FA C O L T À D I SC I E N Z E MA T E M A T I C H E, FI S I C H E E NA T U R A L I
Corso di Laurea Magistrale in
BIOLOGIA APPLICATAALLA BIOMEDICINA
Valutazione della permeabilità di membrana plasmatica
pe
r cellule HeL
a dopo irradiamento con laser terahertz.
Tesi di Laurea di Luca Matteo Barbieri
Relatore:
Dott. Gian Michele Ratto
Correlatori:
Dott.ssa Garcìa Gil Maria De Las Mercedes Prof. Mario Pellegrino
“I do not know what I may appear to the world, but to myself I seem to have been only like a boy playing on the seashore, and diverting myself in now and then finding a smoother pebble or a prettier shell than ordinary, whilst the great ocean of truth lay all undiscovered before me.”
Isaac Newton
“I have approximate answers and possible beliefs and different degrees of uncertainty about different things, but I am not absolutely sure of anything”
Riassunto
Le interazioni delle radiazioni elettromagnetiche therahertz con la materia biologica rimangono ancora oggi un ambito poco esplorato. L'uso di queste frequenze si è per ora affermato solo in alcuni settori, ad esempio nel controllo della qualità di prodotti industriali, in dispositivi per la sicurezza aeroportuale e nell'astronomia con telescopi relegati a siti estremamente secchi come il Continente Antartico poiché il vapore acqueo atmosferico impedisce alla maggior parte della radiazione Thz naturale proveniente dallo spazio di pervenire sulla superficie terreste. Dunque le prime applicazioni delle radiazioni THz di origine antropica in ambiti pubblici ed il possibile sviluppo di nuove tecnologie biomediche, le quali si avvalgano di tali frequenze elettromagnetiche, suscitano interesse precauzionale verso la valutazione di rischio per la salute, nonostante si possono già considerare frequenze alquanto sicure poiché non ionizzanti.
In quest'ottica e sulla base di precedenti lavori si è concretizzato l'oggetto di studio sperimentale della presente tesi di laurea: la valutazione della permeabilità di membrana successiva all'esposizione a radiazione THz per cellule della linea tumorale immortalizzata umana HeLa, considerata uno standard per la ricerca.
Le cellule sono state caricate con fluoroforo calceina-AM, estere dell'acetossimetilcalceina: esso ha avuto la funzione, assodata da numerosi altri studi, di indicatore della permeabilità cellulare. Sono state effettuate misurazioni della fluorescenza intracellulare prima e dopo l'esposizione al laser THz. È quindi stato possibile valutare gli effetti di permeabilizzazione in base alla diminuzione di fluorescenza per le cellule trattate rispetto alle cellule di controllo non irradiate. Al fine di aumentare la potenza dell'analisi statistica è stata creata ad hoc una maschera di alluminio, interposta fra il campione ed obbiettivi, grazie alla quale è stato possibile individuare le medesime cellule prima e dopo il trattamento. Onde evitare l'estrusione attiva di calceina da parte delle multidrug resistance proteins, le cellule sono tutte state trattate con sulfinpirazone, molecola nota per la sua capacità di inibire queste proteine trasportatrici.
Per le acquisizioni immagine multistrato è stato utilizzato un microscopio confocale Leica SP2. Da tali acquisizioni è stato possibile quantificare la fluorescenza nelle varie fasi degli esperimenti sfruttando il software open source ImageJ.
Per l'irraggiamento THz il presente studio si è avvalso della innovativa tecnologia laser a cascata quantica creata dal gruppo di lavoro di Alessandro Tredicucci presso il centro di ricerca per le nanotecnologie NEST, National Enterprise for nanoScience and nanoTechnology, di Pisa. Utilizzando tale strumento è stato possibile irradiare cellule con un preciso controllo dei parametri fisici della radiazione applicata.
Abstract
Currently the interaction of terahertz electromagnetic radiation with biological matter still remains a scarcely explored field. The use of such frequencies is established only in some sectors, as in quality control for industrial products, in airports security scanning devices and in astronomical research with radio telescopes confined to extremely dry locations as Antarctica, because atmospheric water vapor blocks most of the THz radiation from space. Therefore the first applications of antropic terahertz radiation in public areas (and the likely development of biomedical application of these frequencies) cause interest in risk assessment for health issues, even if millimetric radiation can be generally considered safe since not ionizing.
In this context, and in light of previous researches, takes shape the experimental focus of the present thesis: the evaluation of cytoplasmic membrane permeability after exposure to a terahertz laser for HeLa cells, a line considered a gold standard for research.
The cells have been loaded with with calceine-AM, calcein acetoxy-methyl ester: this had the well established function, as demonstrated by numerous other studies, of indicating cell permeability. Measures of fluorescence have been conducted before and after the exposure to terahertz laser. Hence it has been possible to evaluate the permeabilization effects by means of comparing fluorescence reduction measured in treated cells with the physiological reduction observed in the untreated controls. In order to increase the statistical power of our observations an aluminum mask has been carved allowing the identification of the same cells before and after the treatment. To avoid active extrusion of calcein by multidrug resistance proteins, all cells have been treated with sulfinpyrazone, a molecule known for it's capability of blocking such transporter proteins.
To acquire images a Leica SP2 confocal microscope has been utilized. From these acquisitionsit has been possible to quantify fluorescence in the various phases of the experiments adopting the open source software ImageJ.
For Thz irradiation the present study utilized the innovating quantum cascade laser technology created by the research group of Alessandro Tredicucci, in the NEST, National Enterprise for nanoScience and nanoTechnology, of Pisa. Thanks to this instrument it has been possible to irradiate the cell with precise control of the physical parameters of the applied electromagnetic beam.
Indice generale
Introduzione...1
I. Scopo dello studio...11
II. Materiali e metodi...13
Tecniche di coltura: terreni, piastre e linee cellulari...13
Semina delle cellule nelle piastre da esperimento...14
Caricamento del fluoroforo e dell'inibitore delle MDR...15
Lavaggi...18
Microscopia confocale...18
Maschera di alluminio...18
Prima acquisizione immagini...20
Sorgente di radiazioni terahertz...20
Irraggiamento delle cellule...21
Seconda acquisizione immagini...21
Software per l'elaborazione e l'analisi delle immagini...21
Elaborazione software delle immagini...21
Controlli...24
III. Risultati...27
IV. Discussione...33
Bibliografia...35
I n t r o d u z i o n e .
La radiazione solare è la principale fonte di energia per la vita, scaldando la superficie del pianeta ed alimentando la fotosintesi. La sua componente visibile ha interessato l'uomo sin dagli albori della cultura poiché caratterizza il fuoco e soprattutto in quanto ci fornisce un canale fondamentale di informazioni su ciò che ci circonda. Aristotele, Democrito, Leonardo da Vinci, Alhazen in epoca prescientifica hanno investigato la sua natura. Personalità come Galileo Galilei, Sir Isaac Newton ed Albert Einstein devono alla luce proveniente dagli astri molte delle loro fondamentali dimostrazioni che hanno rivoluzionato il sapere scientifico e la concezione del mondo. Nelle stesse epoche, volgendo lo sguardo al mondo microscopico, le scienze biologiche e mediche hanno ricevuto un impulso eccezionale dalla scoperta delle cellule e dei microorganismi.
Telescopi ed microscopi si sono evoluti assieme poiché condividono materiali e principi di funzionamento, tuttavia furono due esperimenti condotti in scala macroscopica a svelare l'esistenza dell'ampio spettro elettromagnetico oltre il visibile. L'11 febbraio 1800 Frederick William Herschel, musicista ed astronomo scopritore di Urano, rilevò l'esistenza dei raggi infrarossi ponendo termometri oltre la posizione del rosso nella luce solare diffratta da un prisma[1]. Similmente l'anno successivo Johann
Wilhelm Ritter, uno dei padri dell'elettrochimica, dimostrò la presenza di raggi invisibili posizionati oltre il violetto i quali avevano la capacità di indurre modificazioni chimiche nel cloruro d'argento e dunque e li battezzò “raggi chimici”, termini non molto distanti dall'attuale definizione di “raggi ionizzanti” utilizzata per i raggi ultravioletti.
