2. MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi

57

2. MATERIALI E METODI

2.1

M

V

Il materiale vegetale utilizzato è costituito: dalla specie Helianthus annus, accessione HT S. Pietro/100 (HTPI) fornito dal Dipartimento di Biologia delle Piante Agrarie, Università di Pisa; dall’ibrido interspecifico tetraploide H. annuus x H. tuberosus (2n = 4x = 68), prodotto dall’incrocio di piante della linea pura HA89 di H. annuus, usata come pianta femminile emasculata manualmente prima dell’allungamento dello stilo, con individui di Helianthus tuberosus accessione HT S. Pietro/100 (HTPI). Il materiale ibrido è anche impiegato in esperimenti di rigenerazione in vitro condotti nella Sezione di Genetica del Dipartimento di Biologia delle Piante Agrarie. Essendo l’H. tuberosus una specie allogoma, ogni seme ottenuto dall’ibridazione interspecifica è geneticamente diverso, di conseguenza ogni seme è stato propagato in vitro attraverso il metodo del “single node cutting” per ottenenere cloni da cui sono stati prelevati espianti fogliari utilizzati nella rigenerazione (Fambrini et al., 1996; 1997; Bianchi et al., 1999). Tali esperimenti hanno consentito di isolare cloni che manifestano un’elevata potenzialità morfogenetica in vitro (Fambrini et al., 1997; Bianchi et al., 1999). In particolare, in questo lavoro di tesi si è preso in considerazione il clone EMB-2 derivato dalla rigenerazione dell’ibrido A-2 di H. annuus x H. tuberosus. Una preliminare caratterizzazione istologica ha dimostrato che il clone EMB-2 manifesta fenomeni di epifillia in vivo ed in vitro con la produzione di germogli ed embrioni ectopici (Fambrini et al., 2000).

58

2.1.1

C

A-2

EMB-2

’

INTERSPECIFICO

H. ANNUUS X H. TUBEROSUS

Le plantule dei cloni A-2 (controllo) ed EMB-2 (clone epifillico) dell’ibrido inerspcifico

H. annuus x H. tuberosus sono state propagate in vitro per frammenti di fusto a singolo

nodo (“single node cutting”) nel substrato di Murashige e Skoog (1962) privo di ormoni. Le beute da 125 ml sono state mentenute in camera di crescita alla temperatura di 25 + 1°C, con fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio ed un intensità luminosa pari a 35 µmol m-2 s-1, fornita da tubi fluorescenti Sylvania Day Light F 36 W/ 56.

2.1.2

A

HELINTHUS ANNUUS,

H. ANNUUS X

H.

A-2)

H. ANNUUS X H. TUBEROSUS

(

)

Plantule di H. annuus x H. tuberosus (cloni: A-2 e EMB-2), radicate, ottenute con il metodo “single node cutting”, sono state trasferite in vasi contenenti una miscela di terreno commerciale, torba e vermiculite, dopo aver eliminato con accurato lavaggio i residui di substrato dalle radici. Le plantule in vaso, protette con coperture di plastica per prevenire la disidratazione e favorire l’attecchimento, sono state allevate in camera di crescita, con fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio e un intensità luminosa pari a 35 µmol m-2 s-1, alla temperatura di 22 + 1 °C. Dopo 15-20 giorni la copertura è stata rimossa e le piantine sono state cresciute fino alla fioritura e alla produzione dei tuberi. Nella stessa cella climatica sono state allevate le plantule della linea pura HA89 di H. annuus utilizzate per il prelievo degli organi su cui sono state condotte le analisi di espressione del gene HaL1L (RT-PCR Relativa ed ibridazione in situ).

Materiali e Metodi

59

2.2

E

RNA

L’estrazione degli RNA è stata condotta, in accordo con il protocollo del “TriPure Isolation Reagent Kit” (Roche), su embrioni immaturi, cotiledoni, foglie giovani (2 cm di lunghezza), foglie espanse (15 cm di lunghezza), radici, fusto ed infiorescenze immature di H. annuus (HA89), foglie epifilliche e non epifilliche del clone EMB-2 e foglie di piante A-2 di H. annuus x H. tuberosus. I campioni appena prelevati sono stati congelati mediante immersione in azoto liquido, quindi 300 mg di materiale sono stati polverizzati in mortaio mantenendoli ghiacciati sempre con azoto liquido. La polvere ottenuta è stata trasferita in una provetta da 2 ml ed incubata per 5 minuti a temperatura ambiente dopo l’aggiunta di 1 ml di “TriPure Isolation Reagent”. Successivamente, sono stati addizionati 200 µl di cloroformio e la provetta è stata agitata vigorosamente per 15 secondi, quindi lasciata a temperatura ambiente per 5 minuti ed infine centrifugata a 9000 rpm per 25 minuti in rotore Kroton A 8.24 a 4 °C. La fase superiore acquosa è stata recuperata e trasferita in un’altra provetta, dove sono stati aggiunti 500 µl d’isopropanolo ed il tutto è stato vigorosamente mescolato. La soluzione è stata incubata a temperatura ambiente per 10 minuti, per favorire la precipitazione del RNA, quindi centrifugata a 9000 rpm in rotore Kroton A 8.24 per 25 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato scartato, mentre il precipitato formatosi, è stato lavato per eliminare eventuali residui di cloroformio con 1 ml d’etanolo al 75%, centrifugando a 7500 rpm in rotore Kroton A 8.24 per 5 minuti a 4 °C. Il surnatante è stato scartato e l’RNA precipitato è stato fatto asciugare all’aria per eliminare i residui d’etanolo. L’RNA precipitato è stato poi sciolto in acqua trattata con DEPC e conservato a –80°C.

60

2.3

C

E

G

’A

C

D

Il gel è stato preparato sciogliendo l’agarosio in H2O DEPC con aggiunta di formaldeide

e MOPS 10X preriscaldati a 65 °C. La miscela è stata versata sul supporto e lasciata polimerizzare. Il gel polimerizzato è stato posto nel tampone di corsa (MOPS 1X) ed è stata effettuata una precorsa di 10 minuti a 60 mA. I campioni sono stati preparati aggiungendo 3 volumi di soluzione denaturante, incubandoli a 65 °C per 15 minuti. I campioni, così denaturati, sono stati tenuti in ghiaccio per 5 minuti e poi è stato aggiunto il tampone di caricamento in quantità pari a 1/5 del volume finale. Caricati i campioni, è stata effettuata una corsa per circa 2 ore a 50mA, per verificare l’integrità dell’RNA estratto.

