Riassunto
Il progetto in cui si inserisce il mio lavoro di tesi ha come obbiettivo finale quello di proporre il lievito S. cerevisiae come sistema modello per la produzione di vettori derivati dal virus adeno-associato (AAV) per la terapia genica.
AAV è un virus difettivo, non patogeno, della famiglia dei Parvovirus che dipende dalla co-infezione di un virus helper (come adenovirus o Herpes simplex) per una sua
replicazione produttiva. In assenza del virus helper, AAV stabilisce un’infezione latente attraverso un’ integrazione sito specifica nel genoma dell’ospite o resta in una forma episomale persistente.
La tesi si propone di aumentare e di ottimizzare l’espressione di VP1, VP2 e VP3, le tre proteine del capside di AAV per permettere la formazione del capside stesso nel ceppo di lievito RSY12.
E’ stato visto che per l’assemblaggio corretto dei capsidi ricombinanti di AAV le tre proteine devono essere espresse secondo un rapporto di concentrazione VP1:VP2:VP3 che oscilla da 1:1:8 a 1:1:20 rispettivamente. Questo è molto importante poiché solo i capsidi assemblati in maniera corretta sono capaci di infettare le cellule umane.
In laboratorio, erano già disponibili un vettore in cui l’espressione della proteina VP3 è controllata dal promotore p40 di AAV ed un altro che esprime la proteina VP1 sotto il controllo del promotore inducibile da galattosio pGAL.
Il vettore contenente il gene VP3 sotto il controllo del promotore p40 è stato dimostrato essere attivo in lievito ma l’espressione della proteina non raggiunge alti livelli rispetto a VP1 controllato da pGAL.
Quindi, nell'intento di aumentare il livello di espressione di VP3 rispetto a VP1 abbiamo costruito, mediante diversi steps di clonaggio, tre diversi vettori contenenti le sequenze codificanti VP2 e VP3. In due vettori VP2 e VP3 sono stati clonati sotto il controllo del promotore pADH700 che è stato dimostrato essere attivo in tutte le fasi di crescita, ottenendo il vettore pESCADH700-VP2,3 e pESCADH700-UTR-VP2,3.
In quest’ultimo vettore è stata mantenuta una sequenza UTR presente nel sistema naturale tra i due diversi “start sites” che potrebbe avere un funzione regolatoria. In un terzo vettore, la sequenza VP2,3 è stata clonata sotto il controllo del pGAL, inducibile da galattosio, strettamente regolato in S. cerevisiae e fortemente represso in presenza di glucosio, ottenendo il vettore pGAL-VP2,3.
L’analisi dell’espressione delle proteine dai costrutti suddetti, effettuata mediante Western blot utilizzando un anticorpo specifico per le tre proteine capsidiche, ha mostrato una maggiore quantità di VP2 e VP3 ottenuta da cellule del ceppo di lievito RSY12 trasformate con pESCADH700-VP2,3 rispetto a quelle trasformate con
pESCADH700-UTR-VP2,3. Ancora migliore è il livello di espressione di queste proteine con il vettore pESCGAL10VP2,3.
Ottenuto l’aumento della proteine VP2,3 è stato costruito un nuovo vettore che contiene le sequenza codificante per le tre proteine capsidiche sotto la regolazione di pGAL1 e pGAL10: pESCLEUGalVP2,3GalVP1KM.
Altri due vettori che abbiamo costruito ponendo sempre le tre proteine capsidiche sotto il controllo di promotori pGAL sono: pESCGAL1VP1KM e pYESGAL1VP2,3. Dopo aver trasformato le cellule di lievito con varie combinazioni di questi vettori, siamo arrivati a capire che la presenza nella cellula di un vettore contenente
pGALVP2,3 determini un maggior numero di copie di questi due geni e porti ad un più alto livello delle due proteine.
Finora, i risultati ottenuti indicano un aumento della quantità di proteine e presumibilmente anche di capsidi AAV nel lievito.
La formazione di questi capsidi AAV viene analizzata cercando di mettere a punto la loro purificazione ed estrazione con ultracentrifuga e cuschion di saccarosio al 40%.
Questo studio ci permetterà di capire se il lievito S. cerevisiae possa essere utilizzato come sistema modello non solo per lo studio dei fattori coinvolti nell’assemblaggio del capside virale, ma anche per il suo successivo packaging con il genoma single strand di AAV.
