Capitolo 1

Capitolo 1

PARTE INTRODUTTIVA

1.1

Importanza del monossido di azoto in vivo:

Il monossido di azoto (NO) è una molecola gassosa altamente reattiva e dai molteplici effetti biologici. Essa viene prodotta da numerose cellule, sia negli organismi

invertebrati che in quelli superiori, suggerendo che la sintesi di questo radicale possa risalire già all’origine dell’evoluzione.1

Il NO viene continuamente sintetizzato in vivo a partire dalla L-arginina ed O2, in una

reazione catalizzata da una famiglia di enzimi chiamata NO-sintetasi (NOS).2 Una volta prodotto, il NO diffonde nel circostante muscolo liscio, dove induce rilassamento e dilatazione dei vasi sanguigni.3 Recentemente è stato dimostrato che questa molecola è in grado di controllare il tono vascolare in regioni anche distanti dal suo sito di formazione.3, 4, 5 Essendo il NO una molecola molto reattiva, appare dunque evidente che questi effetti endocrini dipendano da molecole ben più stabili, adatte al trasporto e alla conservazione del NO stesso.6, 7

Nel 1992, Stamler e collaboratori postularono l’esistenza nel plasma di una “riserva” di NO in cui questo radicale si trova in equilibrio con molecole caratterizzate dall’avere un legame covalente S-NO, ad esempio gli S-nitrosotioli.45

L’effetto che il NO possiede in vivo dipende dal sito di formazione, dall’entità della sua produzione ed dal tipo di tessuto bersaglio.

Il monossido di azoto è coinvolto non solo nella fisiologia dell’apparato cardiocircolatorio, ma possiede anche effetti antimicrobici,8 inibisce l’aggregazione piastrinica,9 ha azione broncodilatatoria,10 inibisce la motilità intestinale11 ed è coinvolto in vari processi di regolazione del sistema nervoso periferico e centrale e nel sistema immunitario.12 Il monossido di azoto, inoltre, è coinvolto non solo in meccanismi regolatori e protettivi, ma può anche essere causa di artriti, epatiti, shock settici e varie disfunzioni auto-immunitarie.13,14,15

In presenza di O2, NO può dar luogo alla formazione di varie specie tossiche, quali il

perossinitrito (ONOO-), capaci di danneggiare la struttura del DNA e di inibire l’attività di molti enzimi.

La Figura 1.1 mostra i principali ruoli del NO nell’ambito fisiologico:

Figura 1.1: La chimica fisiologica del monossido di azoto: effetti biologici regolatori, protettivi e tossici.

In ambito fisiologico, le azioni del monossido di azoto vengono suddivise in dirette (reazioni in cui è direttamente coinvolto NO) ed indirette (reazioni in cui vengono coinvolti NO-derivati). Nelle azioni indirette vengono prodotte concentrazioni relativamente elevate del NO (superiori all’1 µM), mentre nelle azioni dirette la produzione di monossido di azoto è minore (inferiori al µM).16

Tra gli effetti diretti più importanti del NO troviamo le reazioni con centri metallici e le reazioni con radicali liberi:

Reazione di NO con metalli: NO reagisce con centri metallici per formare

complessi nitrosilici. Nel caso del ferro (emico o non emico) il NO si lega con elevata affinità al Fe++ piuttosto che al Fe+3: l’elettrone nell’orbitale 3d6 è più

esterno rispetto all’elettrone nell’orbilate 3d5, e può dar luogo ad un addotto nitrosil-eme stabile. 17,18

A seconda della proteina, la formazione del complesso ferro-nitrosile può comportare l’attivazione o l’inattivazione delle funzioni della proteina stessa. Un esempio per il primo caso è l’attivazione della guanilato ciclasi solubile (sGC), con conseguente produzione della guanosina monofosfato ciclica (cGMP), mentre un esempio del secondo caso è dato dall’inattivazione della Citocromo c Ossidasi (il NO è competitivo nei confronti dell’ O2).