Oggi lo spettro elettromagnetico è ritenuto continuo, ma per convenzione esso viene suddiviso in parti in base alla lunghezza d'onda della radiazione ed è generalmente rappresentato dalle onde γ sino alle onde radio molto lunghe (Figura 1).
Il primo interesse ed uso pratico delle radiazioni terahertz (1012 Hz), nel secolo
scorso, era rivolto all'osservazione degli eventi celesti, costituendo quella parte della radiazione del corpo nero indispensabile alla rilevazione e caratterizzazione di molti oggetti astronomici. Le radiazioni millimetriche, presenti negli strati alti dell'atmosfera e parte delle radiazioni provenienti dallo spazio, non sono presenti in quantità significative nella biosfera a causa del loro assorbimento da parte dell'acqua, sia liquida che sotto forma di vapore o cristalli di ghiaccio nell'aria[2] (Figura 2).
I primi usi delle radiazioni terahertz per creare immagini in questo campo risalgono agli anni '60, mentre il primo uso di tali radiazioni per tecniche di imaging non astronomico risalgono al 1975. Già allora gli autori di questa tecnologia, nell'atto di conferenza dove la annunciarono, suggerirono il potenziale sviluppo negli anni susseguenti di queste tecniche per scopi industriali, militari, di sicurezza e per applicazioni biomediche[2].
Figura 1: Diagramma rappresentante lo spettro elettromagnetico con evidenziate le caratteristiche fisiche della radiazione terahertz.
Figura 2: Rappresentazione dell'assorbimento atmosferico e di usi comuni per le radiazioni elettromagnetiche. In alto a sinistra è presente il simbolo di pericolo per le radiazioni ionizzanti, a destra per le onde radio.
Nell'arco dei successivi 40 anni tale previsione si è sostanzialmente avverata, e le onde millimetriche sono divenute di interesse per le scienze biologiche e biomediche in virtù del particolare spettro di assorbimento dell'acqua, di proteine, di acidi nucleici, di zuccheri, di grassi e di altre biomolecole. Lo sviluppo delle conoscenze ha portato all'invenzione di nuove tecnologie che rendono possibile emettere e captare facilmente le onde terahertz con maggiore precisione rispetto a quanto non fosse possibile sino a poco tempo addietro[3]; in sintesi, molte nuove tecnologie applicate a questa parte dello spettro
elettromagnetico favoriscono la realizzazione di dispositivi di bioimaging diagnostico non invasivi in grado di mettere in risalto variazioni di composizione dei tessuti difficilmente o del tutto invisibili con altre tecniche.
Sono stati condotti numerosi studi mirati all'identificazione diagnostica di variazioni istologiche di tessuti umani, con particolare riguardo ai tumori[4,5,6]. Tra questi una grande
porzione degli studi diagnostici si sono rivolti verso l'identificazione di tumori al seno[7,8,9,10,11,12], della pelle[13,14,15,16,17,18,4,19,20], epatocellulari[21,22], ma anche gliomi[23], del
tratto digerente[24,25,26], ed epiteliari in genere[27]. Il principio comune a molte di tali
metodiche si trova nel riconoscimento dell'alterazione del liquido interstiziale ad alto contenuto di acqua che caratterizza sovente le neoplasie, ma anche nel riconoscimento del differente contenuto di proteine e di acqua nelle cellule affette. In entrambi i casi si tratta di elementi con buoni assorbimenti e specifici profili spettrografici nel range di radiazioni THz[28,29].
L'uso diagnostico per il cancro può inoltre avvalersi di nanoparticelle d'oro grazie ad una tecnica chiamata nanoparticle-contrast-agent-enabled terahertz imaging (CATHI)[30].
Anche il riconoscimento e la quantificazione di molte specie chimiche nel fumo di sigaretta è stato sperimentato con la spettroscopia THz[31].
Lesioni al miocardio[22] sono state oggetto di indagine. I disturbi cardiaci sono molto
diffusi, hanno enormi costi sociosanitari, anche in termini di decessi e complicanze secondarie, e sono ben caratterizzati e meno eterogenei del cancro. Tale variabilità delle neoplasie, inerente la crescita di tumori e la diffusione delle metastasi rendono utilissime tecniche che possano individuare e descrivere lo sviluppo individuale della malattia. Quindi è comprensibile come la ricerca nel campo dell'imaging biomedico THz si sia incentrata sulle neoplasie.
Alcuni studi si sono incentrati sulla visualizzazione di tessuti ossei[32,33], in particolare
a scopi dentistici[34,35]. Quest'ultimo è un settore promettente per le tecnologie di imaging
THz poiché ha un ampio bacino d'utenza, tuttavia le tecniche di diagnostica per immagini basate sui raggi X sono molto evolute, consentono altissima risoluzione ed allo stato dell'arte utilizzano poche radiazioni, quindi rimangono la tecnologia più promettente per l'imaging in questa branca della medicina[36].
Uno primo studio nel quale è stato sperimentato l'uso della radiazione THz in vivo sulla pelle umana per la sua caratterizzazione è stato pubblicato nel 2004[37], e già nel
commercialmente disponibile appositamente realizzato per indagare la composizione della pelle umana in vivo[38] (Figura 3). Intense pulsazioni THz hanno depresso geni
associati con il cancro della pelle e la psoriasi, suggerendo la possibilità di usi terapeutici di tali procedure[39]. Alcuni lavori hanno evidenziato la caratteristica dei dotti sudoripari
umani di agire come antenne in grado di captare le radiazioni THz in virtù della loro forma a spirale e della loro dimensioni di ordine di grandezza millimetrico[40,41], facendo
supporre che le onde terahertz possano essere utilizzate per determinare lo stato mentale di una persona da distanza come già proposto per frequenze di 90 GHz[42], in pratica
evidenziando alterazioni importanti della sudorazione.
In ambito biomedico l'uso spettrografico analitico delle radiazioni THz è stato studiato per la caratterizzazione del sangue[43,44,45,46].
È stato proposto l'uso di onde THz come strumento di ablazione chirurgica microinvasiva, ricalcando i principi che hanno portato ad una tecnica la quale sfrutta le radiazioni infrarosse per la rimozione dell'endometrio[47].
Esperimenti su modelli animali sono stati condotti per affinare tecnologie di imaging e spettroscopia basate su frequenze THz e per studiare gli effetti biologici delle radiazioni. La pelle di topi irraggiata con pulsazioni molto intense per durate di femtosecondi ha mostrato una importante reazione da danno, i cui dettagli hanno portato i realizzatori della sperimentazione alla conclusione che l'effetto probabilmente dipenda dell'attivazione della via di segnalazione TGF-β[48]. Irradiando la pelle d'orecchio di topo
in vivo con radiazione a 2.7 THz e potenza media 260 mW/cm2 per 30 minuti sono state
causati danni da infiammazione acuta, senza però rilevare surriscaldamenti della pelle durante l'irraggiamento, quindi escludendo un effetto termico[49]. Studi comportamentali
Figura 3: Strumento per indagare la composizione dell'epidermide prodotto e commercializzato dall'azienda britannica TeraView Ltd.[38]. Esso è parte di una categoria in forte espansione di
su topi maschi, hanno mostrato aumenti di ansietà dopo esposizione a laser THz[50].
Tuttavia in ratti albini stimolati con radiazioni THz in specifiche frequenze ad alto assorbimento da parte dell'ossido nitrico, si osserva depressione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene inducendo la riduzione della secrezione di catecolamine associata allo stress da immobilizzazione al quale gli animali erano sottoposti[51]. Altri esperimenti in
simili condizioni inducono aumento dei nitriti nel siero[52], depressione ed aumento
dell'aggregazione piastrinica[53], e differenze fra i sessi sono state osservate con evidenze
di maggiore sensibilità alla radiazione da parte delle femmine, specialmente durante l'estro[54]. Cellule staminali mesenchimali di topo irradiate a banda larga THz, con
potenze paragonabili a quelle del presente lavoro, dopo 9 ore di esposizione hanno mostrato incremento della concentrazione dell'RNA di adiponectina, GLUT4 e PPARG[55].
Su ratti sono anche stati condotti esperimenti per caratterizzare differenti tessuti del tratto intestinale[56], ed ustioni[57].
