Ieva Mačiulaitytė
V kursas, 10 grupėANTIBAKTERINIS ETERINIŲ ALIEJŲ POVEIKIS
BURNOS PATOGENAMS IN VITRO SĄLYGOMIS
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbo vadovė
Doc. Inga Vaitkevičienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS DANTŲ IR BURNOS LIGŲ KLINIKA
ANTIBAKTERINIS ETERINIŲ ALIEJŲ POVEIKIS BURNOS PATOGENAMS IN VITRO SĄLYGOMIS
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbą atliko:
magistrantė ……… (parašas) Ieva Mačiulaitytė V kursas, 10 grupė
2018 m……… (mėnuo, data)
Darbo vadovas ...………….
(parašas)
Doc. Inga Vaitkevičienė
2018 m……… (mėnuo, data)
KLINIKINIO - EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO LENTELĖ Įvertinimas: ... Recenzentas: ... (moksl. laipsnis, vardas pavardė)
Recenzavimo data: ...
Eil.Nr. BMD dalys BMD vertinimo aspektai
BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas Taip Iš dalies Ne 1.
Santrauka (0,5 balo)
Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo
turinį bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
2. Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo
turinį bei reikalavimus? 0,2 0.1 0
3. Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0,1 0 0
4.
Įvadas, tikslas, uždaviniai (1 balas)
Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas,
aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0,2 0
5. Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota
problema, hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0,2 0
6. Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0
7.
Literatūros apžvalga (1,5 balo)
Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su kitų mokslininkų darbais Lietuvoje ir pasaulyje?
0,4 0,2 0
8.
Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų rezultatai ir išvados?
0,6 0,3 0
9.
Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama problema?
10.
Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir sisteminti mokslinę literatūrą yra pakankamas? 0,3 0,1 0 11. Medžiaga ir metodai (2balai)
Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika, ar ji tinkama iškeltam tikslui pasiekti?
0,6 0,3 0
12.
Ar tinkamai sudarytos ir aprašytos imtys, tiriamosios grupės; ar tinkami buvo atrankos kriterijai?
0,6 0,3 0
13.
Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, reagentai, įranga ir pan.)?
0,4 0,2 0
14.
Ar tinkamai aprašytos statistinės programos naudotos duomenų analizei, formulės, kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį?
0,4 0,2 0
15.
Rezultatai (2 balai)
Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į
iškeltą tikslą ir uždavinius? 0,4 0,2 0
16. Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka
reikalavimus? 0,4 0,2 0
17. Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste
kartojasi informacija? 0 0,2 0,4
18. Ar nurodytas duomenų statistinis
reikšmingumas? 0,4 0,2 0
19. Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0 20. Rezultatų aptarimas (1,5 balo)
Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų svarba, trūkumai) bei gautų duomenų patikimumas?
0,4 0,2 0
21.
Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų santykis su kitų tyrėjų naujausiais duomenimis?
0,4 0,2 0
22. Ar autorius pateikia rezultatų
23.
Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti kituose skyriuose (įvade, literatūros apžvalgoje, rezultatuose)?
0 0,2 0,3
24. Išvados (0,5 balo)
Ar išvados atspindi baigiamojo darbo
temą, iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0
25. Ar išvados pagrįstos analizuojama
medžiaga; ar atitinka tyrimų rezultatus ? 0,2 0,1 0
26. Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0,1 0
27.
Literatūros sąrašas (1 balas)
Ar bibliografinis literatūros sąrašas
sudarytas pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0
28.
Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami literatūros šaltiniai?
0,2 0,1 0
29. Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo
tinkamas moksliniam darbui? 0,2 0,1 0
30.
Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau nei 70% šaltinių, o ne senesni kaip 5 metų – ne mažiau kaip 40%?
0,2 0,1 0
Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių 31. Priedai Ar pateikti priedai padeda suprasti
nagrinėjamą temą? +0,2 +0,1 0
32. Praktinės rekomendacijo s
Ar yra pasiūlytos praktinės rekomendacijos
ir ar jos susiję su gautais rezultatais? +0,4 +0,2 0 Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių
33.
Bendri reikalavimai
Ar pakankama darbo apimtis (be priedų) 15-20 psl. (-2 balai)
<15 psl. (-5 balai) 34. Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2 balai -1 balas
35.
Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo
darbo rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai
36.
Ar darbas parašytas taisyklinga kalba,
moksliškai, logiškai, lakoniškai? -0,5 balo -1 balas 37.
Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio
38.
Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties subalansuotumas?
-0,2 balo -0,5 balo
39. Plagiato kiekis darbe >20%
(nevert. ) 40.
Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus?
-0,2 balo -0,5 balo
41.
Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir poskyrių pavadinimai?
-0,2 balo -0,5 balo
42. Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas) Bioetikos komiteto leidimas?
-1 balas
43. Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų
ir santrumpų paaiškinimai? -0,2 balo
-0,5 balo
44.
Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)?
-0,2 balo -0,5 balo *Viso (maksimumas 10 balų):
*Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų.
__________________________________ _________________________________
TURINYS
SANTRAUKA ... 10
SUMMARY ... 11
SANTRUMPOS ... 12
ĮVADAS ... 13
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 14
1. LITERARŪROS APŽVALGA ... 15
1.1 Periodontito etiologija ... 15
1.2 Bakterijos sukeliančios periodonto ligas ... 16
1.3 Periodontito gydymas ... 17
1.4 Eteriniai aliejai ... 19
2. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI ... 22
2.1 Tiriamųjų atrankos kriterijai ... 22
2.2 Grynosios mikroorganizmų kultūros išskyrimas iš tiriamosios medžiagos ir jos identifikavimas ... 22
2.3 Bakterijų rūšių kultivavimas ir suspensijų ruošimas ... 23
2.4 16,7% Pelargonijų ekstrakto, 100%, 1%, 0,5% Arbatmedžio eterinio aliejaus, 100%, 1%, 0,5% Gvazdikėlių eterinio aliejaus, 0,02% ir 0,05% Chlorheksidino digliukonato, Listerine®Mentol™ tirpalų tyrimas ... 23
2.5 Statistinė duomenų analizė ... 26
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
3.1 Tiriamųjų charakteristika ... 27
3.2 Eterinių aliejų, Chlorheksidino digliukonato ir Listerine®Mentol™ poveikis skirtingoms bakterijų rūšims...29
3.3 Eterinių aliejų, Chlorheksidino digliukonato, Listerine®Mentol™ poveikio palyginimas skirtingoms bakterijų rūšims ... 32
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
5. IŠVADOS... 40
Antibakterinis eterinių aliejų poveikis burnos patogenams in vitro sąlygomis
SANTRAUKA
Periodontitu serga 10% pasaulio populiacijos. Šią ligą sukelia dantų apnaše esančios bakterijos. Apnašą galima sumažinti kasdieniniu mechaniniu dantų valymu bei naudojant antibakteriškai veikiančius burnos skalavimo skysčius. Įprastas ir dažnai naudojamas toks skystis Chlorheksidino digliukonato (CHX) tirpalas. Kasdieninėje burnos priežiūroje alternatyva įprastom priemonėm galėtų būti antibakteriškai veikiantys eteriniai aliejai.
Tyrimo tikslas - nustatyti antibakterinį eterinių aliejų poveikį burnos patogenams in vitro sąlygomis. Tyrimo metodika. Iš 43 pacientų dantenų kišenių buvo paimti mėginiai bakteriologiniam tyrimui. In vitro sąlygomis išauginta Streptococcus salivarius, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Rothia dentocariosa, Rothia aeria bakterijų rūšys. Tirtas 100%, 1%, 0,5% Arbatmedžio, Gvazdikėlių eterinių aliejų, 16,7% Pelargonijų ekstrakto, 0,02%, 0,05% CHX tirpalų bei Listerine®Mentol™ antibakterinis efektyvumas, matuojant sterilios zonos skersmenį. Duomenys apdoroti „SPSS 13“ programa. Skirtumai laikyti statistiškai patikimais, esant ne didesnei nei 5 % paklaidai (p<0,05).
Tyrimo rezultatai. Arbatmedžio ir Gvazdikėlių 100% koncentratai antibakteriškai veikė stipriausiai (p<0,05) ir jų poveikis reikšmingai nesiskyrė nuo 0,05% CHX tirpalo ir Listerine®Mentol™ poveikio. 16,7% Pelargonijų ekstrakto, 0,02% CHX, 0,5% ir 1% Gvazdikėlių bei Abatmedžio eterinio aliejaus tirpalų antibakterinis poveikis buvo reikšmingai (p<0,05) silpnesnis. Statistiškai reikšmingo poveikio skirtumo tarp šių medžiagų rasta nebuvo.
Tyrimo išvados. Panašiu kaip 0,05% CHX tirpalo antibakteriniu poveikiu pasižymi tik Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eterinių aliejų koncentratai, kurie klinikinėje praktikoje sunkiai gali būti pritaikomi. 16,7% Pelargonijų ekstrakto tirpalas antibakteriškai veikia silpniau nei 0,05% CHX tirpalas, bet stipriau nei 0,02% CHX tirpalas ir gali būti naudojamas pacientų kaip alternatyva įprastiems burną dezinfekuojantiems tirpalams.
