ŢIURKĖS RAUMENINĖS KILMĖS KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ IŠSKYRIMAS IR CHARAKTERIZAVIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS MEDICINOS FAKULTETAS

FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS

DANIELIUS UMBRASAS

ŢIURKĖS RAUMENINĖS KILMĖS KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ

IŠSKYRIMAS IR CHARAKTERIZAVIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. Arvydas Ūsas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS

FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

ŢIURKĖS RAUMENINĖS KILMĖS KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ IŠSKYRIMAS IR CHARAKTERIZAVIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. Arvydas Ūsas Data

Recenzentas

Data

Darbą atliko

Magistrantas Danielius Umbrasas Data

TURINYS

1.1.1. Kamieninių ląstelių kilmė ... 13

1.1.2. Kamieninių ląstelių klasifikacija ... 14

1.1.3. Indukuotos pluripotentinės kamieninės ląstelės ... 16

1.2. Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės ... 16

1.2.1. Kamieninės ląstelės raumeniniame audinyje ... 16

1.2.2. RKKL savybės: ... 17

1.2.3. Miogeninė diferenciacija bei raumenų regeneracija ... 18

1.2.4. Osteogeninė diferenciacija bei kaulų regeneracija ... 19

1.2.5. Chondrogeninė diferenciacija bei kremzlės regeneracija ... 20

1.2.6. Neurogeninė diferenciacija bei nervinių ląstelių regeneracija ... 21

1.2.7. Diferenciacija į hepatocitus bei kepenų audinio regeneracija ... 22

1.3. Klinikiniai tyrimai su RKKL ... 23

1.4. RKKL charakterizavimas ... 24

1.4.1. Charakterizavimo metodai ... 26

1.4.1.1. Tėkmės citometrija ... 26

1.4.1.2. Polimerazės grandininė reakcija ... 26

1.4.1.3. Imunofluorescensija ... 27

2. Tyrimo metodika ... 28

2.1. Ląstelių išskyrimas ... 28

2.1.1. Flakonų padengimas kolagenu ... 29

2.1.2. Griaučių raumenų izoliavimas bei fermentinis skaidymas ... 29

2.1.3. Ląstelių sėjimas ... 30

2.1.5. RKKL persėjimas ... 31

2.1.6. RKKL uţšaldymas ... 32

2.1.7. Uţšaldytų RKKL atšildymas ... 32

2.2. Populiacijos dvigubėjimo laiko skaičiavimas ... 32

2.3. Tėkmės citometrija ... 33 2.4. Imunofluorescensija ... 33 2.5. Tirti bioţymenys ... 33 2.5.1. c-kit ... 33 2.5.2. CD59 ... 34 2.5.3. CD90 ... 34 2.5.4. CD45 ... 34 2.6. Ląstelių diferenciacija ... 35 2.6.1. Miogeninė diferenciacija ... 35 2.6.2. Adipogeninė diferenciacija ... 35

2.6.3. Oil red o daţymas ... 35

2.6.4. Chondrogeninė diferenciacija ... 36

2.6.5. Alciano- mėlynasis daţymas ... 36

2.6.5. Osteogeninė diferenciacija ... 37

2.6.5. Von Kossa daţymas ... 37

3. Rezultatai ... 38

3.1. Ląstelių išskyrimas ir kultivavimas ... 38

SANTRAUKA

D. Umbraso magistro baigiamasis darbas. Ţiurkės raumennės kilmės kamieninių ląstelių išskyrimas ir charakterizavimas. Mokslinis vadovas doc. A. Ūsas. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Fiziologijos ir farmakologijos institutas, Kaunas 2016.

Tyrimo tikslas: Išskirti, kultivuoti ir charakterizuoti ţiurkės raumeninės kilmės kamienines ląsteles (RKKL).

Tyrimo uţdaviniai: Išskirti ir kultivuoti ţiurkės raumeninės kilmės kamienines ląsteles, įvertinti jų morfologiją bei proliferacijos gebą bei atlikti jų kokybinę analizę taikant imunofluorescensijos ir tėkmės citometrijos metodus. Įvertinti RKKL multipotentinės diferenciacijos gebą.

Metodika: Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės buvo išskiriamos iš 3 savaičių Wistar veislės ţiurkių patino. Ląstelių išskyrimui buvo naudota metodika, pagrįsta ląstelių prikibimo prie kolagenu padengto paviršiaus greičiu. Išskirtos ląstelės pirma buvo įvertintos morfologiškai bei įvertintas jų proliferacijos greitis skaičiuojant populiacijos dvigubėjimo laiką. RKKL buvo charakterizuojamos vertinant jų gebą diferencijuotis miogenine, osteogenine, chondrogenine ir adipogenine kryptimis, taip pat atliktas jų paviršinių bioţymenų (CD34, CD45, CD90, c-kit bei desmino) kokybinė analizė taikant imunofluorescensijos metodą bei bioţymenų (CD34, CD45, CD59 bei CD90) kiekybinė analizė taikant tėkmės citometrijos metodą.

SUMMARY

Master thesis of D. Umbrasas. Isolation and characterization of rat muscle-derived stem cells. Scientific supervisor doc. A. Ūsas. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Medicine, Institute of Physiology and Pharmacology. Kaunas 2016.

Aim of the study: Isolation, cultivation and characterization of rat muscle-derived stem cells (MDSCs).

Tasks of the study: Isolate and cultivate rat MDSCs, evaluate their morphology and proliferation capacity. Carry out their qualitative analysis using immunohistochemistry and flow cytometry. Evaluate their multi- lineage differentiation.

Methods: MDSCs were isolated from a 3 week old male rat (Wistar breed). The cells were isolated using the pre-plate method. First the isolated MDSCs were evaluated morphologically and their proliferation rate was evaluated by calculating the population doubling time. MDSCs were characterized by their multipotential (myogenic, osteogenic, chondrogenic and adipogenic) differentiation ability. Qualitative analysis of surface biomarkers CD34, CD45, CD90, c-kit and desmin was carried out using immunohistochemistry and quantitative analysis of biomarkers CD34, CD45, CD59 and CD90 was performed using flow cytometry.

Results: MDSCs were successfully isolated using the pre-plate technique. They appeared as small round, triangular or spindle shaped cells. The population doubling time was 43.64±3.10 hours. MDSCs were able to differentiate into all four cell lineages (myogenic, osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Myogenic differentiation was determined morphologically (fibrous, multinuclear cells) and by their expression of desmin (>98%). Osteogenic differentiation was determined by Von Kossa staining, chondrogenic - by alcian blue staining, adipogenic - by oil red o staining. Immunohistochemistry showed that MDSCs are highly positive for CD90 and desmin, poorly positive for c-kit and negative for CD34 and CD45. Flow cytometry showed that MDSCs are negative (<1%) for biomarkers CD34 and CD45, poorly positive for c-kit (1.17%), the expression of CD59 was 48% and for CD90 - 99.7%.

PADĖKA

SANTRUMPOS

BMP- kaulų morfogenetinis proteinas BSA- jaučio serumo albuminas CEE- viščiuko em;pbriono ekstraktas

DAPI- 4,6-diiamidino-2-fenilindol dihidrochlorido hidratas DMEM- Dulbecco modifikuota erelio terpė

DMSO- dimetsulfoksidas

DPBS- Dulbecco fosfatinis buferinis tirpalas EDTA- etildiaminotetraacto dinatrio druska EKL- embrioninės kamienės ląstelės

FBS- jaučio fetalinis serumas FITC- fluoresceino izotiocianatas

HBSS- Hanko subalansuotas druskos tirpalas HNF1α- hepatocitų branduolių faktorius 1 alfa HNF4α- hepatocitų branduolių faktorius 4 alfa HS- arklio serumas (angl. Horse serum) ĮŠN- įtampos šlapimo nelaikymas KL- kultivavimo laikas

KLF4- į Kruppel geną panašus faktorius 4 LIN28- lin-28 homologas A

MAK- membranų atakos komplekasas

MAP2- su mikrotubulėmis susijęs proteinas-2 MYHC- miozino sunkioji grandinė

MKL- kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės NSK- neurosferiniai klasteriai

OA- osteoartritas

Oct4 – oktamerą surišantis transkripcijos faktorius 4 P/S- penicilinas/ streptomicinas

PDS- populiacijos dvigubėjimo skaičius PGR- polimerazės grandininė reakcija

rhBMP-2- rekombinantinis ţmogaus kaulų morfogenetinis proteinas- 2 RKKL- raumeninės kilmės kamieninės ląstelės

RRF- raumenų reguliaciniai faktoriai

SKL- suaugusio organizmo kamieninės ląstelės (audiniui specifinės kamieninės ląstelės) Sox2- lytį apsprendţiančio regiono Y 2 domenas

ĮVADAS

Kamieninės ląstelės yra savaime atsinaujinančios, nespecializuotos ir gebančios diferencijuotis ląstelės.Jos geba neribotai dalintis, taip iš jų gali atsirasti tiek naujos kamieninės ląstelės, tiek daugiau diferencijuotos specifinės audinių ląstelės, įskaitant ir pilnai funkcionuojančias audinių ląsteles. Suaugusių organizmų kamieninės ląstelės geba atnaujinti specifinių audinių ląsteles (pavyzdţiui, ţarnyno kamieninės ląstelės, hematopoetinės kamieninės ląstelės ir kt.), tačiau tam tikros kamieninių ląstelių rūšys turi gebėjimą diferencijuotis į daugelio audinių funkcines ląsteles ( pavyzdţiui, nervinės kamieninės ląstelės, kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės ir kt.). Tokios suaugusių organizmų kamieninės ląstelės yra vadinamos “multipotentinėmis”, tačiau savo geba diferencijuotis jos yra panašios į embriono pluripotentines kamienines ląsteles. Kultivuojant daugelį kamieninių ląstelių in vitro gali kilti įvairių problemų, o terapinis jų pritaikymas nėra labai paplitęs, todėl reikalingi tolimesni moksliniai tyrimai. [1]

Intensyvūs moksliniai tyrimai su kamieninėmis ląstelėmis pastaraisiais dešimtmečiais ne tik padėjo geriau suprasti kamienines ląsteles, tačiau ir audinių bei organų formavimosi procesus, savaiminę ląstelių kaitą bei regeneraciją po paţeidimų.Tai yra labai svarbu regeneracinei medicinai, nes norint gauti rezultatus in vivo, reikalingos ţinios apie natūralius organizmo atsinaujinimo procesus. [2]

Embrioninės kamieninės ląstelės buvo ţinomos jau labai seniai, tačiau jų naudojimas medicinoje yra apipintas etinėmis problemomis. Per pastaruosius du dešimtmečius buvo atrastos ir tiriamos suaugusių organizmų kamieninės ląstelės, kurių dėka galima išvengti visų etinių dilemų. Iš pradţių buvo galvota, kad suaugusiųjų kamieninės ląstelės gali diferencijuotis tik į savo specifinio audinio funkcines ląsteles, tačiau buvo pastebėta, kad kai kurios kamieninės ląstelės, pavyzdţiui kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės, yra multipotentinės ir gali diferencijuotis į daugumą ląstelių linijų. Taip pat buvo atrasta, kad šios ląstelės gali cirkuliuoti kraujyje ir, esant poreikiui, nukeliauti į paţeistą organizmo vietą. [2]

ląstelių diferenciaciją į tam tikras ląstelių linijas reikia stimuliuoti papildomais baltymais, kuriuos, pasitelkiant biotechnologijas, gali ekspresuoti pačios kamieninės ląstelės.