Materiali e Metodi 61 Soluzioni utilizzate: GEL DI AGAROSIO 1% (70 ml): Agarosio 0,7 g H2O DEPC 52,5 ml Formaldeide 37% 10,5 ml MOPS 10X 7 ml SOLUZIONE DENATURANTE: MOPS 10X 50 ml Formaldeide 37% 75 ml Formammide deionizzata 250 ml TAMPONE DI CARICAMENTO: Saccarosio 30% Blu di Bromofenolo q.b.

62 MOPS 10X: MOPS 0,2 M (pH 7) Acetato di sodio 80 mM Na2EDTA 10 mM

2.4

R

Per la retrotrascrizione degli RNA è stato seguito il protocollo del “Super-script-Kit” (Invitrogen):

La miscela per la retrotrascrizione è costituita da:

oligonucleotide per RT (50 µM) 1 µl

RNA (5µg) X µl

dNTP( 20mM) 1 µl

H2O- DEPC q.b. fino a 12 µl

L’oligonucleotide per RT, ovvero per la retrotrascrizione, è stato, a seconda dei casi: Oligo-dT-Anchor, Oligo-dT o un oligonucleotide specifico. La miscela è stata incubata a 65 °C per 5 minuti quindi posta immediatamente in ghiaccio per 5 minuti. Successivamente, dopo aver centrifugato brevemente la soluzione, sono stati aggiunti

Materiali e Metodi

63 nell’ordine: 4µl di “First-Strand Buffer” (5X), 2 µl di 0.1M DTT ed 1µl di inibitore delle RNasi. La miscela è stata incubata a 42 °C per 2 minuti, quindi è stato aggiunto 1 µl di SuperScript II RT (200 U/µl) ed il tutto è stato rimesso ad incubare a 42 °C per 50 minuti. La reazione è bloccata ponendo la provetta a 70 °C per 15 minuti. Il cDNA ottenuto è amplificato in successive reazioni di PCR.

2.5

A

DNA

PCR

La miscela di reazione della retrotrascrizione, è stata utilizzata nella reazione di amplificazione con il seguente protocollo, al quale è fatto riferimento, nei paragrafi successivi, ogni volta che è richiamata la tecnica della PCR.

Miscela di amplificazione:

concentrazione iniziale concentrazione finale

Buffer (10X) 1X MgCl2 (25mM) 1,25 mM dNTPs (10mM) 0,20 mM P1 specifo (10µM) 0,2-0,4 µM P2 specifico (10µM) 0,2-0,4 µM  Taqpolimerasi 0,75 U/100 µl cDNA 1,00 µl H2O q.b. fino a 20 µl

64 Le condizioni di amplificazione variano a seconda degli oligonucleotidi utilizzati e della lunghezza degli amplificati attesi.

Esempio di un ciclo tipico:

temperatura (°C) 94 94 55 72 72

tempo 5’ 30’’ 20’’ 30’’ 7’

---

35 cicli

2.6

C

E

G

A

I campioni amplificati per mezzo della PCR sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio. L’agarosio era stato disciolto, a concentrazioni variabili tra l’1% ed il 2%, a seconda dell’ampiezza attesa per la banda amplificata, in un tampone Tris-acetato (TAE) 1X, contenente 0,5 µg/ml di bromuro d’etidio. Per il caricamento sono stati aggiunti ad ogni campione 0,2 volumi di tampone di caricamento.

Materiali e Metodi 65 Soluzioni utilizzate: TAMPONE DI CARICAMENTO: Saccarosio 60% (p/v) Na2EDTA pH 8 25 mM Orange G 0,1% (p/v)

TAMPONE TRIS-ACETATO (TAE) 10X:

Tris-acetato 0,4 M

Na2-EDTA 0,01 M

pH 7,7 con acido acetico glaciale

2.7

3’

RACE

Un oligonucleotide per condurre la 3’ RACE è stato selezionato allineando sequenze aminoacidiche di proteine L1L presenti in banca dati figura 5. L’allineamento ha consentito di scegliere un oligonucleotide, LEC2, di 21 nucleotidi di lunghezza. (GCTTCCATGGCTACCGCAAGC), capace di distinguere l’L1L non solo dalle proteine HAP3, ma anche dalla proteina LEC1 (Tabella 1). In questa reazione di amplificazione del cDNA, insieme all’oligonucleotide LEC2, è stato utilizzato l’oligonucleotide “Anchor”,

66 complementare ad una porzione dell’oligonucleotide Oligo-dT-Anchor a sua volta impiegato nella reazione di retrotrascrizione.

Le condizioni della reazione di amplificazione sono state le seguenti:

temperatura (°C) 94 94 55 72 72

tempo 5’ 30’’ 30’’ 50’’ 7’

---

M ate ria li e M etodi 67 Posizione cDNA 55-76 802-820 663-681 1-18 156-176 107-127 145-168 515-536 Caratteristiche senso antisenso senso senso antisenso antisenso antisenso antisenso antisenso senso Tm (°C) 61 54 50 51 54 64 64 64 72+64 72+32 72 68 66 Sequenza GCTTCCATGGCTACCGCAAGC GTAGATGGAGAGTGTCAG TATGCTCAGTGTAAAGAC CTAGAGAGAGACAATTCC CAATGCACTCATTGTCTTC TGCTTCTGCTTCATATCCGGC CTCATTGTCTTCTGTARATGTGG TGCTTCTGCTTCATATCCGGC GACCACGCGTCTCGATGTCGAC(G)16V GACCACGCGTCTCGATGTCGAC(T)16V GACCACGCGTCTCGATGTCGAC TYTCTGGWGGWGCAACCACC GATTCCGTTGCCCWGAGGTY Oligonucleotidi LEC2 CHI-SR CHI-SF CHI-TCDNA CHI-REL CHI 5-1 CHI 5-2 CHI 5-3 Oligo-dG-Anchor Oligo-dT-Anchor Anchor ACT3 ACT5 T abe lla 1. O lig onuc le ot idi ut iliz za ti ne lle r ea zioni di r etr ot ra sc riz ione e a m pl ifi ca zione .

