 _p=0,1

23

12.2 Gentamicino sukeltas ląstelių žūties būdas

Šio eksperimento metu ląstelės buvo auginamos techniniuose triplikatuose (kiekviena tiriamoji grupė turėjo po tris atskirus šulinėlius plokštelėje), vėliau atliekant tėkmės citometriją, ląstelių triplikatai buvo sujungti į vieną mėginį, todėl statistinė analizė neatlikta. Ląstelių populiacijos pasirinktos pagal ląstelių dydį ir grūdėtumą, o vėliau analizuotos pagal nusidažymą aneksinu V ir (arba) PI (5 pav.).

5 pav. apoptotinių ląstelių nustatymas tėkmės citometrijos metodu. Ląstelės išsidėsčiusios pagal

grūdėtumą (išilgai y ašies) ir pagal nusidažymą aneksinu V (išilgai x ašies). Raudona punktyrinė linija žymi tyrime analizuotą ląstelių populiaciją, nusidažiusią aneksinu V.

Atliktuose tėkmės citometrijos tyrimuose, didžiausias žuvusių ląstelių skaičius buvo ląsteles paveikus 1000 µg/ml ir 1500 µg/ml GM dozėmis, o 500 µg/ml GM koncentracija apoptotinių ląstelių skaičiaus nedidino. AR apsauginis poveikis stebimas ląsteles paveikus 1000 µg/ml ir 1500 µg/ml GM koncentracijomis. Priešingas efektas pastebėtas su 500 µg/ml GM koncentracija– išankstinis AR poveikis padidino žuvusių ląstelių skaičių, lyginant su kontrolinėmis (niekuo neveiktomis ląstelėmis) ir ląstelėmis, veiktomis tik 500 µg/ml GM (6 ir 7 pav.).

Aneksinas V Š oninės šviesos skl aida ( Š Š S ) Kontrolė GM 1500

24

6 pav. Ankstyvų apoptotinių ląstelių skaičius skirtingose tiriamosiose grupėse.

7 pav. Vėlyvų apoptotinių ląstelių skaičius skirtingose tiriamosiose grupėse.

Apibendrinant rezultatus, stebima tendencija, kad ≥1000 µg/ml GM koncentracija didina apoptotinių ląstelių skaičių, o išankstinis poveikis AR, toksinį šių koncentracijų GM poveikį sumažina.

0 2 4 6 8 10 12 14 Ane ksinu i V poz it yvių ląste li ų ska ičius (% ) Tiriamosios grupės 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Ane ksinu i V ir P I poz it yvių ląste li ų ska ičius (% ) Tiriamosios grupės AR - askorbo rūgštis (100 µg/ml) GM – gentamicinas (500-1500 µg/ml) AR - askorbo rūgštis (100 µg/ml) GM – gentamicinas (500-1500 µg/ml)

25

12.3 Kaspazių-3/7 aktyvumas ląsteles veikiant gentamicinu

Ankstyvos apoptozės identifikacijai atliktame kaspazių-3/7 nustatymo eksperimente, visomis gentamicino koncentracijomis (500 µg/ml, 1000 µg/ml ir 1500 µg/ml) veiktose ląstelėse matomas didesnis kaspazėms-3/7 pozityvių ląstelių skaičius, lyginant su niekuo neveikta kontrole. Išankstinis AR poveikis sumažino 500 ir 1000 µg/ml GM apoptotinį poveikį (8 pav.). Siekiant objektyviau įvertinti eksperimento rezultatus, atsitiktinai pasirinkta po tris regėjimo laukus kiekvienoje tiriamojoje grupėje ir juose ImageJ programa skaičiuotos kaspazėms-3/7 pozityvios ląstelės. Ląstelių skaičiaus vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai pateikti 8 pav. grafike.

D E B C 0 20 40 60 80 100 Ka spa zė ms po zit yvių ląste li ų ska ičius (% ) Tiriamosios grupės A p=0,4 p=1 p=0,4 p=0,7 p=0,7 p=0,1

26

8 pav. Kaspazėms-3/7 pozityvios ląstelės (žalia spalva). A – niekuo neveiktos RKL; B – GM

500 µg/ml; C – AR ir GM 500 µg/ml; D – GM 1000 µg/ml; E – AR ir GM 1000 µg/ml; F – GM 1500 µg/ml; G – AR ir GM 1500 µg/ml. Nuotraukos darytos 100x padidinimu.