Raktiniai žodžiai : essential oils, alternative medicine, Pelargonium, Melaleuca alternifolia, Adhe-sins, Bacterial
In vitro antibacterial activity of essential oils on oral pathogens
SUMMARY
Around 10% of human population worldwide suffers from periodontitis which is caused by the bacteria present in the dental plaque. Dental plaque can be controlled and reduced by daily teeth brushing and the use of antibacterial mouthwash. Chlorhexidine digluconate (CHX) solution is often used as a mouth rinse. However, essential oils with antibacterial properties could be used as an alternative in daily oral care.
The goal of the study is to determine in vitro antibacterial effects of essential oils on oral pathogens. Research methods. 43 patients produced samples from periodontal pockets for a bacteriological test. The following bacteria species were grown in vitro: Streptococcus salivarius, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus sanguinis, Veillonella parvula, Rothia dentocariosa, Rothia aeria. The antibacterial effectiveness of 100%, 1% and 0,5% concentrated tea tree and carnation essential oils, 16,7% concentrated pelargonium essential oil, 0,02% and 0,05% concentrated CHX solutions and Listerine®MentolTM was assessed by measuring the diameter of the sterile area. The data were processed using SPSS 13 software. The differences were deemed statistically reliable when the deviation was no higher than 5% (p<0,05).
Research results. The 100% concentrated tea tree and carnation essential oils had the best antibacterial effects (p<0,05). No significant differences were noted in their effects compared to the 0,05% concentrated CHX solution and Listerine®MentolTM. The antibacterial effects of the 16,7% concentrated pelargonium essential oil, 0,02% concentrated CHX solution, and 1% and 0,5% concentrated tea tree and carnation essential oils were significantly weaker (p<0,05). No statistically significant difference in the effects of these solutions was determined.
Conclusions. Only the concentrated tea tree and carnation essential oils have similar antibacterial effects as the 0,05% concentrated CHX solution. However, these essential oils can hardly be applied in clinical practice. The 16,7% concentrated pelargonium essential oil has weaker antibacterial effects compared to the 0,05% concentrated CHX solution; however, it is a better choice when compared to the 0,02% concentrated CHX solution. Thus, patients can use this essential oil as an alternative to regular disinfectant mouthwashes.
Keywords: essential oils, alternative medicine, Pelargonium, Melaleuca alternifolia, Adhesins, Bacterial.
SANTRUMPOS
CHX – Chlorheksidino digliukonatas Ca – kalcis P – fosforas F – fluoras n – imties tūriszα/2 – standartinio normaliojo skirstinio N (0,1) α lygmens kritinė reikšmė N – atrankinės visumos dydis
π – mus dominančio parametro proporcija atrankinėje visumoje Ɛ – atrankos paklaida
ĮVADAS
Žmogaus burnoje randama daug mikroorganizmų rūšių. Daugelis iš jų yra dantų ir periodonto ligų sukelėjai. Būdami bakterinių dantų apnašų sudėtine dalimi, jie išskiria toksinus, savo veiklos produktus, veikia kaip antigenai ir sąlygoja periodonto uždegimą, bei audinių degeneraciją. Susikaupę ant dantų paviršių ir ilgą laiką nenuvalyti minkšti, o vėliau mineralizavęsi ir susiformavę kietieji bakteriniai dantų apnašai (akmenys) lemia dantenų uždegimo - gingivito-išsivystymą [1]. Didesnę šių apnašų bakterijų dalį sudaro aerobinės ir fakultatyvinės anaerobinės bakterijos [1].
Ligai progresuojant bakterinės dantų apnašos kaupiasi po dantenomis ir inicijuoja periodonto raiščio bei alveolės kaulo pažeidimą, periodonto kišenės susidarymą. Po dantenomis susidariusi aplinka palanki spartesniam anaerobinių mikroorganizmų dauginimuisi. Pasikeitusi bakterinių apnašų sudėtis dėl didesnio anaerobinių bakterijų kiekio sąlygoja didesnius degeneracinius pokyčius periodonto raištyje, alveolės kaule, kurie yra pagrindinės dantų netekimo ir kramtymo funkcijos sutrikimo priežastys.
Siekiant sustabdyti uždegiminio proceso periodonte progresavimą ir išgydyti gingivitą, periodontitą, šalinamas pagrindinis etiologinis veiksnys - bakterinės dantų apnašos. Minkštąjį dantų apnašą galima pašalinti kasdieniniu mechaniniu dantų valymu ir papildomai naudojant chemoterapinius preparatus [1]. Kietasis apnašas pašalinamas atlikus profesonalią burnos higieną. Į kasdien individualiai naudojamas dantų pastas ir dantų skalavimo skysčius įvedamos medžiagos, kurios slopina bakterijų augimą [1]. Dažniausiai tai - chlorheksidinas, fluoridai, fenolio junginiai ir naturalūs produktai, tokie kaip: mentolis, eugenolis. CHX yra daugiausiai tirtas ir populiariausias dėl savo veiksmingiausio antibakterinio poveikio [2]. Pagrindinis jo pranašumas prieš kitas antibakterines medžiagas yra tas, kad jis prisijungia prie minkštųjų ir kietųjų audinių ir veikia ilgesnį laiką [3]. Tačiau be teigiamų savybių šis junginys turi ir nepageidaujamų savybių. Viena iš jų- prisijungdamas prie danties kietųjų audinių CHX palieka estetiškai nepriimtinas rudos spalvos dėmes [4]. Pastaruoju metu ieškomos alternatyvos šiam preparatui. Didesnis mokslininkų dėmesys nukreiptas į natūralių medžiagų, kurioms būdingos antibakterinės savybės, tyrimus. Vienos iš jų eteriniai aliejai, kurie gali būti pritaikyti naudoti odontologijoje [5]. Nustatyta, kad eteriniai aliejai yra tokie pat veiksmingi, kaip CHX, kuris sumažina dantenų uždegimą po 6 mėnesių vartojimo [3].
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas:
Nustatyti antibakterinį eterinių aliejų poveikį burnos patogenams in vitro sąlygomis. Tyrimo uždaviniai:
1. Nustatyti Gvazdikėlių ir Arbatmedžio eterinių aliejų 100% koncentratų antibakterinį poveikį in vitro sąlygomis.
2. Nustatyti Pelargonijų 16,7%, Gvazdikėlių ir Abatmedžio 1%, 0,5% eterinių aliejų tirpalų antibakterinį poveikį in vitro sąlygomis.
3. Palyginti eterinių aliejų ir 0,02%, 0,05% Chlorheksidino digliukonato tirpalų, Listerine®Mentol™ skalavimo skysčio antibakterinį poveikį in vitro sąlygomis.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Periodontito etiologija
Periodontas – tai dantį palaikantys audiniai, sudaryti iš dantenų, alveolinio kaulo, danties šaknies cemento ir periodonto raiščio.
Dažniausiai pasireiškiančios periodonto ligos yra lėtinis gingivitas ir periodontitas [6]. Gingivitas yra uždegimo procesas, kuris prasideda dantenose ir vėliau, negydant, pažeidžia kitus periodonto audinius. Periodontitas išsivysto laiku negydant gingivito [6]. Atliktais tyrimais nustatytas lėtinio periodontito paplitimas išsivysčiusiose šalyse, pavyzdžiui, Jungtinėje Karalystėje ir JAV, svyruoja nuo 5% iki 35% visų gyventojų [6]. Periodontitas – infekcinis ir uždegiminis procesas, dėl kurio prarandami dantį palaikantys audiniai [7,8]. Nustatyta, kad lėtinis suaugusiųjų periodontitas yra pagrindinė dantų praradimo priežastis nuo 25 metų [9]. Liga prasideda nuo dantenų uždegimo, kuriam progresuojant pažeidžiami periodonto audiniai, dantis praranda prisitvirtinimą prie kaulo ir tampa paslankus [9]. Pirminis etiologinis gingivito ir periodontito faktorius – dantų apnašos, kurios sąlygiškai gali būti suskirstytos į viršdantenines ir podantenines [8]. Viršdanteninės apnašos yra prisitvirtinę prie dantų paviršiaus, atribotos laisvuoju dantenų kraštu ir gali būti pašalinamos kasdieniniu mechaniniu dantų valymu arba profesonalia burnos higiena [8]. Podanteninės apnašos kaupiasi po laisvuoju dantenų kraštu ir jų pašalinimas yra sudėtingesnis. Dantų apnašos yra sudarytos iš 70%-80% ląstelių: bakterijų, leukocitų, makrofagų ir 20%-30% rišliosios medžiagos: ekstraceliulinių polisacharidų, seilių ir bakterijų metabolizmo produktų. Taip pat jose randama mineralinių komponentų: Ca, P, F.