68

A.t LEC1 ---MTSSVIVAGAGDKNNGIVVQQQPPCVAREQD 31

A.t L1L MERGGFHGYRKLSVNNTTPSPPGLAANFLMAEGSMRPPEFNQPNKTSNGGEEECTVREQD 60 P.c L1L MESGGFHGYRKLP--NTTS--PGLKLSVSDMNNVNTSRQVAGDNNHTADESNECTVREQD 56 .. . * . *..**** LEC1 QYMPIANVIRIMRKTLPSHAKISDDAKETIQECVSEYISFVTGEANERCQREQRKTITAE 91 L1L RFMPIANVIRIMRRILPAHAKISDDSKETIQECVSEYISFITGEANERCQREQRKTITAE 120 P.coc L1L RFMPIANVIRIMRKILPPHAKISGDAKETIQECVSEYISFITGEANERCQREQRKTITAE 116 ::***********: **.*****.*:**************:******************* LEC1 DILWAMSKLGFDNYVDPLTVFINRYREIETDRGSALRGEPPSLRQTYGGNGIGFHGPSHG 151 L1L DVLWAMSKLGFDDYIEPLTLYLHRYRELEGERGVSCSAGSVSMTNGLVVKRPNGTMTEYG 180 P.coc L1L DVLWAMSKLGFDDYMEPLTMYLHRYRELEGDR---TSMRGESLGKRTIEYAPMGVGVAT- 172 *:**********:*::***::::****:* :* *: : LEC1 LPPPGPYGYGMLDQSMVMGGGRYYQNGSSGQDESSVGGGSSSSINGMPAFDHYGQYK 208 L1L AYGPVPGIHMAQYHYRHQNGFVFSGNEPNSKMSGSSSGASGARVEVFPTQQHKY--- 234 P.coc L1L AFVP-PQFHPNGYYGPAMGAYVAPPNAASSHHHGMPNTEPNARSM--- 216 * * : .. * ...: . . ..:

Figura 5. Allineamento delle sequenze aminoacidiche di LEC1 e L1L di A. thaliana (L1L: AY138461, LEC1: AF036684) e di L1L di P. coccineus

Materiali e Metodi

69

2.8

5'

RACE

Questa tecnica permette l’isolamento e il sequenziamento dell’estremità 5' di un mRNA. L’mRNA è stato retrotrascritto, con l’oligonucleotide antisenso gene-specifico CHI 5-3 (Tabella 1), per ottenere il primo filamento di cDNA. Dopo digestione con RNasi, per degradare l’RNA residuo, il cDNA è stato purificato dai nucleotidi non incorporati e dall’oligonucleotide. Alle estremità 3’ del cDNA è stata costituita una coda di poli-C, mediante l’utilizzo di TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase), che consente l’appaiamento dell’oligonucleotide Oligo-dG-anchor. Quest’ultimo oligonucleotide è stato utilizzato, in una prima reazione di PCR, in coppia con un oligonucleotide specifico: CHI 5-2. L’amplificato ottenuto è stato re-amplificato in una seconda reazione di PCR con un terzo oligonucleotide sequenza-specifico, CHI 5-1, e l’oligonucleotide Anchor. Di seguito è descritta la reazione.

I FASE:SINTESI DEL CDNA

In una provetta da 0,5 ml sono stati aggiunti:

RNA totale: 5 µg

Oligonucleotide CHI 5-3 (2,2 µM) 1.14 µl

70 La miscela è stata incubata a 70 °C per 15 minuti per denaturare l’RNA e posta in ghiaccio per 1 minuto per bloccare la reazione. Dopodiché alla miscela di reazione sono aggiunti:

PCR buffer 10X : 2,5 µl

MgCl2 25 mM 2,5 µl

dNTP (10 mM ciascuno): 1,0 µl

DTT 0,1 M: 2,5 µl

La miscela è stata incubata per 1 minuto a 42 °C, dopodiché è stato aggiunto 1µl di retrotrascrittasi (SuperScript II RT: 200 unità per µl) e mantenuta a 42 °C per 50 minuti. Il volume finale della reazione era 25µl. Infine, la reazione è stata bloccata incubando la miscela a 70 °C per 15 minuti.

IIFASE:PURIFICAZIONE DEL CDNA

Terminata la retrotrascrizione, l’RNA residuo è stato eliminato mediante digestione enzimatica aggiungendo 1µl di RNasi e incubando per 30 minuti a 37 °C. Alla fine la reazione è stata bloccata ponendo la miscela in ghiaccio.

Materiali e Metodi

71 III Fase: Attacco di una coda di poli-C in posizione 3'

Alle estremità 3' del cDNA è stata costituita una coda di poli-C utilizzata in seguito come sito di riconoscimento del primer Oligo-dG-anchor. La reazione è stata la seguente:

in un tubo da centrifuga da 0,5 ml sono stati aggiunti

cDNA purificato: 6,5 µl

dCTP 2 mM: 2,5 µl

Tailing Buffer 5X: 5,0 µl

La miscela è stata incubata 3 minuti a 94 °C e posta in ghiaccio per 1 minuto. È stato aggiunto lµl di TdT e la reazione è avvenuta incubando a 37 °C per 10 minuti. Per inattivare la TdT la miscela è stata scaldata a 65 °C per 10 minuti.

72 IVFASE:AMPLIFICAZIONE DEL CDNA

Il cDNA così ottenuto è stato amplificato mediante PCR in una reazione di 50 µl come segue: cDNA stampo: 5 µl PCR buffer 10X: 5 µl MgCl2 50 mM: 3 µl dNTP (10 mM ciascuno): 4 µl oligonucleotide CHI5-2 (10 µM): 2 µl oligonucleotide Oligo-dG-anchor (10 µM): 2 µl

Taq polimerasi 5 U/ µl (Promega): 0,5 µl

H2O: 28,5 µl

Le condizioni di reazione sono state le seguenti:

temperatura (°C) 94 94 55 72 72

tempo 5’ 30’’ 30’’ 20’’ 7’

---

Materiali e Metodi

73

2.9

C

DNA

I prodotti ottenuti dalle reazioni di 3’ RACE e 5’ RACE sono stati clonati in vettore opportuno. I prodotti di amplificazione sono clonati secondo il protocollo del “TOPO Cloning Kit” (Invitrogen). La procedura qui descritta è utilizzata ogni volta sia stato necessario effettuare un clonaggio.

2.9.1

I

’

DNA

(“LIGATION”)

In una provetta da 0.5 ml è stata preparata la miscela di legame:

Prodotto di PCR 0,5-4 µl

Salt Solution 1 µl

TOPO vector 1 µl

H2O q.b. fino a 6 µl

La miscela è stata incubata a temperatura ambiente (22-23 °C), per un tempo che può variare da 30 secondi a 30 minuti e messa in seguito in ghiaccio.