12.4 Gentamicino poveikis ląstelių oksidaciniam stresui

Tyrimais įrodyta, kad pagrindinis gentamicino pažaidos mechanizmas inkstų ląstelėms yra oksidacinis stresas. Atlikus raumeninių kamieninių ląstelių, veiktų AR ir GM, ROS analizę DCFH-DA nustatyta, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp tiriamųjų grupių (9 pav.).

9 pav. ROS kiekis ląstelėse, skirtingose tyrimo grupėse. Raudona linija žymi kontrolę (niekuo

neveiktų ląstelių ROS kiekį.

G F AR - askorbo rūgštis (100 µg/ml) GM – gentamicinas (500-1500 µg/ml) H2O2 – vandenilio peroksidas 0 50 100 150 200 250 Fluore sc uojanč ių ląste li ų da li s, ly ginant su kont role (% ) Tiriamosios grupės p=0,1 p=0,1 p=0,1 p=0,2 p=0,7 p=0,1

27

12.5 Raumeninių kamieninių ląstelių diferenciacija

Kamieninių ląstelių gebėjimas diferencijuoti į raumenines ląsteles buvo vertintas po dvidešimties dienų nuo tyrimo pradžios – po 24 val., kai ląstelės buvo išsėtos į 48 šulinėlių plokštelę, 72 val. jos buvo veikiamos AR ir/arba GM 500-1500 µg/ml. Vėliau tiriamosios medžiagos pašalintos, ląstelės plautos PBS ir pridėta miogeninė terpė, kurioje ląstelės augo 14 dienų. Per šį laikotarpį ląstelės geba diferencijuoti į raumenines ląsteles, kurios gamina raumeninių skaidulų baltymą desminą. Nediferencijuotose kontrolinėse ląstelėse (tiriamąjį laikotarpį augusios proliferacinėje terpėje) desmino nebuvo rasta. Diferenciacinėje terpėje augusių kontrolinių ir tiriamųjų grupių ląstelėse buvo rasta desmino. GM veiktos ląstelės nusidažė intensyviau nei GM neveiktos (10 pav.).

B

C

Desminas _{DAPI Desminas+DAPI}

28 D G H I E F

29

10 pav. raumeninių kamieninių ląstelių diferenciacija: A – nediferencijuotos kontrolinės

(niekuo neveiktos) RKL; B – diferencijuotos kontrolinės (niekuo neveiktos) RKL; C – diferencijuotos, 24 val. veiktos distiliuotu vandeniu RKL; D – diferencijuotos, 24 val. veiktos AR RKL; E – diferencijuotos, 48 val. veiktos 500 µg/ml GM RKL; F – diferencijuotos, AR ir GM 500 µg/ml veiktos RKL; G – diferencijuotos, 48 val. veiktos 1000 µg/ml GM RKL; H – diferencijuotos, AR ir GM 1000 µg/ml veiktos RKL; I - diferencijuotos, 48 val. veiktos 1500 µg/ml GM RKL; J – diferencijuotos, AR ir GM 1500 µg/ml veiktos RKL. Nuotraukos darytos 200x padidinimu.