DARBO TIKSLAS

Išskirti, kultivuoti ir charakterizuoti ţiurkės raumeninės kilmės kamienines ląsteles.

DARBO UŢDAVINIAI

1. Išskirti bei kultivuoti ţiurkės RKKL, įvertinti ląstelių morfologiją ir proliferacijos gebą.

2. Atlikti išskirtų raumeninės kilmės kamieninių ląstelių kultūrų kokybinę analizę charakterizuojant jas pagal bioţymenis taikant tėkmės citometrijos ir imunofluorescencijos metodus.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Kamieninės ląstelės

Kamieninės ląstelės- tai nespecializuotos ląstelės, randamos visuose daugialąsčiuose organizmuose, kurios gali pačios atsinaujinti ir virsti į specializuotas ląsteles. Kamieninės ląstelės turi tris pagrindines savybes: jos turi gebėti pačios atsinaujinti, diferencijuotis į bent vienos rūšies ląsteles bei gebėti atkurti pradinį audinį. Geriausias kamieninių ląstelių pavyzdys- tai kaulų čiulpų (hematopoetinės) ląstelės: jos yra nespecializuotos, tačiau gali diferencijuoti į visų rūšių kraujo ląsteles, kurios turi specifines funkcijas. Kadangi kamieninės ląstelės gali neribotai daugintis bei diferencijuotis į funkcionuojančias audinių ląsteles, jų funkcija suaugusiame organizme yra audinių atkūrimas. [3], [4]

Kamieninės ląstelės gali būti išskirtos iš embriono, gemalo, virkštelės bei suaugusio organizmo. Skirtingos kilmės kamieninės ląstelės turi skirtingas charakteristikas, tačiau svarbiausia iš jų yra gebėjimas diferencijuotis į skirtingas ląstelių linijas (potencija). Embriono kamieninės ląstelės išskirtos iš morulės yra totipotentinės- iš jų gali išaugti visas naujas organizmas. Ląstelės, išskirtos iš blastocistos vidinės ląstelių masės yra pluripotentinės- iš jų gali išaugti bet koks audinys, tačiau negali išsivystyti visas organizmas. Suaugusio organizmo kamieninės ląstelės gali būti multipotentinės (gali diferencijuoti į specifinio audinio ląsteles) arba unipotentinės (gali diferencijuoti į vienos rūšies ląsteles). [3], [4]

1.1.1. Kamieninių ląstelių kilmė

suaugusio organizmo audiniai, tarp jų ir suaugusio organizmo kamieninės ląstelės, kitaip vadinamos audiniui specifinėmis kamieninėmis ląstelėmis. [5], [6]

1 pav. Kamieninių ląstelių diferenciacijos keliai [6]

1.1.2. Kamieninių ląstelių klasifikacija

(motions organizmas). Totipotentinių ląstelių pavyzdys- blastomerai iš morulės stadijos embriono. Iš kiekvienos ląstelės gali išsivystyti bet koks embrioninis ir ekstraembrioninis audinys, kuris reikalingas ţinduolių vystymuisi. Po blastocistos susiformavimo, vidinės ląstelių masės ląstelės yra pluripotentinės- iš jų gali išsivystyti visos somatinės ir gemalo ląstelės. Ląstelės iš trijų gemalo sluoksnių (endodermos, mezodermos ir ektodermos) taip pat yra pluripotentinės. Šios ląstelės yra aukšto proliferacinio indekso, tačiau jų panaudojimas medicinoje labai ribotas dėl etinių problemų. Daugiausiai dėmesio šiais laikais yra skiriama multipotentinėms ląstelėms- tai yra audiniui specifinės kamieninės ląstelės. Jos gali diferencijuoti į kelias vienam audiniui priklausančių ląstelių linijas.Geriausiai aprašytas šių ląstelių pavyzdys yra hematopoetinės kaulų čiulpų ląstelės, tačiau yra izoliuota ir centrinės nervų sistemos, epidermio, ţarnų, kepenų, plaučių, tinklainės ir skeleto raumenų kamieninės ląstelės.Unipotentinės kamieninės ląstelės taip pat yra randamos visuose audiniuose, tačiau jos gali diferencijuotis tik į vieno tipo ląstelę (pavyzdţiui miosatelitinės ląstelės gali diferencijuoti į miocitą). [6]

2 pav. Kamieninių ląstelių klasifikacija pagal lokalizaciją, potenciją bei diferenciacijos kryptį [6]

Ląstelių pavadinimas

Ląstelių rūšis (lokacija) Diferenciacijos potencija

Diferenciacijos kryptis

EKL Morulės stadijos ląstelės Totipotentinės Embriono bei ekstraembrioninių audinių

kamieninės ląstelės

EKL Vidinės ląstelių masės

ląstelės blastocistos stadijoje

Pluripotentinės Visos somatinės ir gemalo ląstelės

EKL Epiblasto ląstelės Pluripotentinės Ektoderma, mezoderma ir endoderma

EKL Ektodermos, mezodermos ir endodermos ląstelės

Pluripotentinės Visos somatinės ląstelės

SKL Specifinio audinio ląstelės Multipotentinės Viena ar keletas ląstelių rūšių priklausomai

nuo audinio (pavyzdţiui hematopoetinės ląstelės)

SKL Vietinės audinių ląstelės Unipotentinės Viena ląstelių rūšis (pavyzdţiui

miosatelitinės raumenų ląstelės)

Kamieninės ląstelės gali būti klasifikuojamos pagal jų kilmę: tai embrioninės kamieninės ląstelės ir audiniui specifinės kamieninės ląstelės (1 lentelė).

1.1.3. Indukuotos pluripotentinės kamieninės ląstelės

Somatinių ląstelių branduolių transplantacija- tai procedūra, kurios metu somatinės ląstelės branduolys yra perkeliamas į ţinduolio oocitą, iš kurio buvo pašalintas branduolys. Šio proceso metu tam tikri oocito faktoriai gali grąţinti somatinį branduolį į nediferencijuotą stadiją ir taip yra gaunamos indukuotos pluripotentinės kamieninės ląstelės. Šios ląstelės turi normalų kariotipą bei telomerazės aktyvumą, taip pat jos ekspresuoja ląstelių paviršinius ţymenis bei genus, būdingus embrioninėms kamieninėms ląstelėms ir geba diferencijuotis į visų trijų pirminių gemalo sluoksnių ląstelių linijas.[7] Po sėkmingo avies Dolly klonavimo, naudojant somatinių ląstelių branduolių transplantaciją, buvo pradėta ieškoti faktorių, kurie galėtų pakeisti somatinės ląstelės branduolį į nediferencijuotą stadiją nenaudojant branduolių transplantacijos. N. Maherali ir kt. atliko tyrimą, kurio metu parodė, kad keturi transkripcijos faktoriai (Oct4, Sox2, c-myc ir Klf4) gebėjo reprogramuoti pelės fibroblastus į nediferencijuotas pluripotentines kamienines ląsteles. [8] Reprogramuotos ţmogaus ląstelės naudojant tam tikrus faktorius leistų sukurti pacientams specifines pluripotentines kamienines ląsteles nenaudojant branduolių transplantacijos, tačiau buvo pastebėta, kad c-Myc geno ekspresija ţmogaus EKL sukelia diferenciaciją ir ţūtį. [9] Yu ir kt. pademonstravo, kad galima somatines ţmogaus ląsteles reprogramuoti su faktoriais Oct4, Sox2, NANOG bei LIN28. [10]

1.2. Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės

1.2.1. Kamieninės ląstelės raumeniniame audinyje

vienintelės kamieninės ląstelės, esančios skersaruoţiame raumenyje, tačiau vėlesnių tyrimų metu buvo įrodytas multipotentinių raumeninės kilmės kamieninių ląstelių (RKKL) egzistavimas. Iš paukščių bei ţinduolių išskirtos RKKL, stimuliuojamos deksametazonu (sintetiniu gliukokortikoidu) gebėjo diferencijuotis į raumeninį, riebalinį, kaulinį bei kremzlinį audinius in vitro. [11]

Gretutinė raumens kamieninių ląstelių populiacija (angl. Muscle side population cells) yra heterogeninė ląstelių populiacija, išskiriama iš griaučių skersaruoţių raumenų naudojant modifikuotą kaulų čiulpų gretutinės populiacijos išgryninimo metodą.[12] Dalis šios populiacijos ląstelių gali diferencijuotis miogenine linkme, o populiacijos heterogeniškumas priklauso nuo jų išskyrimo sąlygų (Hoechst daţo koncentracijos)- maţo heterogeniškumo populiacijoje daugiau nei 90% ląstelių ekspresuoja kamieninių ląstelių antigeną-1 (Sca-1) ir neekspresuoja hematopoetinių ląstelių ţymenų. [13] Moksliniai tyrimai rodo, kad šios ląstelės, suleistos į veną gali įsiterpti į distrofinį raumenį ir prisidėti prie jo regeneracijos, tačiau sėkmingam jų pritaikymui medicinoje reikalingi tolimesni tyrimai. [14]