Apnašose esančios bakterijos ir jų metabolizmo produktai sukelia uždegiminį procesą periodonte [10]. Periodonto ardymo procese dalyvauja gram-teigiamos ir gram-neigiamos bakterijos. Gram-teigiamų bakterijų ląstelių sienelių komponentai sukelia pirminį uždegiminį atsaką [7]. Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad nesant patologijai ar grįžtamojo gingivito stadijoje, apnašose dominuoja aerobinės bakterijos, tačiau gingivitui pereinant į sunkesnę formą, periodontitą, pradeda dominuoti anaerobinės bakterijos [6]. Laiku negydant šis procesas progresuoja, prarandamas dantenų prisitvirtinimas, periodonto raištis, vėliau ir alveolinis kaulas. Kliniškai būdingi tokie simptomai, kaip kraujavimas iš dantenų, blogas kvapas, dantenų recesija, dantų paslankumas ir migracija [9]. Nustatyta, kad ne tik bakterinis apnašas sukelia periodonto uždegimą, šiai ligai išsivystyti ir progresuoti gali turėti įtakos imunosupresinė būklė, rūkymas, cukrinis diabetas, genetinis polinkis [6].
1.2 Bakterijos sukeliančios periodonto ligas
Burnos ertmė yra kūno vartai į išorinę aplinką ir viena iš biologiškai sudėtingiausių žmogaus kūno vietų [11]. Tai palanki vieta mikroorganizmams kolonizuoti ir daugintis [11]. Dantų paviršius turi unikalų, kietą, atvirą paviršių, kuris suteikia sąlygas bakterijoms kauptis apnašų pavidalu [11]. Dauguma bakterijų yra normali žmogaus mikroflora, tačiau naujausiuose moksliniuose tyrimuose nustatyta, kad bakterijos gali tapti oportunistinės ir sukelti dantų ir periodonto ligas [12].
Rothia dentocariosa yra įprastos žmogaus burnos ertmės ir ryklės floros dalis [13]. Tačiau, pacientams, turintiems imunosupresinę būklę dėl sisteminių ligų, šie mikroorganizmai gali sukelti periodontitą [13]. Nustatyta, kad Rothia dentocariosa gali sukelti ne tik periodontitą, bet ir, patekusi nuo dantų paviršiaus į organizmą, gali sukelti endokarditą, plaučių uždegimą, pilvo ir plaučių infekcijas [13]. Tai gyvybiškai pavojingos būklės žmogui.
Kita vyraujanti burnos ertmėje bakterija yra viridanų grupės streptokokai. Tai fakultatyvinė anaerobinė bakterija. Remiantis rRNR seka, streptokokus galima suskirstyti į 5 grupes (Lentelė Nr.1),[14].
Lentelė Nr. 1.Streptokokų rūšys
Grupė Bakterijos
Streptococcus sanguinis (Streptococcus sanguis)
Streptococcus sanguinis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus gordonii ir Streptococcus sinensis
Streptococcus mitis Streptococcus pseudopneumoniae,
Streptococcus cristatus, Streptococcus peroris ir Streptococcus infantis
Streptococcus anginosus Streptococcus anginosus, Streptococcus
constellatus, and Streptococcus intermedius
Streptococcus mutans Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus downei, Streptococcus ratti, Streptococcus macacae ir Streptococcus ferus
Streptococcus salivarius Streptococcus salivarius, Streptococcus
vestibularis, Streptococcus infantarius, Streptococcus thermophilus ir Streptococcus hyointestinalis
Burnos streptokokai yra izoliuota bakterijų rūšis, kuri atlieka didelį vaidmenį formuojantis dantų apnašoms ir karieso išsivystyme [15]. Ši įprasta natūrali burnos mikroflora konkuruoja su patogeninėmis bakterijomis kolonizuojant burnos ertmę [16]. Nustatyta, kad Streptococcus sanguinis yra susijęs ne tik su apnašų susidarymu ant dantų paviršiaus, bet ir buvo apibūdintas kaip oportunistinis patogenas, kuris yra vienas iš pagrindinių etiologinių veiksnių, galinčių sukelti infekcinį endokarditą pacientams, kurie turi širdies vožtuvų defektų ar kuriems diagnozuota neutropenija [16].
Veillonella parvula dar viena burnos ertmėje randama bakterija ir ji priskiriama oportunistinių infekcijų sukėlėjams [17]. Ši bakterija yra anaerobinė, tai reiškia, kad ji gali gyvuoti ir daugintis bedeguoninėje terpėje. Veillonella parvula dažniausiai randama dantų apnaše, ant liežuvio ir ant žando gleivinės [17]. Nustatyta, kad Veillonella parvula anksti kolonizuoja dantų apnašą [17]. Šios bakterijos rūšys taip pat randamos ankstyvojo vaikų dantų karieso ertmėse [17].
Actinomyces odontolyticus - dar vienas burnos ertmėje randamas anaerobinis mikroorganizmas, kuris gali daugintis esant nedideliam deguonies kiekiui [7]. Actinomyces odontolyticus anksti kolonizuoja burnos ertmę ir dalyvauja formuojantis dantų apnašoms [7]. Ši bakterija yra randama viršdanteniniame ir podanteniniame apnaše ir sukelia periodonto ligas. Actinomyces odontolyticus ir Veillonella parvula dažniausiai randamos podanteniniame apnaše [7]. Actinomyces odontolyticus turi išskirtinį gebėjimą stipriai prisitvirtinti prie danties paviršiaus ir koagreguoti (sukibti) su kitomis bakterijomis [7]. Atlikti tyrimai parodė, kad Actinomyces Odontolyticus su Veillonella parvula gali susijungti ir tapti kompleksu [7].
Rothia aeria – aerobinė, gram-teigiama bakterija, kuri dažnai randama burnoje [18]. Ši bakterijų rūšis, nusilpus žmogaus organizmui, gali sukelti sistemines ligas [19]. Viena jų – periodontitas.
1.3 Periodontito gydymas
Pagrindinis periodonto ligos gydymo tikslas -skatinti pereiti iš patogeniškos terpės į žmogui suderinamą terpę, siekiant klinikinio ir mikrobiologinio stabilumo [20]. Daugeliu atvejų, sveikimo efektas pasiekiamas tik po ilgo gydymo laiko [20]. Optimalus apnašų kontroliavimas yra pagrindinis veiksnys, siekiant sėkmingai gydyti periodontitą [4]. Veiksminga apnašų šalinimo kontrolė gali sustabdyti periodonto patologijos progresavimą ir pasikartojimą [21]. Viršdanteninių apnašų šalinimas gali būti laikomas kaip „sanitarinė“ procedūra, kuri mažina potencialiai patogeniškas bakterijų rūšis burnos ertmėje [4]. Viršdanteninių apnašų kontroliavimas turi įtakos
viršdanteninių apnašų bakterijos daro tiesioginę įtaką podanteninėse apnašose esančioms bakterijoms ir poveikį periodonto audiniams [4]. Šis potencialiai patologinių kolonijų mažinimas yra labai svarbus mažinant periodonto ligų pasikartojimo riziką ypač burnos patogenams jautriems žmonėms [4].
Vienas iš būdų išvengti periodonto ligų yra mechaniškai pašalinti apnašas su dantų šepetėliu, tarpdančius valyti su tarpdančių siūlu, šepetėliais [22]. Vien mechaniniu valymu neįmanoma pašalinti apnašų [22]. Daugelis žmonių dantis valydamiesi vieną kartą per dieną pašalina mažiau nei pusę apnašų, palikdami 60% tikimybę jų atsinaujinimui [22].
Daugelis žmonių mechaniškai nepakankamai išsivalo dantis [10], tad reikėtų naudoti papildomas priemones [22]. Viena tokių – CHX, katijoninis bisbiguanido junginys, su labai plačiu antimikrobiniu spektru [22]. CHX siūlomas naudoti kaip papildoma priemonė mechaninėse apnašų šalinimo procedūrose ir atskirai [22]. CHX gali būti naudojamas keliais būdais: kaip dantų skalavimo skystis, gelis ir purškiklis [22]. Dažniausiai naudojamas dantų skalavimo skysčio forma.
CHX tiriamas beveik 60 metų, o pirmasis vaistas su CHX buvo sintezuotas 1954m. [22]. Iš pradžių ši medžiaga odontologijoje buvo naudojama prieš chirurgines intervencijas ir endodontijoje, o apnašų šalinimui šią medžiagą pasiūlė Schroeder ir Hirzel [22] dėl jos savybės gydyti gingivitą [12]. Mokslinėje literatūroje teigiama, kad CHX efektyviausiai kontroliuoja šią ligą [3]. Nustatyta, kad naudojant CHX, bakterijų skaičius nuosekliai sumažėja nuo 10% iki 20% nuo pradinio lygio po vieno skalavimo, ir efektas išlieka nuo 7 iki 12 valandų [3]. Jis slopina dantų apnašų biofilmų susidarymą ir vystymąsi [12]. Antibakterinis CHX poveikis priklauso nuo dozės, 0,1% yra didžiausia koncentracija naudojama burnos ertmėje [4]. Nepaisant didelio antimikrobinio aktyvumo, CHX turi šalutinį poveikį: gali sukelti skonio pasikeitimus burnoje ir palieka geltonas, rudas pigmentines dėmes ant dantų paviršių bei ant restauracijų [15,12].