30

REZULTATŲ APTARIMAS

Nustatyta, kad raumeninės kamieninės ląstelės pasižymi multipotentinėmis savybėmis ir gali būti naudojamos kaulo, kremzlės, raumens, periferinio nervo, inkstų ir kitų audinių bei organų regeneracijai. Lietuvos sveikatos mokslų universitete atliktame tyrime nustatytas teigiamas RKL poveikis gydant gentamicino sukeltą ūmų inkstų pažeidimą [30]. Šio tyrimo metu sukūrėme in vitro modelį ir plačiau nagrinėjome, kaip gentamicinas, susikaupęs inkstuose, galėtų paveikti į pažeidimo vietą migravusias RKL. Yra žinoma, kad tęstinė didesnė nei 2 mg/l GM koncentracija kraujo plazmoje yra susijusi su didesne toksiškumo rizika [39]. Mažai žinoma apie GM koncentraciją inkstuose, kuri turėtų būti didesnė nei plazmoje, kadangi šis antibiotikas kaupiasi inkstuose. Edwards C. ir kt. tyrė GM gydytų mirusių pacientų inkstuose esančio GM koncentraciją ir nustatė, kad ji gali siekti iki 540 µg/g inkstų audinio [40]. Kol kas nėra saugių pacientams tyrimo metodų, kurie leistų įvertinti GM koncentraciją pacientų inkstuose, todėl sunku įvertinti tyrimui reikalingas koncentracijas, tačiau šiame tyrime naudotos GM koncentracijos turėtų būti laikomos labai didelėmis. Atlikti eksperimentai parodė, kad nėra statistiškai patikimo poveikio ląstelių gyvybingumui ir oksidaciniam stresui, lyginant kontrolines ir gentamicinu veiktas ląsteles. Kartotiniuose eksperimentuose su gentamicinu pastebime jo poveikį ląstelių proliferacijai – didesnės nei 1000 µg/ml gentamicino koncentracijos slopina ląstelių proliferaciją, tačiau dėl mažų imčių statistinis patikimumas nenustatytas. Chang Y. ir kt. atliktame tyrime nustatytas GM proliferaciją slopinantis poveikis MKL jas veikiant ≥100 µg/ml GM [32]. Pountos I. ir kt., nagrinėjantys GM poveikį MKL taip pat nustatė didesnės nei 75 µg/ml GM koncentracijos proliferacijos slopinimą MKL [31]. Reikėtų detalesnio tyrimo įvertinti GM poveikį MKL ir RKL, tačiau literatūros analizės rezultatus lyginant su atliktais eksperimentais atrodo, kad RKL turėtų būti atsparesnės GM poveikiui, o tai būtų pranašumas renkantis jas terapijai.

Šiame tyrime taip pat tyrėme AR poveikį ląstelėms, tikėdamiesi jas apsaugoti nuo neigiamo GM poveikio jų proliferacijai ir išgyvenamumui. Kamieninių ląstelių terapija gali būti susijusi su neoplastiniu procesu, ypač tada, kai ląstelės injekuojamos sistemiškai [41]. Sumažinus GM toksiškumą, būtų galima sumažinti injekuojamų ląstelių skaičių, o tai sumažintų onkologinio proceso išsivystymo tikimybę. Nors atliktuose skirtinguose eksperimentuose stebimas didelių GM dozių toksiškas poveikis ląstelėms, o taip pat ir AR apsauginis poveikis, tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tiriamųjų grupių nenustatytas. Šiame tyrime naudota 100 µg/ml AR koncentracija, taip pat tyrėme ir 200 bei 400 µg/ml AR poveikį RKL, tačiau didesnė koncentracija buvo toksiška ląstelėms (duomenys šiame darbe nepateikti). Taip pat tikslinga būtų tirti ir mažesnes koncentracijas, kurios, ląsteles veikiant ilgiau, yra net veiksmingesnės. Zhang P. ir kt. atliktame tyrime apie AR poveikį riebalinės kilmės kamieninėms ląstelėms nustatyta, kad ląstelių inkubacija 24 val. su 30, 60 ir 90 µg/ml AR, statistiškai reikšmingai

31 paskatino ląstelių proliferaciją, tačiau veikiant ląsteles 48 ir 72 val., išryškėjo 30 µg/ml koncentracijos didesnis veiksmingumas [35].

Tęsiant tyrimą, RKL būtų galima palyginti su kitomis kamieninėmis ląstelėmis – kaulų čiulpų, riebalinės kilmės ir kt., ir pagal atsparumą GM, įvertinti jų tinkamumą ŪIP gydymui. Kamieninių ląstelių kultivavimas kartu su inkstų ląstelėmis (angl. co-culture) leistų tiksliau įvertinti kamieninių ląstelių išskiriamų medžiagų (mikropūslelių, egzosomų, uždegimo mediatorių ir kt.) poveikį pažeistam inkstų audiniui. In vivo tyrimų metu kamieninės ląstelės tampa mažiau atsparios, nes be GM jas veikia ir įvairūs kiti poveikiai, pvz., uždegimas, be to, nėra žinoma, kaip ląsteles veikia kartotinės GM dozės, ir ar AR efektas yra ilgalaikis, taigi, šių tyrimų metu būtų galima tiksliau įvertinti apsaugančios medžiagos poreikį.