M. G. Minasi ir kt. 2002 metais iš pelės dorsalinės aortos išskyrė dar vieną miogeninių ląstelių populiaciją- mezangioblastus. Šios ląstelės ekspresuoja endotelinėms ląstelėms bei pericitams būdingus ţymenis ir gali diferencijuotis į daugumą mezodermos audinių. Mokslininkai, tyrę šias ląsteles, iškėlė hipotezę, kad besivystant audiniams, kai juos penetruoja kraujagyslės, su kraujagyslėmis susiję progenitoriai (kurie ko gero kilę iš mezangioblastų, o ne hemo-angioblastų) palieka kraujagysles ir prisitaiko prie to audinio, kurį penetravo kraujagyslė. Tokių progenitorių diferenciacija priklausytų nuo jų aplinkos, o ne nuo pirminės jų funkcijos. [15]

1.2.2. RKKL savybės:

metodą, buvo rasta T-limfocitų, B-limfocitų, granuliocitų bei makrofagų, išsivysčiusių iš RKKL. Šie tyrimai įrodo, kad aplinka, kurioje yra ląstelės, siunčia molekulinius stimulus, kurie inicijuoja įvairius RKKL diferenciacijos kelius. [19]

1.2.3. Miogeninė diferenciacija bei raumenų regeneracija

Pats akivaizdţiausias raumeninės kilmės kamieninių ląstelių terapinis pritaikymas- tai griaučių raumenų regeneracija. Griaučių skersaruoţiai raumenys geba pakankamai gerai regeneruotis: po paţeidimo yra aktyvuojamos miosatelitinės ląstelės ir tada formuojasi nauji miocitai. Raumenų regeneracija prasideda po 24 valandų nuo paţeidimo, o po 3- 5 dienų galima histologiškai aptikti naujai susidariusius miocitus. Esant stipriam raumenų paţeidimui, miosatelitinės ląstelės konkuruoja su fibroblastais, kurie sudaro jungiamąjį audinį, taigi raumuo atsikuria ne visiškai, jame susiformuoja randas. [20] Kamieninės ląstelės, išskirtos iš traumuoto raumens ekspresuoja daug TGF-β3 (transformuojantis augimo faktorius beta 3), kuris palaiko citokinų balansą, reikalingą raumens regeneracijai. Atlikti eksperimentai su pelėmis rodo, kad gydymas RKKL ţenkliai pagerina raumens regeneraciją dėl savo galimybių diferencijuotis į kapiliarus bei nervus raumens paţeidimo vietoje. [16] Dėl šios prieţąsties jos yra pranašesnės negu miosatelitinės ląstelės. RKKL taip pat galėtų padėti gydant Diušeno raumenų distrofiją. Eksperimentai su mdx pelėmis (distrofinio raumens modeliais) rodo, kad po RKKL transplantavimo, yra stebima pagerėjusi raumenų struktūra (atsiranda ląstelės, ekspresuojančios distrofiną). [21]

Eksperimento metu buvo tiriama, kaip skiriasi RKKL, fibroblastų ir šių ląstelių mišinio (50/50) nauda gydant ĮŠN (įtampos šlapimo nelaikymą). Buvo tirta, kaip padidėja šlapimo nutekėjimo slėgio riba gydant šiomis ląstelėmis. ĮŠN modelis buvo sukurtas ţiurkėms chirurgiškai paţeidus sėdmens nervą (lot.

Nervus ischiadicus). Tiriant šlapimo nutekėjimo slėgio ribą po gydymo ląstelėmis buvo pastebėta, kad

visų tipų ląstelės turėjo teigiamą efektą (padidėjo šlapimo nutekėjimo slėgio riba) ir šis efektas priklausė nuo injekuotų ląstelių kiekio. Labiausiai šlapimo nutekėjimo slėgio ribą padidino 1x107

fibroblastų injekcija, kiek maţiau 1x107 _{RKKL injekcija. Izoliuotą šlaplės sfinkterį stimuliuojant elektriniu lauku}

Eksperimentinė ţiurkių grupė buvo padalinta į 3 pogrupius: kontrolė, denervuota + druskos tirpalo injekcija ir denervuota + alogeninė RKKL injekcija (1-1,5x 106_{). Po dviejų savaičių nuo injekcijos, buvo}

paimti šlaplės raumens fragmentai ir atliktas elektrinės stimuliacijos testas. Taip pat buvo tiriamas tubokurarino, fentolamino bei tetrodotoksino farmakologinis efektas stimuliuojant raumens kontrakcijas elektriniu lauku. Šlaplės audiniai taip pat buvo tiriami imunohistochemiškai. RKKL injekcija raumenų kontrakcijos amplitudę padidino nuo 8,77% (druskos tirpalo grupė) iki 87,02% (RKKL grupė) lyginant su normaliu raumens susitraukimu. Imunohistocheminė analizė parodė, kad šlaplėje, injekcijos vietoje, susiformavo didelis kiekis naujų raumens skaidulų. [23]. Taip pat RKKL injekcijų metu galima naudoti lidokainą kaip vietinį anestetiką. Lidokainas yra plačiai vartojamas vietinis anestetikas, tačiau buvo pastebėta, kad jis turi citotoksinių savybių. Tai labai riboja jo pritaikymą ląstelių transplantavimo operacijose, tačiau Dae Kyung Kim ir kt. atliktas tyrimas parodė, kad RKKL ląstelės yra pakankamai atsparios lidokaino citotoksiniam poveikiui: ≥500µM lidokaino koncentracija neturėjo jokio efekto RKKL augimui in vitro. Esant 1mM tirpalo koncentracijai, ląstelių išgyvenamumas sumaţėjo, o esant 5mM koncentracijai visos ląstelės ţuvo. Terapinėmis dozėmis lidokaino vartojimas prieš ĮŠN gydymą RKKL neturėjo neigiamos įtakos gydymo efektyvumui. [24]

Raumeninės kilmės kamieninių ląstelių injekcija į miokardą gali tapti potenciali miokardo infarkto gydymo strategija. Iki šiol ląstelinėje miokardo infarkto terapijoje buvo naudojami mioblastai. Klinikinių tyrimų metu įrodyta, kad po mioblastų injekcijos širdies funkcija reikšmingai pagerėja, tačiau buvo atvejų, kai pacientams pasireiškė ilgalaikės skilvelinės tachikardijos. Taip pat klinikinių tyrimų metu buvo pastebėtos kitos problemos, tokios kaip ribotas injekuotų ląstelių gyvybingumas. [25] Į miokardą (po MI) suleistos RKKL, ekspresuojančios vaskulinį endotelio augimo faktorių (VEGF) turėjo geresnį terapinį efektą negu mioblastai: ląstelės geriau prigijo, buvo stimuliuojama neoangiogenezė, išvengta miokardo persitvarkymo ir galiausiai širdies funkcija reikšmingai pagerėjo. RKKL taip pat yra atsparesnės oksidacinio streso sukeltai apoptozei ir išemijai palyginus su mioblastais- tai gali paaiškinti šių ląstelių geresnį prigyjimą prie audinio- recipiento. [26]

1.2.4. Osteogeninė diferenciacija bei kaulų regeneracija

(rekombinantinis ţmogaus kaulų morfogenetinis proteinas-2). Kaulų formavimasis buvo stebimas radiografiškai ir histologiškai 14-15 dienų po ląstelių injekcijos. Radiografinė analizė parodė, kad po 14 dienų pelių galūnėse pradėjo formuotis ektopinis kaulinis audinys. Histologinė analizė, naudojant LacZ daţymą parodė, kad besiformuojančio kaulinio audinio mineralizuotame matrikse yra mc13 ląstelės tipinėje osteoblastų ir osteocitų vietoje. [17]

2014 metais buvo atliktas tyrimas, norint palyginti raumeninės kilmės kamieninių ląstelių bei kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninų ląstelių (MKL) galimybes regeneruoti kaulinį audinį. Eksperimento metu taip pat buvo tiriamas BMP-2 vaidmuo kaulų regeneracijoje, naudojant kamienines ląsteles. Ląstelės buvo išskirtos iš ţmonių griaučių raumenų bei kaulų čiulpų bioptatų. Naudojant citomegalo virusą, koduojantį BMP-2 geną, buvo gautos RKKL bei MKL populiacijos, ekspresuojančios BMP-2. Pelėms buvo padarytas kaukolės defektas pašalinus 5mm skersmens kaulo dalį. Eksperimento metu buvo tiriama osteogeninė diferenciacija in vitro bei kaulų regeneracija in vivo lyginant MKL ir RKKL prieš transdukciją virusiniu-BMP-2 vektoriumi bei po jos. Visos keturios ląstelių grupės gebėjo diferencijuotis osteogenine linkme in vitro, tačiau ląstelių, ekspresuojančių BMP-2 grupėse (tiek RKKL, tiek MKL) buvo stebima centrinė bei periferinė kaulinio audinio mineralizacija, kai tuo tarpu ląstelių, neekspresuojančių BMP-2 grupėse buvo stebima tik periferinė mineralizacija. In vivo tyrimai su BMP-2 neekspresuojančiomis ląstelėmis neparodė reikšmingo kaulų regeneracijos pagreitėjimo. BMP-2 ekspresuojančių ląstelių transplantacijos vietoje kaulinis audinys pradėjo formuotis po 2 savaičių. Kai kurie defektai sugijo visiškai, tiek MKL, tiek RKKL grupėse. MKL ląstelėų grupėje kaulo sugyjimas buvo 50- 90%, o RKKL 60- 80 procentų, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta. [27]

1.2.5. Chondrogeninė diferenciacija bei kremzlės regeneracija

pirminiams chondrocitams, nes jos turi didesnę atsinaujinimo, proliferacijos potenciją bei didesnį atsparumą mikroaplinkos sukeltam stresui. Eksperimentais įrodyta, kad RKKL, transdukuotos retrovirusu, koduojančiu BMP-4 geną,pagerina kremzlinio audinio regeneraciją in vitro bei in vivo naudojant kremzlės defekto modelį. [30]