La produzione di cGMP conseguente all’attivazione della sGC, può avere, in base al sito in cui avviene l’attivazione della guanilato ciclasi, i seguenti effetti: 1. azione antinfiammatoria

2. regolazione della pressione 3. produzione di prostaglandine

4. inibizione dell’aggregazione piastrinica 5. azione antiossidante

Dalla reazione del NO con l’ossiemoglobina, invece, si forma meta-emoglobina (in cui il ferro è in stato d’ossidazione +3) e nitrato.19 La met-Hb non può più legare l’ossigeno molecolare, ma la met-Hb reduttasi riduce la met-Hb, garantendo il riciclo dell’Hb. E’ probabile che questo processo sia stato selezionato nel corso dell’evoluzione affinché l’emoglobina possa rimuovere l’eccesso di NO. Tuttavia simulazioni al computer hanno dimostrato che data l’elevata velocità di reazione tra NO ed Hb, (k=3.4 107 M-1 s-1),20 non si hanno mai livelli di NO fisiologicamente sufficienti ad attivare la sGC (tempo di emivita calcolato= 2*10-6 s).21 Ad oggi molti aspetti riguardanti il ruolo dell’emoglobina nel metabolismo del NO non sono ancora chiari.

Interazioni con radicali liberi: il NO è un radicale capace di reagire molto

velocemente (ai limiti della velocità di diffusione) con altri radicali organici liberi, che possono essere causa di numerose patologie a carico della perossidazione lipidica.13

Gli effetti indiretti sono dovuti alla formazione di derivati del monossido di azoto formati per reazione con l’ossigeno, in particolare il triossido di diazoto (N2O3) e il

perossinitrito (ONOO-). In presenza di ossigeno, l’NO viene ossidato a triossido di diazoto:

2NO+1/2 O2 N2O3

N2O3 è un potente agente nitrosilante, e la sua reazione con tioli porta alla formazione

degli S-nitrosotioli, molecole che giocano un ruolo chiave nel trasporto e nel metabolismo del monossido di azoto.

Il perossinitrito è un agente fortemente ossidante che si forma per reazione del NO con il con lo ione superossido:

O2- + NO  ONOO-

Esso è potenzialmente dannoso, ma a pH fisiologico isomerizza rapidamente (tempo di emivita di 1-2 secondi) in nitrato secondo le seguenti reazioni:40

ONOO - + H+ _{ ONOOH}

ONOOH _{ NO}3- + H+

Attraverso questa reazione, con la quale vengono rimossi i superossidi, il monossido di azoto agisce da agente protettivo (agente di “scavenging”) e come anti-infiammatorio.22

In Figura 1.2 sono riportate le principali azioni del monossido di azoto suddivise in effetti diretti ed effetti indiretti.

Figura 1.2: Effetti diretti ed indiretti del monossido di azoto

1.2 Proprietà chimiche e fisiche del monossido d’azoto

Il NO è un radicale relativamente poco polare,23 liofilo, capace, dunque, di penetrare facilmente le membrane biologiche.24 Il NO è un gas incolore a temperatura ambiente, (eventuale colorazione blu è dovuta alla presenza di tracce di N2O3), e la sua solubilità

in acqua a 25°C ed 1 atmosfera è costante in un vasto range di pH (da 2 a 13) con un valore di circa 1,8 ×10-3 mol dm-3 .

La struttura del NO può essere così rappresentata:

●N+—O-  ● N=O  --_N=O+● _

N≡O●

La presenza dell’elettrone spaiato comporta un ordine di legame di 2,5. Tuttavia il NO è un radicale che non dimerizza molto facilmente, sia perché l’elettrone spaiato è delocalizzato su una vasta superficie, sia perché la dimerizzazione non comporterebbe un aumento dell’ordine di legame.

In soluzione acquosa il NO viene ossidato a nitrito con una cinetica del terzo ordine: prim’ordine rispetto alla concentrazione di O2 e secondo ordine rispetto alla

concentrazione di NO. Questo suggerisce un meccanismo che passi attraverso la formazione di N2O3 (l’anidride dell’acido nitroso), secondo il seguente schema

ipotizzato da Williams25:

Tuttavia poiché la reazione di idrolisi dell’NO2 compete con la reazione tra NO ed NO2,

l’ossidazione del NO in soluzione acquosa porta ad una miscela di nitriti e nitrati.25

Queste reazioni fanno sì che, sia in vitro che in vivo, il tempo di emivita del monossido d’azoto sia di soli pochi secondi .26

Oltre all’idrolisi dell’NO, sono note altre vie di inattivazione in vivo per questo radicale:

 reazione con l’ossiemoglobina (formazione di metaemoglobina e nitrato);

 reazione con gruppi eme e metalli di transizione non eme-associati, come le ferroproteine;

 reazioni di N-nitrosazione ( sintesi di nitrosamine nei macrofagi).