Tessuti freschi di suini sono stati caratterizzati come modello di studio finalizzato alla realizzazione di metodiche per il bioimaging diagnostico in vivo utilizzando l'interferometria a feedback basato su un laser terahertz a cascata quantica[58].
Un altro animale, la Drosophila melanogaster, è servito come modello per studi sull'invecchiamento dopo esposizione a radiazione THz: è stato osservato un effetto sulla sopravvivenza neutro o negativo in moscerini giovani ed un effetto positivo su soggetti più vecchi. Anche in questo caso le femmine si sono dimostrate diversamente sensibili[59].
Sottoponendo le Drosophila a condizioni di stress, ossia 3 ore senza cibo in spazio ristretto, si ottengono risultati positivi sulla sopravvivenza solo se irradiate nella fasi di declino costante della popolazione. Per contro si ha risultato opposto irradiando i moscerini in fasi di stabilità della popolazione. Ciò suggerisce un effetto indiretto sui geni che regolano la lunghezza della vita[60]. Sono state irradiate anche delle femmine
prima dell'accoppiamento per 30' in condizioni di stress alla fine di 2:30' di digiuno. In questo caso ed è stata rilevata una carenza di maturazione di maschi alla generazione F1. I dati hanno anche mostrato che solo gli oociti maturi sono sensibili alla radiazione[61].
Tutt'altro utilizzo delle suddette tecniche di imaging è stato rivolto verso indagini archeologiche e per la conservazione dei beni culturali[62,63,64,65,66,67,68], permettendo di
rilevare disegni celati sotto lo strato a vista di affreschi di epoca romana (Figura 4). Urne e mummie egizie di uccelli e reperti archeologici in siti preistorici sono stati oggetto di indagine con queste tecniche.
Applicazioni industriali delle radiazioni THz sono allo studio per il controllo di qualità di prodotti farmaceutici, in particolare volti alla verifica di compresse. Il ridotto assorbimento ed alterazione dei farmaci, e la capacità di rilevare precisamente il contenuto di acqua, rendono queste applicazioni molto promettenti come metodi non invasivi per la verifica del prodotto finito.
Le potenziali applicazioni nel settore farmaceutico hanno spinto alla realizzazione di molte ricerche, per esempio per valutare l'efficacia di metodi di deposizione dei rivestimenti di compresse[69]; per lo studio della dissoluzioni di film di rivestimento per
l'assorbimento ritardato[70], ma soprattutto mirate a vari aspetti del controllo di qualità dei
prodotti in tutte le fasi di fabbricazione[71] delle forme farmaceutiche solide (compresse)
in primis[72,73,74,75], comunque sempre con particolare riguardo al rivestimento
esterno[76,77,78,79,80,81,82,83,84,85] ed alla distribuzione di densità e qualità dell'interno[86,87,88],
all'elasticità ed alla porosità[89,90] ed alla composizione del contenuto[91]. Di grande utilità è
la possibilità di determinare il grado di idratazione di un prodotto anche in forme semisolide o nei cerotti transdermici[92]. Le applicazioni si spingono fino al controllo
all'invecchiamento dei prodotti[93]. In ogni caso sono tutti metodi non invasivi.
Atri studi sono stati rivolti alla applicazione di radiazioni THz per il controllo di qualità di prodotti alimentari. Anche in questo settore è di interesse la possibilità di
Figura 4: Applicazione di una tecnologia di imaging THz ha permesso di rivelare tratti nascosti sotto l'affresco d' epoca romana “Tre uomini con lancia” conservato al museo del Louvre di Parigi.
automatizzare verifiche e misurazioni di caratteristiche importanti del loro interno senza intaccarli, e con maggiore discernimento di materiali a bassa densità rispetto a sistemi che usano i raggi x, anche per prodotti già confezionati[94],o per riconoscere corpi estranei
in alimenti processati come gli spaghetti istantanei[95]. A titolo di esempio si pensi alla
possibilità di identificare frutta secca a guscio avariata altrimenti non distinguibile da quella sana. Nel medesimo settore studi si sono incentrati sulla caratterizzazione di oli[96],
sulla detezione di melamina in alimenti[97], di residui di antibiotici in cibi e mangimi[98], e
di pesticidi nel miele[99]; sempre usando tecniche basate sulla radiazione THz è stato
possibile mettere appunto sistemi per determinare il grado di deterioramento (germinazione) di semi di frumento destinati al consumo[100] e diversi tipi di pesticidi
presenti in alimenti con particolare riguardo sempre alle farine di frumento[101].
Anche al livello agrario sono state studiate applicazioni delle radiazioni THz per la rilevazione dell'acqua contenuta in foglie di vegetali vivi[102,103], con interessanti
applicazioni per la rilevazione istantanea, non invasiva ed a distanza dello stress idrico che questi posso aver subito.
La prima applicazione non scientifica delle radiazioni THz di grande successo sono stati i dispositivi scanner per la sicurezza aeroportuale. Essi permettono di visualizzare le sagome di armi nascoste non rilevabili tramite i classici dispositivi metal detector ma hanno il limite di non penetrare in profondità nell'organismo[5] (Figure 5 e 6). Nelle
nazioni che per prime hanno adottato questi dispositivi l'approvazione dell'utilizzo su individui è stato giustificato dai potenziali benefici in termini di sicurezza dei trasporti, accelerando quelle che sono le normali procedure per la loro omologazione. L'utilità di questi body scanner è poi lentamente divenuta popolare in tutto il mondo dopo una serie di eventi che potevano essere scongiurati se tali sistemi fossero stati in uso.
Rispetto all'altra tecnologia utilizzata per simili finalità, ossia lo scanner a retrodiffusione di raggi X, è inconfutabile che le radiazioni THz evitano il rischio legato alla ionizzazione ed alla rottura di legami molecolari in grado di provocare effetti
genomici potenzialmente causa cancro e mutazioni nella progenie. Si deve però notare che le dosi di raggi X assorbite dagli individui con una tipica scansione aeroportuale sono equivalenti a quelle ricevute in circa 2 minuti di volo in un aeroplano di linea ad alta quota; inoltre permettono altissime risoluzioni e possono attraversare molti materiali invalicabili alle radiazioni THz. Quest'ultime però sono viceversa in grado di caratterizzare moltissimi materiali indistinguibili con i raggi X, in particolare differenti sostanze di origine biologica, con grande beneficio per i controlli doganali ad esempio per la ricerca di sostanze stupefacenti.
Nel contesto dei controlli sulle persone e sui bagagli e merci, la possibilità di rilevare alcune sostanze nascoste grazie a caratteristici e specifici profili spettrografici THz ha infatti dato luogo a studi mirati alla ricerca di esplosivi e droghe illegali da abuso nascoste[104,74]. Ben presto comunque i dispositivi THz hanno suscitato preoccupazioni per
la salute e per la privacy da parte dell'opinione pubblica[105]. Diversi studi hanno cercato
di appurare l'eventuale rischio per la salute presentato dalle radiazioni Thz. Ciò è in linea con effetti potenzialmente dannosi legati alla comprovata interazione tra onde THz e termodinamica della cromatina[106] e dell'annealing del DNA, come mostrato da B.S.
Alexandrov ricercatore del Center for Nonlinear Studies presso il Los Alamos National Laboratory in New Mexico, Usa[107].
Nell'ambito militare sono stati condotti studi per la rilevazione THz del contorno di elicotteri in condizioni di ridotta visibilità[108], situazione piuttosto frequente e critica a
causa del notevole spostamento d'aria il quale alza nuvole di polvere ed impedisce di visualizzare ostacoli quando il velivolo si trova vicino al terreno. Sempre come potenziali applicazioni militari sono allo studio tecniche di cloacking in grado di rendere invisibile oggetti alle radiazioni THz[109].
