COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000 CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

(1)

COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000

CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

(2)

LE RNA POLIMERASI COME

RICONOSCONO I PROMOTORI?

Transcribed region Promotore

-contiene sequenze

Specifiche per il legame della

polimerasi

(3)

FATTORI DI TRASCRIZIONE

• FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter”

• REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI

- REPRESSORI

Transcribed region

ELEMENTO

ENHANCER ELEMENTO DEL

PROMOTORE Basal factor binding sites

(4)

• Il legame promotore RNA polimerasi

richiede i fattori di trascrizione generali

(5)

Promotori

~200 bp

gene

(6)

Reporter gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene

100%

Reporter gene

20%

Reporter gene

1%

Reporter gene

0%

(7)

Reporter gene eg CAT, luciferase

ATTIVITA’

100%

Reporter gene

100%

Reporter gene

400%

Reporter gene

1%

Reporter gene

0%

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

(8)

Li v e llo d i tr a sc ri zi o n e

basale

attivato

represso

(9)

Transcribed region

Elementi del Core promoter

• siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale

La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla

Azione di fattori di trascrizione gene-specifici

(10)

~24bp TATA

BRE

Inr DPE

TATA-box 8 bp elemento ricco in AT

BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIID

Bound by TFIIB

Inr DPE Bound by TFIID

RNAP II

(11)

TFIIA

TFIIE

TFIIF

TFIIH RNAP II

TFIIB

TFIID 2-3 subunits

2 subunits

1 subunit

10 subunits

2 subunits

12 subunits

~40 polipeptidi

(12)

~24bp TATA

BRE

Inr DPE

TATA-box 8 bp AT

BRE 6 bp

lega TFIID

lega TFIIB

Inr DPE lega TFIID

RNAP II

(13)

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(15)

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(16)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIIH TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

(17)

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(18)

TFIID contiene la

TATA-Box Binding Protein TBP

TFIID

(19)

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors

—TAFs

-aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr

-legano i fattori di trascrizione gene specifici

-aiutano a decompattare la cromatina

(20)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID

(21)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

-aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIA

(22)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

-si lega a TBP e richiama la polimerasi

-Partecipa alla selezione del sito d’inizio e

Stabilisce la direzione

(23)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIF

Stabilizza il complesso di preinizio e induce

Una torsione nel DNA

(24)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore.

Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

(25)

~24bp TATA

BRE Inr DPE

TFIIH TFIID TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNAP II

TFIIE

TFIIH

Fosforila una delle subunita’ della polimerasi

dando l’avvio alla trascrizione

(26)

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(27)

— REGOLATORI GENE SPECIFICI

Transcribed region

SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

(28)

Regolatori gene specifici

• hanno una struttura modulare

• contengono un dominio che lega il DNA

• contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale

• qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione

• qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(MADS box)

(34)

N H

H O C

Donatore Accettore

(35)

A D A M A A D M A D A D A A

A A A D A A A A D A

(36)

Regolatori gene specifici

1) Contengono un dominio che lega il DNA

2) E un dominio di attivazione trascrizionale

(37)

Gli Attivatori come influenzano la

trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?

DNA loop

(38)

Enhancers- stimolano la trascrizione

1. Attivatori si legano ad un sito specifico

2. Il DNA si ripiega

(39)

Enhancers- stimolano la trascrizione

Attivatori si legano ad un sito

specifico

Il DNA si ripiega

Si forma il complesso

nel promotore

(40)

Enhancers- stimolano la trascrizione

Attivatori si legano ad un sito specifico

Il DNA si ripiega

Si forma il complesso nel promotore

Si lega la RNA polimerasi

Inizio della trascrizione

(41)

Controllo combinatoriale

dell’espressione genica

(42)

Con poche proteine

regolatorie si possono

controllare un elevato numero di geni

Diverse

combinazioni

producono

fenotipi

differenti

(43)

Heterodimerization of DNA binding proteins can alter

their sequence specificity

(44)

Enhancer e Repressori

gene promotore

enhancer

repressore 10-50,000 bp

repressore previene il legame dell’enhancer

RNAP

enhancer

interagiscono con RNAPtrascrizione

(45)

Con poche proteine

regolatorie si possono

controllare un elevato numero di geni

Diverse

combinazioni

producono

fenotipi

differenti

(46)

Recettori nucleari

Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche

• Cambio dell’attivita’