Todėl CHX yra prieštaringai vertinamas, ypač naudojimui vaikų gydyme [12]. Beje, nustatyta, kad CHX retais atvejais dirgina burnos gleivinę, kai yra naudojama per didelė koncen-tracija, pakeičia pelikulės spalvą, dažniausiai kontaktiniuose ir liežuviniuose paviršiuose [4]. Dau-gumoje skalavimo skysčių su CHX yra etanolis, kuris priklausomai nuo koncentracijos gali sukelti skausmą [4]. Kai kuriuose burnos skalavimo skysčiuose etanolio gali būti 25% ir daugiau: tai gali padidinti burnos vėžio išsivystymo riziką, ypač reguliariai vartojantiems [4].
1.4 Eteriniai aliejai
Atsižvelgiant į didėjantį mikroorganizmų atsparumą cheminiams sintetiniams vaistams bei šių vaistų šalutinį poveikį, mokslininkai vis labiau linkę ieškoti alternatyvių vaistažolių ir jų aktyvių komponentų [15]. Daugybė besivystančių šalių gyventojų tiki žolelių veiksmingumu pirminėje sveikatos priežiūroje [15]. Nuo seniausių laikų augalinės kilmės preparatai buvo naudojami ligoms gydyti. Mokslininkai ištyrė daugelį augalinių produktų, siekdami nustatyti jų veiksmingumą dantų apnašų formavimosi prevencijoje. Nustatyta, kad vaistinių augalų ekstraktai slopina dantų apnašų susidarymą, sumažinant mikrobinių patogenų sukibimą prie danties paviršiaus arba sumažinant bakterijų skaičių [12]. Eteriniuose aliejuose yra augalų antrinių metabolitų, kurie gali slopinti mikroorganizmų augimą [23]. Nustatyta, kad eteriniai aliejai yra veiksmingi siekiant užkirsti kelią gingivitui ir sumažinti dantų apnašas [24]. Pagal maisto ir vaistų federaciją, jie yra laikomi saugūs naudoti žmonėms [24]. Eteriniai aliejai sunaikina ląstelių membraną ir slopina bakterijų fermentinį aktyvumą, tokiu būdu jie neleidžia bakterijoms prisijungti prie danties pelikulės ir mažina bakterijų dauginimąsi, be to, eteriniai aliejai turi bakteriocidinį poveikį [24]. Eteriniai aliejai yra natūralūs gaminiai, kuriuos augalai gamina pagal savo poreikius [25]. Jie išgaunami įvairiais metodais: vandens distiliavimo, tirpinant tirpikliu, spaudimo būdu [26]. Eteriniai aliejai yra lakūs ir vandenyje netirpūs, todėl labai sunku nustatyti jų antibakterinį poveikį [25]. Be to, jų didelis hidrofobiškumas ir klampumas sukelia netaisyklingą pasiskirstymą terpėje [25].
Tradicinis burnos skalavimo skystis, kuriame yra eterinių aliejų, Listerine®Mentol™ (Johnson&Johnson, Naujasis Džersis, JAV). Šio preparato sudėtyje yra 0,092% eukalipto, 0,064% timolio, 0,06% metilsalicilato ir 0,042% mentolio, vandens ir 21,6-26,9% alkoholio [25]. 1879 m. dr. Josep Lawrence ir vaistininkas Jordanas Wheat Lambert sukūrė fenolio junginį, kurio anti-mikrobinis aktyvumas buvo sustiprintas derinant jį su kai kuriais eteriniais aliejais (Thyme, Euca-lyptus, Baptisia, Gahulteria ir Mentha Arvensis) [25]. Ši formulė vadinama Listerine® Joseph Lis-ter garbei [26]. 2017 metais atliktame in vivo tyrime buvo pastebėta, kad jis ypač veiksmingas prieš mikroorganizmus, įprastai randamus burnos ertmėje [25]. Tačiau šis preparatas prieštaringai vertin-amas dėl jame esančio alkoholio. Yra tirivertin-amas etanolio naudojimas burnos skalavimo skysčiuose, taip pat jo poveikis kompozicinėms restauracijoms ir jo galimas vaidmuo ryklės vėžio išsivystyme [27]. Nėra įrodyta tiesioginių sąsajų tarp burnos skalavimo skysčių su alkoholiu vartojimu ir burnos ryklės vėžio atsiradimu [27], tačiau manoma, kad vaikams ir tiems, kuriems yra didesnė vėžio išsivystymo rizika preparatų su alkoholiu pageidautina nevartoti [28].
antibakterinis poveikis [21]. Pirmieji tyrimai atlikti devynioliktojo amžiaus pabaigoje: Belaiche šį preparatą minėjo 1895 m. kaip priemonę prieš Candida [21]. Arbatmedžio aliejus – lakus eterinis aliejus, kuris pirmą kartą buvo išgautas Australijoje iš Melaleuca alternifolia medžio lapų [29]. Šis medis priklauso Myrtaceae šeimai ir jam priskiriama 230 rūšių, kurių didžioji dalis auga Australijoje [21]. Šis medis taip pat auga Europoje, Šiaurės Amerikoje ir Afrikoje [30]. Melaleuca pavadinimas yra kilęs iš graikų žodžio mèlas, kuris reiškia juodas ir leukòs – baltas, dėl tamsiai žalių lapų ir baltos žievės spalvų kontrasto [21]. Aborigenai šį augalą vadina „universaliausiu gydytoju iš gamtos“ dėl jo unikalių savybių [21]. Arbatmedžio eterinio aliejaus antibakterinis poveikis aiškinamas tuo, kad aliejuje esantys antimikrobiniai komponentai sukelia 260 nm šviesą absorbuojančios medžiagos nutekėjimą ir paverčia ląsteles jautrias natrio chloridui [29]. Taigi, Arbatmedžio aliejus sukelia antimikrobinį poveikį per ląstelių lizę ir membranų suardymą, dėl kurio susidaro jonų nutekėjimas ir slopinamas ląstelės kvėpavimas [29]. Bakteriocidinis Arbatmedžio aliejaus poveikis aiškinamas tuo, kad jį sudarantys angliavandenilių komponentai denatūruoja baltymus, esančius bakterijų membranoje, suardo ląstelių sienelių struktūrą ir pakeičia jų funkciją [31]. Pastaruoju metu vis dar atliekami tyrimai su Arbatmedžio eteriniu aliejumi. 2016 metais atliktame tyrime nustatytas Arbatmedžio eterinio aliejaus antibakterinis poveikis prieš burnos patogenus [32]. Šiame tyrime ištirtas Arbatmedžio eterinio aliejaus 0.002%, 0.001% ir 0.0005% koncentracijų antibakterinis poveikis prieš P. gingivalis ir P. Endodontalis burnos patogenus bei palygintas su CHX 0.01% ir 0.0038% tirpalų poveiku prieš tuos pačius patogenus [32]. Šio tyrimo rezultatai atskleidė statistiškai reikšmingą (p<0,05), efektyvų Arbatmedžio eterinio aliejaus antibakterinį poveikį [32]. 2017 metais atliktame in vivo tyrime taip pat nustatytas stiprus 1% kon-centracijos Arbatmedžio aliejaus antibakterinis poveikis prieš burnos patogenus [29]. Rezultatai atskleidė, kad 1% Arbatmedžio eterinis aliejus sumažina bakterijų kolonijų skaičių net 7 kartus [29].
Dar viena alternatyva cheminiams preparatams, naudojamiems prieš burnos patogenus - Gvazdikėlių eterinis aliejus. "Eugenia caryophyllus" paprastai žinomas kaip gvazdikėlis priklauso Myrtaceae šeimai [33]. Šis augalas pasižymi antibakterinėmis, antigrybelinėmis, antioksidacinėmis savybėmis ir yra naudojamas maisto pramonėje kaip antimikrobinė ir kvapioji medžiaga [33]. 2015 metais atliktame tyrime buvo nustatytas efektyvus Gvazdikėlių eterinio aliejaus tirpalo antibakterinis poveikis prieš dvi gram-teigiamas bakterijas (Bacillus subtilis, Staphyloccocus aureus) ir dvi gram-neigiamas bakterijas (Klebsiella pneumonia, Vibrio cholerae) [33]. Mokslinėje literatūroje teigiama, kad gvazdikėlio stiprios antibakterinės savybės daugiausiai yra susiję su dideliu eugenolio kiekiu esančiu šiame augale [33].
Antibakteriškai veikiantiems eteriniams aliejams priskiriamas ir Pelargonijų ekstraktas.,,Pelargonium graveolens“ priklauso Geraniaceae augalų šeimai, kurios lapai yra plačiai naudojami, kaip kvapioji medžiaga kvepalų pramonėje, aromaterapijoje, skirtoje virškinamojo trakto, gerklės infekcijų gydymui [34]. Be to, mokslinėje literatūroje nustatytas Pelargonium graveolens ekstrakto antimikrobinis bei antigrybelinis poveikis [34]. 2012 metais atliktame tyrime ištirtas ir nustatytas stiprus Pelargonijų ekstrakto antibakterinis poveikis teigiamoms ir gram-neigiamoms bakterijoms. Šiame tyrime buvo tirtas 5,7 – 21,5% Pelargonijų ekstrakto antibakterinis poveikis prieš gram-teigiamas bakterijas (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus ir Listeria monocytogenes) ir gram-neigiamas bakterijas (Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae). Tyrimo rezultatai parodė, kad Pelargonijų ekstraktas turi potencialiai didelį antimikrobinį aktyvumą. Kai kurių bakterijų sterili (neaugimo) zona siekė net 13- 26mm [34].