Vaskulinis endotelio augimo faktorius (VEGF), ekspresuojamas chondrocitų yra siejamas su kremzlės destrukcija bei artrito pradţia. Eksperimentais įrodyta, kad blokuojant VEGF su sFlt-1 (VEGF receptorių antagonistas) yra sumaţinamas osteoartrito sunkumo laipsnis naudojant peles- osteoartrito modelius. Taip pat vėliau yra bandyta sąnario kremzlės defekto modelius gydyti RKKL, transdukuotų sFlt-1 ir BMP-4 genais, intrakapsuline injekcija. Tokia injekcija reikšmingai pagerino sąnarinės kremzlės atsinaujinimą dėl BMP-4 medijuojamų efektų. Taip pat šis gydymas sukuria geresnę terpę chondrocitams, kurioje nėra inicijuojama jų apoptozė. Terpės pagerėjimą galima aiškinti VEGF vidinio- katabolinio poveikio blokavimu bei vidinės VEAF medijuojamos kraujagyslių invazijos blokavimu. sFlt-1 ir BMP4 transdukuotų RKKL transplantacija- tai potencialus OA gydymo būdas, kuris pagerina regeneruotos kremzlės kokybę bei išsilaikymą. [31], [32]

1.2.6. Neurogeninė diferenciacija bei nervinių ląstelių regeneracija

RKKL, patalpintos į atitinkamą terpę gali diferencijuotis į neuronų prekursorius- neurosferinius klasterius. 2012 metais Yang j ir kt. atliktas tyrimas įrodė, kad RKKL gali diferencijuotis į nervines ląsteles. Iš ţiurkės išskirtos RKKL buvo patalpintos į terpę, pritaikytą neurosferinių klasterių (NSK) auginimui. Kontrolei buvo naudojami pelių mioblastai bei ţiurkių mioblastai. Po 7-10 kultivavimo dienų visos trys ląstelių grupės suformavo panašius į NSK darinius. Norint patikrinti, ar susidariusios ląstelės tikrai yra nervinės kilmės, buvo atliekamas imunofluorescentinis daţymas. RKKL grupėje buvo ryškiai sumaţėję desminui (raumeninėms ląstelėms būdingam antigeną) ekspresuojančių ląstelių (nuo 96,37±0,24% iki 21,07± 2,18%). 84,73±0,50% šių ląstelių pradėjo ekspresuoti NSK- specifinį antigeną nestiną. Kontrolinėse grupėse desmino raiška nesumaţėjo. Norint patvirtinti visišką konversiją iš miogeninių į neurogenines ląsteles, buvo atlikta polimerazės grandininė reakcija (PGR). Ji parodė, kad RKKL grupėje miogeninių faktorių (desmino, Myf5, MyoD ir miogeninio mRNR) ekspresija buvo reikšmingai sumaţėjusi, o tuo tarpu neurogeninių faktorių (nestino, MAP2 mRNR) ekspresija buvo ryškiai padidėjusi. [33]

rūgštis. Tyrimas įrodė, kad retinoinė rūgštis gali gerokai pagreitinti RKKL diferenciaciją neuronų terpėje, tačiau po ilgesnės inkubacijos terpėje su retinoine rūgštimi, diferencijavusių ląstelių kiekis maţėja dėl retinoinės rūgšties citotoksiškumo. Tyrimo metu diferencijuotos ląstelės ekspresavo nervinėms ląstelėms specifinius ţymenis: neuronams-specifinę enolazę, neuronams-specifinį βIII tubuliną, oligodendrocitų markerį, 2„,3„-ciklinio nukleotido 3„-fosfodiesterazę. Ląstelių grupėje, kurių terpėje nebuvo retinoinės rūgšties, šie paviršiniai antigenai nebuvo ekspresuojami. [34]

1.2.7. Diferenciacija į hepatocitus bei kepenų audinio regeneracija

1.3. Klinikiniai tyrimai su RKKL

. 2014 metų Geguţės mėnesį buvo pradėtas klinikinis tyrimas „Intramuskulinė raumeninės kilmės kamieninių ląstelių bei riebalinės kilmės kamieninų ląstelių transplantacija pacientams, sergantiems FSHD distrofija“ (angl. Facioscapulohumeral dystrophy). FSHD arba veido-mentės-ţąsto raumenų distrofija iš pradţių paţeidţia veido raumenis ir gali pasireikšti sutrikusiu akių uţmerkimu. Vėliau vystosi pečių juostos raumenų silpnumas, gali būti ir pilvo bei kojų raumenų silpnumas. Paţeidţiamas priekinis blauzdos raumuo, bet dvilypis blauzdos raumuo išlieka sveikas. Ligos daţnis yra 1-3: 100 000 asmenų per metus. Tai autosominė dominantinė liga, kuri vystosi dėl 4q chromosomos subtelomerinės srities delecijos. Kaip šio geno pakitimas susijęs su raumenų paţeidimu, šiuo metu dar neţinoma. Kreatinkinazės koncentracija būna normali arba tik šiek tiek padidėjus. Specifiniai histologiniai pakitimai raumenų bioptatui nebūdingi. Liga progresuoja įvairiu greičiu, bet daugelio sergančiųjų gyvenimo trukmė yra normali. [41]

Tyrimas vyksta šiuo metu ir I-oji fazė baigsis 2016 metų Lapkričio mėnesį. Šiame tyrime yra tiriama 15 pacientų, sergančių FSHD bei atitinkačių kitus kriterijus (18-50 metų amţiaus, abiejų lyčių, kuriems pasireiškia veido raumenų silpnumas, yra nustatytas FSHD fenotipas, o genetinio FSHD testo rezultatas taip pat teigiamas. Pacientai negali dalyvauti tyrime, jeigu serga širdies, kvėpavimo takų ligomis, vėţinėmis ligomis bei reumatologinėmis ligomis, taip pat jeigu FSHD progresuoja arba pacientas negali pasirašyti sutikimo dėl tyrimo). Visiems pacientams buvo atlikta fizinė apţiūra, laboratoriniai tyrimai, taip pat elektroneuromiografija, ultragarsinis raumenų tyrimas bei magnetinis rezonansas. Raumens bioptatas buvo paimamas iš dvigalvio šlaunies (m. biceps femoralis) raumens ir iš jo buvo išskiriamos RKKL. Riebalinės kilmės kamieninės ląstelės buvo išskiriamos iš Royan riebalinio audinio banko. Pacientams neurologas suleido ląstelių suspensiją į dvigalvį ţąsto (m. biceps brachii), trigalvį ţąsto (m. triceps brachii) bei trapecinį (m. Trapezius) raumenis. Po ląstelių transplantacijos pacientai buvo stebimi 5 valandas ir jeigu per tą laiką nepasireiškė jokios nepageidaujamos reakcijos, buvo išleidţiami namo. Visi pacientai buvo apţiūrimi po 1, 2, 4, 6 ir 12 mėnesių po ląstelių injekcijos. Apţiūros metu buvo stebima, ar pacientams nepasireiškia mialgija, auglių formavimasis, hematoma, raumenų sukietėjimas bei buvo ištirta ir įvertinta kreatinkinazė. [42]

sfinkterio nepakankamumo arba dėl abiejų šių prieţasčių. ĮŠN gydymas vaistais nėra labai veiksmingas- tam tikromis medţiagomis (alfa agonistais, politetrafluoroetilenu, jaučio kolagenu ir kt.) buvo pasiektas trumpalaikis efektas, tačiau po ilgesnio laiko pacientams daţnai pasireiškia komplikacijos. RKKL taikymas audinių inţinerijoje šiuo metu yra plačiai tiriamas. Šių ląstelių pritaikymas gydant ĮŠN turi daug privalumų: jas galima išskirti iš ţmogaus raumenų naudojant minimaliai invazinę procedūrą- paprastą raumens biopsiją; atliekant autologinę transplantaciją yra išvengiama imuninio atsako; po diferenciacijos į miocitus, RKKL yra riboto dauginimosi, todėl sumaţėja šlaplės obstrukcijos rizika; miotubulės bei raumeninės skaidulos, išsivysčiusios iš RKKL, tampa įnervuotomis, dėl to jų funkcija yra ne tik uţpildyti degeneruotą raumeninį audinį, tačiau ir pagerinti jo funkciją. [43], [23].

Pirmasis klinikinis tyrimas Šiaurės Amerikoje, gydant ĮŠN su RKKL vyko Toronto universitete. Aštuoni pacientai buvo gydomi RKKL, kurios buvo išgautos iš šlaunies raumenų bioptatų. Buvo atliekamos 2-4 injekcijos į vidurinę šlaplę ir išorinį šlaplės sfinkterį trans- arba periuretraliniu būdu. Poveikis buvo vertinamas tiriant nutekėjusio šlapimo kiekį bei gyvenimo kokybės apklausą. Būklės pagerėjimai buvo stebimi pacientams, kurių gydymui buvo naudojama 10mm adata, o injekcija, naudojant 8mm adatą buvo neveiksminga. Po 16.5 mėnesių penkiems iš aštuonių pacienų būklė pagerėjo. Vienam iš šių penkių pacientų ĮŠN buvo eradikuota, o dar trims pacientams buvo suleista dar viena RKKL injekcija. Po antros injekcijos buvo pasiektas tolesnis būklės pagerėjimas, tačiau ne visiškas išgyjimas. Būklės pagerėjimas buvo pasiektas po 3-8 mėnesių nuo ląstelių injekcijos. Norint geriau suprasti šlaplės raumenų regeneraciją ţmonėms, naudojant RKKL, reikalingi tolimesni tyrimai. [44]

1.4. RKKL charakterizavimas

Vykstant raumenų vystymuisi, miogenezės pradţioje yra ekspresuojami raumenų reguliaciniai faktoriai (RRF) MyoD ir Myf5. Šie griaučių raumenims specifiniai transkripcijos faktoriai yra miogenezės iniciatoriai, bet terminaliniai raumenų vystymosi koordinatoriai yra miogeninas ir RRF4. [12] Galutinė ląstelių susiformavimo stadija yra identifikuojama morfologiškai stebint ląstelių susiliejimą į multibranduolinius miocitus, kurie ekspresuoja miogeniną, RRF4 ir miozino sunkiąją grandinę (angl.