74

2.9.2

T

Sono stati aggiunti 2 µl della miscela di legame in una provetta contenente una coltura di cellule di “One Shot Chemically Competent E. coli”, rese chimicamente competenti ad accogliere il DNA plasmidico. Per consentire la trasformazione, in altre parole l’inserimento del plasmide nelle cellule batteriche, è necessario uno “shock” termico che è eseguito come descritto: la provetta è stata incubata in ghiaccio per 30 minuti, quindi rapidamente trasferita a 42 °C per 30 secondi e subito dopo di nuovo in ghiaccio per 2 minuti. Successivamente sono stati aggiunti 250 µl di SOC (brodo di coltura) e di seguito è stata effettuata un’incubazione di un’ora a 37 °C in agitatore orizzontale. Quindi 100 µl della coltura di cellule trasformate sono stesi accuratamente su piastre di substrato solido di coltura (preriscaldate a 37 °C). Queste sono state incubate a 37 °C o.n., per permettere la crescita batterica. La selezione delle colonie viene fatta col metodo della distinzione blu-bianco: nel plasmide è infatti presente l’operone Lac-Z che codifica per il polipeptide beta-galattosidasi; quest’enzima è in grado di scindere la molecola X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galattopiranoside) in 5-bromo-4-cloroindolil e 5,5’-dibromo-4,4’-dicloroindigo che è di colore blu. Poiché durante il clonaggio, il frammento s’inserisce all’interno dell’operone, viene interrotta la sequenza per la beta-galattosidasi che non è più sintetizzata. Le cellule che contengono l’inserto non saranno in grado di scindere lo X-gal presente nel substrato, quindi saranno di colore bianco; mentre quelle prive dell’inserto metabolizzeranno lo X-gal colorandosi di blu. Le colonie bianche sono state sospese singolarmente in provette con LB e ampicillina, e fatte crescere o.n. a 37 °C. I cloni si conservano in glicerolo al 20% a –80 °C.

Materiali e Metodi

75

2.9.3

S

C

Nella fase di amplificazione possono crearsi artefatti, in quantità non visualizzabili su gel di agarosio, che sono però clonati contemporaneamente agli amplificati specifici. Tali artefatti, che possono essere della stessa dimensione degli amplificati specifici, presentano, ad entrambe le estremità, lo stesso oligonucleotide (P1/P1 e P2/P2). E’ necessario quindi individuare le colonie bianche effettivamente contenenti l’inserto d’interesse. A tale proposito è stata effettuata una PCR da colonie, in cui è utilizzata direttamente un’aliquota della sospensione batterica. Devono essere impiegati non più di 2 µl di sospensione batterica, in volumi di 20 µl totali di miscela di amplificazione. Le condizioni di PCR sono le stesse già descritte, è stato però prolungato a 10 minuti il tempo iniziale di denaturazione, prima della fase ciclica, per ottenere lisi delle cellule batteriche e liberazione del DNA plasmidico, che deve essere impiegato come stampo. Oltre ad utilizzare una miscela d’amplificazione contenente entrambi gli oligonucleotidi, sono state condotte separatamente anche amplificazioni con miscele contenenti singolarmente i due oligonucleotidi. Queste ultime servono ad evidenziare gli artefatti del tipo: P1/ P1 e P2/P2. Sono stati considerati positivi i cloni i cui amplificati sono ottenibili solo con la miscela di incubazione contenente entrambi gli oligonucleotidi contemporaneamente, e che, visualizzati su gel di agarosio, risultano essere delle dimensioni attese.

76 Soluzioni utilizzate: LB (LURIA-BERTANI) LIQUIDO: Bactotriptone 10 g Yeast extract 5 g NaCl 5 g H20 1 l

YT AGAR SOLIDO UTILIZZATO PER LE PIASTRE:

Bactotriptone 8 g Yeast extract 5 g NaCl 5 g Bacto-Agar 15 g H20 1 l AMPICILLINA:

Materiali e Metodi

77

2.9.4

E

DNA

Il DNA plasmidico dei cloni selezionati è stato estratto in accordo con il protocollo del ”High Pure Plasmid Isolation Kit” (Roche). Circa 20 µl di crescita dei cloni conservati a -80 °C sono stati sospesi in 4 ml di substato LB, contenente ampicillina, e incubati a 37 °C o.n. Al termine dell’incubazione la crescita batterica è stata centrifugata a 9000 rpm per 30 secondi, in centrifuga da tavolo. Il surnatante è stato scartato, le cellule impacchettate sono state nuovamente sospese in 250 µl di tampone di sospensione contenente RNasi. Quindi sono stati aggiunti 250 µl di tampone di lisi e la miscela incubata a temperatura ambiente per 5 minuti. Successivamente sono stati aggiunti 350 µl di tampone di legame pre-raffreddato ed il tutto è stato incubato, in ghiaccio, per 5 minuti. Al fine di eliminare la fase precipitata, è stata effettuata, in centrifuga da tavolo, una centrifugazione a 14000 rpm per 10 minuti; il surnatante, contenente il DNA plasmidico, è stato recuperato e messo in una provetta munita di filtro. Quindi, è stata condotta una centrifugazione a 14000 rpm per 40 secondi e la soluzione che passa attraverso il filtro è stata scartata. Il filtro è stato lavato con 700 µl di tampone di lavaggio, centrifugando a 14000 rpm per 40 secondi. Un’ulteriore centrifugazione nelle stesse condizioni è stata eseguita per eliminare i residui del tampone di lavaggio. Il DNA, presente nel filtro, è stato recuperato aggiungendo 50 µl di H2O

78

2.10

S

DNA

I plasmidi contenenti gli inserti sono stati sequenziati in entrambe le direzioni (usando gli oligonucleotidi M13R e M13F) con un sequenziatore automatico da parte della ditta MWG (Ebersberg, Germany). Sono sufficienti 1,5 µg circa di DNA che deve essere inviato seccato in provette da 1,5 ml.

La precipitazione è stata ottenuta nel modo seguente:

DNA plasmidico Xµl

acetato di sodio 3M pH 5.2 0,1 Xµl

alcol etilico assoluto a –20 °C 2,2 Xµl

Dove X è il volume della preparazione di DNA contenente 1,5 µg.

La miscela è stata incubata a –80 °C per 1 ora oppure a –20 °C o.n., per precipitare il DNA che è stato recuperato con una centrifugazione a 9000 rpm per 15 minuti a 4 °C Kroton A 8.24. Il surnatante è stato scartato, mentre il precipitato è stato lavato con 300 µl di alcool etilico al 70% freddo, centrifugando a 9000 rpm per 15 minuti a 4 °C. Il DNA precipitato è stato lasciato asciugare all’aria.

