Valutazione degli effetti modulatori di tre specie di Echinacea sulla generazione, maturazione e attivita' funzionale delle cellule dendritiche umane

Università di Pisa

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Corso di Laurea in

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Tesi di Laurea

Valutazione degli effetti modulatori di tre specie di

Echinacea sulla generazione, maturazione e attività

funzionale delle cellule dendritiche umane

Candidato

Marta Compagnino

Relatore

Prof. Rita Consolini

A tutte le persone che hanno creduto in me e che mi hanno sostenuto in questo lungo cammino. Grazie.

Indice

1.1.3 Distribuzione geografica e coltivazione ...7

1.1.4 Storia, folclore e leggende sull’uso dell’Echinacea...8

1.1.5 Composizione chimica...10

1.1.6 Attività farmacologiche ...13

1.2 Le cellule dendritiche...19

1.2.1 Caratteristiche generali ...19

1.2.2 Origine e generazione ...20

1.2.3 Ruolo delle cellule dendritiche nell’immunità...25

Capitolo 2. Materiali e Metodi ...34

2.1 Materiali...35

2.2 Metodi...37

2.2.1 Purificazione magnetica delle cellule CD14+...37

2.2.2 Generazione in vitro delle DC da monociti circolanti ...39

2.2.3 Trattamento in vitro con estratti di Echinacea ...40

2.2.4 Recupero delle DC dai pozzetti di coltura e valutazione della vitalità...41

2.2.5 Caratterizzazione morfologica delle cellule coltivate...42

2.2.6 Caratterizzazione immunofenotipica mediante citometria a flusso...42

2.2.7 Analisi funzionale delle cellule dendritiche...43

2.2.8 Analisi statistica...45

Capitolo 3. Risultati...46

3.1 Vitalità e caratterizzazione morfologica delle cellule dendritiche...47

3.1.1 Valutazione della vitalità ...47

3.1.2 Analisi morfologica ...47

3.2 Caratterizzazione immunofenotipica delle cellule dendritiche...48

3.2.1 Echinacea aggiunta al giorno 0 di coltura...49

3.2.2 Echinacea aggiunta al giorno +6 di coltura ...55

3.3 Analisi funzionale delle cellule dendritiche...59

3.3.1 Endocitosi di FITC-destrano...59

3.3.2 Dosaggio immunoenzimatico delle citochine...60

Indice

Capitolo 4. Discussione...63

Conclusioni ...71

Ringraziamenti...73

Indice delle figure ...74

Indice delle tabelle ...75

Elenco degli acronimi ...76

Riassunto

Introduzione. L’Echinacea è una pianta erbacea perenne originaria del Nord America, ma

da molto tempo coltivata anche in Europa. Esistono dieci specie appartenenti al genere, di cui solo tre presentano proprietà medicinali: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida,

Echinacea purpurea.

Ad oggi formulazioni costituite da estratti di Echinacea sono state impiegate comunemente in virtù della loro attività immunostimolante, antinfiammatoria, antivirale e antiossidante, anche se il meccanismo d’azione dei principi attivi di tali componenti non è stato ancora sufficientemente investigato.

Pertanto questo studio si è proposto di approfondire il meccanismo di azione tramite cui i fitoestratti di Echinacea svolgono l’attività immunostimolante; in particolare è stato indagato l’effetto di tali composti sulla generazione, maturazione e attività funzionale delle cellule dendritiche (DC). Le DC sono le più importanti cellule presentanti l’antigene: controllano sia l’inizio che il mantenimento delle risposte immuni adattative e l’induzione di tolleranza.

Materiali e Metodi. Le DC sono state generate a partire da monociti CD14+ _circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da buffy coat di donatori sani mediante separazione immunomagnetica. I monociti CD14+ _{così ottenuti sono stati coltivati in} terreno RPMI 1640 addizionato di siero fetale bovino, L-glutammina, streptomicina e penicillina, e supplementato con fattori di crescita (GM-CSF e IL-4), in presenza o assenza di estratto di radice delle tre specie di Echinacea a concentrazioni comprese tra 3 e 300 µg/mL.

Riassunto

Al 6° giorno di coltura le cellule ottenute sono state indotte a maturare mediante aggiunta di LPS per ulteriori 24 ore; al 7° giorno le cellule mature sono state sottoposte ad analisi morfologica (tramite allestimento di citocentrifugati e colorazione May-Grunwald Giemsa) e fenotipica (mediante citometria a flusso). Marcatori utilizzati sono l’antigene CD14, espresso dai monociti e perso durante il processo di generazione delle DC, le molecole costimolatorie CD40 e CD80, l’antigene HLA di classe II (HLA-DR) e l’antigene CD83 espresso dalle DC mature.