Myosin Heavy Chain- MYHC). [45]

diferenciacijos bei proliferacijos potencialus, mišinys. Nors toks mišinys yra tinkamas terapiniam pritaikymui, tačiau norint geriau suprasti šias ląsteles, reikalingos ţinios apie RKKL specifiką. Norint charakterizuoti raumeninės kilmės kamienines ląsteles, yra taikomas paviršinių antigenų nustatymo metodas. Yra bandyta sukurti bendrą RKKL paviršinių antigenų profilį tam, kad būtų lengviau ląsteles išgryninti ir identifikuoti. Svarbu yra suţinoti, ar RKKL, išskirtos iš skirtingų rūšių arba raumeninių audinių, gali būti identifikuojamos pagal tą patį imunofenotipą. Deja, skirtingi ląstelių išskyrimo metodai ir visuotinai priimtino ląstelių paviršinių baltymų raiškos profilio stoka, labai apsunkina tiesioginį įvairių ląstelių populiacijų palyginimą. Taip pat, dauguma paviršinių bioţymenų ekspresija gali keistis in vitro dėl skirtingų kultivavimo sąlygų arba ląstelių diferenciacijos. Antroje lentelėje pateikta informacija apie paviršiaus biologinius ţymenis atlikus įvairius tyrimus. Daugiausia tyrimų buvo atlikta su ţmonių ir pelių griaučių skersaruoţių raumenų audiniais, tačiau keletas tyrimų buvo atliktas su kitų gyvūnų raumeniniais audiniais. Šiuo metu nėra apibrėţto standartinio RKKL bioţymens. Patys naujausi tyrimai rodo, kad RKKL ekspresuoja CD13, šiek tiek maţiau CD10, Sca-1 ir CD56, o neekspresuoja hematopoetinių ţymenų, tarp jų ir CD45. Reikalingi tolimesni tyrimai norint įvertinti skirtumus ir panašumus tarp skirtingų ląstelių populiacijų. [46], [47]

Ţymens tipas Paviršinis antigenas Ţmogaus audinys Pelės audinys Teigiamas Flk-1 + + Sca-1 + + CD13 + + CD10 + + CD56 + + CD90 + + CD105 + + Neigiamas CD45 - - CD4 - - CD5 - - Varijuoja c-kit +/- +/- CD34 +/- +/- CD144 +/- +/- Desminas +/- +/- MyoD +/- +/-

1.4.1. Charakterizavimo metodai 1.4.1.1. Tėkmės citometrija

Tėkmės citometrija atsirado norint padidinti morfologinio ląstelių tyrimo efektyvumą , tikslumą bei sumaţinti subjektyvumą. Šiuo metodu galima tirti suspensijos dalelių (ląstelių) dydį, jų paviršiaus bei vidinių struktūrų kompleksiškumą, kiekybiškai įvertinti ląstelių nukleorūgštis, lipidus, jonus, organeles ir kt. Taip pat atsiradus fluorochromais paţymėtiems specifiniams monokloniniams antikūnams, atsirado galimybės ištirti ląstelių paviršinius antigenus bei vidines baltymines struktūras. Norint tirti ląsteles tėkmės citometrijos būdu, pirma jas reikia surikiuoti erdvėje eilute. Tai galima pasiekti hidrodinaminiu suspensijos srauto fokusavimu (efektas, kai į didelio skersmens nešančiojo skysčio srovės vidurį įšvirkščiama dalelių suspensija kreipiama į siaurėjantį piltuvą tol, kol srauto skersmuo pasidaro toks siauras, kad labai pagreitėjusioje srovėje ląstelės pradeda rikiuotis viena paskui kitą) arba akustinio fokusavimo (atliekamas pjezoelektriniu garso generatoriumi, išrikiuojančiu suspensijos daleles,

nepriklausomai nuo skysčio nešėjo srovės skersmens ir greičio) principais. Eilute išrikiuotos ląstelės po vieną praeina pro monochromatinės šviesos lazerį ir jų sąveika su šviesa (šviesos sklaida, fluorochromų šviesos emisija ir kt.) yra verčiama sustiprintais elektriniais signalais, kurie yra apdorojami ir perkeliami į kompiuterio ekraną. Tyrimo rezultatai gali būti pavaizduojami keliomis skirtingomis diagramomis (daţnio histograma, taškinė diagrama, kontūrinė diagrama ir trimatė diagrama). Tėkmės citometrijos metodu galima ištirti nuo 5 iki 18 vienos ląstelės parametrų ir iki 70 000 ląstelių per sekundę. [48]

1.4.1.2. Polimerazės grandininė reakcija

Naudojant šį metodą galima selektyviai bei pakartotinai dauginti tam tikrą DNR fragmentą. Tipinėje PGR procedūroje DNR yra paveikiama restriktazėmis ir taip „sukarpoma“ į maţus segmentus. Šie segmentai yra denatūruojami iki viengubos grandinės ir į analitę yra pridedama specifinių

Atvėsinus mišinį iki pradinės temperatūros (50-60o

C) procesas kartojasi. Kiekvieno ciklo metu norimo padauginti DNR fragmento kopijų padvigubėja. Ląstelių charakterizavimui šitas metodas yra naudojamas patikrinti, ar ląstelės ekspresuoja tam tikrus (pavyzdţiui, kamieninių ląstelių) genus. [49]

1.4.1.3. Imunofluorescensija

Šis metodas yra skirtas ištirti specifinius baltymus, esančius ląstelės paviršiuje arba jos viduje. Imunofluorescencijai yra naudojamas fluorescentinis mikroskopas, specifiniai antikūnai (norimai ištirti struktūrai) bei fluorescentiniai daţai. Medţiaga yra vadinama fluorescentine, jeigu ji geba absorbuoti šviesą, kurios bangos ilgis trumpesnis nei regimosios šviesos (pavyzdţiui, UV spinduliai) ir spinduliuoti specifinio bangos ilgio, esančio regimosios šviesos spektro dalyje, šviesą. Daţniausiai naudojami

fluorescentiniai daţai yra rodaminas, kuris spinduliuoja raudoną šviesą ir fluoresceinas, kuris spinduliuoja ţalią šviesą. Moderniuose fluorescensiniuose mikroskopuose vaizdas yra formuojamas tik iš

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Ląstelių išskyrimas

Pirmiausia buvo paruošiami ląstelių išskyrimui reikalingi tirpalai:

1. Audinių skaidymo (virškinimo) tirpalai: paruošiami 0,2 % XI tipo kolagenazės; 2,4 U/ml dispazės bei 0,1 % tripsino-EDTA tirpalai. Visi tirpalai yra ruošiami kaip tirpiklį naudojant HBSS bei filtruojami pro 0,22 µl sterilų filtrą. Tirpalai patalpinami 10 ml talpos mėgintuvėliuose ir laikomi -20o C temperatūroje. Prieš naudojant juos reikia pašidlyti iki 37 laipsnių Celsijaus temperatūros. 2. Proliferacijos terpė: Visi proliferacijos terpei reikalingi komponentai, išskyrus DMEM, turi būti

laikomi -20o C temperatūroje. Prieš ruošiant terpę, visi komponentai yra atšildomi iki 37o C temperatūros. Ruošiama 500 ml proliferacijos terpės: sumaišoma 395,5 ml DMEM, 50 ml PBS (10 %), 50 ml HS (10%) bei 5 ml P/S (1%) 500 ml talpos sterilaus filtravimo sistemoje. Išsifiltravus beveik visam tirpalui (kai lieka maţdaug 10ml) į filtravimo sistemą įpilama 2,5 ml CEE (0,5%). Proliferacijos terpė turi būti laikoma 4o

C temperatūroje ne ilgiau kaip 4 savaites. 3. Uţšaldymo terpė: 1:10 santykiu skiestas DMSO su FBS arba proliferacijos terpe.

4. Kolageno tirpalas, skirtas padengti flakonams kolagenu. Šis tirpalas ruošiamas tris dienas:

Pirmoji diena: Sterilioje aplinkoje (laminare) į sterilų, uţsukamą, 1 litro talpos butelį įdedama 0,1g I rūšies kolageno. Steriliame matavimo cilindre pamatuojama 5,7 ml ledinės acto rūgšties ir sumaišoma su 1 litru dvigubai distiliuoto vandens. Acto rūgšties ir vandens mišinys filtruojamas pro 500 ml talpos filtrą į butelį, kuriame yra kolagenas. Paliekama per naktį maišant magnetine maišykle.

Antroji diena: Sterilioje aplinkoje (laminare), I-ojo tipo kolagenas supilamas į 50 ml talpos sterilius polistireno centrifugavimo buteliukus ir centrifuguojama 2630 x g 20 minučių 4o _{C temperatūroje.}

Centrifugatas surenkamas į sterilius butelius. Tada, laminare, naudojant sterilų stiklinį piltuvą, į surinktą tirpalą iš lėto pilamas chloroformas (50 ml chloroformo 500 ml tirpalo). Chloroformas suformuoja sluoksnį po kolageno tirpalu.Šios mišinio negalima purtyti ir maišyti.Mišinys paliekamas per naktį (gali būti paliekamas dviems paroms) 2-8o

C temperatūroje.