Per quanto concerne le applicazioni pratiche delle onde elettromagnetiche nelle scienze biomediche l'uso di radiazioni diverse dalla luce ha permesso di sviluppare
Figura 6: Esempio di applicazione per la sicurezza dell'azienda SafeView Inc. detentrice di molti brevetti per l'imaging THz.
dispositivi di spettroscopia e bioimaging diagnostico il cui capostipite è la radiografia: appena 14 giorni dopo l'annuncio della scoperta dei raggi x da parte di Wilhelm Roentgen nel 1895, Friedrich Otto Walkhoff effettuò la prima radiografia dentale[110].. È importante
sottolineare come gli effetti nocivi di questa tecnologia (legati anche allo smaltimento dei materiali radioattivi) siano stati prima sconosciuti, e poi sottovalutati in varie fasi del suo uso e sviluppo sino a tempi recenti, fatto evidenziato dai continui abbassamenti dei limiti consentiti per le esposizioni lavorative nel corso XX secolo. Molti benefici (realizzati o potenziali) non vengono dunque senza rischi per la salute. Sono inoltre ben noti e documentati anche effetti nocivi sia causati delle radiazioni appena oltre il violetto, sia causati da forti emissioni non ionizzanti, quindi la loro esposizione per gli individui è strettamente regolamentata[111].
Prendendo atto di questi fatti storici oggi la tendenza degli enti legislativi, a causa anche di una risposta emotiva dell'opinione pubblica, è quella di utilizzare il principio di precauzione di non usare onde elettromagnetiche su individui fintanto che non sia stata appurata la loro innocuità. Questo approccio non va confuso con il principio di prevenzione che invece fa riferimento a pericoli appurati.
La creazione di laser THz a cascata quantica ha permesso lo sviluppo di un microscopio confocale[112] e di tecniche near-field[113], basati su onde millimetriche, che
dunque permettono una precisa ricostruzione tridimensionale degli oggetti studiati. L'imaging con radiazioni terahertz ha il vantaggio di poter bene visualizzare fino ad una discreta profondità i tessuti in vivo con invasività praticamente assente in quanto la radiazione non è ionizzante, e con effetti termici trascurabili alle basse potenze sufficienti utilizzate; la lunghezza dell'onda rende il limite di risoluzione massima nell'ordine di grandezza millimetrico o appena submillimetrico, dunque con dimensione dei pixel o dei voxel nelle immagini acquisite paragonabili a quelle ottenibili con le più avanzate tecniche di risonanza magnetica nucleare.
Sono stati create fibre ottiche per la trasmissione di queste radiazioni allo specifico fine di essere utilizzate in applicazioni biomediche per fini endoscopici[114] ed in
microscopia near-field THz[113] per la diagnosi di tumori del seno[115], ma anche per altri
usi come nelle telecomunicazioni.
Per quanto riguarda la comunicazione attraverso l'aria, le radiazioni THz sono state indagate ed hanno mostrato minore attenuazione del segnale nella nebbia rispetto a connessioni infrarosse[116] (i raggi infrarossi sono attualmente molto diffusi in dispositivi
per il controllo di accesso -ascensori, cancelli automatizzati etc.- e telecomandi).
È stato recentemente annunciato lo sviluppo di dispositivi in grado di sfruttare le frequenze elettromagnetiche THz per la trasmissione di dati, sufficientemente miniaturizzati ed appositamente disegnati in modo da essere integrati in apparecchiature portatili come ad esempio gli smartphone o i tablet: essi sono capaci di trasferire informazioni 100 volte più velocemente rispetto alle migliori tecnologie mobile[117]
attualmente diffuse. La sempre crescente necessità di banda, ad esempio per la visualizzazione di video ad altissima risoluzione, ed i continui avanzamenti della capacità di calcolo e miniaturizzazione dei dispositivi portatili, la quale raddoppia all'incirca ogni 18 mesi sin dal 1965 in base al principio enunciato nella “legge di Moore”[118], fanno
prevedere che probabilmente si giungerà presto all'uso diffuso di tali nuovi dispositivi per le telecomunicazioni THz. Nell'era digitale, le telecomunicazioni senza fili, basate sulla trasmissione di onde elettromagnetiche, sono tecnologie che hanno assunto un ruolo cruciale, imprescindibile ed in continua crescita sia nella nostra società che in quelle in via di sviluppo, facilitando ed abbreviando i tempi per le trasmissioni di informazioni, e aiutando la condivisione e fruibilità del sapere. È dunque oggi impossibile rimuovere queste radiazioni (le quali costituiscono sovente un vero e proprio elettrosmog) dagli ambienti in cui viviamo poiché esse sono divenute parte integrante delle nostre società.
I . S c o p o d e l l o s t u d i o .
Nonostante la recente comparsa di molti nuovi strumenti in grado di emettere radiazioni THz per svariati scopi, e l'imminente diffusione di massa di alcuni di questi dispositivi, ad oggi non sono ancora presenti sufficienti studi sugli effetti che le frequenze elettromagnetiche terahertz hanno sulla nostra biologia.
Dunque il presente lavoro si prefigge lo scopo di avanzare le conoscenze in materia di interazione tra onde elettromagnetiche terahertz e cellule umane per quanto concerne la loro permeabilità di membrana, alla luce di precedenti studi i quali hanno evidenziato, in particolari condizioni, l'occorrenza di aumento di permeabilità di membrana[119], in
particolare con i lavori di Siegel e Pikov[120,121], dopo irraggiamento THz.
Per verificare l'occorrenza della perdita di citoplasma dalle cellule abbiamo utilizzato la molecola fluorescente calceina. Tale fluorocromo ha svolto la funzione di indicatore quantitativo della permeabilizzazione, infatti l'eventuale riduzione della fluorescenza intracellulare dei campioni trattati con il laser terahertz rispetto ai controlli è indice della perdita di citoplasma in cui la molecola è contenuta. In altri termini il presente studio vuole verificare la possibile comparsa di aperture sulla membrana citoplasmatica in grado di far fuoriuscire con il soluto intracellulare molecole di dimensioni almeno pari a quelle della calceina.
La scelta di studiare le membrane plasmatiche è motivata dalla loro centralità nella vita delle cellule: esse sono le principali barriere e sedi fondamentali di aggregazione di complessi necessari alla biologia e fisiologia cellulare animale. In particolar modo le membrane plasmatiche rappresentano il luogo deputato al mantenimento dell'omeostasi in tutti i tipi cellulari e anche deputato alla trasmissione di segnali in cellule eccitabili come i neuroni. Esse permettono la compartimentazione del citoplasma rispetto all'esterno, il quale può essere matrice o soluto extracellulare, altre cellule, cavità od esterno dell'organismo. Alterazioni anche lievi della normale attività delle membrane possono causare enormi modifiche della biologia cellulare. La conseguente perdita dell'omeostasi funzionale infatti può causare patologie. In quest'ottica lo studio presente si prefigge anche lo scopo di aiutare la valutazione di eventuali rischi per la salute .
Oltre a fornire informazioni sperimentali generiche per la ricerca di base, il duplice interesse che ha spinto la realizzazione della presente tesi di laurea è rivolto da un lato alle applicazioni biomediche e dall'altro alla valutazione del rischio. Infatti, se confermata l'induzione della permeabilizzazione temporanea (una permeabilizzazione irreversibile porterebbe inevitabilmente a necrosi), si prospetterebbe lo sfruttamento della
radiazione THz per metodologie biomediche le quali necessitino di tali effetti su cellule o tessuti, come ad esempio per il drug delivery in vivo e per la trasfezione di cellule in vitro, ossia, in ambito molecolare e cellulare, operando in maniera analoga a quanto viene fatto con l'elettroporazione al fine di permettere a materiale genico esterno di entrare in una cellula. Sempre nell'ambito tecnologico applicativo, se non confermato l'effetto si aggiungerebbe un tassello alle conoscenze dei componenti cellulari meno affetti dal passaggio delle radiazione in questione, elemento di interesse per la messa appunto di tecniche di imaging biomedico THz , le quali infatti solitamente cercano di garantire la minima invasività e rappresentano un settore fiorente.
I I . M a t e r i a l i e m e t o d i .
Tecniche di coltura: terreni, piastre e linee cellulari.
Terreni.