Studi funzionali delle DC, in presenza di E. purpurea, hanno compreso l’analisi citofluorimetrica dell’attività endocitotica mediata dal recettore per il mannosio, utilizzando come antigene il destrano FITC-coniugato, ed il dosaggio con metodo immunoenzimatico delle citochine (IL-6, IL-1, IL-10, IL-12, TGF-β, TNF-α) rilasciate nei surnatanti delle colture di DC.

Risultati. I fitoestratti non compromettono la generazione delle DC a partire dai monociti

(perdita di espressione dell’antigene CD14), mentre ne ostacolano la maturazione, come mostrato dalla ridotta espressione dell’antigene CD83 (< 10%) rispetto ai controlli (> 83%). In presenza di Echinacea, inoltre, è stata osservata una ridotta espressione (sia come percentuale che come intensità media di fluorescenza) delle molecole di superficie CD80 (< 55%) e HLA-DR (< 60%), rispetto al controllo (rispettivamente > 84% e > 86%); per quanto riguarda l’antigene CD40 è stata osservata una riduzione di espressione della sola intensità media di fluorescenza (< 500, nel controllo: 700). Non sono state riscontrate differenze significative relative al fenotipo cellulare tra gli estratti provenienti dalle tre specie in analisi.

Riassunto

v

Dall’analisi dell’endocitosi, in presenza dell’E. purpurea alla concentrazione di 100 μg/mL, sono emersi risultati contrastanti, in quanto alcuni esperimenti hanno mostrato un incremento dell’attività endocitotica mentre altri una riduzione, sebbene nessun dato sia statisticamente significativo. Sono quindi necessari ulteriori esperimenti.

Conclusioni. Questi risultati preliminari dimostrano un’attività immunomodulatoria

dell’Echinacea sulle DC, con effetti sovrapponibili per tutte e tre le specie. L’attività funzionale delle suddette cellule sarà oggetto di ulteriori approfondimenti.

Abstract

Introduction. Echinacea represents a perennial plant indigenous to North America, but

also cultured in Europe since a lot of years.

Ten species belong to this genus, but only three species show pharmacological properties:

E. angustifolia, E. pallida, E. purpurea.

Up to date, formulations with Echinacea extracts are usually used for their immunomodulatory, antiiflammatory, antiviral and antioxidant activities, even if the mechanism of the action of their component has not yet been investigated.

Our study would understand the mechanism of the action by which Echinacea phytocompounds have an immunoenhancing activity; above all, we investigated the effects of these extracts on dendritic cells (DCs) generation, maturation and biological activity. DCs are the most important antigen-presenting cells: they check both the first phase and the maintenance of adaptative immune responses and the induction of tolerance.

Materials and Methods. DCs are generated from CD14+ _{circling monocytes, obtained} from mononuclear cells of healthy donors, through an immunomagnetic system. Monocytes are cultured in RPMI 1640 medium, added with fetal bovine serum, L-glutamine, streptomycin and penicillin and supplemented with growth factors (GM-CSF and IL-4), in presence or absence of Echinacea (E. purpurea, E. pallida, E. angustifolia) root extracts. These extracts are tested at a concentration range from 3 to 300 μg/mL. After 6 days of incubation, LPS is added to the culture, in order to induce maturation.

Morphological and phenotypical analysis are performed respectively by cytospin, May-Grunwald Giemsa staining and cytometric assays.

Abstract

vii

The markers used are CD14 antigen, present on monocytes surface, but not on DC surface, CD40 and CD80 costimulatory molecules, HLA class II (HLA-DR) antigen and CD83 antigen, expressed by mature DCs.

Functional studies on DCs generated in presence of E. purpurea include cytometric analysis of endocytotic activity mediated by mannose receptor and the dosage of culture surnatant cytokines (IL-6, IL-1, IL-10, IL-12, TNF-α, TGF-β) through an enzyme immunoassay.

Results. The phytocompounds don’t compromise DC generation from monocytes (loss of

CD14 expression on cells surface), while they interfere with the maturation, as the reduced expression of CD83 antigen (< 10%) shows if compared to the control (> 83%). Moreover, in presence of Echinacea, a reduced expression (both as percentage and mean) of the CD80 (< 55%) and HLA-DR (< 60%) has been observed, if compared to the control (respectively > 84% and > 86%); as far the CD40 antigen is concerned, its percentage remains unchanged, while the mean decreases in presence of the extracts (< 500) compared to the control (= 700). No significant differences of cell phenotype among the extracts belonging to the three analysed species have been noticed.

In endocytosis assay, in presence of E. purpurea at 100 μg/mL concentration, our experiments showed contrasting results. Some experiments displayed an increment of endocytic activity, while others displayed a reduction, although any result is not statistically significant.

Conclusions. These preliminary results show that Echinacea has an immunomodulatory

activity, with superimposable effects for each species on DCs. Further investigations deserve about the functional features of DCs treated with Echinacea.