Trečioji diena: Sterilioje aplinkoje (laminare) viršutinis (vandeninis) mišinio sluoksnis surenkamas į naują sterilų 1 l talpos butelį ir laikomas 2-8o

2.1.1. Flakonų padengimas kolagenu

I-ojo tipo kolageno tirpalas yra pašildomas iki 37oC temperatūros. Tuomet į flakonus yra pridedamas rekomenduojamas (priklauso nuo flakono tūrio) kiekis tirpalo. Reikia atkreipti dėmesį į tai, kad flakono paviršiuje tirpalas būtų pasiskirstęs tolygiai- tą galima pasiekti švelniai vartant flakoną kol tirpalas padengia visą jo paviršių. Flakonus reikėtų palikti atsuktus inkubatoriuje 3-4 valandas (idealiu atveju– 7 valandas), pirmas dvi valandas juos daţnai pavartant. Išėmus flakonus iš inkubatoriaus, pipete nusiurbiamas kolageno tirpalas ir supilamas į butelį, paţymėtą „panaudotas I-ojo tipo kolagenas“. Šį tirpalą bus galima naudoti ateityje padengiant flakonus kolagenu. Padengtus flakonus pirmąją naktį reikia palikti laminare dalinai atsuktus, kad jie gerai išdţiūtų (pirmas dvi valandas įjungus UV lempą). Kitą dieną flakonai yra uţsukami, paţymimi, supakuojami atgal į savo pakuotę ir laikomi kambario temperatūroje. [50]

2.1.2. Griaučių raumenų izoliavimas bei fermentinis skaidymas

1. Sterilizuojami chirurginiai įrankiai. 2. Pelė eutanizuojama CO2 kameroje.

3. Išpjaunami skersaruoţiai raumenys. Naudojant suaugusią pelę, reikalingi uţpakalinių galūnių raumenys gasrocnemius, soleus, quadriceps (350-450 mg raumenų masės). Jeigu naudojama jauna pelė (1- 7 dienų), tuomet imami visi uţpakalinių galūnių raumenys. Išpjauti raumenys patalpinami į 15 ml talpos mėgintuvėlį, uţpildytą HBSS tiek, kad apsemtų raumenis, ir dedama ant ledo.

4. Po vieną, raumenys yra perkeliami į 65 mm Petri lėkštelę ir tris kartus perplaunami naudojant HBSS, kad būtų pašalintos visos atliekos, lurios galėjo prikibti prie raumens disekcijos metu. 5. Sterilioje 35 mm Peri lėkštelėje, naudojant chirurgines ţnyples bei ţirkles, pašalinami nereikalingi

audiniai (kaulai, sausgyslės, nervai, didelės kraujagyslės, riebalai bei jungiamasis audinys).

6. Paimama nauja Petri lėkštelė su 10 ml HBSS ir naudojant labai aštrias ţirkles, raumenys susmulkinami iki vientisos masės.

7. Susmulkinta raumenų masė perkeliama į 15 ml centrifūgavimo mėgintuvėlį naudojant 10 ml pipetę. Centrifuguojama 930 xg 2-8o_{C temperatūroje 5 minutes.}

8. Centrifugatas pašalinamas, raumenų masė resuspenduojama HBSS ir centrifugavimas kartojamas taip, kaip aprašyta 7 ţingsnyje.

10. Pradedamas fermentinio skaidymo procesas: 15 ml centrifugavimo mėgintuvėlyje raumenų masės gumulėlis uţpilamas 10 ml pašildyto 0,2% XI-tipo kolagenazės tirpalu (maţdaug 1 ml 0,1 g raumenų masės). Inkubuojama 37o_{C temperatūroje švelniai pavartant mėgintuvėlį kas 15 minučių.}

Po 1 valandos centrifuguojama 2630 x g 5 minutes.

11. Centrifugatas nupilamas, o raumenų masės gumulėlis resuspenduojamas 10 ml pašildyto dispazės tirpalo (2,4 vienetai/ml). Inkubuojama 37oC temperatūroje 45 minutes. Kas 15 minučių mėgintuvėlis pavartomas. Po 45 minučių centrifuguojama 2630 x g 5 minutes.

12. Centrifugatas nupilamas, o raumenų masė resuspenduojama 0,1% tripsino-EDTA tirpale, praskiestame HBSS. Inkubuojama 37oC temperatūroje 30 minučių. Kas 15 minučių mėgintuvėlis pavartomas. Centrifuguojama 2630 x g 5 minutes.

13. Centrifugatas nupilamas, o raumenų masės gumulėlis resuspenduojamas 10 ml proliferacijos terpės.

14. Resuspenduota raumenų masė filtruojama per 70 µm ląstelių filtrą, kuris patalpintas virš 50 ml talpos sterilio kūginės kolbutės. Filtras perplaunamas proliferacijos terpe, kad būtų surinktos visos ląstelės. [50]

2.1.3. Ląstelių sėjimas

1. Ląstelės iš vieno gyvūno (vieno mėgintuvėlio) sėjamos viename I-ojo tipo kolagenu padengtame flakone (T-25) ir inkubuojamos 37oC temperatūroje, drėgname 5% CO2

inkubatoriuje 2 valandas.

2. Po dviejų valandų inkubacijos, greitai prikimbančios ląstelės (pagrinde fibroblastai) bus prikibę prie kolagenu padengto flakono paviršiaus. Ši ląstelių populiacija paţymima kaip pp1. 3. Terpė, kurioje liko neprikibusios ląstelės perkeliama į naują kolagenu padengtą T-25 flakoną ir

paţymima pp2. Flakonai patalpinami į inkubatorių.

4. Po 18 valandų terpė iš pp2 perkeliama į 15 ml centrifugavimo kolbą ir centrifuguojama 930 x g 4oC temperatūroje 5 minutes. Centrifugatas nupilamas, o ląstelių gumulėlis resuspenduojamas 5 ml proliferacijos terpės. Ši terpė talpinama į naują kolagenu padengtą T-25 flakoną, paţymima pp3, o į pp2 poopuliaciją pridedama 5 ml švieţios terpės. Flakonai graţinami į inkubatorių.

ląstelių prikibimas. Terpė pp2-pp5 populiacijose keičiama kas antrą dieną, o kai pasiekiamas optimalus kiekis ląstelių, jos yra uţšaldomos. Dauguma pp6 populiacijos ląstelių miršta, tačiau išlikusios ląstelės pradeda iš lėto proliferuoti sudarydamos maţas prikibusias kolonijas. Šios gyvos ląstelės yra maţos, apvalios ir refraktyvios. Pp6 populiacijos ląstelės yra vadinamos raumeninės kilmės kamieninėmis ląstelėmis. [50]

2.1.4. Ląstelių kultivavimas

Pašalinama kultivavimo terpė ir ląstelės plaunamos HBSS. Tada į flakoną įpilama pašildyto 0.25% tripsino-EDTA, ištirpdyto HBSS, ir švelniai pabaksnojama į flakono kraštus, kad būtų stimuliuojamas ląstelių atkibimas. Po vienos minutės patikrinama, ar ląstelės atkibo nuo flakono, naudojant mikroskopą. Jeigu ląstelės atkibo, kitas ţingsnis yra inhibuoti tripsino-EDTA kompleksą pridedant proliferacijos terpės (maţdaug 3 ml į 25ml flakoną). Tada ląstelės centrifuguojamos 15 ml talpos mėgintuvėlyje 930xg 5 minutes 4oC temperatūroje. Centrifugatas nupilamas, o ląstelės resuspenduojamos proliferacijos terpėje. Ląstelės suskaičiuojamos ir sęjamos 500-100 ląstelių/cm2

tankiu (~12 000- ~25 000 ląstelių 25 ml talpos flakone) naujame, I-ojo tipo kolagenu padengtame flakone. Ląstelės inkubuojamos 37o_{C temperatūroje drėgname, 5% CO}

2 inkubatoriuje. Ląstelės turėtų būti

laikomos pakankamai maţais tankiais (apie 30% flakono uţpildymo) norint išvengti miogeninės diferenciacijos. Jeigu pastebimos maţos ląstelių kolonijos, RKKL būtina tripsinizuoti neatsiţvelgiant į bendrą ląstelių tankį flakone. Po pasėjimo, RKKL reikia kultivuoti 3-4 savaites prieš jas uţšaldant arba darant eksperimentus. [50]

2.1.5. RKKL persėjimas

Jeigu pp6 kultūroje yra daug didelių, plokščių, panašių į fibroblastus ląstelių, būtina atlikti ląstelių persėjimą. Viskas vykdoma kaip ir ląstelių kultivavimo skyriuje, bet po paskutinio centrifugavimo ląstelių gumulėlis resuspenduojamas proliferacijos terpėje naujame, I-ojo tipo kolagenu padengtame flakone. Inkubatoriuje flakonas paliekamas 20-30 minučių, kad ląstelės prikibtų prie kolagenu padengto paviršiaus. Tada surenkama terpė, kurioje yra neprikibusios ląstelės, ir jos sėjamos į naują kolagenu padengtą flakoną. Ląstelės inkubuojamos 37o_{C temperatūroje, drėgname 5% CO}

2 inkubatoriuje. Persėjimo ţingsnis

2.1.6. RKKL užšaldymas

Pp1-pp5 populiacijos yra uţšaldomos, kai pasiekia 80% pasiskirstymo paviršiuje tankį. Pp6 populiacija gali būti uţšaldoma, kai pasiekiamas reikiamas ląstelių kiekis, palaikant maţą ląstelių tankį (<30%) flakone. Ląstelių gumulėliai, kuriuose yra maţdaug 1 x 105

-3 x 105 ląstelių yra patalpinami į šaldymo terpę (DMSO:FBS santykiu 1:10) ir įdedami į -20o_{C temperatūros šaldiklį, kur yra laikomi 2}

valandas. Ląstelių talpyklės tada įdedamos tarp 2 termoizoliacinių plokščių (pavyzdţiui, polistirolo) ir nugabenamos iki -80oC temperatūros šaldiklio. Norint ląsteles laikyti ilgą laiką, po 3 mėnesių jos turėtų būti patalpinamos į skystą azotą. [50]

2.1.7. Užšaldytų RKKL atšildymas

Iš šaldiklio arba skysto azoto ląstelės yra nugabenamos iki 37o_{C temperatūros vandens vonios ant}

sauso ledo.Atšildymas turi būti atliktas greitai, nes DMSO yra toksiškas ląstelėms. Šaldymo talpyklės turinys yra perkeliamas į 15 ml mėgintuvėlį, kuriame yra 5 ml proliferacijos terpės, tada centrifuguojamas 930 x g 5 minutes 4oC temperatūroje. Cenrifugatas nupilamas, o ląstelės resuspenduojamos maţame proliferacijos terpės tūryje. Dieną po atšildymo reikia pakeisti terpę tam, kad būtų pašalinamos ţuvusios ląstelės. [50]