Le quattro formulazioni di terreni che abbiamo prodotto ed utilizzato, (di seguito descritte rispettivamente come terreno di mantenimento, t. di starvation, t. di
caricamento e t. di lavaggio ed irraggiamento), sono state tutte preparate a partire dal
mezzo di coltura DMEM Dulbeccos's Modified Eagle Medium (marca Life Technologies linea Gibco® [REF 21063-029]). Esso è fornito già preconfezionato contenente 4,5 g/L di D-Glucosio, L-Glutammina ed HEPES 25 mM. In tutti i terreni formulati abbiamo aggiunto al DMEM gli antibiotici penicillina e streptomicina (marca Life Technologies linea Gibco® [REF 15140-148]), e siero fetale bovino FBS (marca Life Technologies linea giaco® [REF 10108-165]) in concentrazione del 10% nel caso del terreno di
mantenimento, mentre la concentrazione di FBS è stata del 2,5% per il terreno di starvation per i restanti due da questo derivati.
Piastre da coltura cellulare.
Per gli irraggiamenti abbiamo utilizzato apposite piastre totalmente in polistirene di marca WillCo-dish® aventi diametro 35 mm. La scelta del polistirene è stata obbligata dal fatto che il vetro non può essere utilizzato in quanto assorbe completamente le onde millimetriche.
Prima di iniziare gli esperimenti abbiamo verificato le proprietà di assorbimento del laser THz da noi utilizzato, avente frequenza ~2,9 THz, da parte del polimero di cui le piastre sono costituite, ponendone una senza coperchio tra laser e rilevatore di potenza: in base alle misure effettuate la percentuale della radiazione assorbita dal fondo del supporto è risultata essere del 55,1%.
Linee cellulari.
Per condurre gli esperimenti è stata utilizzata la linea cellulare tumorale umana HeLa in quanto molto resistente. Essa deriva da una biopsia di carcinoma epiteliale dell'utero prelevato nel 1951 dalla statunitense Herietta Lacks. Questa linea immortalizzata umana è stata la prima ad essere coltivata in vitro ed oggi è divenuta disponibile nei principali laboratori di tutto il mondo, costituendo uno standard per la ricerca.
Sono state usate cellule coltivate a partire da aliquote concentrate, in terreno di coltura arricchito con dimetilsolfossido (DMSO) e conservate in azoto liquido refrigerato a -120°C.
Appena scongelate le cellule è stato rimosso il DMSO mediante diluizione e centrifugazione. Si è proceduto subito alla semina. Per la fase di propagazione e mantenimento in incubatore delle cellule sono state utilizzate piastre di polistirene aventi diametro 100 mm. Il mezzo di coltura utilizzato è stato terreno di mantenimento. Questo terreno è servito unicamente per crescere, propagare e mantenere le cellule dal momento del loro scongelamento dall'azoto liquido fino alla semina nelle piastre da esperimento da 35 mm. Per evitare l'accumulo di mutazioni nella linea coltivata, nel corso degli esperimenti sono state scongelate 3 volte cellule conservate a -120°C aventi basso numero di replicazioni, garantendo dunque maggiore uniformità genomica di controlli e trattati.
Semina delle cellule nelle piastre da esperimento.
È stato necessario trasferire le cellule dalle piastre di mantenimento più grandi a quelle da 35 mm. Solo quest'ultime infatti avevano dimensioni adatte agli alloggi di supporto sui piani di lavoro nel nostro setup sperimentale, inoltre il trasferimento delle cellule ha permesso di cambiare il terreno con il t. di starvation in grado di indurre la sincronizzazione delle cellule.
48 ore prima di procedere con l'irraggiamento, e poco prima di arrivare alla confluenza delle cellule, si è proceduto alla rimozione del t. di mantenimento, quindi al lavaggio delle cellule attaccatesi al fondo della piastra. Il lavaggio è stato effettuato gocciando delicatamente soluzione idrosalina PBS, phosphate buffered saline, onde rimuovere cellule morte, corpuscoli e residui di soluti extracellulari quali ad esempio l'antitripsina. Successivamente le cellule sono state staccate dal substrato trattandole con l'enzima tripsina (marca Life Technologies linea Gibco®[REF 25300-096]). A questo punto le cellule sono state lasciate per alcuni minuti in incubatore a 37°C, fino al rendersi visibile della loro avvenuta separazione dal fondo, evidenziata dallo sbiancamento ed opacizzazione osservabile ad occhio nudo inclinando la piastra. La separazione è dovuta all'azione dell'enzima il quale catalizza il taglio idrolitico di proteine di adesione presenti all'esterno della cellula al livello di residui di arginina e lisina. È importante ridurre al minimo necessario questa fase in quanto la tripsina è in grado di danneggiare le cellule se lasciata agire per troppo tempo.
Appena distaccatesi, le cellule sono state risospese e seminate nelle WillCo-dish® da 35 mm con il t. di starvation, scaldato in bagnetto a 37°C. Le cellule così preparate sono state lasciate in incubatore per 48 ore.
Caricamento del fluoroforo e dell'inibitore delle MDR.
Trascorse 48 ore in incubatore, al fine di caricare le cellule con il fluoroforo, ossia per permettere l'internalizzazione della calceina-AM, è stato sostituito il terreno in cui esse si trovavano fino a questo momento con il t. di caricamento. Quest'ultimo ha composizione identica al t. di starvation precedentemente utilizzato, ma in più contiene sulfinpirazone 250 µM ed il fluoroforo calceina-AM 0,8 µM.
Il sulfinpirazone (Figura 7) è un inibitore delle multidrug resistance protein (MDR) (Figura 8), le quali sono gruppo di proteine integrali di membrana del tipo ATP-binding
cassette utilizzate dalle cellule per estrudere alcune classi di molecole estranee[122] tra cui figura la calceina. Senza sulfinpirazone (o altre molecole ad azione simile come ad esempio il verapamil) le MDR potenzialmente alterano il quadro sperimentale del presente studio.
Figura 7: A sinistra: Formula di struttura del sulfinpirazone, farmaco inibitore delle multidrug resistance proteins. A destra: Cambio conformazionale di una MDR in seguito all'idrolisi di adenosina trifosfato. La proteina di membrana contiene residui idrofobici nella parte interna. In rosso e blu sono evidenziati i siti catalitici per il trasporto dei substrati.
N N O O O S
Per disporre agevolmente del sulfinpirazone necessario ad ogni esperimento abbiamo precedentemente provveduto a preparare aliquote d'esso a partire dalla sostanza pura. Abbiamo prodotto tali aliquote di sulfinpirazone da 0,375 ml a concentrazione 10 mM e subito le abbiamo congelate a -18°C. Il loro contenuto è stato ottenuto sciogliendo lentamente 40,448 μg di sulfinpirazone in polvere puro al 99% (Fluka®Analytical) in 10 ml di H2O microfiltrata. Per effettuare tale soluzione è stato usato come contenitore un tubo Falcon® da 15 ml. Si è proceduto versando gradualmente con pipetta Pasteur quantità minime indispensabili di NaOH in gocce, e nel contempo aggiungendo piccole quantità del sulfinpirazone in polvere sino a raggiungerne il suo completo scioglimento, facendo attenzione di agitare delicatamente il tubo onde evitare la flocculazione.
Per ogni ripetizione degli esperimenti le sopra descritte aliquote di sulfinpirazone sono state scongelate in bagnetto a 37°C e diluite immediatamente in 14,635 ml di t. di
starvation, così ottenendo 15 ml alla concentrazione voluta pari a 250 µM. Tale prodotto
di diluizione è il t. lavaggio ed irraggiamento. Da questi 15 ml così ottenuti abbiamo subito prelevato 5 ml per aggiungervi la calceina-AM la cui addizione ha prodotto il t. di
caricamento, come descritto di seguito. I restanti 10 ml sono invece serviti sia al termine
del caricamento per effettuare i successivi tre lavaggi necessari a rimuovere la calceina non internalizzata nelle cellule, sia come terreno per mantenere le cellule nelle fasi finali degli esperimenti: durante l'acquisizione immagine al microscopio confocale e durante l'irraggiamento con laser terahertz.
Figura 8: Meccanismo di estrusione della calceina ad opera delle multidrug resistance proteins, in particolare la MDR1. Quando è presente un inibitore (indicato con I), come ad esempio il sulfinpirazone o il verapamil, le multidrug resistance proteins non riescono a far uscire la calceina e le esterasi intracellulari possono convertire maggiore quantità di fluoroforo acetossimetilato (CAM) nella sua forma attiva fluorescente (indicata con C). Immagine tratta da Human Multidrug Resistance
ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoimmunity Defense System, Physiological Reviews (2006).