IL monossido di azoto può esistere in tre forme interconvertibili come mostrato in Figura 1.3:

Figura 1.3: Le forme chimiche del monossido di azoto

La differente forza di legame tra azoto ed ossigeno nelle tre specie, si traduce in differenti effetti biologici: il radicale NO. lega le emoproteine ed i centri ferro-zolfo, lo ione nitrosonio, NO+ , dà reazioni di nitrosazione con gruppi nucleofili (tioli, ammine, anelli aromatici, ecc), ed infine l’anione nitrossile, NO- , dimerizza generando ossido di diazoto (N2O) o reagisce con i tioli (ossidando i gruppi sulfidrilici) ed i metalli.

1.3 La sintesi del monossido di azoto in vivo: le NOS

Il NO viene sintetizzato in vivo a partire da L-arginina grazie ad una famiglia di enzimi detti NO-sintasi (NOS). Le NOS sono ossidasi calcio-dipendenti. La prima tappa della sintesi consiste nell’idrossilazione dell’L-arginina ad N-idrossi-L-arginina (reazione NADPH-dipendente). Quest’ultima viene successivamente ossidata a chetone (reazione che richiede NADPH e tetraidrobiopterina), quindi avviene il distacco di un H e l’uscita di NO. Infine la carboiimide così formata reagisce con acqua formando

L-citrullina(Fig 1.4 e 1.5): 22

Figura 1.5: La sintesi del monossido di azoto in vivo

Le NOS esistono in tre isoforme, di cui due costitutive (cNOS), ed una inducibile (iNOS). Le NOS costitutive si divodono in NOS neuronali ed in NOS endoteliali. Le NOS neuronali (nNOS) sono state isolate nelle cellule neuronali, nel muscolo scheletrico, nello stomaco e nell’utero. Le NOS endoteliali (NOS III o eNOS) sono state isolate nell’endotelio. Il NO prodotto dalle nNOS è coinvolto in meccanismi di neurotrasmissione, nella regolazione del tono muscolare e nella motilità intestinale.

Il NO prodotto dalle eNOS, invece, è adibito a regolare il tono vascolare.

Sia le eNOS che le nNOS si presentano come dimeri (Fig 1.6) contenenti una molecola di FAD, una di FMN, un gruppo eme, ed una di tetraidrobiopterina (BH4), l’assenza

della quale porta alla produzione di superossido piuttosto che di NO. Tali cofattori, assieme alla calmodulina e al NADPH, sono necessari all’attività enzimatica.26

Figura 1.6: Schema della struttura delle NOS

I monomeri da soli non riescono a sintetizzare NO: l’assemblaggio in dimeri, infatti, modifica l’ambiente dell’eme in modo da facilitare il trasferimento degli elettroni con conseguente sintesi del NO. 27

Le cNOS vengono attivate dall’ aumento della concentrazione di Ca++ intracellulare: il Ca++ si lega alla calmodulina e tale complesso si lega al dimero NOS per favorire il flusso di elettroni dalla porzione reduttasica (contenente NADPH, FMN, FAD e CaM) alla porzione ossigenasica contenente l’eme, ovvero il sito di legame di arginina e tetraidrobiopterina.

Le NOS inducibili, invece, sono calcio-indipendenti. 27

Alcuni analoghi dell’L-arginina che si comportano da inibitori competitivi nei confronti delle NOS sono riportati in figura 1.7. 27

Figura 1.7: Inibitori competitivi delle NOS27

1.4 Meccanismo di azione del monossido d’azoto in vivo:

attivazione della guanilato ciclasi.

E’ noto da tempo che, analogamente all’adenosina monofosfato ciclica (cAMP), anche la guanosina monofosfato ciclica (cGMP) si comporta da secondo messaggero in alcuni tipi di cellule dell’intestino, del cuore, dei reni, dei vasi sanguigni e del cervello, con

funzioni diverse a seconda del tipo cellulare. Nel rene e nell’intestino per esempio, determina variazioni ioniche, nel cuore il rilassamento del muscolo. La cGMP viene sintetizzata dalla guanosina trifosfato (GTP) ad opera della guanilato ciclasi solubile (sGC) secondo la reazione mostrata in figura 1.8:

Figura 1.8: Attività della guanilato ciclasi solubile: sintesi della guanosina monofosfato ciclica a partire dalla guanosina trifosfato

Sono stati identificati due isoenzimi per la guanilato ciclasi solubile: un isoenzima è una proteina integrale della membrana plasmatica, l’altro è una proteina citosolica.28 Il primo ha, nella parte esterna extracellulare, un dominio recettore dell’ormone ANF (fattore natriuretico atriale), che viene rilasciato dalle cellule atriali quando si verifica un aumento di volume. Una volta trasportato dal sangue al rene, l’ANF attiva la sGC, e il conseguente aumento di cGMP determina un’espulsione di ioni sodio , quindi di acqua, con conseguente riduzione di volume.