2.2. Populiacijos dvigubėjimo laiko skaičiavimas

Norint įvertinti RKKL proliferacijos gebą, buvo atliktas ląstelių populiacijos dvigubėjimo laiko tyrimas.Ląstelės buvo pasėtos į šešių šulinėlių lėkšteles 104

ląstelių/cm2 tankiu. Ląstelės buvo skaičiuojamos 6 kartus kas 72 valandas. Populiacijos dvigubėjimo laiko testas buvo atliktas tris kartus. PDL (populiacijos dvigubėjimo laikas) buvo apskaičiuotas naudojantis formulėmis:

PDL=KL/PDS PDN=logN/N0x3.31

PDL- populiacijos dvigubėjimo laikas, KL- kultivavimo laikas tarp ląstelių skaičiavimų, PDS- populiacijos dvigubėjimo skaičius, N- ląstelių skaičius kulivacijos laikotarpio pabaigoje, N0- ląstelių

2.3. Tėkmės citometrija

Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės buvo analizuojamos tėkmės citometrijos metodu nustatant mezenchiminių kamieninių ląstelių bioţymenis CD90 ir CD59, kamieniškumo ţymenį c-kit (CD117), hematopoetiškumo ţymenį CD45 bei endotelinį ţymenį CD34. Analizė buvo vykdoma naudojant su fluorochromu konjuguotus antikūnus: CD34-FE (fikoertrinas), CD45-FITC, CD59-FITC, CD90-FITC ir CD117-biotinas (c-kit). Inkubacijos terpė buvo pagaminta iš 0,5% BSA ištirpinto PBS be kalcio ir magnio. Inkubacijos su antikūnais buvo vykdomos 30 minučių tamsoje, kambario temperatūroje, tada ląstelės buvo praplaunamos inkubacijos terpėje. Atitinkamai paţymėtos izotipinės kontrolės buvo naudojamos nustatant specifinius regionus.

2.4. Imunofluorescensija

Raumeninės kilmės kamieninėse ląstelėse buvo nustatomi bioţymenys CD34, CD45, CD90, c-kit ir desminas imunohistochemijos metodu. Prieš daţymą, ląstelės buvo praplaunamos PBS, fiksuojamos 2 % formaldehido tirpalu 15 minučių ir vėl praplaunamos. Prieš antikūnų inkubaciją, ląstelės buvo blokuojamos su 10 % arklio serumu 1 valandą norint išvengti nespecifinių baltymų tarpusavio sąveikų. Su pirminiais antikūnais ląstelės buvo inkubuojamos per naktį fosfatinio buferio tirpale (PBS), 4o

C temperatūroje. Su antriniu antikūnu ląstelės buvo inkubuotos PBS 1 valandą kambario temperatūroje, po to buvo vykdoma inkubacija su streptavidinu-Cy3 1:400 fosfatinio buferio tirpale 15 minučių (tik CD34, c-kit ir desminui). Tada ląstelės buvo daţomos su 4,6-diiamidino-2-fenilindol dihidrochlorido hidratu (DAPI) 1:10 000 PBS 10 minučių. Po kiekvieno ţingsnio, ląstelės buvo plaunamos PBS. Visos konjugacijos su antikūnais buvo atliktos tamsoje.

2.5. Tirti biožymenys 2.5.1. c-kit

kurių auglių. Tyrimai su pelėmis, pasitelkiant inaktyvuojančias c-kit geno mutacijas arba c-kit ligandą SLF (angl. Steel factor) parodė, kad normalus c-kit glikoproteino funkcionalumas yra būtinas normaliai hematopoezei, melanogenezei, gametogenezei, taip pat putliųjų ląstelių bei intersticinių Cajal ląstelių augimui bei diferenciacijai. [51]

2.5.2. CD59

CD59 yra 18 kDa molekulinio svorio membraninis glikoproteinas, kuris su ląstelių membranomis yra sujungtas glikozil-fosfatidilinozitolio jungtimi. Šis baltymas yra organizme plačiai pasiskirstęs: jį ekspresuoja kraujo ląstelės (eritrocitai bei leukocitai), taip pat kraujagyslių endotelio ląstelės, kasos, tulţies, seilių, bronchų bei inkstų latakų ląstelės. CD59 taip pat buvo aptiktas ir tam tikrose placentos ląstelėse. CD59 baltymo funkcija yra apsauginė- jis riboja komplemento membranų atakos komplekso (MAK) susidarymą. CD59 jungias prie C8 ir C9 susidarant MAK. Prijungtas prie C8, šis proteinas stabdo C9 išsilankstymą, o prijungtas prie C9 jis riboja C9 polimerizaciją taip ribodamas ir MAK susidarymą bei funkcionalumą. Kita CD59 funkcija yra komplemento iššaukto trombocitų sekrecinio atsako reguliavimas. [52]

2.5.3. CD90

CD90 yra gausiai glikozilintas glikozil-fosfatidilinozitolio jungtimi prie ląstelių paviršiaus prisijungęs proteinas, kurio molekulinis svoris yra maţdaug 35 kDa. CD90 yra receptorius, lokalizuotas endotelio ląstelių paviršiuje, priklausantis Ig superšeimai. Jis dalyvauja leukocitų sulaikyme bei tvirtame jų prisitvirtinime prie endotelio. Ţmogaus organizme CD90 yra ekspresuojamas aktyvuotų endotelio ląstelių, fibroblastų, neuronų bei tam tikrų periferinių CD34 teigiamų kamieninių ląstelių. [54]

2.5.4. CD45

dėl aukštos bazinės CD45 ekspresijos limfocituose bei šio proteino gebėjimo defosforilinti tiek inhibuojančius, tiek aktyvacijos kilpos tirozinus Src šeimos kinazėse. [55]

2.6. Ląstelių diferenciacija

Raumeninės kilmės kamieninėms ląstelėms buvo tirta geba diferencijuotis į miogeninės, adipogeninės, chondrogeninės bei osteogeninės linijų ląsteles in vitro.

2.6.1. Miogeninė diferenciacija

Ląstelės (6 x 104_{) buvo pasėtos ant kolagenu padengtas 12-šulinių lėkšteles. Kitą dieną, kai}

ląstelės buvo prikibusios, terpė buvo pakeista į miogeninės diferenciacijos terpę (DMEM, prisotintą gliukozės, kuriame yra 2% FBS bei 1% penicilino/streptomicino). Terpė buvo keičiama tris kartus per savaitę, o eksperimentas tęsėsi dvi savaites. Miogeninė diferenciacija buvo tikrinama su anti- greitos miozino sunkiosios grandinės (angl. fast myosin heavy chain) antikūnais bei desminu, naudojant trigubą imunofluorescentinį daţymą su 4„,6-diamidino-2-fenilindol dihidrochloridu (DAPI) kaip branduolių daţą. [56]

2.6.2. Adipogeninė diferenciacija

Ląstelės (2 x 105_{) buvo sėjamos ant kolagenu padengtos šešių šulinių lėkštelės. Antrąją dieną,}

ląstelėms prikibus, jos buvo patalpinamos į adipogeninės indukcijos terpę 3 dienoms, tada perkeltos į adipogeninę palaikymo terpę, kur buvo laikomos 2 dienas. Neindukuotos ląstelės, kurios visą kultivavimo laiką buvo adipogeninėje palaikymo terpėje, buvo naudojamos kaip kontrolė. Po trijų indukcijos ciklų, ląstelės buvo inkubuojamos adipogeninėje palaikymo terpėje dar 7 dienas. Adipogeninė diferenciacija buvo tikrinama naudojant aliejinį- raudonąjį (angl. oil red o) daţymą. [56]

2.6.3. Oil red o dažymas

sumaišomos su 2 dalimis dejonizuoto vandens ir paliekama kambario temperatūroje 10 minučių. Šis tirpalas stabilus išlieka tik 2 valandas, todėl reikia pasigaminti tokį kiekį, koks bus naudojamas vienam daţymui. Po 10 minučių tirpalas filtruojamas per filtrinį popierių. Pasiruošus daţo tirpalą, nuo ląstelių yra pašalinamas formalinas ir ląstelės praskalaujamos su 2 ml sterilaus vandens.Į kiekvieną šulinį pridedama 2 ml 60% izopropanolio ir paliekama 2- 5 minutėms. Tada nusiurbiamas izopropanolis ir į kiekvieną šulinį pridedama 2 ml daţo tirpalo lėtai sukiojant lėkštelę ir paliekama stovėti 5 minutes. Skalaujama vandeniu, kol išeinantis vanduo bus skaidrus ir bespalvis. Po skalavimo, į kiekvieną šulinį pridedama 2 ml hematoksilino daţo ir paliekama 1 minutę. Tada ląstelės vėl skalaujamos vandeniu, kol išeinantis vanduo bus bespalvis. Ląstelės stebimos per mikroskopą: lipidai turi būti nusidaţę raudonai, o branduoliai- mėlynai. [57]

2.6.4. Chondrogeninė diferenciacija

Ląstelės (2,5 x 105_{) buvo patalpinamos į 15 ml talpos centrifugavimo mėgintuvėlius ir buvo}

centrifuguojamos 800 x g 5 minutes. Tada ląstelės buvo resuspenduojamos bazinėje chondrogeninėje terpėje ir centrifuguojamos dar kartą. Po to ląstelės buvo suspenduojamos pilnoje chondrogeninėje terpėje (bazinė chondrogeninė terpė su 10ng/ml transformuojančio augimo faktoriaus β3) ir centrifuguojamos 500 x g 5 minutes. Ląstelių gumulėliai buvo inkubuojami chondrogeninėje terpėje 21 dieną. Terpė buvo keičiama 3 kartus per savaitę. Chondrogeninė diferenciacija buvo patvirtinta naudojant alciano- mėlynąjį daţymą. [56]

2.6.5. Alciano- mėlynasis dažymas

bespalvis.Po to ląstelės yra dehidratuojamos 95% alkoholiu 2 kartus pakeičiant alkoholį, kiekvieną kartą laikant jį 3 minutes. Tada ląstelės paveikiamos ksilenu arba ksileno pakaitalu ir ląstelės stebimos pro mikroskopą. [58]

2.6.5. Osteogeninė diferenciacija

Osteogeninės diferenciacijos testui ląstelės buvo kultivuojamos gumulėlių pavidalu. 2.5x105 ląstelių patalpinamos į 15 ml talpos mėgintuvėlį, centrifuguojamos ir tada resuspenduojamos osteogeninėje terpėje (gliukozės prisotintas DMEM su 10% FBS, 1% penicilino/streptomicino, 10-2 _M