Il fluoroforo calceina-AM, acetossimetilcalceina, (Figura 9) è velocemente assorbito dalle cellule. Al loro interno la molecola si dissocia dai gruppi acetossimetile per idrolisi ad opera di esterasi intracellulari. La calceina così ottenuta perde la capacità di attraversare le membrane e diviene fluorescente con picchi di assorbimento in eccitazione alla lunghezza d'onda di 495 nm e di emissione a 515 nm.
Come per il sulfinpirazone anche questa molecola è stata precedentemente preparata in aliquote poi ricongelate: a partire da fiale Life Technologies [REF C3100MP] contenenti 50 μg di calceina-AM conservate a -18°C; il fluoroforo è poi stato diluito con DMSO e suddiviso in microvial, producendo singole aliquote da 2 µl a concentrazione 2 mM poi rapidamente ricongelate, onde evitarne la facile degradazione.
Le aliquote di calceina-AM sono state scongelate immediatamente prima di ogni esperimento cercando di evitarne l'esposizione alla luce. Questa fase costituisce un punto critico dell'esecuzione degli esperimenti data la celere alterazione della molecola a temperatura ambiente. È importante sottolineare che la calceina-AM si degrada in tempi apprezzabili anche a -18°C, quindi è altamente sconsigliabile conservare aliquote in tal modo per tempi superiori ad alcuni mesi.
Appena decongelata ciascuna aliquota, ad essa sono stati immediatamente aggiunti 5 µl di DMSO; si è dunque proceduto col sonicare la microvial contenente la calceina-AM
Figura 9: Formula di struttura della Calceina (C30H26N2O13, peso molecolare 622.53).
Somministrata alle cellule nella sua forma AM (a sinistra) viene internalizzata prontamente in virtù della sua idrofobicità. Giunta nel citoplasma, esterasi residenti all'interno della cellula la deacetossimetilano (a destra) catalizzandone la conversione nella sua forma idrofilica attiva come fluoroforo con picco di assorbimento in eccitazione a 470 nm e di emissione a 509 nm.
per la durata di 3' in bagnetto a 37°C, ed infine l'aliquota è stata aggiunta ai 5 ml di t. di
lavaggio ed irraggiamento contenente il sulfinpirazone, ottenendo il t. di caricamento.
Le cellule sono state così lasciate in incubatore a 37°C immerse nel t. di caricamento per 30'.
Lavaggi.
Dopo 30' in incubatore a 37°C si è proceduto alla rimozione del t. di caricamento ed alla esecuzione di tre lavaggi con il t. di lavaggio ed irraggiamento preriscaldato a 37°C, rimuovendo in tal modo la calceina-AM residua esterna alle cellule al fine di interromperne l'assorbimento cellulare durante le fasi successive.
Infine per il mantenimento delle cellule durante le fasi di acquisizione di immagini al microscopio confocale e di irraggiamento le cellule lavate sono state immerse in t. di
lavaggio ed irraggiamento preriscaldato a 37°C.
Microscopia confocale.
Per le acquisizioni delle immagini digitali necessarie alla misura della fluorescenza intracellulare iniziale e finale è stato utilizzato un microscopio confocale Leika SP2 (Figura 13, pag.25), posizionato sopra un piano da lavoro ammortizzato. Grazie al principio su cui si basano i microscopi confocali, è stato possibile effettuare rapide e precise acquisizioni multistrato attraverso lo spessore verticale di gruppi costituiti da poche cellule, catturandone le emissioni elettromagnetiche del fluoroforo internalizzato, ma escludendo gran parte della luce proveniente dall'ambiente circostante.
Per tutti gli esperimenti è stato usato un obbiettivo a secco 10x il quale ha permesso di mettere a fuoco le cellule nonostante lo spessore della maschera di alluminio abbia rialzato le piastre contenenti le cellule allontanandole molto e quindi aumentando la distanza focale.
Onde garantire alle cellule una condizione di minore stress, il piano di lavoro del microscopio era munito di cameretta con flusso di CO2 costante al 5% e temperatura controllata di 37°C. Questi dispositivi sono stati accesi con largo anticipo per stabilizzare il flusso di aria arricchita di anidride carbonica e la temperatura.
Maschera di alluminio.
Al fine di rintracciare agevolmente le singole cellule dopo il loro riposizionamento sul piano di lavoro del microscopio confocale successivamente all'irradiamento, è stata
creata una maschera in alluminio (Figura 10). Questo metallo non è attraversato dalle frequenze elettromagnetiche THz. La maschera aveva sette fori marcati univocamente del diametro di 1 mm. Attraverso i fori sono state acquisite le immagini digitali. Tale maschera è stata fissata con pasta adesiva al di sotto della piastra di polistirene, ed ivi è rimasta saldamente attaccata anche durante l'irraggiamento, svolgendo la funzione di assicurare che soltanto le cellule corrispondenti ad un foro prescelto fossero irradiate, e costituendo una barriera invalicabile contro eventuali diffrazioni della radiazione nel percorso ottico a monte del campione.
La forma della maschera è stata modellata per fresatura partendo da un cilindro appiattito in modo da produrre una sagoma capace di alloggiare all'interno del suo incavo la piastra da 35 mm. Sei fori sono stati fatti ai vertici di un esagono regolare, ed un settimo foro al centro di tale poligono coincidente con il centro della maschera in alluminio e della piastra in polistirene. Il profilo delle perforazioni, svasato a forma di cono tronco con base rivolta verso i campioni (Figura 11), ha minimizzato eventuali effetti di riflessione e rifrazione della radiazione THz da parte dell'alluminio sulle cellule che non dovevano essere irradiate. La forma dei buchi ha inoltre permesso il passaggio del cono di luce necessario all'obbiettivo del microscopio confocale per l'acquisizione immagini.
La sagoma esterna della maschera è stata fatta per calzare perfettamente nel supporto del piano di lavoro del microscopio SP2 Leica ed anche nel setup sul banco dal lavoro
Figura 10: Lato superiore della maschera porta campione ricavata da un cilindro di alluminio. Essa ha avuto il ruolo di schermare le cellule di controllo durante l'irraggiamento attraverso uno dei fori delle cellule trattate ed ha inoltre permesso di ritrovare agilmente le medesime cellule al microscopio confocale.
dove è stata effettuata l'esposizione al laser THz.
Prima acquisizione immagini.
Le piastra contenente il campione caricato con calceina, lavato ed immerso in t. di
lavaggio ed irraggiamento, è stata attaccata nella maschera di alluminio grazie a piccole
quantità di pasta adesiva posta ai suoi margini. La maschera è stata dunque delicatamente posizionata nella sua sede sul piano di lavoro del microscopio confocale. Le immagini sono state acquisite attraverso vari strati, variando piano sull'asse Z per una profondità di circa 8 µm, ossia per l'altezza tipica di una cellula HeLa adesa ad un substrato di polistirene. Per la messa a fuoco si è usata la luce trasmessa facendo attenzione a limitare il tempo di esposizione delle cellule, al fine di evitare fenomeni di photobleaching e per non scaldare i campioni. Simili accortezze sono state adottate nel calibrare al minimo necessario la potenza del laser dell'SP2, e viceversa aumentando al massimo utile la sensibilità del fotomoltiplicatore. Le acquisizioni multistrato sono state effettuate per tutti i fori registrando il nome univoco del foro ad ogni sequenza di acquisizione.
Sorgente di radiazioni terahertz.
Il laser a cascata quantica, avente frequenza ~2,9 THz e potenza 1,642 mW/cm2, è stato montato su un bancone da laboratorio munito di gambe ammortizzate (Figura 14, pag.26). Mediante ottiche riflettenti e lenti, la radiazione è stata convogliata dal basso
Figura 11: Spaccato della maschera di alluminio posta sul piano per l'esposizione al laser THZ (qui rappresentato come un fascio rosso). Il disegno vuole mette in evidenza la svasatura dei fori non visibile dall'alto.
verso i campioni da irradiare. Al disopra dei campioni un dispositivo fisso per la misura della potenza ha fornito informazioni sui parametri fisici della radiazione applicata utili per la calibrazione precedente agli esperimenti e per la verifica della potenza durante l'esposizione dei campioni.