32

IŠVADOS

1. Pastebima tendencija, kad 1500 µg/ml GM mažina ląstelių gyvybingumą, ≥1000 µg/ml GM didina apoptotinių ląstelių skaičių, ≥500 µg/ml GM poveikis susijęs su kaspazių-3/7 aktyvumo padidėjimu, tačiau statistinis patikimumas RKL gyvybingumui, proliferacijai, morfologijai ir oksidaciniam stresui nenustatytas;

2. Pastebima tendencija, kad išankstinis poveikis 100 µg/ml AR sumažino toksinį poveikį RKL gyvybingumui jas veikiant 1500 µg/ml GM, taip pat sumažino apoptotinių ląstelių skaičių jas veikiant ≥1000 µg/ml GM bei apsaugojo nuo 500 ir 1000 µg/ml GM poveikio kaspazių-3/7 aktyvumui, tačiau statistinis patikimumas nenustatytas.

33

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Kushner B, Allen PD, Crane BT. Frequency and demographics of gentamicin use. Otol Neurotol . 2016;37(2):190–5.

2. Selby NM, Shaw S, Woodier N, Fluck RJ, Kolhe N V. Gentamicin-associated acute kidney injury. Qjm. 2009;102(12).

3. Petersen L, Rogers C. Aminoglycoside-induced hearing deficits – a review of cochlear ototoxicity. South African Fam Pract. 2015;57(2):77–82.

4. Bianchi F. Potential advantages of acute kidney injury management by mesenchymal stem cells. World J Stem Cells. 2014;6(5):644-650.

5. Takaori K., Yanagita M. Kidney regeneration and stem cells. The Anatomical Record. 2013;297(1):129–36.

6. Durante-Mangoni E, Grammatikos A, Utili R, Falagas ME. Do we still need the aminoglycosides? Int J Antimicrob Agents. 2009;33(3):201–5.

7. Avent ML, Rogers BA, Cheng AC, Paterson DL. Current use of aminoglycosides: indications, pharmacokinetics. Internal Medicine Journal. 2011;41(6):441–9.

8. Rizzi MD, Hirose K. Aminoglycoside ototoxicity. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2007;15(5):352–7.

9. Leggett JE. Aminoglycosides. Infect Dis (Auckl). 2017;1233–1238.e1.

10. Quiros Y, Vicente-Vicente L, Morales AI, López-Novoa JM, López-Hernández FJ. An Integrative Overview on the Mechanisms Underlying the Renal Tubular Cytotoxicity of Gentamicin. Toxicol Sci. 2011;119(2):245–56.

11. Lopez-Novoa JM, Quiros Y, Vicente L, Morales AI, Lopez-Hernandez FJ. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int.

2011;79337:33–45.

12. Paquette F, Bernier-Jean A, Brunette V, Ammann H, Lavergne V, Pichette V, et al. Acute Kidney Injury and Renal Recovery with the Use of Aminoglycosides: A Large Retrospective Study. Nephron. 2015;131(3):153–60.

13. Sweileh WM. A prospective comparative study of gentamicin- and amikacin-induced nephrotoxicity in patients with normal baseline renal function. Fundam Clin Pharmacol. 2009;23(4):515–20.

14. Hayward RS, Harding J, Molloy R, Land L, Longcroft-Neal K, Moore D, et al. Adverse effects of a single dose of gentamicin in adults: a systematic review. British Journal of Clinical

Pharmacology. 2017;84(2):223–38.

15. Ahmed RM, Hannigan IP, MacDougall HG, Chan RC, Halmagyi GM. Gentamicin ototoxicity: a 23-year selected case series of 103 patients. The Medical Journal of Australia.

2012;(196):701–4.

16. Foster Ii J, Tekin M, Macdonald JT. Aminoglycoside induced ototoxicity associated with mitochondrial DNA mutations. Egypt J Med Hum Genet. 2016;17:287–93.

17. Huth ME, Ricci AJ, Cheng AG. Mechanisms of Aminoglycoside Ototoxicity and Targets of Hair Cell Protection. Int J Otolaryngol. 2011;2011:1–19.

34 18. Barnes CJ, Distaso CT, Spitz KM, Verdun VA, Haramati A. Comparison of stem cell therapies

for acute kidney injury. Am J Stem Cells. 2016;5(1):1–10.

19. Eggenhofer E, Luk F, Dahlke MH, Hoogduijn MJ. The life and fate of mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2014;5:148.

20. Bruno S, Grange C, Collino F, Deregibus MC, Cantaluppi V, Biancone L, et al. Microvesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Enhance Survival in a Lethal Model of Acute Kidney Injury. PLoS One. 2012;7(3):e33115.