Atsižvelgiant į didelį burnos ir dantų ligų paplitimą dėl oralinių patogenų ir visuomenės susidomėjimą vaistiniams augalams, šiame tyrime buvo siekiama įvertinti Pelargonijų ekstrakto, Arbatmedžio, Gvazdikėlių eterinio aliejaus poveikį Streptococcus salivarius, Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Actinomyces odontolyticus, Rothia aeria, Veillonella parvula in vitro sąlygomis.
2.
TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1 Tiriamųjų atrankos kriterijaiTyrimas buvo atliktas ,,Moters sveikatos centre“, odontologijos skyriuje, gavus Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro leidimą (Nr. BEC – OF – 94, išdavimo data 2017-02-05)(Priedas Nr. 1) bei tiriamajam asmeniui sutikus dalyvauti tyrime.
Visi tyrimui atrinkti pacientai buvo ne jaunesni kaip 18m., neturėjo ortodontinių aparatų, pastaruosius 3 mėnesius nevartojo antibiotikų ir nesirgo infekcinėmis ligomis, kurios galėtų turėti įtakos rezultatams, ir turėjo bent vieną dantenų kišenę >3mm. Steriliais 30# dydžio sauskaisčiais iš dantenų kišenės buvo paimti mėginiai bakteriologiniam tyrimui.
Iš viso tyrime dalyvavo 43 pacientai. Teigiamas bakterijų rūšių augimas buvo 32 pacientų mėginiuose.
Žinant, kad apie 10% pasaulio populiacijos serga periodontitu [35] ir planuojant tyrimą, buvo apskaičiuota reikalinga tiriamųjų imtis pagal sekančią formulę:
n= 𝑧𝛼/2 2 ∗𝑁∗[𝜋∗(1−𝜋)] 𝜀2∗(𝑁−1)+ 𝑧𝛼 2 2∗[𝜋∗(1−𝜋)] n – imties tūris;
zα/2 – standartinio normaliojo skirstinio N (0,1) α lygmens kritinė reikšmė (su 95 % patikimumu zα/2 = 1.959;
N – atrankinės visumos dydis;
π – mus dominančio parametro proporcija atrankinėje visumoje; jei iš ankstesnių tyrimų neturime informacijos apie atrankinės visumos proporcijas, tariame, kad π = 0,5;
Ɛ – atrankos paklaida, maksimali leistina atrankos paklaidos riba yra +- 5 %; Atsižvelgiant į gautus rezultatus, nuspręsta imti daugiau nei 40 mėginių.
2.2 Grynosios mikroorganizmų kultūros išskyrimas iš tiriamosios medžiagos ir jos identifikavimas
Tiriamosios medžiagos mėginiai laboratorijoje buvo sėjami sterilia kilpele štrichų metodu į kraujo ir Šedlerio agarus. Kraujo agaras su pasėta tiriamąja medžiaga buvo kultivuotas termostate anaerobinėmis sąlygomis 48 h, esant 35⁰C temperatūrai ir aerobinėmis sąlygomis 24h, esant 35⁰C. Išaugintos bakterijos buvo identifikuotos, kaip Streptococcus salivarius, Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Actinomyces odontolyticus, Rothia aeria, Veillonella
parvula (1 pav.) su MALDI Biotyper IVD identifikavimo sistema ir pasėtos į gausinimo terpes su tioglikoliniu buljonu dar parai. Išaugę bakterijų rūšys buvo užšaldytos.
1 pav. Veillonella parvula augimas Šedlerio agare
2.3 Bakterijų rūšių kultivavimas ir suspensijų ruošimas
Identifikuotos bakterijų rūšys (Streptococcus salivarius, Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Actinomyces odontolyticus, Rothia aeria, Veillonella parvula) buvo ruošiamos steriliame fiziologiniame tirpale. Bakterijų ląstelių kiekis suspensijoje standartizuotas McFarland‘o standartiniu indikatoriumi („standart indicator McFarland“), matuojančiu suspensijos drumstumą. Buvo vorteksuota (maišoma) viena bakterijos rūšis su 2ml fiziologinio tirpalo (0,9%NaCl) ir standartizuota 0,5 McFarland‘o drumstumo bakterijos rūšies suspensija. Suspensija sėjama sterilia kilpele štrichų metodu į kraujo lėkštelę.
2.4 16,7% Pelargonijų ekstrakto, 100%, 1%, 0,5% Arbatmedžio eterinio aliejaus, 100%, 1%, 0,5% Gvazdikėlių aterinio aliejaus, 0,02% ir 0,05% Chlorheksidino digliukonato,
Listerine®Mentol™ tirpalų tyrimas
16,7% Pelargonijų ekstraktas buvo ruošiamas steriliame inde: tiksliai pamatuota 2g sausų Pelargonijų šaknų ekstrakto miltelių ir įdėta į Elenmejerio kolbą. Į kolbą buvo įpilta 10ml vandens, kuriame buvo 0,9% Na2CO3 (tirpiklis). Pagamintas tirpalas buvo uždengtas aliuminio folija ir laikomas tamsoje 4° temperatūroje 10 dienų. Tuomet iš tirpalo buvo nufiltruotos nuosėdos greito filtravimo popieriumi ir tirpalas buvo paruoštas naudojimui (2,3 pav.), [15,34].
H2Om= 1g/ml * 10ml = 10g;
m(H2O) + m(Pelargonijų ekstrakto)= m(tirpalo); 10g + 2g = 12g;
ω (A) - medžiagos masės dalis, m(A) - medžiagos masė, m(tirpalo) - tirpalo masė; m(A) – 2g, m(tirpalo) – 12g;
ω (A) = 16,7%.
2 pav. Pelargonijų ekstrakto tirpalo ekstrakto gamyba
3pav. Pelargonijų ekstrakto tirpalo filtravimas
Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eterinių aliejų ekstraktai tyrimui buvo naudojami 100%, 1% ir 0,5%. 100% arbatmedžio eterinio aliejaus ekstraktas buvo naudojamas neskiestas, grynas. Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eteriniai aliejai buvo skiedžiami sodos vandeniu, kuriame natrio karbonato yra 0,9g/100ml. 1% tirpalas buvo gaunamas skiedžiant 100 µl eterinio aliejaus su 10ml sodos vandeniu. 0,5% tirpalas buvo gaunamas skiedžiant 50µl su 10 ml sodos vandeniu.
Tyrime naudoti 0,02% ir 0,05% Chlorheksidino digliukonato ir Listerine®Mentol™ tir-palai buvo jau pagaminti, laikyti steriliomis sąlygomis.
Petri lėkštelėse su pasėtomis bakterijomis steriliu pincetu buvo dedama penki standartizuoti 6mm skersmens sterilūs aukštos kokybės sugeriamojo popieriaus diskeliai, ant kurių per 15 minučių sterilia mikropipete buvo lašinama po 10µl tiriamų tirpalų. Tirpalai pateikti lentelėje (Lentelė Nr.2.). Į termostatą petri lėkštelės sudėtos per 15 minučių. Petri lėkštelės su Streptococcus salivarius, Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Rothia aeria buvo kultivuojamos termostate 24h 35⁰C temperatūroje aerobinėmis sąlygomis, o Petri lėkštelės su Actinomyces odontolyticus ir Veillonella parvula 48h 35⁰C temperatūroje anaerobinėmis sąlygomis. Apie tiriamos medžiagos antibakterinį poveikį buvo sprendžiama pagal sterilią zoną (bakterijų neaugimo zona) aplink diskelį. Mikrometru buvo matuojamas sterilios zonos diametras, įskaitant 6mm diskelį. Gauti rezultatai suapvalinti iki 0,5mm paklaidos.
Lentelė Nr. 2. Tiriamos medžiagos
Numeris Medžiaga
1 16,7% Pelargonijų ekstraktas
2 0,02% Chlorheksidino digliukonato tirpalas
3 0,05% Chlorheksidino digliukonato tirpalas
4 Listerine®Mentol™
5 100% Arbatmedžio eterinio aliejaus koncentratas 6 0,5 Arbatmedžio eterinio aliejaus tirpalas
7 1% Arbatmedžio eterinio aliejaus tirpalas 8 0,5% Gvazdikėlių eterinio aliejaus tirpalas
9 1% Gvazdikėlių eterinio aliejaus tirpalas
2.1 Statistinė duomenų analizė
Tyrimo statistinė duomenų analizė buvo atlikta standartiniais programinės įrangos paketais: „Microsoft Office Excel 2007“ ir „SPSS 13“. Kelioms priklausomoms imtims buvo taikytas neparametrinis Wilcoxon metodas. Dviems nepriklausomoms imtims buvo taikytas Mann-Whitney testas. Normalusis kiekybinių dydžių skirstinys buvo nustatytas Kolmogorov – Smirnov testu. Kiekybinių dydžių lyginimas atliktas naudojant Stjudento t ir Fišerio kriterijus. Kiekybinių kintamųjų rezultatai pateikti vidurkiais (mm) su standartine paklaida (SP). Skirtumai laikyti statistiškai patikimais, esant ne didesnei kaip 5 % paklaidai (p<0,05).