Irraggiamento delle cellule
Dopo la prima acquisizione immagini attraverso il microscopio confocale, la maschera di alluminio contenente la piastra con le celluleè stata messa nell'apposita sede su un podio costruito nel setup per l'esposizione al laser THz.
Sono stati effettuati vari esperimenti con differenti tempi di esposizione, ossia per lassi di 30', 60', 90' e 120'.
Seconda acquisizione immagini.
Terminata l'esposizione alla radiazione THz si è proceduto rimettendo la maschera con la piastra sul piano di lavoro del microscopio confocale, e poi ripetendo le acquisizioni. Si noti che è stato necessario ripetere le messe a fuoco in quanto non è possibile mantenere perfettamente fermo il piano di lavoro con la precisione necessaria durante le operazioni di spostamento dal microscopio confocale SP2 al setup per l'esposizione THz e viceversa.
Software per l'elaborazione e l'analisi delle immagini.
Le rielaborazioni delle immagini digitali sono state effettuate utilizzando Fiji[12],
programma open source basato sul software ImageJ2[123] prodotto dall'istituto governativo statunitense per la salute NIH, National Institutes of Health. Fiji è un suo derivato che si distingue soprattutto per avere preinstallati numerosi plug-in orientati all'elaborazione delle immagini.
Elaborazione software delle immagini.
Utilizzando il software Fiji le acquisizioni multilayer sono state oggetto di rielaborazione iniziale mediante l'uso della funzionalità Maximum Projection: con essa è possibile produrre un'unica immagine bidimensionale, la quale tuttavia è quantitativamente rappresentativa delle caratteristiche di fluorescenza di tutto il volume
cellulare.
Le immagini acquisite sono state oggetto di disegno manuale del perimetro (ROI,
Region Of Interest) (Figura 12, pag.23) per le singole cellule ivi presenti, tipicamente una
decina, ammesso che fossero interamente circoscritte nell'immagine e prive di sovrapposizioni o altri disturbi alle misurazioni, quali ad esempio corpuscoli, bolle o piccoli detriti. La demarcazione dei perimetri cellulari, ossia del loro contorno, è stata facilitata, riducendo le ambiguità e le sovrapposizioni, grazie scelta dello starvation, la quale ha diminuito la motilità cellulare, le mitosi, e le cellule hanno assunto una forma lievemente più ovalizzata rispetto a quelle in t. di mantenimento.
Per ciascuna ROI così ottenuta è stata effettuata la misura dell'area, la cui unità di misura è il pixel, e la misura della fluorescenza integrata totale, (IntDen), ossia la misura dalla somma dei valori di luminosità di tutti i pixel presenti all'interno di un perimetro cellulare.
Sono stati misurati i valori medi di luminosità per i pixel delle aree prive di cellule, permettendo così il calcolo del valore medio di background dei pixel di ciascuna Maximum Projection. Per ogni cellula, motiplicandolo l'area delle ROI per il valore medio di background si è ottenuto il valore totale di luminosità da sottrarre alla fluorescenza integrata.
I valori così ottenuti sono stati oggetto di analisi statistica utilizzando il software specializzato Origin 8 prodotto dall'azienda OriginLab.
Figura 12: Disegno di ROI con software Imagej/Fiji su maximum projection di acquisizioni multistrato.
Controlli.
Le cellule site in corrispondenza delle sei perforazioni nella maschera di alluminio, le quali non hanno ricevuto l'irraggiamento THz, hanno costituito i controlli di verifica dell'esperimento: difatti essendo poste nelle medesime piastre, ma in regioni lontane e distinte al loro interno, hanno ricevuto, in tutto e per tutto, trattamenti identici rispetto alle cellule le quali invece sono state sottoposte al laser. Trattati e controlli hanno dunque subito identici iter protocollari, conseguenti alla collocazione di cellule irradiate e di controllo nelle stesse piastre, a distanza di circa 10 mm, ma anche grazie alla contemporaneità della esecuzione della procedura sperimentale. Dunque si è fatto il possibile per garantire, con l'espediente della coolocalizzazione di trattati e controlli sulla medesima piastra, che tutte cellule degli esperimenti abbiano subito le stesse variazioni contingenti dei parametri fisici ambientali, le quali possano essere intervenute durante la conduzione dell'esperimento.
S t r u m e n t o d i a c q u i s i z i o n e i m m a g i n i : m i c r o s c o p i o c o n f o c a l e L e i c a S P 2
Figura 13: Ricostruzione del setup nel microscopio confocale Leica SP2 con alloggiata la maschera di alluminio contenente la piastra con le cellule. Nelle immagini non è mostrato l'encasing utilizzato per garantire un flusso costante di CO2 e temperatura controllata a 37°C. Seconda immagine realizzata utilizzando il software di disegno tridimensionale Trimble Sketchup.
S e t u p s u b a n c o o t t i c o a m m o r t i z z a t o p e r l ' e s p o s i z i o n e a l l a s e r T H z .
Figura 14: In alto: Fotografie dei dispositivi e delle ottiche utilizzate. In
basso: Ricostruzione espansa del setup per l'esposizione delle cellule al laser
terahertz. Si noti l'imponente impianto di raffreddamento necessario al suo corretto funzionamento: il tubo corrugato serve a portare il refrigerante al dispositivo emittitore del laser. Immagine realizzata utilizzando il software di disegno tridimensionale Trimble Sketchup.
30' 60' 90' 120' 0 100 200 300 400 500 Controlli Cellule irradiate
Tempi di esposizione al laser THz
N um er o di c el lu le
I I I . R i s u l t a t i .
Le singole sessioni sperimentali condotte sono state 48, così ripartite: 13 per il tempo di irraggiamento di 30', 11 per 60', 13 per 90', ed 11 per 120'.
Il numero di cellule per le quali sono state fatte le misurazioni delle fluorescenze prima e dopo l'irraggiamento e la numerosità delle cellule di controllo sono indicate nella tabella 1:
Tabella 1: a) Numerosità dei gruppi di cellule analizzate divisi per tempi di esposizione. b) Numerosità mostrate in forma di barre sovrapposte.
(a) Durata dell'esposizione a laser Thz (b)
30' 60' 90' 120'
n° di cellule
irradiate 88 58 89 77
controlli 211 316 317 229
La statistica descrittiva dei dati sperimentali può essere riassunta dalla seguente tabella 2:
Tabella 2: Statistica descrittiva dei dati:
T e m p i d i i r r a g g i a m e n t o
3 0 ' 6 0 ' 9 0 ' 1 2 0 '
IRR CTRL IRR CTRL IRR CTRL IRR CTRL
Rapporto di fluorescenza prima/dopo (media del gruppo)
0,9901 0,97049 1,07854 1,05732 1,0751 1,0782 1,15039 1,14621
Errore standard
della media 0,01675 0,01052 0,03954 0,0096 0,01115 0,01149 0,02385 0,01069
Deviazione standard 0,15715 0,15287 0,30116 0,17058 0,10522 0,20465 0,20927 0,16174
I risultati possono anche essere visualizzati graficamente come mostrato dalle seguenti quattro illustrazioni (figure 15-18):
Figura 15: Grafico di tutte le cellule irraggiate e di controllo per 30 minuti di esposizione a laser THz. Le ascisse rappresentano i valori di fluorescenza per ogni cellula prima del trattamento, le ordinate quelli succesivi al trattamento.
Figura 16: Grafico di tutte le cellule irraggiate e di controllo per 60 minuti di esposizione a laser THz. Le ascisse rappresentano i valori di fluorescenza per ogni cellula prima del trattamento, le ordinate quelli succesivi al trattamento.
Figura 17: Grafico di tutte le cellule irraggiate e di controllo per 90 minuti di esposizione a laser THz.Le ascisse rappresentano i valori di fluorescenza per ogni cellula prima del trattamento, le ordinate quelli succesivi al trattamento.