21. Chen Y-T, Sun C-K, Lin Y-C, Chang L-T, Chen Y-L, Tsai T-H, et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Protects Kidneys against Ischemia-Reperfusion Injury through Suppressing Oxidative Stress and Inflammatory Reaction. J Transl Med. 2011;9(51):1–17. 22. Tamaki T, Uchiyama Y, Hirata M, Hashimoto H, Nakajima N, Saito K, et al. Therapeutic

isolation and expansion of human skeletal derived stem cells for the use of muscle-nerve-blood vessel reconstitution. Front Physiol. 2015;6:165.

23. Usas A, Huard J. Muscle-derived stem cells for tissue engineering and regenerative therapy. Biomaterials. 2007;28(36):5401–6.

24. Lavasani M, Lu A, Thompson SD, Robbins PD, Huard J, Niedernhofer LJ. Isolation of muscle-derived stem/progenitor cells based on adhesion characteristics to collagen-coated surfaces. Methods Mol Biol. 2013;976:53–65.

25. Gharaibeh B, Lu A, Tebbets J, Zheng B, Feduska J, Crisan M, et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 2008;3(9):1501–9.

26. Danišovič Ľ, Polák Š, Vojtaššák J. Adult stem cells derived from skeletal muscle - biology and potential. Cent Eur J Biol. 2013;8(3):215–25.

27. Jankowski R, Deasy B, Huard J. Muscle-derived stem cells. Gene Ther. 2002;9:642–7. 28. Alessandri G, Pagano S, Bez A, Benetti A, Pozzi S, Iannolo G, et al. Isolation and culture of

human muscle-derived stem cells able to differentiate into myogenic and neurogenic cell lineages. Lancet. 2004;364(9448):1872–83.

29. Lavasani M, Thompson SD, Pollett JB, Usas A, Lu A, Stolz DB, et al. Human muscle – derived stem / progenitor cells promote functional murine peripheral nerve regeneration. J Clin Invest. 2014;124(4):1745–56.

30. Pavyde E, Maciulaitis R, Mauricas M, Sudzius G, Ivanauskaite Didziokiene E, Laurinavicius A, et al. Skeletal Muscle-Derived Stem/Progenitor Cells: A Potential Strategy for the Treatment of Acute Kidney Injury. Stem Cells Int. 2016;2016:1-13.

31. Pountos I, Georgouli T, Henshaw K, Howard B, Giannoudis P V. Mesenchymal Stem Cell physiology can be affected by antibiotics: An in vitro study. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2014;60(4):1–7.

32. Chang Y, Goldberg VM, Caplan AI. Toxic effects of gentamicin on marrow-derived human mesenchymal stem cells. Clin Orthop Relat Res. 2006;452:242–9.

33. Bohannon LK, Owens SD, Walker NJ, Carrade DD, Galuppo LD, Borjesson DL. The effects of therapeutic concentrations of gentamicin, amikacin and hyaluronic acid on cultured bone marrow-derived equine mesenchymal stem cells. Equine Vet J. 2013;45(6):732–6. 34. Burns JJ. Ascorbic acid. Natl Cent Biotechnol Information PubChem Compd Database;

35 35. Zhang P, Li J, Qi Y, Zou Y, Liu L, Tang X, et al. Vitamin C promotes the proliferation of

human adipose-derived stem cells via p53-p21 pathway. Organogenesis. 2016;12(3):143-51. 36. Liu C, Sun S, Zhang Q, Lin H, Tang W. [Effect of different concentrations of vitamin C on

proliferation and apoptosis of C2C12 myoblasts]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2010;35(7):732–7.

37. Cell Viability / Apoptosis | Research at St. Michael’s Hospital [Internet]. [cited 2018 May 10]. Available from:

http://stmichaelshospitalresearch.ca/staff-services/research-facilities/facilities/flow-cytometry-core/cell-viability-apoptosis/

38. Wang Y, He J, Pei X, Zhao W. Systematic review and meta-Analysis of mesenchymal stem/stromal cells therapy for impaired renal function in small animal models. Nephrology. 2013;18(3):201–8.

39. Fjalstad JW, Laukli E, Van Den Anker JN, Klingenberg C. High-dose gentamicin in newborn infants: Is it safe? Eur J Pediatr. 2014;173(4):489–95.

40. Ed2wards CQ, Smith CR, Baughman KL, Rogers JF, Lietman PS. Concentrations of gentamicin and amikacin in human kidneys. Antimicrob Agents Chemother. 1976;9(6):925–7.

41. Herberts CA, Kwa MSG, Hermsen HPH. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 2011;9:29.