• Cambio della localizzazione cellulare

(47)

Recettori nucleari

TBP TAF TAF TAF

TAF

RNA pol II

Il legame del ligando causa cambiamenti

conformazionali

(48)

Nuclear Receptors

GR

^hsp90^hsp90

GR

Legame dell’ormone

Dissociazione da hsp90 dimerizzazione

GR GR

Migrazione nel nucleo

GR GR

Legame al DNA

(49)

Regolazione mediante fosforilazione

• Ormoni attivano una chinasi

• La chinasi fosforila un fattore di trascrizione

• Il fattore e’

attivato

(50)

Cascata delle chinasi

GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase

Il recettore dimerizza

Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase)

MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase

SEK fosforila JNK – una MAP kinase

MEKK

P MEKK

P SEKSEK P

JNK JNK

P

(51)

Cascata delle chinasi

JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN

C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1

AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –

TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali

JNK P

nucleo

C-JUNC-JUN

P

RNA pol II

C-FOS P

(52)

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(53)

Metilazione del DNA

• La citosina puo’ essere metilata:

• La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del

• Risulta in una maggiore condensazione della cromatina

(54)

Trascrizione e struttura della cromatina

• Il DNA nella cromatina condensata non e’

accessibile

• La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente

• La condensazione della cromatina dipende

ANCHE dalla acetilazione degli istoni

(55)

Acetilazione degli Istoni

• E’ una modificazione post-traduzionale

• Gruppi acetilici (CH

₃

COO

^–

) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive

• Eliminano le interazioni ioniche con il DNA

• Diminuiscono la condensazione

• Associati con una attiva trascrizione

(56)

– Acetilazione/Deacetilazione

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(57)

Attivatori: acetilazione degli Istoni

• Alcuni attivatori attirano delle acetilasi

• Il macchinario di trascrizione puo’ accedere

al DNA meno condensato

(58)

Alcune Istone Acetilasi (HAT)

• p300/CBP

• TAF II 250

• Ambedue sono dei co-attivatori

• SAGA e’ a ponte tra un Fattore di

Trascrizione e la TBP

(59)

Repressori: deacetilazione degli Istoni

• Alcuni repressori attirano delle deacetilasi

• Prevengono l’accesso del macchinario di

trascrizione al DNA

(60)

– Acetilazione/Deacetilazione

(61)

SWI/SNF in Lievito

SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO

(accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio).

Queste proteine catalizzano il rimodellamento

ATP-dipendente del DNA

(62)

Macchinari di Rimodellamento

• Tutti contengono subunita’ simili a swi- 2/snf

• NTP-binding proteins

(63)

(64)

(65)

http://www.uniroma2.it/didatti ca/biochimica/deposito/

Lez8-10.ppt Lez15-10.ppt Lez22-10.ppt

Lez29-10.ppt (ancora da aggiungere)

(66)

Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNA

transcript

mRNA mRNA

inactive mRNA

protein

inactive protein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione degradazione

controllo dell’attivita’

(67)

Controllo della Traduzione

1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina

Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva

Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR

Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina

Come viene regolato tutto questo?

(68)

(69)

M

AUG

Fe m⁷G

Iron Response Element

IRE-BP (cytosolic aconitase)

Fe

M

Fe

Ferritin mRNA

Coding region AUG

1. Repressione :-Ferro, ferritina NO

2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI

M

(70)

AUG

m⁷G

Fe

M

Fe

TFR mRNA

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

(71)

AUG

m⁷G

TFR mRNA

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

Fe

RNAse

(72)

Controllo dello Splicing:

espressione di Fibronectine tessuto-specifiche

(73)

(74)

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene

• Lo splicing alternativo puo’

produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa

specificita’

• Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a

produrre anticorpi solubili

• Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che

codificano per domini

idrofobici

(75)

Trasporto segnale-mediato

attraverso il poro nucleare (NPC)

Figure 11-28

The nuclear pore complex

(76)

La proteina HIV Rev regola il

trasporto dell’RNA virale non ancora

maturo

(77)

L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-

mRNA

Figure 11-39

(78)

• mRNA editing

La deaminasi e’ presente solo nell’intestino

Nel fegato

(79)

GDP

No Aminoacidi

eIF2 Gcn2p kinase

eIF2

eIF2B _GTP

No tRNA amino-acetilati

P S51

Translation competent

eIF2

GDP 