Materiali e Metodi

79

2.11

Le sequenze nucleotidiche ottenute sono state comparate con le sequenze depositate in banca dati (GenBank/EMBL) mediante i programmi FASTA (Pearson, 1990) e BLAST-N (Altschul et al. 1990) per l’individuazione di sequenze omologhe. Ciò ha permesso di identificare i cDNA clonati come relativi al gene L1L di Heliantus annuus. Le informazioni derivate dal sequenziamento delle regioni 5’ e 3’ sono state utilizzate per scegliere oligonucleotidi specifici: CHI-TcDNA, CHI-SR e CHI-SF. Il primo è stato utilizzato in coppia con l’oligonucleotide Anchor per ottenere un amplificato di tutto il cDNA comprendente la coda poli-A, che è stato clonato e sequenziato (clone HaK-3). La sequenza è depositata in banca dati con il codice d’accessione: AJ863116. Gli oligonucleotidi CHI-SR e CHI-SF sono stati utilizzati per l’amplificazione di una regione al 3’UTR per la preparazione di una sonda in grado di distinguere il gene L1L dal gene

LEC1 in esperimenti d’ibridazione in situ. Questa regione è inserita nel clone L1L-Sonda.

2.12

P

S

Il DNA plasmidico contenente la porzione del cDNA codificante per la sequenza delimitata dai due oligonucleotidi specifici, CHI-SR e CHI-SF, del gene L1L è stato amplificato per preparare una sonda molecolare da utilizzare in esperimenti di ibridazione in

situ. Dal clone L1L-Sonda, conservato a –80 °C, con ansa sterile è stata raccolta un’aliquota

di cellule che è stata inoculata in una provetta da 1,5 ml contenente 1 ml di substrato LB ed ampicillina. La coltura è stata lasciata crescere su un agitatore per 14-16 ore a 37 °C. Una diluzione opportuna della crescita è stata utilizzata come stampo per le reazioni di PCR.

80 Con il sequenziamento del DNA plasmidico contenente il cDNA e l’analisi della sequenza è stato possibile capire l’orientamento dell’inserto e stabilire i giusti accoppiamenti oligonucleotidi specifici/ M13F o M13R. Le reazioni d’amplificazione sono state condotte come precedentemente descritto.

Oligonucleotidi utilizzati nelle amplificazioni per la sonda a RNA usata nell’ibridazione in situ:

Antisenso: CHI-SF accoppiato con M13F

Senso: CHI-SR accoppiato con M13R

2.13

M

S

IBRIDAZIONE IN SITU

Il metodo non radioattivo del “DIG-RNA Labeling Kit Nonradioactive” (Roche) è stato utilizzato, secondo protocollo fornito dalla ditta, per realizzare la sonda a RNA complementare al cDNA codificante per l’L1L, in grado di ibridarsi con il relativo mRNA in esperimenti di ibridazione in situ.

Materiali e Metodi

81 miscela di reazione per la marcatura:

Antisenso Senso

(CHI-SF/M13F) (CHI-SR/M13R)

prodotto di PCR purificato: 200 ng 200 ng

10X transcription buffer: 2 µl 2 µl

10X NTP labelling mixture: 2 µl 2 µl

inibitore delle RNasi (20 unità/ µ l): 1 µl 1 µl

RNA polimerasi SP6/T7 (20 u/ µl): T7: 2 µl SP6: 2 µl

H2O DEPC fino a 20 µl fino a 20 µl

Il campione è stato incubato per 2 ore a 37 °C. Il DNA stampo è stato rimosso dalla miscela aggiungendovi 2 µl (20 unità) di DNasiI ed incubando 15 minuti a 37 °C. La trascrizione è stata bloccata aggiungendo 2 µl di EDTA 0,2 M DEPC a pH 8 e il trascritto ottenuto è stato precipitato con 2,5 µl di LiCl 4 M DEPC e 75 µl di etanolo assoluto pre-raffreddato, con incubazione o.n. a –20 °C. Dopo una centrifugazione di 25 minuti a 13.000 rpm, il precipitato è stato lavato con etanolo al 70% DEPC, asciugato a temperatura ambiente e solubilizzato in 30 µl di H2O DEPC, incubando a 37 °C per 15 minuti. La

trascrizione effettuata con T7 polimerasi ha permesso di ottenere la sonda antisenso, la trascizione operata dalla SP6 polimerasi ha invece consentito di ottenere la sonda senso.

82

2.14 I

in situ RNA:RNA

L'ibridazione in situ (ISH) è una tecnica molto potente e versatile che consente di individuare sequenze di DNA o di RNA, che hanno localizzazioni spesso specifiche, sia nelle cellule sia nei tessuti. Informazioni relative a quest’aspetto non sono, viceversa, deducibili da ibridazioni su “Southern” o “Northern-blot” che richiedono l’estrazione, mediante omogeneizzazione, e il trasferimento su membrana degli acidi nucleici. Dal punto di vista metodologico, la tecnica ISH comprende quattro fasi principali:

I fase: marcatura della sonda gia descritta nel paragrafo 2.13.

II fase: preparazione dei campioni e dei vetrini (fissazione, allestimento delle sezioni, trattamenti di pre-ibridazione),

III fase: ibridazione,

IV fase: visualizzazione e localizzazione del sito d’ibridazione (post-ibridazione).

Nel corso di queste tappe deve essere evitata la degradazione degli mRNA da parte delle RNasi. A tale scopo è necessario far uso di guanti, contenitori di plastica sterili e la vetreria deve essere sterilizzata a 180 °C per 2 ore in stufa a secco o autoclavata a 121 °C per 20 minuti. L'acqua, utilizzata per la preparazione di tutte le soluzioni deve essere “RNasi free” e viene preparata trattandola con DEPC (dietil-pirocarbonato) allo 0.1%, che è un forte, sebbene non totale, inibitore delle RNasi. L'acqua è poi autoclavata o bollita per inattivare il DEPC. Nei nostri esperimenti il materiale sperimentale utilizzato comprende: embrioni di H. annuus (linea pura HA89) a diversi stati di sviluppo foglie epifilliche del clone EMB-2 di H. annuus x H. tuberosus e foglie di piante di controllo del clone A-EMB-2 dell’ibrido interspecifico H. annuus x H. tuberosus.