β-glicerol fosfatu, 50 µg/ml L-askorbo rūgšties-2-fosfatu ir 10-7

M deksametazono). Šioje terpėje ląstelės vėl buvo centrifuguojamos 500 x g 5 minutes. Terpė ląstelėms buvo keičiama 3 kartus per savaitę. Po 4 savaičių gumulėlis buvo patalpinamas į NEG50 šaldymo terpę ir buvo uţšaldytas naudojant skystą azotą. 8-µm mėginiai buvo atpjaunami nuo gumulėlio, 10 minučių fiksuojami 10% neutraliam buferiniame formaline. Mineralizacija buvo nustatoma naudojant von Kossa daţymą. [56]

2.6.5. Von Kossa dažymas

3. REZULTATAI

3.1. Ląstelių išskyrimas ir kultivavimas

Ląstelės buvo išskirinėjamos 3 kartus. Visus tris kartus RKKL buvo sėkmingai išskirtos iš 3 savaičių ţiurkių patinų uţpakalinių galūnių raumenų naudojant prikibimo prie kolagenu padengto paviršiaus metodą (angl. pre plate). Pp6 populiacija buvo išgauta po 5 dienų nuo eksperimento pradţios ir buvo laikoma pirmuoju pasaţu. Dauguma prie kolagenu padengto paviršiaus neprikibusių ląstelių pp6 populiacijoje ţuvo, tačiau išlikusios prikibusios ląstelės pradėjo iš lėto proliferuoti. Šios išlikusios ląstelės buvo maţos apvalios, trikampio arba verpstės formos (4 pav.) . Per 14 dienų pp6 (1 pasaţas) populiacija pasiekė 65- 70% paviršiaus pasiskirstymo tankį. Pasiekus <70% paviršiaus pasiskirstymo tankį, ląstelės buvo persėjamos į kitą flakoną (2 pav. pasaţai 2-6) Ląstelių PDL buvo 43,64 ±3,10 valandų.

4 pav. RKKL morfologija. 1 pasažas- pp6 populiacija, 2 pasažas- populiacija po pirmojo persėjimo, 6 pasažas- populiacija po 5 persėjimo

3.2. Tėkmės citometrija

Atlikus tekmės citometrijos tyrimą, buvo kiekybiškai įvertinta bioţymenų (CD34, CD45, CD59, CD90, c-kit) ekspresija raumeninės kilmės kamieninėse ląstelėse. RKKL gausiai (99,7%) ekspresavo mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms būdingą ţymenį CD90. Membranų atakos komplekso (MAK) inhibicinis proteinas CD59 buvo ekspresuojamas 48%. Ląstelės silpnai ekspresavo (1,17%) kamieninių

ląstelių augimo faktoriaus receptorių c-kit (CD117).RKKL buvo neigiamos (<1%) hematopoetiniam bei endoteliniam ţymenims CD45 ir CD34. Tėkmės citometrijos tyrimo rezultatai pavaizduoti 2 lentelėje.

5 pav. Tėkmės citometrijos metu nustatyta RKKL biožymenų raiška

3.2. Imunofluorescencija

Bioţymuo/ Antikūnas

FITC DAPI FITC+DAPI

CD34

CD45

CD90

c-kit

6 pav. Imunofluorescensija. FITC- prie paviršinių antigenų prisijungęs su fluorochromu konjuguotas antikūnas. DAPI- branduolių dažas.

3.3. Multipotentinė diferencijacija

Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės diferencijacijos testo metu gebėjo diferencijuotis į visas tirtas ląstelių linijas (adipogenezė, chondrogenezė, osteogenezė bei miogenezė). Ląstelės, tiriamos dėl adipogeninės diferenciacijos po 3 indukcijos ciklų per 3 savaites, rodė teigiamą reakciją riebalų lašeliams po aliejinio- raudonojo daţymo (7 pav.). Kontrolinės grupės ląstelės, kultivuotos standartinėje terpėje, nerodė teigiamos reakcijos riebalų lašeliams po aliejinio- raudonojo daţymo. RKKL, kultivuotos chondrogeninėje terpėje 21 dieną, taip pat parodė teigiamus diferenciacijos rezultatus- matriksas buvo teigiamas alciano- mėlynajam daţymui ir lakūnose buvo ląstelių (8 pav.) Kontrolinės grupės ląstelės, kultivuotos standartinėje terpėje, neturėjo alciano- mėlynajam daţymui teigiamo matrikso

bei lakūnų.

Ląstelės, kultivuotos osteogeninės diferenciacijos terpėje 4 savaites, suformavo kaulinio audinio gumbelius, kaip buvo patvirtinta von Kossa daţymu (9 pav.). Ląstelės, kultivuotos standartinėje terpėje,

nesuformavo gumbelio ir buvo neigiamos von Kossa daţymui.

7 pav. Adipogeninė diferenciacija

9 pav. Osteogeninė diferenciacija

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Tyrimo metu buvo išsamiai tiriamos raumeninės kilmės kamieninės ląstelės: jų išskyrimo problemos, proliferacijos greitis, jų charakteristika pagal bioţymenis bei diferenciacijos geba in

vitro. Yra atlikta nemaţai tyrimų, kurių metu buvo tiriama RKKL diferenciacijos geba in vivo,

kurių rezultatai teikia vilčių, kad šios ląstelės dešimtmečio bėgyje bus plačiau taikomos klinikiniams tyrimams įvairioms indikacijoms [27, 30, 31, 47]. Be abejo, norint taikyti ląsteles bet kokiam gydymui, reikia gerai jas charakterizuoti bei standartizuoti. Deja, nėra atlikta daug tyrimų, kuriuose buvo išsamiai charakterizuojamos RKKL, todėl šiuo metu nėra tikslaus, pripaţinto RKKL profilio pagal bioţymenis bei kitas charakteristikas. Norint pritaikyti ląsteles terapijai, taip pat yra būtina turėti standartą, pagal kurį galima būtų palyginti savo tiriamas ląsteles, todėl RKKL (taip pat ir kitų kamieninių ląstelių) charakterizavimo tyrimai šiuo metu yra labai reikalingi.

Šiame tyrime buvo pastebėta, kad RKKL išskyrimas nesukelia ypatingų problemų naudojant M. Lavansi et al publikuotą metodą, pagrįstą ląstelių prikibimo prie kolagenu padengto paviršiaus greičiu. [50] Išgauti „ankstyvąją“ ląstelių populiaciją uţtrunka maţdaug 5 paras , o gauti pakankamą ląstelių kiekį eksperimentams atlikti gali uţtrukti iki kelių savaičių. Lyginant su MSK (grynos populiacijos išgavimas gali uţtrukti iki 3 savaičių) bei riebalinės kilmės kamieninėmis ląstelėmis (gali būti išskiriamos ir išgryninamos per 30 minučių), galima teigti, kad RKKL išskyrimo trukmė bei proliferacijos greitis yra vidutinis. [60, 61] Be to, ţmogaus RKKL išskyrimo procedūra yra minimaliai invazinė bei neskausminga, o MSK ląstelėms išgauti, reikėtų atlikti kaulų čiulpų punkciją (skausminga procedūra).

Ląstelių bioţymenų charakteristika rodo, kad RKKL ekspresuoja mezenchiminėms kamieninėms ląstelėms būdingus ţymenis CD59 bei CD90. Taip pat įrodėme šių ląstelių raumeninę kilmę (ląstelės ekspresuoja raumenims būdingą ţymenį desminą). Kamieniškumo ţymuo c-kit buvo ekspresuojamas silpnai. CD45 ir CD34 ţymenų nebuvimas rodo, kad RKKL nėra hematopoetinės bei endotelinės kilmės. Norint sukurti RKKL bioţymenų profilį, reikia atlikti daugiau charakterizavimo tyrimų ir galiausiai sukurti standartą, pagal kurį gali būti lyginamos tiriamos RKKL.

5. IŠVADOS

1. RKKL, išskirtos iš 3 sav. amţiaus Wistar veislės ţiurkės patino yra maţos, apvalios, trikampio arba verpstės formos, gebančios proliferuoti.

2. RKKL ekspresuoja mezenchiminių ląstelių bioţymenis CD90 ir CD59, kamieninių ląstelių bioţymenį c-kit, raumenims specifinį ţymenį desminą, neekspresuoja hematopoetinėms bei endotelinėms ląstelėms būdingų ţymenų CD45 ir CD34.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Bradley JA, Bolton EM, Pedersen RA Stem Cell Medicine Encounters the Immune System, Nature reviews, Immunology, vol. 2, 2002

2. Mimeault M, R. Hauke, S.K. Batra: Stem Cells: A Revolution in Therapeutics- Recent Advances in Stem Cell Biology and Their Therapeutic Applications in Regenerative Medicine and Cancer Therapies (2007), Clinical pharmacology and therapeutics, vol. 82, no. 3

3. Bongso A, Lee EH Stem cells: Their Definition, Classification and Sources In: STEM CELLS- From Bench to Bedside. (2005) World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. P. 1-13

4. Hui H, Tang Y, Hu M, Zhao X. Stem Cells: General Features and Characteristics. In: Gholamrezanezhad A, editor. Stem Cells in Clinic and Research. InTech; 2011

5. Sadler TW Langman„s medical embryology 12th ed. (2012) p. 37-40

6. A Concise Review on the Classification and Nomenclature of Stem Cells. Turkish J Hematol. 2008;25(2):57–9.

7. Willmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH: Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells, Nature (1997); 385(6619):840-3

8. Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadfeld M, Yachechko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K: Directly Reprogrammed Fibroblasts Show Global

Epigenetic Remodeling and Widespread Tissue Contribution, Cell Stem Cell 1, 55-70, 2007

9. Sumi T, Tsuneyoshi N, Nakatsuji N, Suemori H: Apoptosis and differentiation of human

embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc, Oncogene, 2007, 16;26(38):5564-76

10. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA: Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells, SCIENCE vol.318, 2007

11. Jankowski RJ, Deasy BM, Huard J Muscle- derived stem cells, Gene Therapy (2002) 9, 642-647