Figura 18: Grafico di tutte le cellule irraggiate e di controllo per 120 minuti di esposizione a laser THz.Le ascisse rappresentano i valori di fluorescenza per ogni cellula prima del trattamento, le ordinate quelli succesivi al trattamento.
Il seguente grafico invece mostra le medie dei valori di rapporto di fluorescenza prima/dopo per tutti gli esperimenti condotti:
Anche se la semplice statistica descrittiva fin qui mostrata pare essere piuttosto eloquente si è voluto dare significatività statistica ai risultati ottenuti.
Abbiamo dunque effettuato inferenza statistica per descrivere i nostri risultati.
Prima di applicare il test t di Student ai dati raccolti nei nostri esperimenti, è stata verificata la normalità della distribuzione per ciascun gruppo di cellule applicando il test di normalità di Shapiro–Wilk e quello di Kolmogorov–Smirnov come mostrato nella seguente tabella 3:
Figura 19: Grafico che riassume gli esperimenti condotti: in esso vengono mostrate le medie e gli errori standard delle medie. Sull'asse delle ordinate è riportata la media dei rapporti fra la fluorescenza precedente e successiva all'esposizione. Sulle ascisse è indicato il tempo di esposizione di ogni gruppo per il quale è stata calcolata la media. Come si può notare le differenze sono minime a 30' e 60' e praticamente irrilevanti a 90' e 120'.
Tabella 3: Risultati dei test di verifica della normalità dei campioni con livello di significatività 0,05:
√ = distribuzione gaussiana
T e m p i d i i r r a g g i a m e n t o
3 0 ' 6 0 ' 9 0 ' 1 2 0 '
IRR CTRL IRR CTRL IRR CTRL IRR CTRL
Test di Shapiro–Wilk X X X X X X X X
Test di
Kolmogorov–Smirnov √ √ X X √ X X √
Non tutti i gruppi hanno passato i test di normalità (Tabella 3), tuttavia questi appaiono non discostarsi da una forma a campana, ed in base al numero non esiguo di elementi in ogni gruppo, è stato comunque possibile condurre i test t di Student[124]:
utilizzando la riduzione della fluorescenza nei controlli come valore di riferimento, abbiamo verificato per ciascuno dei quattro tempi di esposizione l'ipotesi nulla H0 per la quale non ci sono perdite statisticamente significative di fluorescenza nelle cellule trattate rispetto alle non trattate. La riduzione della fluorescenza è stata misurata come rapporto fra il valore di fluorescenza prima e dopo il trattamento:
Tabella 4: Test di verifica statistica d'ipotesi con α=0,05. Ipotesi ad una coda: H0: Cellule irradiate e di controllo
non mostrano differenze significative di perdita di fluorescenza nel tempo; H1: Le cellule irradiate perdono più
velocemente la fluorescenza di quelle di controllo.
T e m p i d i i r r a g g i a m e n t o 3 0 ' 6 0 ' 9 0 ' 1 2 0 ' Test t di Student a singola coda X X X X Test t di Student a due code X X X X Mahn-Withney U test singola coda X X X X Mahn-Withney U test a due code X X X X
In questo caso i risultati statistici sono inequivocabili, quindi accettiamo l'ipotesi nulla H0 e rigettiamo l'ipotesi alternativa H1 secondo la quale la radiazione THz ha
aumentato la permeabilità di membrana delle cellule analizzate.
Per ulteriormente testare le lievi differenze rilevate fra trattati e controlli abbiamo proceduto all'analisi statistica calcolando le regressioni lineari totali di cellule irraggiate rispetto controlli. La figura 20 mostra graficamente i dati impostati in questo modo:
Calcolando un'unica retta di regressione prima per tutte le cellule irradiate e poi per tutte le cellule di controllo, abbiamo ottenuto le due pendenze di tali rette che sono rappresentative degli andamenti complessivi delle fluorescenze. Tali pendenze sono state oggetto di inferenza statistica per testare l'ipotesi che le cellule irradiate in toto abbiano perso più fluorescenza dei controlli. Anche in questo caso, con α = 0,10, è stata rigettata
Figura 20: Grafici che rappresentano i valori di rapporto di fluorescenza (prima/dopo), ossia la diminuzione di fluorescenza per tutti i quattro tempi di irraggiamento.
tale ipotesi alternativa (H1: la pendenza per le cellule irraggiate è significativamente maggiore rispetto ai controlli).
I V. D i s c u s s i o n e .
I risultati del presente studio non mostrano effetti di permeabilizzazione ad opera della radiazione millimetrica con frequenza ~2,9 THz con potenza media 1,642 mWcm-2 e
picchi a 8,212 mWcm-2) applicata alle cellule della linea HeLa per i tempi di
irradiamento compresi fra 30 e due ore. Questa evidenza sperimentale si inserisce in un contesto controverso, dove diversi studi hanno mostrato in alcuni casi ridotti o assenti effetti sulla biologia cellulare (ad esempio con verificata tramite comet assay, test del micronucleo e test di proliferazione[125]), mentre in altri sono state dimostrate alcune
alterazioni, tra le quali hanno interesse centrale la potenziale cancerogenicità e mutazioni nella progenie dovuta all'alterazione di geni.
Durante la conduzione del presente lavoro è stata valutata la possibilità di raffrontare l'area delle cellule prima e dopo l'irraggiamento nei trattati rispetto ai controlli grazie alle misure derivate dalle ROI. Ciò permetterebbe di valutare l'effetto della radiazione THz sulla biologia cellulare in particolare per quanto concerne strutture fondamentali come citoscheletro. Anche forma e motilità cellulare potrebbero essere un ragionevole oggetto di indagine in condizioni sperimentali simili. Da una prima analisi dei dati per quanto concerne le variazioni di area non è emerso alcun tipo di differenza tra cellule irradiate e controlli (dati non riportati), dunque questo ambito di indagine è stato abbandonato precocemente nel presente studio.
È bene sottolineare che gli esperimenti condotti sono stati fatti utilizzando sempre un'unica frequenza e con flusso di energia medio lievemente superiore a quanto considerato il limite secondo le raccomandazioni dell'ICNIRP, International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection, ente che raccomanda di non superare 1 mWcm-2
per l'esposizione umana. Tuttavia è bene ricordare che tale limite è riferito a radiazioni a fino a 300 GHz, identico limite a quello previste dalla legge Italiana[111], situazione che
ricalca un vuoto di conoscenze e sperimentazioni nel cosiddetto “teraherz gap”[126] ossia
l'intervallo di frequenze comprese circa fra i 100 GHz ed i 10 THz ed oltre, situazione probabilmente dovuta alla pregressa assenza di dispositivi in grado di produrre quantità consistenti di queste radiazioni.
Limitazioni e suggerimenti per futuri studi.
La procedura sperimentale adottata ha garantito contemporanei spostamenti e condizioni ambientali per le cellule esposte alle radiazioni e per quelle di controllo, tuttavia soltanto il microscopio confocale era munito di atmosfera a flusso controllato di CO2 al 5% con temperatura tenuta costante di 37°C. Per contro il setup per l'esposizione
al laser terahertz era privo di atmosfera controllata e si è svolto a temperatura ambiente di circa 20 °C. Dunque, sebbene le medesime condizioni ambientali contingenti presenti nel laboratorio al momento degli esperimenti siano state garantite per trattati e controlli, non è stato possibile assicurare valori ottimali di temperatura e CO2 durante l'esposizione al
laser,, potenzialmente dando luogo a alterazioni della fisiologia e biologia cellulare dei campioni durante l'irraggiamento.
Un elemento che dovrebbe essere preso in considerazione in futuri studi i quali vogliano ispirarsi al presente, è la diffrazione della radiazione THz nel mezzo acquoso la quale potrebbe influenzare minimamente le cellule di controllo.
La linea cellulare utilizzata è estremamente resistente e sicuramente altre linee non tumorali possono essere considerate migliori modelli per le cellule del corpo umano
Ulteriori studi sono raccomandabili per chiarire elementi così cruciali della interazione di questa parte dello spettro elettromagnetico la quale è destinata ad aumentare negli ambienti in cui viviamo, sia per usi legati alla sicurezza, che per usi in ambiti lavorativi industriali, telecomunicazioni a breve distanza e per applicazioni biomediche di imaging.