Il secondo isoenzima, invece, viene attivato dal monossido di azoto.

Nel sistema vascolare, l’ NO viene prodotto dalla NOS endoteliale in seguito a segnali di stress fisiologico,22 e grazie a derivati endoteliali, diffonde nelle cellule e si lega al gruppo eme della guanilato ciclasi attivandola. Gli aumenti del cGMP che ne conseguono determinano diversi effetti: nel cuore, ad esempio, determina una diminuzione della concentrazione di ioni calcio, perciò anche una diminuzione della contrazione del muscolo cardiaco (azione anticostrittrice).29 Dopo pochi secondi dalla sua produzione, il NO non reagito viene ossidato a nitrito o a nitrato. In Figura 1.9 è riportato il percorso di transduzione indotto dall’ NO.

Figura 1.9: Percorso di transduzione dell’NO: a seguito di un segnale di stress si verifica un aumento dei livelli di calcio, e dunque l’attivazione della eNOS, con conseguente produzione di NO. Quest’ultimo diffonde nelle cellule del muscolo liscio dove attiva la sGC (guanilato ciclasi solubile), con conseguente attivazione della PKG (proteina chinasi G), la quale, a sua volta, diminuisce la concentrazione

degli ioni calcio determinando un rilassamento vascolare.29

Nei successivi paragrafi sono riportate in breve le principali funzioni biologiche del NO.

1.4.1: Azione vasodilatatrice, antiaggregante e neurotrasmettitrice del

NO:

L’azione vasodilatatrice, antiaggregante e neuromediatrice del NO è da attribuire alla stimolazione della guanilato ciclasi ed al conseguente aumento della cGMP. Il NO viene dunque definito EDFR (endothelium-derived relaxing factor) per la guanilato ciclasi, ma il meccanismo col quale l’aumento della cGMP media la vasodilatazione e l’effetto piastrinico antiaggregante, non è ancora del tutto chiaro.30

Tuttavia, non tutti gli effetti del NO sono mediati da un aumento della cGMP. Sono stati riscontrati casi in cui l’NO abbassa il livello intracellulare degli ioni calcio indipendentemente dalla cGMP.31

La figura 1.10 riporta una schematizzazione della regolazione del tono vascolare e del flusso sanguigno da parte dell’NO prodotto dall’endotelio e preservato nel circolo sanguigno sottoforma di HbSNO, HbNO, RSNO e NO2 -.

Figura 1.10: regolazione del tono vascolare e del flusso sanguigno nell’endotelio

1.4.2: Attività citotossica dei macrofagi:

Il ruolo dell’NO nell’attività citotossica è confermato dal fatto che in soggetti con un’infezione in corso si notano concentrazioni più elevate di nitrati nelle urine. L’elevata produzione di NO da parte dei macrofagi potrebbe essere la causa dell’ ipotensione e, nelle infezioni più gravi, dello shock settico che si verifica durante le infezioni. Il NO prodotto in eccesso ha la funzione di attaccare i batteri, ma non le cellule sane, reagendo coi superossidi prodotti dai macrofagi stessi secondo le reazioni:32

NO + O2- ONOO

-ONOO- + H+

_↔

Il perossinitrito è un acido debole protonato a pH fisiologico, e si decompone in NO2 e

radicali idrossilici responsabili della rottura della membrana lipidica e del DNA delle cellule bersaglio.