Materiali e Metodi

83 I fase: preparazione delle sonde

L’ibridazione è stata effettuata sia con la sonda antisenso, complementare al mRNA relativo al gene L1L, sia con la sonda senso che costituisce un controllo negativo. La loro preparazione è descritta nei paragrafi 2.12 e 2.13.

II Fase: fissazione dei campioni

Entro 5-10 minuti dal suo isolamento, sono stati arrestati i processi biologici del campione, per conservare sia la morfologia del campione sia gli RNA presenti in natura. Questo scopo è stato raggiunto attraverso la fissazione in paraformaldeide al 4% in tampone 1X PBS pH 7.0. Per favorire la penetrazione del fissativo, è stata usata una pompa da vuoto per qualche minuto; quindi, dopo un cambio con fissativo fresco, il materiale è stata posto a 4 °C in lenta agitazione per tutta la notte. Il materiale è stato quindi disidratato, per prepararlo all'inclusione in paraffina, attraverso immersioni in una serie di alcoli a gradazione crescente, a partire dall'etanolo al 30% fino all'etanolo assoluto, mantenendolo a 4 °C e in agitazione. Per l'inclusione, l'etanolo è stato sostituito gradualmente con lo xilolo e quest’ultimo con paraffina in crescenti concentrazioni. Dopo diversi cambi con paraffina pura, questa è stata fatta polimerizzare a temperatura ambiente. I blocchetti di paraffina sono stati tagliati al microtomo ottenendo sezioni spesse 7-8 µm. Durante l'ibridazione le sezioni sono sottoposte ad una serie di lavaggi e trattamenti che ne causano spesso il distacco dai vetrini. Per evitare questo, i vetrini sono stati preparati, prima della deposizione delle sezioni di materiale sperimentale, secondo il seguente protocollo: sono stati accuratamente puliti con un lavaggio in acido nitrico concentrato per 30 minuti, sciacquati in acqua deionizzata per circa 2 ore e poi lasciati asciugare all'aria. Dopo un passaggio in acetone di 15 minuti, i vetrini sono stati asciugati in stufa a 180 °C

84 per 2 ore. Su ogni vetrino è stata, quindi, posta una goccia di poly-L-lysina (PM=300.000, 1 mg/ml in acqua “RNasi-free”), che è stata distribuita su tutta la superficie, usando un coprioggetto, in modo da costituire un film omogeneo. Infine i vetrini sono lasciati seccare in stufa a 40 °C, per tutta la notte, a questo punto erano pronti per essere utilizzati. Dopo aver disposto le sezioni sui vetrini, questi sono stati messi ad asciugare su una piastra riscaldata a 37 °C, per tutta la notte. Tale fase è molto importante perché permette alle sezioni di aderire bene al vetrino e di resistere ai lavaggi della post-ibridazione. La pre-ibridazione consta di una serie di passaggi che permette di: incrementare la capacità di accesso della sonda alle sequenze bersaglio, ridurre le probabilità della sonda di ibridarsi aspecificamente, minimizzare le interazioni con proteine o altre molecole che possono legare la sonda. In particolare, le sezioni incluse in paraffina sono state prima de-paraffinate secondo il seguente protocollo:

• 2X 10 min. xilene • 2X 1-2 min. 100% EtOH • 1-2 min. 95% EtOH • 1-2 min. 70% EtOH • 1-2 min. 40% EtOH • 1-2 min. H2O

Materiali e Metodi

85 Quindi, è stata effettuata la permeabilizzazione che richiede un trattamento con Proteinasi K: il buffer TE 5X (50 mM Tris HCl, pH 8,5, 5 mM EDTA) è stato preriscaldato a 37 °C; a questo è stato aggiunta proteinasi K (10 mg/ml) fino a concentrazione 1 µg/ml, con lo scopo di rimuovere le proteine che potrebbero interferire con la sonda e aumentare il segnale di fondo. La digestione con proteinasi K in TE 5X a 37° ha una durata di 30 minuti al termine dei quali viene effettuato un trattamento con glicina 2 mg/ml in PBS a temperatura ambiente per 2 minuti per inattivare la proteinasi K. Successivamente sono state eseguite una breve post-fissazione con paraformaldeide al 4% in 2xPBS per 5 min e poi l’acetilazione mediante immersione, in agitazione, dei vetrini in una soluzione di trietanolamina 0.1M a pH 8.0, a cui è stata aggiunta anidride acetica fino ad ottenere una concentrazione finale dello 0.5%. Dopo la fase di acetilazione i vetrini sono lavati in PBS 2 volte per 5 min a temperatura ambiente e quindi nuovamente disidratati con le seguenti soluzioni di etanolo:

• 30 sec. 40% EtOH • 30 sec. 70% EtOH • 30 sec. 95% EtOH • 2x 30 sec. 100% EtOH

86 Soluzioni utilizzate: PBS10x NaCl 1.3 M Na2HPO4 70 mM NaH2PO4 30 mM

III fase: ibridazione.

20 µl delle sonde, senso o antisenso, (100 ng di RNA in 50% formammide demonizzata) sono state denaturate per 2 minuti ad 80 °C, poste in ghiaccio e centrifugati prima di essere aggiunti a 80 µl di miscela di ibridazione. A questo punto vengono posti 100 µl della miscela di ibridazione, contenente la sonda ad RNA, nel centro di un vetrino coprendo col parafilm e incubando in camera umida. L’ibridazione avviene per una notte a temperature comprese tra i 48 e i 50 °C.

Materiali e Metodi

87 Soluzione utilizzate:

SOLUZIONE DI IBRIDAZIONE (per ogni vetrino):

7 µl H20 (trattata con DEPC)

40 µl formammide deionizzata

20 µl 50% destran solfato

2 µl 50X Denhardt’s solution

1 µl tRNA (100 mg/ml)

10 µl 10X sali per la in situ

80 µl volume totale

Questa soluzione è assai viscosa a causa del destran solfato, si è quindi riscaldata prima dell’utilizzo.

88 Lavaggi successivi all’ibridazione

E’ stata eseguita esegue una serie di lavaggi:

• E’ stato rimosso il parafilm immergendo i vetrini in 0.2X SSC preriscaldato a 55 °C.

• 30 min per 2 volte in 0.2X SSC preriscaldato a 55 °C agitando delicatamente.

• 5 min per 2 volte in NTE preriscaldato a 37 °C agitando delicatamente.

• 30 min in RNAsi (20 µg/ml RNasi A in NTE), che digerisce solo l'RNA a singolo filamento e quindi non ibridato, a 37 °C agitando delicatamente..

