2 MATERIALI: 2.1 Costrutti plasmidici

2 MATERIALI:

Questo costrutto plasmidico è stato ottenuto dalla fusione della sequenza codificante del gene Xbh1 nel plasmide pCS2.

Possiede un promotore forte di origine virale (CMV), e, come molti plasmidi normalmente utilizzati in biologia molecolare, siti di attacco per i primers T7 e SP6, una regione polylinker con siti di taglio per diversi enzimi di restrizione tra cui HindIII, una origine di replicazione per E.coli, e il gene per la resistenza all’ampicillina.

Fig. 2.1 - Mappa del costrutto pCS2-Xbh1. Vedi testo.

I siti di taglio per l’enzima Hind III possono essere usati per una digestione diagnostica per verificare preliminarmente che il plasmide sia quello giusto; in questo caso si distacca un frammento di 774 bp. Ovviamente questa è una verifica meno accurata di un sequenziamento.

pCS2 Xbh1doppio mutante

Il costrutto doppio mutante ha le stesse caratteristiche del wild type da cui differisce per due mutazioni che modificano le lisine (K) dei due siti canonici in arginine (R): mutazioni K→ R148, 161.

pCS2 Xbh1-wt-HA

L’unica differenza dei costrutti con epitopo è che al 5’ della coding region di Xbh1 è presente in frame una sequenza che codifica per tre ripetizioni dell’epitopo HA. pCS2 LacZ

Questo costrutto è stato usato in Andreazzoli et al 2003

2.2 Embrioni di Xenopus laevis

I vantaggi nell’uso di Xenopus laevis come sistema modello risiedono nel gran numero di uova che una femmina può deporre in una sola volta, nelle dimensioni delle uova ( 1mm di diametro), nella velocità di sviluppo, in tre giorni si passa da un uovo fecondato ad un girino, e perché gli embrioni per gli esperimenti sono ottenuti mediante fecondazione in vitro.

Prima di essere operato per la rimozione dei testicoli, il maschio è stato anestetizzato immergendolo in una soluzione 0.1% di MSS (metansulfonato dell’estere etilico dell’acido 3-amminobenzoico) disposta in ghiaccio per abbassare rapidamente il metabolismo dell’animale. I testicoli si possono conservare per 3-5 giorni a 4°C immersi nella soluzione per testicoli. Dopo l’operazione il maschio viene sacrificato. Lo stoccaggio avviene secondo la vigente normativa veterinaria.

Le femmine di Xenopus laevis sono state pre-stimolate con 1000 UI di Profasi HP 5000 Serono (gonadotropina corionica) 10-12 h prima della deposizione: l’ormone è stato somministrato mediante iniezione nel sacco perilinfatico.

Le uova da fecondare sono state ottenute esercitando una leggera pressione sull’addome degli animali e raccolte in piastre Petri: questa

operazione può essere ripetuta a intervalli di 2-3 ore. La fecondazione è stata effettuata bagnando le uova con una sospensione ottenuta sminuzzando un frammento di testicolo in MMR 0,1X e lasciandole in poco MMR 0,1X. Dopo almeno 30 minuti o quando comunque fosse ben rilevabile la

rotazione corticale degli embrioni, effetto dell’avvenuta fecondazione, gli embrioni sono stati privati del loro rivestimento gelatinoso ricoprendoli di

soluzione degelificante e lasciandoveli 5-10 minuti e comunque fino a che non fosse evidente la perdita del suddetto rivestimento. La soluzione degelificante è stata rimossa lavando gli embrioni in MMR 0,1x.

Gli embrioni vengono fatti sviluppare in MMR 0.1x fino allo stadio

1967) Gli embrioni sono stati di norma fissati in MEMFA 1h a RT o ON a 4°C e conservati in metanolo 100% a -20°C.

2.3 Soluzioni per la fecondazione, la crescita e l’iniezione di embrioni MMR NaCl 0.1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES 5 mM pH 7.8 EDTA 0.1 mM Soluzione degelificante DTT 3.2 mM Tris-HCl 0.2 M pH 8,8 Soluzione per il testicolo MMR 1x

Siero di agnello inattivato al calore 10% Gentamicina 20µg/ml

Soluzione per l’iniezione di embrioni MMR 1x Ficoll 3% MEMFA MOPS 0.1 M pH 7.4 EGTA 2 mM MgSO4 1 mM Formaldeide 3.7%

Generalmente si preparano “stocks” sterili di una soluzione 10x dei Sali (MEM) che viene diluita e addizionata di formaldeide al momento dell’uso. Soluzione di ferri

K3Fe(CN)6 30 mM

K4Fe(CN)6.3H2O 30 mM PBS 1x

Stock Salmon-gal

2.4 Soluzioni per gli esperimenti whole mount ( ISH e TUNEL) PBS NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2PO4.16H2O 1.44 g KH2PO4 0.24 g pH 7.4 TBS NaCl 8 g KCl 0.2g Tris base 3 g pH 7.4 SSC 20x NaCl 3.0 M Na citrato 0.3 M MAB Acido maleico 0.1 M NaCl 0,15 M pH7,5 con NaOH MABT MAB 1x Tween0.1% PBTw 0.1% PBS 1x Tween 20 0.1% TBSx TBS 1x Triton X-100 0.1% Paraformaldeide 20%

· Sciogliere 5 g di paraformaldeide in 100 ml H2O RF a 60°C · Chiarificare con 10 µl NaOH 10 N, portare a volume e filtrare. · Conservare a -20°C. Una volta scongelata usare entro un mese. Tampone di ibridazione

SSC 5x

RNA di torula 1 mg/ml Eparina 100 µg/ml

Roche Bocking reagent 1 % Tween 20 0.1 %

CHAPS 0.1 % EDTA 10 mM

Soluzione stock di Proteinasi K 20µg/µl “Egg extract”

· Omogeneizzare embrioni conservati a -20°C in 1 volume di PBS 1x · Centrifugare 10’ a 4°C a 12000 rpm, recuperare la fase acquosa. · Centrifugare 5x10’ a 4°C a 12000 rpm recuperando la fase acquosa. · Denaturare a 56°C per 15’, centrifugare per 10’ a 12000 rpm a 4°C. · Aliquotare e conservare a -20°C.

“Blocking buffer” per ISH TBSx 1.6 ml

Siero di agnello ( lamb serum) inattivato al calore 300 µl Egg extract 100 µl

Roche blocking reagent 400 µl. Blocking buffer per Tunel MABT 1.5 ml

Siero di agnello ( lamb serum) inattivato al calore 500 µl Roche blocking reagent 500 µl

AP-Buffer (“Alcaline phosphatase buffer”) Tris HCl pH 9.5 100 mM MgCl2 50 mM NaCl 100 mM Tween 20 0.1 % Tetramisole 2 mM “Bleaching solution” H2O2 3-4 % SSC 0.5x Formammide 5