3.
REZULTATAI
3.1 Tiriamųjų charakteristika
Tyrime dalyvavo 43 pacientai. 32 pacientų (iš kurių 18 vyrų, 14 moterų (5pav.)) mėginiuose buvo identifikuotos, izoliuotos ir užšaldytos bakterijos, 11 pacientų mėginiuose bakterijų augimo nebuvo (4pav.).
4 pav. Tyrime dalyvavusių pacientų mėginių charakteristika
5 pav. Pacientų, kurių mėginiuose buvo stebimas bakterijų augimas, pasiskirstymas pagal lytį
Pacientų, kurių mėginiuose buvo stebimas teigiamas bakterijų augimas, amžiaus vidurkis buvo 55±1,54 metai (jauniausias 38m., vyriausias 69m.). Statistiškai reikšmingos priklau-somybės tarp rasto teigiamo bakterijų rūšių augimo ir pacientų amžiaus nenustatyta (p>0,05), tačiau pastebėta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp nepriklausomų amžiaus grupių ir bakterijų rūšių teigiamo augimo kiekio (p<0,05). Pas pacientus, kurių amžius buvo 49,4-55,6 (vidurkis 52,5±1,54) metai, buvo išauginta ≤ 2 bakterijų rūšių, o pas 53,7-63,8 metų (vidurkis 63,4±1,54) amžiaus pacientus buvo rasta ≥ 2 bakterijų rūšių augimas (6pav.)
Moterys 44% Vyrai 56% 74% 26% Teigiamas bakterijų augimas Bakterijų augimo nebuvimas
6 pav. Rastų bakterijų kiekis pagal pacientų amžių
Buvo identifikuotos 58 bakterijos, iš kurių: 16 Streptococcus salivarius, 13 Actinomyces odontolyticus, 11 Streptococcus sanguinis, 9 Veillonella parvula, 6 Rothia dentocariosa, 3 Rothia aeria (7pav.)
7 pav. Išaugintų bakterijų pasiskirstymas pagal rūšį (%)
28 10 19 22 5 16 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus Rothia aeria Veillonella parvula
Buvo identifikuotos aerobų rūšys (Rothia dentocariosa, Rothia aeria), fakultatyvinių anaerobų rūšys (Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius) ir anaerobų rūšys (Veillonella parvula, Actinomyces odontolyticus)(8pav.).
8 pav. Išskirtų tyrimui bakterijų pasiskirstymas priklausomai nuo augimo sąlygų
3.2 Eterinių aliejų, Chlorheksidino digliukonato ir Listerine®Mentol™ poveikis skirtingoms bakterijų rūšims
Tirtomis medžiagomis impregnuoti diskeliai buvo sužymėti skaičiais šalia diskelio pagal lentelę (Lentelė Nr.2.) (9pav.- 20pav.). Buvo veikiamos bakterijų rūšys: Streptococcus salivarius (9,10 pav.), Rothia dentocariosa (11,12pav.), Streptococcus sanguinis (13,14 pav.), Actinomyces odontolyticus (15,16pav.), Rothia aeria (17,18pav.), Veillonella parvula (19,20pav.).
34% 33% 33% Aerobai Fakultatyviniai anaerobai Anaerobai
9,10 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Streptococcus salivarius
11,12 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Rothia dentocariosa
1
4
5
10
6
7
8
9
1
2
3
2
3
4
5
8
9
7
10
6
13,14 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Streptococcus sanguinis
15,16 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Actinomyces odontolyticus
17,18 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Rothia aeria
9
8
10
7
6
3
4
5
2
1
1
2
4
3
5
6
7
8
9
10
10
7
6
1
2
8
9
3
5
4
19,20 pav. Antibakterinis tiriamųjų medžiagų poveikis Veillonella parvula
3.3 Eterinių aliejų, Chlorheksidino digliukonato ir Listerine®Mentol™ poveikio palyginimas skirtingoms bakterijų rūšims.
Atlikus tyrimą, buvo nustatyta, kad 16,7% Pelargonijų ekstrakto tirpalas efektyviausiu antibakteriniu poveikiu pasižymėjo prieš Actinomyces odontolyticus, dvigubai silpnesiu poveikiu prieš Streptococcus salivarius, mažesniu efektyvumu prieš Rothia dentocariosa, Streptococcus sanguinis, Rothia aeria ir Veillonella parvula (21 pav.).
21 pav. 16,7% Pelargonijų ekstrakto tirpalo poveikis skirtingoms bakterijoms
8 7 7 10 7 7 0 2 4 6 8 10 12 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a( mm )
8
7
10
9
6
3
5
2
1
4
Tyrime naudotas 100% Arbatmedžio eterinis aliejus buvo efektyviausias prieš Streptococcus salivarius ir Rothia aeria , nežymiai silpnesis poveikis prieš Rothia dentocariosa, Actinomyces odontolyticus ir Veillonella parvula, mažiausiai efektyvus prieš Streptococcus sanguinis (22 pav.).
Tyrime naudotas 1% Arbatmedžio eterinis aliejus nebuvo efektyvus.
22 pav. 100% Arbatmedžio eterinio aliejaus poveikis skirtingoms bakterijoms
Tyrime naudotas 0,5% Arbatmedžio eterinis aliejus pasižymėjo nežymiu antibakteriniu poveikiu prieš Streptococcus sanguinis, kitų bakterijų rūšių neveikė (23 pav.).
23 pav. 0,5% Arbatmedžio eterinio aliejaus poveikis skirtingoms bakterijoms
14 12 10 12 14 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m ) 0 0 7 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m )
dar silpnesniu prieš Streptococcus sanguinis ir mažiausiu poveikiu prieš Actinomyces odontolyticus ir Streptococcus salivarius bakterijas (24 pav.).
Tyrime naudotas 0,5% ir 1% Gvazdikėlių eterinis aliejus buvo neefektyvus.
24 pav. 100% Gvazdikėlių eterinio aliejaus poveikis skirtingoms bakterijoms
Tyrime naudotas Listerine®Mentol™ efektyviausias buvo prieš Rothia dentocariosa ir Rothia aeria, nežymiai silpnesnis poveikis prieš Actinomyces odontolyticus ir Veillonella parvula, mažiausiai veikė Streptococcus salivarius ir Streptococcus sanguinis (25 pav.).
25 pav. Listerine®Mentol™ poveikis skirtingoms bakterijoms
7 18 10 8 30 18 0 5 10 15 20 25 30 35 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m ) 10 16 8 12 14 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m )
0,05% Chlorheksidino tirpalas efektyviausiu poveikiu pasireiškė prieš Rothia den-tocariosa ir Rothia aeria, nežymiai silpnesniu prieš Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula bei Streptococcus salivarius, mažiausiai veikė Streptococcus sanguinis (26 pav.)
26 pav. 0,05% Chlorheksidino tirpalo poveikis skirtingoms bakterijoms
Tyrime naudoto 0,02% Chlorheksidino digliukonato tirpalas efektyviausiai veikė prieš Streptococcus sanguinis, Actinomyces odontolyticus ir Veillonella parvula, neveikė Streptococcus salivarius, Rothia dentocariosa ir Rothia aeria (27 pav.)
27 pav. 0,02% Chlorheksidino tirpalo poveikis skirtingoms bakterijoms
Stipriausiu antibakteriniu poveikiu tiriamosioms kultūroms pasižymėjo 0,05%
14 18 10 16 18 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m ) 0 0 7 7 0 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Streptococcus salivarius Rothia dentocariosa Streptococcus sanguinis Actinomyces odontolyticus
Rothia aeria Veillonella parvula Ste ri li zo n a ( m m )
Šiek tiek silpnesniu (statistiškai nereikšmingas skirtumas) antibakteriniu poveikiu nei 0,05% Chlorheksidino digliukonato tirpalas ir 100% Gvazdikėlių eterinio aliejaus koncentratas pasižymėjo 100% Arbatmedžio eterinio aliejaus koncentratas ir Listerine®Mentol™. Be to, reikšmingo 100% Arbatmedžio aliejaus ir Listerine®Mentol™ poveikio išaugintoms bakterijoms skirtumo nebuvo rasta (p>0,05).
16,7% Pelargonijų ekstraktas antibakteriškai veikė reikšmingai silpniau nei 0,05% Chlorheksidino digliukonato tirpalas (p<0,05), 100% Arbatmedžio eterinio aliejaus koncentratas (p<0,05), Listerine® Mentol ™ (p<0,05) (28 pav.).
