I
INDICE
RIASSUNTO III
1. INTRODUZIONE 1
1.1 Tumori cerebrali: il glioblastoma multiforme 2
1.2 Invasività e metastasi 5
1.3 Le metalloproteasi di matrice 6
1.3.1 La metalloproteasi di matrice 2 10
1.4 Inibitori di sintesi delle metalloproteasi di matrice 11
1.5 Terapie attuali del glioblastoma multiforme 12
1.6 Temozolomide: agente alchilante del DNA 13
1.7 Scopo della tesi 16
2. MATERIALI E METODI 17
2.1 Sostanze 18
2.2 Condizioni di coltura cellulare 19
2.2.1 Procedura di scongelamento delle U87MG 19
2.2.2 Procedura di congelamento delle U87MG 20
2.3 Saggio di vitalità cellulare: MTS assay 21
2.4 Saggio di invasività su matrigel 22
2.4.1 Preparazione dei filtri di gelatina 23
2.4.2 Preparazione del matrigel 24
2.4.3 Conta delle cellule per il calcolo dell’indice di invasività 24
2.4.4 Invasività su matrigel delle cellule U87MG trattate con i composti in esame 25 2.5 Trattamenti delle U87MG a lungo termine 26
2.5.1 Semina e trattamenti a lungo termine con la Temozolomide 26
2.5.2 Conta cellulare: Trypan Blue exclusion assay 27
2.6 Cotrattamenti sulle cellule U87MG con Temozolomide e CC27 28
2.6.1 Vitalità cellulare 28
2.6.2 Invasività cellulare 29
II
2.7 Analisi dei dati 30
3. RISULTATI 31
3.1 Effetti degli MMPI sulla vitalità 32
3.2 Effetti degli MMPI sull’invasività 34
3.3 Messa a punto dei trattamenti a lungo termine: curve di crescita 36
3.4 Effetti della Temozolomide sulla vitalità cellulare 37
3.5 Cotrattamenti con TMZ e CC27 su cellule U87MG 39
3.5.1 Effetti sulla vitalità cellulare 39
3.5.2 Effetti sull’invasività cellulare 41
4. DISCUSSIONE 43
5. BIBLIOGRAFIA 48
III
Riassunto
Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore più comune e più maligno tra le neoplasie a carico delle cellule della glia. E’ costituito infatti da cellule tumorali di tipo astrocitario che crescono e si dividono senza una normale regolazione. I trattamenti attuali sono, oltre alla chirurgia nei casi possibili, la radioterapia e la chemioterapia, normalmente effettuate dopo l’intervento chirurgico per danneggiare il DNA di eventuali cellule tumorali rimaste e indirizzarle all’apoptosi. Purtroppo la maggior parte dei glioblastomi presenta recidive, probabilmente dovute alla marcata invasività del tumore stesso. L’invasività si basa sulla degradazione della membrana basale, condotta da enzimi quali le metalloproteasi di matrice (MMPs), endopeptidasi contenenti Zinco.
Alcune MMPs sono state associate alla progressione del tumore, poichè promuovono la crescita, attuano la degradazione della matrice, contrastano l’apoptosi e favoriscono l’angiogenesi. Altre MMPs invece presentano effetti che contrastano lo sviluppo del tumore. Ecco perché l’impiego di inibitori di MMPs ad ampio spettro può provocare anche l’inibizione degli effetti benefici antitumorali e causare la comparsa di effetti collaterali, tra cui la nota sindrome muscolo-scheletrica, a carico dei tendini. Tra le varie MMPs la metalloproteasi di matrice-2 (MMP-2) è di primaria importanza in vari tipi di tumori. Numerosi studi hanno confermato che l’aumento della sua espressione è correlabile alla progressione e al grado di malignità del tumore, grazie all’abilità nel degradare vari substrati, tra cui il collagene di tipo IV. Sarà di primaria importanza lo sviluppo di composti capaci di inibire selettivamente la MMP-2 senza interagire con altre metalloproteasi, utili nell’inibizione della crescita tumorale.
Al momento la terapia contro il glioblastoma multiforme comprende l’uso di un agente alchilante del DNA, la temozolomide (TMZ), che è capace di aumentare di qualche mese la sopravvivenza dei pazienti, se associata a radioterapia. Inibisce la crescita tumorale in modo concentrazione-dipendente, anche se alcuni tumori inizialmente responsivi alla terapia, sviluppano in seguito chemioresistenza. Recenti trials clinici propongono la terapia combinata: un esempio è la combinazione di TMZ con marimastat, un inibitore delle MMPs ad ampio spettro.
Il mio lavoro di tesi, condotto presso il laboratorio di Biochimica della Facoltà di Farmacia dell’Università di Pisa, ha avuto come scopo la valutazione dell’attività di due inibitori selettivi di MMP-2, appartenenti alla classe degli N-O-isopropil sulfonamide idrossammati, in relazione all’invasività e alla vitalità cellulare, in cellule di glioma
IV umano U87MG. I composti sono stati utilizzati a concentrazione nanomolare (selettività per la MMP-2) per il trattamento delle cellule. L’invasività è stata valutata utilizzando il saggio di invasività su matrigel (membrana basale ricostuita), mentre la vitalità con il saggio di vitalità cellulare MTS assay e la conta cellulare con il colorante trypan blue . I risultati hanno dimostrato che questi composti sono potenti inibitori dell’invasività (p<0.0001), e non hanno effetto sulla vitalità cellulare. In un secondo momento è stata valutata l’azione combinata della temozolomide con l’inibitore selettivo di MMP-2 CC27, sia su invasività che vitalità cellulare. I risultati dei trattamenti combinati hanno evidenziato un blocco sia di invasività che di vitalità cellulare.
Questi risultati mostrano che gli studi volti ad individuare una terapia combinata con inibitori selettivi di MMPs e agenti alchilanti (temozolomide) possono aiutare nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro il glioblastoma multiforme.