• 5 min per 2 volte in NTE 37 °C agitando delicatamente. • 60 min in 0.2X SSC a 55 °C agitando delicatamente. • 5 min in PBS a temperatura ambiente.

Soluzioni utilizzate:

5X NTE

NaCl 2,5 M

Tris, pH 8.0 50 mM

Materiali e Metodi

89 20X SSC:

NaCl 3 M

Citrato di sodio 0,3 M

Portare a pH 7 con acido citrico ed autoclavare.

IV fase: rivelazione.

• I vetrini sono stati incubati per 45 min con 1% “Roche block” in 100 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl.

• La soluzione precedente è stata sostituita con 1% BSA in 100 mM Tris 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% Triton X-100 per 45 min.

• L’anticorpo anti-dig è stato diluito nella soluzione BSA/Tris/NaCl/Triton (1:1250) Si coprono i vetrini con 100 µl della soluzione anticorpo anti-Dig e si lascia ad incubare per 2 ore a temperatura ambiente in camera umida.

• Sono stati effettuati 4 lavaggi successivi di 10 minuti ciascuno in una soluzione BSA/Tris/NaCl/Triton, a temperatura ambiente agitando moderatamente.

• Sono stati effettuati 2 lavaggi successivi di 10 minuti ciascuno in una soluzione 100 mM Tris 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 a

temperatura ambiente agitando moderatamente.

• I vetrini sono stati coperti con 100 µl della soluzione NBT-BCIP (200 µl di Roche NBT-BCIP in 10 ml della soluzione Tris 9.5/NaCl/MgCl2)

90 • e lasciati ad incubare con parafilm, in un contenitore in camera umida,

in completa oscurità per 1-3 giorni.

• Il parafilm è stato rimosso e i vetrini sono stati posti in TE per fermare la reazione.

• I vetrini sono stati disidratati immergendoli per 5 secondi nelle seguenti soluzioni: 40% EtOH 70% EtOH 95% EtOH 2X 100% EtOH 2X xilene

• I vetrini sono stati chiusi con balsamo del Canada.

• I vetrini sono stati analizzati al microscopio ottico (Axioscop, Zeiss) e le immagini sono state acquisite con una videocamera digitale (Laica DC 100 versione 4,1,8,0).

Materiali e Metodi 91 Soluzioni utilizzate 10X PBS pH 7 1.3 M NaCl 70 mM Na2HPO4 30 mM NaH2PO4 5X NTE 2.5 M NaCl 50 mM Tris pH 8 5 mM EDTA pH 8 20X SSC 3 M NaCl 300 mM Na Citrato

92 STE 0,1 M NaCl 10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8 10X PBS / Glicina a 4 °C 1.3 M NaCl 70 mM Na2HPO4 30 mM NaH2PO4 20 mg/ml Glicina pH 7 RNasi A a 4 °C 20 mg/ml

Materiali e Metodi

93

2.15

E

DNA

M

DELLA

PORTA

(1983)

Giovani foglie di plantule di H. annuus (HA89), accuratamente lavate con acqua sterile, 500 mg di peso totale, sono state congelate immediatamente dopo il prelievo, mediante immersione in azoto liquido, e polverizzate in mortaio. La polvere ottenuta è stata trasferita in tubi da centrifuga graduati nei quali sono stati aggiunti successivamente 20 ml di tampone di estrazione e 3 ml di SDS 10%, necessario per lisare le membrane nucleari. La miscela è stata poi incubata per 30 minuti a 65 °C, agitando saltuariamente. A questo punto sono stati aggiunti 7 ml di soluzione A ed il campione è stato incubato per 30 minuti a 0 °C, e quindi centrifugato a 14000 rpm in rotore Kroton A 8.24 per 30 minuti a 4 °C. Il sovranatante è stato filtrato con “Miracloth” sterile in tubo da centrifuga graduato, nel quale sono stati addizionati 0,6 volumi di isopropanolo. Dopo una breve agitazione il campione è stato incubato a –20 °C per una notte. Dopo una centrifugazione a 12000 rpm, in rotore Kroton A8.24, per 20 minuti a 4 °C, il precipitato ottenuto è stato asciugato all’aria e disciolto in 0,7 ml di soluzione B. Il tutto è stato trasferito in provetta da 1.5 ml e centrifugato in microcentrifuga per 10 minuti. La fase acquosa è stata recuperata e aggiunta ad un volume di fenolo-cloroformio, agitata lentamente e centrifugata in microcentrifuga per 10 minuti. Il sovranatante è stato di nuovo recuperato e aggiunto ad un volume di cloroformio-alcool isoamilico, agitato e centrifugato come sopra. Infine il DNA è stato precipitato addizionando al sovranatante recuperato 1/10, del suo stesso volume, di sodio acetato 3 M pH 5,2 e 0,6 volumi di isopropanolo freddo. Dopo aver agitato vigorosamente la miscela è stata centrifugata in microcentrifuga per 10 minuti. Il precipitato ottenuto è stato lavato con alcool etilico al 70% freddo, asciugato all’aria, e disciolto in un adeguato volume di acqua sterile o TE pH 7.8.

94 Soluzioni utilizzate: TAMPONE DI ESTRAZIONE Tris-HCl 100 mM, pH 8 Na2EDTA 50 mM NaCl 500 mM ß-mercaptoetanolo 10 mM SOLUZIONE A (100 ml): K-acetato 5M 60,0 ml CH3COOH 11,5 ml H2O 28,5 ml SOLUZIONE B: Tris-HCl pH 8 50 mM EDTA pH 8 10 mM

Materiali e Metodi

95 FENOLO SATURO:

Sciogliere a bagnomaria 100 g di fenolo (BDH) a 65 °C ed aggiungere 45 ml di Tris-HCl 100 mM pH 8. Agitare e lasciare al buio per una notte.

CLOROFORMIO/ISOAMILICO:

Cloroformio e alcool isoamilico miscelati, 24:1 (v/v), saturati con Tris-HCl 100 mM pH 8.

FENOLO/CLOROFORMIO:

Fenolo saturo e cloroformio/alcool isoamilico Miscelati 1:1 (v/v).

2.16

RT-

PCR

R

Con questa tecnica è stata valutata l’espressione del gene LEAFY COTYLEDON1-LIKE in diversi organi e/o tessuti del H. annuus e nel materiale vegetale che manifesta fenomeni epifillici. L’RT-PCR Relativa consiste nella co-amplificazione del cDNA di un gene espresso costitutivamente, che rappresenta un controllo interno, e del cDNA di interesse, utilizzando due coppie di oligonucleotidi specifiche nella stessa reazione di PCR.