28 pav. Eterinių aliejų, Chlorheksidino digliukonato tirpalų ir Listerine®Mentol™ antibakterinio poveikio vidurkių prieš tirtas bakterijas palyginimas
6.83 6.50 10.60 9.00 9.17 6.50 10.58 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Ste ri lio s zo n o s v id u rki s (m m )
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrime buvo panaudoti trys eteriniai aliejai: 16,7% Pelargonijų ekstrakto tirpalas, 100% Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eterinių aliejų koncentratai, 1%, 0,5% Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eterinių aliejų tirpalai. Palyginimui buvo pasirinkta Listerine®Mentol™ ir 0,05% bei 0,02% CHX tirpalai. Medžiagos atrinktos pagal atliktus mokslinius tyrimus [34,29,33,36,37]. Atlikus tyrimą, buvo nustatyta, kad stipriausiomis antibakterinėmis savybėmis pasižymėjo 0,05% CHX. D. E. George, R. Shetty, P. J. Shetty ir L. A. Gomessavo 2017 metais at-liktame in vitro tyrime [36] taip pat tyrė CHX tirpalo antibakterinį poveikį. Tyrimus galime palyginti iš dalies, nes jų tyrime buvo naudotas 0,2% koncentracijos CHX tirpalas, buvo išaugintas kitas burnos patogenas (Streptococcus mutans) ir skyrėsi metodika (buvo naudojamas duobučių agare metodas). Rezultatai atskleidė itin efektyvų antibakterinį CHX poveikį: sterilios zonos (bak-terijų neaugimo) skersmuo (įskaitant 6mm duobutę) vidutiniškai buvo 22mm, tuo tarpu šiame ty-rime su 0,05% CHX tirpalu buvo nustatyti mažesni rezultatai: vidutiniškai sterilios zonos skersmuo (įskaitant 6mm diskelį) buvo 15,3mm,o su 0,02% CHX - 3,5mm.
Kitas tyrimas, kuriame buvo nagrinėjamas CHX antibakterinis poveikis in vitro sąly-gomis, buvo Naiana B. Da Silva, Adílis K. F. Alexandria, Aline L. De Lima, Lígia V. Claudino, Thiago F. De Oliveira Carneiro, Adalberto C. Da costa, Ana M. G. Valença ir Alessandro L. Cavalcanti 2012 metais atlikta studija [37]. Tyrime tirtas 0,12% CHX ir Listerine® antibakterinis poveikis. Šiame tyrime buvo imti pacientų seilių mėginiai ir identifikuotos Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis ir Lactobacillus casei bakterijų rūšys. Tačiauatliktą cituojamą darbą ir šio darbo rezultatus palyginti galime tik iš dalies, nes skyrėsi pasirinkta metodika (cituojamame tyrime buvo naudotas duobučių agare metodas). Jų tyrime gauti rezultatai : 0,12% CHX visoms bakterijoms sterilios zonos skersmuo (įskaitant 6mm duobutę) buvo 8mm. Listerine® antibakteriškai neveikė. Šiame tyrime, 0,05% CHX tirpalo paveiktų bakterijų sterilumo zonos skersmuo (įskaitant 6mm diskelį) lyginant su cituojamu darbu buvo didesnis, vidutiniškai 15,3mm, 0,02% CHX mažesnis - 3,5mm, Listerine®Mentol™, priešingai nei cituojamo darbo, buvo efektyvus, sterilumo zonų skersmuo vidutiniškai buvo 12mm.
Atliktame tyrime panašiai, kaip 0,05% CHX tirpalas, veikė 100% Gvazdikėlių eterinio aliejaus koncentratas. Hemalatha R., Nivetha P., Mohanapriya C., Sharmila G., Muthukumaran C., Gopinath M. savo 2016 metais atliktame tyrime [33] taip pat įrodė Gvazdikėlių ekstrakto antibakterinį veiksmingumą. Nors abu tyrimai buvo atlikti in vitro sąlygomis, tačiau šiame tyrime
dvi gram-neigiamos bakterijos (Klebsiella pneumonia, Vibrio cholerae). Taip pat skyrėsi atlikimo metodika (tirpalai buvo lašinami ne ant sterilių diskelių, o buvo naudojamas duobučių agare metodas, taip pat skyrėsi pasirinkti eterinio aliejaus tirpikliai). Minėtas tyrimas buvo atliktas su įvairių koncentracijų Gvazdikėlių eterinių aliejų tirpalais. Šiame tyrime veiksmingas buvo tik 100% Gvazdikėlių koncentratas, 0,5% ir 1% tirpalai nebuvo efektyvūs. Atliktame tyrime nustatyti didesni rezultatai: sterilumo zona buvo 7-30mm (vidurkis ~15,2mm), nei cituojamame tyrime, kuriame sterilumo zonų skersmuo buvo 17-26mm.
Šiame tyrime stipriomis antibakterinėmis savybėmis pasižymėjo 100% Arbatmedžio eterinis aliejus. Minimalų antibakterinį poveikį turėjo 0,5% Arbatmedžio eterinio aliejaus tirpalas. Gaurav Patri ir Aliva Sahu 2017 metais savo atliktame tyrime [29] taip pat vertino Arbatmedžio eterinio aliejaus antibakterinį poveikį, tačiau tyrimus galime palyginti tik iš dalies, nes jų tyrimas buvo atliktas in vivo sąlygomis (tyrime dalyvavo 40 pacientų). Jie lygino 1% Arbatmedžio eterinio aliejaus, 2% Chlorheksidino digliukonato ir Alijošiaus aliejaus antibakterinį poveikį suskirsčius pacientus į skirtingas grupes. Buvo imtas mėginys nuo dantų paviršiaus, tuomet dantų paviršius aplikuojamas tirpalu, po to vėl imtas mėginys ir atlikti abiejų mėginių mikrobiologiniai tyrimai vertinant identifikuotų bakterijų kolonijų skaičių. Tyrimo rezultatai atskleidė, jog pacientai, ant kurių dantų paviršiaus buvo aplikuotas 1% Arbatmedžio eterinio aliejaus tirpalas, bakterijų kolonijų sumažėjo net 7 kartus.
16,7% Pelargonijų ekstraktas pasižymėjo silpniausiomis antibakterinėmis savybėmis. Tačiau jis buvo itin veiksmingas prieš Actinomyces odontolyticus bakteriją. Anis Ben Hsouna ir Naceur Hamdi 2012 metais taip pat tyrė Pelargonijų ekstrakto veiksmingumą [34]. Tyrime buvo tirtas skirtingų koncentracijų nuo 5.7% iki 21.5% Pelargonijų ekstrakto antibakterinis poveikis. Cituojamame tyrime, kaip ir šiame tyrime, buvo pasirinktas eterinių aliejų tirpiklis - sodos vanduo (Na2CO3) bei tokia pati metodika (tirpalu buvo aplikuojami sterilūs 6mm diskeliai), tačiau nesutapo tirtos bakterijos (cituojamame tyrime tirtos gram-teigiamos bakterijos: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes ir gram-neigiamos bakterijos: Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae). Tyrime gauti rezultatai: sterilios zonos (bakterijų neaugimo) skersmuo buvo nuo 12 iki 34mm priklausomai nuo koncentracijos (kuo didesnė koncentracija tuo didesnio skersmens sterilumo zona). Šiame darbe gauta žymiai mažesnė sterili zona, nei cituojamame tyrime, jos skersmuo buvo nuo 7 iki 10mm. Tokius rezultatus galėjo įtakoti pasirinktų kocentracijų skirtumas, bakterijų rūšių atsparumas tirtoms medžiagoms ir kt.
koncentracijomis, galbūt galima būtų tikėtis kitokių rezultatų. Taip pat jei atlikti tyrimai būtų in vivo, rezultatai gali nesutapti, burnos ertmėje rezultatams įtaką gali daryti seilių sudėtis, pH, temperatūra, sisteminės ligos, imuninė sistema. Atliekant tyrimą in vivo, galima aplikuoti tirpalu, įvesti į skalavimo skysčius, dantų pastą, impregnuoti juo dantų siūlą. Manau, rezultatai gali priklausyti ir nuo vartojimo dažnio bei kiekio. Reikia atlikti daugiau tyrimų in vitro sąlygomis, kurie patvirtintų ar paneigtų hipotezes. Gavus teigiamus rezultatus, tikslinga atlikti tyrimus in vivo sąlygomis.
Norėčiau padėkoti LSMUL KK laboratorinės medicinos klinikos vadovei Prof.dr. Astrai Vitkauskienei už suteiktą galimybę tyrimą atlikti mikrobiologijos laboratorijoje bei gyd. Daivai Jomantienei ir Laimai Ivanauskienei už pagalbą, patarimus, sugaištą laiką atliekant tyrimą. Taip pat norėčiau padėkoti savo darbo vadovei doc. Ingai Vaitkevičienei už konsultavimą, pastabas bei patarimus.
Man, Ievai Mačiulaitytei, atliekant tyrimą, ieškant informacijos, interesų konflikto nebuvo.
5. IŠVADOS
1. Nustatyta, kad stipriausias antibakterinis eterinių aliejų koncentratų poveikis būdingas 100% Gvazdikėlių eteriniam aliejui, lyginant su 100% Arbatmedžio eteriniu aliejumi (tarp jų reikšmingo poveikio skirtumo nerasta).
2. Nustatyta, kad 16,7% Pelargonijų ekstrakto tirpalas turi didžiausią antibakterinį poveikį, lyginant su 1%, 0,5% Arbatmedžio ir Gvazdikėlių eterinių aliejų tirpalais, kurie buvo neefektyvūs arba mažai veikė antibakteriškai.