L’effetto citotossico dell’NO è legato anche al blocco della glicolisi. Infatti, l’NO attiva l’ADPribosil transferasi la quale trasferisce un ADPribosile dal NAD+ alla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi con conseguente blocco dell’attività enzimatica.33 La citotossicità è altresì legata alla nitrosilazione di enzimi contenenti ferro o centri ferro-zolfo, quali la cis-aconitasi, il complesso NADH-ubichinone-ossidoriduttasi e il complesso succinato-ubichinone-ossidoriduttasi. Inoltre la nitrosilazione è seguita dal rilascio di Fe3+ che potrebbe promuovere la lipoperossidazione nelle membrane cellulari.34

1.4.3: Inibizione della proliferazione cellulare:

E’ stato riportato che il NO rallenta la proliferazione di cellule tumorali inibendo l’attività della ribonucleotide riduttasi, l’enzima che fornisce i deossiribinucleotidi per la sintesi del DNA di cellule tumorali.34

1.4.4: Mutazione genica:

L’NO è anche un mutageno: in vitro, a pH fisiologico ed in presenza di ossigeno, provoca la deaminazione di desossinucleosidi, desossinucleotidi e DNA intatto,35 e per il 99% dei casi si osserva la transizione G:C _{ A:T per deaminazione della citosina.} Aggiunto a cellule intere NO nitrosila il DNA causandone la rottura.36

1.5 Il monossido di azoto come agente patologico

Come già anticipato, il monossido di azoto non possiede solo effetti protettivi e regolatori, ma può avere effetti anche altamente nocivi. Possiamo, dunque, dividere gli effetti del monossido di azoto in fisiologici e patologici, i primi caratterizzati da livelli bassi di NO (100-500 nM), i secondi caratterizzati da livelli più alti (1-3 µM).

Figura 1.11: effetti fisiologici ([NO]<500nM) e patologici ([NO]> 1uM) del NO16

Il monossido di azoto può essere prodotto in vivo (NO endogeno), ma può provenire anche da fonti esterne (NO esogeno), principalmente dall’inquinamento urbano e dal fumo di sigarette. Basti pensare che ogni boccata di sigaretta contiene mediamente 1014 molecole di NO, cioè dai 400 ai 1000 ppm.16 E’ stato stimato che circa il 70% dell’NO inalato attraverso lo smog atmosferico, viene poi ossidato a nitrato nel nostro organismo.37

Un’altra fonte di NO esogeno deriva dalla digestione di cibi particolarmente ricchi di nitriti e nitrati (principalmente carni ed insaccati): durante la digestione il pH dello stomaco scende a valori molto bassi (circa 2-3), ed in queste condizioni i nitriti ed i nitrati vengono ridotti ad NO. 38

Il destino del NO è determinato in vivo non solo dalla sua concentrazione, ma anche dalle concentrazioni di altre specie (principalmente O2, O2- e radicali liberi) che,

reagendo con NO, possono dar luogo a specie potenzialmente dannose (chiamate reactive nitrogen species o RNS).

A basse concentrazioni, la reazione diretta tra NO e queste molecole non avviene, e l’ NO viene rimosso attraverso varie vie metaboliche (esempio per reazione con l’emoglobina). Quando la concentrazione di radicali liberi prodotti da stress ossidativi di varia natura aumenta, la reazione degli stessi con NO dà luogo a specie potenzialmente pericolose perché fortemente ossidanti e nitrosilanti (esempio NO2 ,

ONOO-, N2O3 ). Queste molecole possono attaccare il DNA, i lipidi, i tioli, gli

amminoacidi ed i metalli, causandone l’ossidazione o la nitrosilazione (figura: 1.12)

Figura 1.12: effetti deleteri delle RNS (reactive nitrogen species)

Queste reazioni possono essere altamente nocive: possono modificare la struttura del DNA, causare l’inattivazione di molti enzimi e la degradazione delle membrane cellulari.

Di particolare interesse è la reazione di NO con O2- . Come già menzionato nel

paragrafo 1.4.2, da questa reazione vengono prodotti perossinitriti che agiscono come potenti agenti ossidanti e nitrosilanti, Figura 1.13).39. Un effetto di questa reazione è l’ipertensione, in quanto la reazione tra NO ed O2- diminuisce la concentrazione di

Figura 1.13: effetti della reazione di NO con superossidi

I perossinitriti a pH neutro isomerizzano a nitrati e nitriti.40 Tuttavia sembra probabile che la via principale di inattivazione dei perossinitriti sia la reazione con la CO2 data

l’elevato valore di costante di velocità (5*104 M-1 s-1 ) e l’elevata concentrazione di anidride carbonica nel sangue (circa 1 mM). 41

Nella reazione tra perossinitrito ed anidride carbonica, (Fig. 1.14) si forma dapprima il nitrosoperossicarbonato (ONOOCO2) che poi decompone in ●NO2 e ●CO3- oppure in

nitrocarbonato (O2NOCO2):

La Figura 1.15 mostra le due vie principali di inattivazione del radicale perossinitrito:16