96

2.15.1

S

β

-A

L’actina è una proteina espressa costitutivamente nelle piante e l’mRNA ad essa relativo costituisce lo standard interno con cui sono stati confrontati gli mRNA per l’HaL1L. Oligonucleotidi per l’amplificazione di un frammento del cDNA della β-actina di lunghezza opportuna, sono stati scelti sulla base dell’allineamento di sequenze di specie vegetali vicine all’Helianthus annuus disponibili in rete.

2.15.2

A

I campioni di RNA usati provengono da:

1. embrioni zigotici di H. annuus a diversi stadi di sviluppo (5, 10, 21, 28 giorni dalla data presunta di fecondazione);

2. foglie cotiledonari di H. annuus di semi germinati da 10 giorni; 3. foglie giovani di H. annuus (2 cm di lunghezza);

4. foglie espanse di H. annuus (15 cm di lunghezza);

5. fusto di piante di H. annuus allo stadio di bottone fiorale; 6. radici di piante di H. annuus allo stadio di bottone fiorale;

7. infiorescenze immature di H. annuus (capolini a 15 giorni dall’antesi); 8. foglie dell’ibrido interspecifico H. annuus x H.tuberosus (clone A-2);

9. foglie dell’ibrido interspecifico H. annuus x H.tuberosus (clone EMB-2) che non manifestano segni evidenti di epifillia (EMB-2 NE);

10. foglie dell’ibrido interspecifico H. annuus x H.tuberosus (clone EMB-2) che manifestano segni evidenti di epifillia (EMB-2 EP);

Materiali e Metodi

97 11. embrioni somatici prelevati dal clone epifillico EMB-2;

12. germogli avventizi prelevati dal clone epifillico EMB-2;

I) Retrotrascrizione:

La miscela per la retrotrascrizione era costituita da:

Reagenti Volume Oligo dT (500 µg/ml) 1 µl RNA (1 µg) X µl dNTP (10 mM) 1 µl H2O – DEPC q.b. fino a 12 µl

La miscela è stata incubata a 65 °C per 5 minuti quindi messa immediatamente in ghiaccio per 5 minuti. Successivamente, dopo aver centrifugato brevemente la miscela, sono stati aggiunti:

Reagenti (concentrazione) Volume First-Strand Buffer (5X) 4 µl

DTT (0.1 mM) 2 µl

98 La miscela è stata incubata a 42 °C per 2 minuti, quindi è stato aggiunto 1 µl di SuperscriptTM II ( Invitrogen) (200 U/µl) e il tutto è stato lasciato ancora a 42 °C per 50 minuti. La reazione è stata, infine, bloccata ponendo la provetta a 70 °C per 15 minuti.

II) Amplificazione del cDNA mediante PCR

La miscela di reazione della retrotrascrizione (MRT), contenente il cDNA sia per la β -actina sia per l’HaL1L, è stata utilizzata come stampo nella reazione di amplificazione condotta con il seguente protocollo.

Miscela di amplificazione per campioni di 15 µl di Volume:

Reagenti Concentrazione finale MgCl2 (25 mM) 4 µl Buffer 10X 1.5 µl dNTP (10 mM) 0.2 µM Oligonucleotidi β-actina 0.1 µM Oligonucleotidi HaL1L 0.1 µM TaqPolimerasi (5U/µl) 0.15 µl MRT 5.00 µl H2O q.b. a 15 µl

Materiali e Metodi

99 L’amplificazione è stata effettuata tramite PCR utilizzando contemporaneamente entrambe le coppie di oligonucleotidi che, per evitare artefatti, non devono presentare regioni complementari. Le coppie di oligonucleotidi impiegate sono CHI-REL/CHI-TcDNA per L1L e ACT3/ACT5 per la β-actina (Tabella 1). In questo tipo di analisi è di fondamentale importanza conoscere il numero di cicli di PCR in cui i due amplificati raggiungono la saturazione. Ogni PCR, infatti, raggiunge il punto di saturazione quando l’aumento del prodotto di amplificazione non è più esponenziale, ovvero non è più proporzionale alla quantità di stampo iniziale poiché sono utilizzati come stampo anche i prodotti amplificati nei cicli precedenti. Per conoscere il punto di saturazione è stata condotta una PCR dalla quale, al termine di cicli successivi, sono state sottratte aliquote di campione immediadamente trasferite in una adiacente macchina per PCR per subire la fase di estenzione finale di 7 minuti a 72 °C. I prodotti di amplificazione, ottenuti nell’intervallo compreso tra 22 e 32 cicli, sono stati analizzati su di un gel di Agarosio ed è stato quindi deciso che il numero di cicli da utilizzare era compreso tra 26 e 30.

Tempo Temperatura (°C) Cicli

3’ 95 1 30’’ 94 30’’ 53 25’’ 72 26 e 30 7’ 72 1

100 Gli amplificati ottenuti sono stati visualizzati su di un gel di Agarosio:

Figura 6. Visualizzazione su gel di Agarosio al 2% dei prodotti di amplificazione ottenuti nell’intervallo compreso tra 22 e 32 cicli

La figura 6 mostra che a 26 cicli la PCR è ancora nella fase esponenziale, mentre a 30 cicli il segnale di amplificazione della β-actina è a saturazione, quindi il numero dei cicli da utilizzare nella RT-PCR relativa deve cadere in questo intervallo. Le quantità relative di ogni prodotto di amplificazione sono state quantificate mediante la scansione diretta del gel di Agarosio al 2% con il densitometro UVP Image Store 5000 (Ultra Violet Product Ltd, Cambridge, England) equipaggiato con l’UVP GelBase-GelBlot TM Windows Software. Per normalizzare i campioni relativamente alla quantità di RNA totale utilizzato e alla

Numero cicli 22 24 26 28 30 32 M bp 1353 872 310 234

Oligonucleotidi HaL1L:

TC-DNA/CHI-REL

Materiali e Metodi

101 efficienza della sintesi di cDNA, le intensità delle bande di amplificazione del frammento del L1L sono state rapportate ai prodotti di amplificazione della β-actina. Un valore arbitrario di 1 è stato assegnato in ogni campione al livello della β-actina. È stata poi effettuata l’analisi statistica della varianza e le medie sono state separate mediante il test di Tukey (con P = 0.05). Per quest’analisi sono stati utilizzati tutti i diversi RNA per ciascun tipo di campione.