3. Nustatyta, kad stipriausiu antibakteriniu poveikiu pasižymėjo 0,05% Chlorheksidino digliukonato tirpalas, lyginant jį su eterinių aliejų koncentratais, tirpalais bei Listerine®Mentol™ skalavimo sky-sčiu.
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Eteriniai aliejai yra alternatyva pacientams, kurie yra natūralios medicinos šalininkai. Taip pat pacientams, kuriems pasireiškia nepageidaujamas šalutinis cheminių preparatų naudojamų burnos ligų profilaktikoje poveikis. Mažomis koncentracijomis eteriniai aliejai gali būti pritaikomi kasdieninėje burnos priežiūroje, pavyzdžiui, galima naudoti skalavimo skysčio pavidalu, aplikuojant, įtraukti į dantų pastų sudėtį, imprengnuoti dantų siūlą ir kt. Rekomenduojama rinktis kasdienines burnos priežiūros priemones, kurių sudedamose dalyse yra mažiau sintetinių medžiagų, kurios gali būti toksiškos, pavyzdžiui propileno glikolis ar natrio fluoridas, alumina , kuris yra neu-rotoksiškas, fluoro jodidas, kuris toksiškas, kancerogeniškas, triklosanas, kuris yra toksiška antibi-otinė medžiaga, galinti sukelti endokrininius sutrikimus. Taip pat rekomenduojama, kad kasdien naudojamų medžiagų sudėtyje būtų kuo mažiau kvapiklių, konservantų, dažiklių. Reikėtų rinktis tokius preparatus, kuriuose yra daugiau natūralių augalinių medžiagų (augalų ekstraktų ir aliejų). Tyrime efektyviomis antibakterinėmis savybėmis pasižymėjo Gvazdikėlių ir Arbatmedžio eteriniai aliejai, tačiau tikslinga būtų tęsti tyrimą in vivo sąlygomis ir vertinti šių eterinių aliejų tolimesnį pritaikomumą odontologijoje.
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Tardugno R., Pellati F., Iseppi R., Bondi M., Bruzzesi G., Benvenuti S. Phytochemical composition and in vitro screening of the antimicrobial activity of essential oils on oral pathogenic bacteria. Nat Prod Res. 2018 Mar; 32(5):544-551.
2. Azizan N., Mohd Said S., Zainal Abidin Z., Jantan I. Composition and Antibacterial Activity of the Essential Oils of Orthosiphon stamineus Benth and Ficus deltoidea Jack against Pathogenic Oral Bacteria. Molecules. 2017 Dec 5;22(12).
3. Van Leeuwen M.P., Slot D.E., Van der Weijden G.A. Essential oils compared to chlorhexidine with respect to plaque and parameters of gingival inflammation: a systematic review. J Periodontol. 2011 Feb;82(2):174-94.
4. Quirynen M., Soers C., Desnyder M., Dekeyser C., Pauwels M., van Steenberghe D. A 0.05% cetyl pyridinium chloride/ 0.05% chlorhexidine mouth rinse during maintenance phase after initial perio-dontal therapy. J Clin Periodontol. 2005 Apr;32(4):390-400.
5. Freires I.A., Denny C., Benso B., de Alencar S.M., Rosalen P.L.. Antibacterial activity of essential oils and their isolated constituents against cariogenic bacteria: a systematic review. Molecules. 2015 Apr 22;20(4):7329-58.
6. S., A. Samuel .The relationship between oral malodour and chronic periodontitis: role of volatile sulfurd compounds.Queen Mary University of London. May 2016.
7. Vielkind P., Jentsch H., Eschrich K., Rodloff A.C., Stingu C.S. Prevalence of Actinomyces spp. in patients with chronic periodontitis. Int J Med Microbiol. 2015 Oct;305(7):682-8.
8. Lakhdar L., Hmamouchi M., Rida S., Ennibi O. Antibacterial activity of essential oils against periodontal pathogens: a qualitative systematic review. Odontostomatol Trop. 2012 Dec;35(140):38-46.
9. Öğrendik M. Oral Anaerobic Bacteria in the Etiology of Ankylosing. Clin Med Insights Arthritis Musculoskelet Disord. 2017 Jun 12;10.
10. V. Quintas, I. Prada-López, M.J. Carreira, D. Suárez-Quintanilla, C. Balsa-Castro ir I. Tomás .In Situ Antibacterial Activity of Essential Oils with and without Alcohol on Oral Biofilm: A Randomized Clinical Trial. Front Microbiol. 2017; 8: 2162.
11. Chandrasekar R.S., Lavu V., Kumar K., Rao S.R. Evaluation of antimicrobial properties of bioactive glass used in regenerative periodontal therapy. J Indian Soc Periodontol. 2015 Sep-Oct;19(5):516-9.
12. G. F. Ferrazzano, E. Scioscia, D. Sateriale, G. Pastore, R. Colicchio, C. Pagliuca, T. Cantile, B. Alcidi, M. Coda, A. Ingenito, E. Scaglione, A. G. Cicatiello, M. G. Volpe, M. Di Stasio, P. Salva-tore, C. Pagliarulo. In Vitro Antibacterial Activity of Pomegranate Juice and Peel Extracts on Cari-ogenic Bacteria. Hindawi. International Journal of Biomaterials. 2017, Article ID 2152749.
13. Tsuzukibashi O., Uchibori S., Kobayashi T., Umezawa K., Mashimo C., Nambu T., Saito M. , Hashizume-Takizawa T., Ochiai T. Isolation and identification methods of Rothia species in oral cavities. J Microbiol Methods. 2017 Mar; 134:21-26.
14. Süzük S., Kaşkatepe B., Çetin M. Antimicrobial susceptibility against penicillin, ampicillin and vancomycin of viridans group Streptococcus in oral microbiota of patients at risk of infective endocarditis. Infez Med. 2016 Sep 1;24(3):190-3.
15. F. Hajifattahi, E. Moravej-Salehi, M. Taheri, A. Mahboubi ir M. Kamalinejad . Antibacterial Effect of Hydroalcoholic Extract of Punica granatum Linn. Petal on Common Oral Microorganisms. Hindawi. International Journal of Biomaterials. 2016
16. El-Rami F., Kong X., Parikh H., Zhu B., Stone V., Kitten T., Xu P. Analysis of essential gene dynamics under antibiotic stress in Streptococcus sanguinis. Microbiology. 2018
Feb;164(2):173-185.
17. Mashima I., Kamaguchi A., Nakazawa F. The distribution and frequency of oral veillonella spp. in the tongue biofilm of healthy young adults. Curr Microbiol. 2011 Nov;63(5):403-7.
18. S. Payungporn, P. Arirachakaran, W. Poomipak, K. Praianantathavorn, G. Charalampakis ir Y. Poovorawan. Identification of Bacteria Associated with a Periodontal Disease in
Thai Patients Based on Next-Generation Sequencing. Jundishapur Journal of Microbiology. June
2017, 10 (6); e13646.
19. Tsuzukibashi O., Uchibori S., Kobayashi T., Umezawa K., Mashimo C., Nambu T., Saito M., Hashizume-Takizawa T., Ochiai T..Isolation and identification methods of Rothia species in oral cavities. J Microbiol Methods. 2017 Mar;134:21-26.
20. Colombo A.P., Bennet S., Cotton S.L., Goodson J.M., Kent R., Haffajee A.D., Socransky S.S., Hasturk H., Van Dyke T.E., Dewhirst F.E., Paster B.J. Impact of periodontal therapy on the subgingival microbiota of severe periodontitis: comparison between good responders and individu-als with refractory periodontitis using the human oral microbe identification microarray. J Periodon-tol. 2012 Oct;83(10):1279-87.
21. C. Salvatori, L. Barchi, F. Guzzo, ir M. Gargari . A comparative study of antibacterial and anti-inflammatory effects of mouthrinse containing tea tree oil. Oral Implantol (Rome). 2017 Jan-Mar; 10(1): 59–70.
22. Slot D.E., Lindeboom R., Rosema N.A., Timmerman M.F., van der Weijden G.A. The effect of 0.12% chlorhexidine dentifrice gel on plaque accumulation: a 3-day non-brushing model. Int J Dent Hyg. 2007 Feb;5(1):45-52.
23. F. Nazzaro, F. Fratianni, L. De Martino, R. Coppola, V. De Feo. Effect of essential oils on pathogenic bacteria. Pharmaceuticals (Basel). 2013 Dec; 6(12): 1451–1474.
24. LuIs H.S., Luis L.S., Bernardo M. In vitro study of the effect of an essential oil and a delmopinol mouth rinse on dental plaque bacteria. . Indian J Dent Res. 2016 Nov-Dec;27(6):648-651.
25. Prada-López I., Quintas V., Donos N., Álvarez-Fernández M., Tomás I. In situ substantivity of the essential oils in the oral cavity. Science, Technology and Education, ed Méndez-Vilas A., editor. (Badajoz: Formatex Research Center; ). 2013; 1112–1122.
26. C. A. Semeniuc, C. R. Pop, A. M. Rotar. Antibacterial activity and interactions of plant essential oil combinations against Gram-positive and Gram-negative bacteria. April 2017; Volume 25, Issue 2,
