4.1 Isolamento di XPet-1
L’ identificazione dell’omologo di Pet-1 in Xenopus laevis è stato il primo passo necessario per poter condurre esperimenti funzionali di sovraespressione genica. Ho eseguito, quindi, uno “screening” di una genoteca di cDNA di Xenopus laevis a stadio 42 (larva natante) utilizzando una sonda a DNA marcata radioattivamente e ottenuta usando come stampo il cDNA di Pet-1 di topo. E’ stato, quindi, possibile identificare uno clone che conteneva l’intera sequenza codificante per il fattore di trascrizione XPet-1.
4.2 Confronto della localizzazione spaziale del gene XPet-1 e della serotonina.
Utilizzando il cDNA di XPet-1 ho costruito una sonda ad RNA antisenso marcata con digossigenina ed ho eseguito esperimenti di ibridazione in situ per analizzare l’espressione spazio-temporale di questo gene durante lo sviluppo di Xenopus. Ho potuto così confrontare la localizzazione di XPet-1 nel sistema nervoso di Xenopus con quello descritto precedentemente per Pet-1 in alcuni mammiferi (Hendricks et al., 2003; Hornung, 2003) confermando un’elevata conservazione nella regolazione trascrizionale di questo gene durante l’evoluzione.
Ho potuto dimostrare, infatti, che questo gene è espresso in una regione ventrale del tubo neurale a livello della vescicola meso-romboencefalica già a partire da stadio 25 dello sviluppo embrionale di Xenopus laevis. Per localizzare con maggiore precisione la regione in cui XPet-1, si esprime, ho effettuato doppie ibridazioni in situ utilizzando specifici marcatori molecolari come XEngrailed, gene espresso specificamente al confine fra mesencefalo e romboencefalo (“Mid-hindbrain Boundary”(MHB)), e XKrox20, marcatore specifico dei
rombomeri r3 e r5. Tramite questi esperimenti ho costatato che la marcatura per XPet-1 è localizzata esclusivamente a livello della porzione più ventrale del romboencefalo.
Per dimostrare che i neuroni esprimenti XPet-1 fossero effettivamente neuroni serotoninergici, ho eseguito parallelamente ad esperimenti di ibridazione in situ per XPet-1, esperimenti di immunoistochimica utilizzando un anticorpo specifico per la serotonina su embrioni allo stesso stadio di sviluppo. Dagli esperimenti condotti è emerso che da stadio 35 le due marcature sono sovrapponibili. Questo dato è stato ulteriormente confermato dalle analisi condotte a stadi più tardivi e su cervello adulto. Da questo si può concludere che XPet-1 è espresso esclusivamente nei neuroni serotoninergici romboencefalici.
Una differenza riscontrata fra Xenopus e i mammiferi è a livello della porzione ventrale di r4. A livello di questo rombomero, nei mammiferi, non vengono specificati neuroni serotoninergici e, quindi, si ha la presenza di un “gap” dovuto ad un prolungamento temporale dell’espressione del gene Phox2b, necessario al differenziamento dei motoneuroni del nervo facciale (Pattyn et al., 2003). In Xenopus laevis questo “gap” non è presente ed i neuroni che esprimono XPet-1 sono distribuiti uniformemente sul pavimento del romboencefalo. Questa differenza potrebbe essere spiegabile ipotizzando che in Xenopus i motoneuroni del nervo facciale (VII nervo cranico) si sviluppino molto più precocemente rispetto ai mammiferi. Sarà quindi interessante verificare se in Xenopus, a livello di r4, XPhox2b venga spento prima di stadio 33-35 per permettere l’espressione di XPet-1, e conseguentemente la formazione di neuroni serotoninergici, anche in r4.
Esperimenti di immunoistochimica e ibridazione in situ su cervello adulto sono stati effettuati per verificare che, anche in Xenopus, il gene XPet-1, una volta acceso, permanga espresso nei neuroni serotoninergici romboencefalici per tutta la vita dell’organismo (Hendricks et al., 2003). Dalle analisi condotte su sezioni seriali di cervello adulto, è stato possibile
vedere come la presenza di serotonina e la marcatura corrispondente all’espressione di XPet-1 siano localizzate al livello degli stessi corpi cellulari con eccezione per una zona più anteriore del cervello positiva alla serotonina ma non a XPet-1. Molto probabilmente questa zona rappresenta una popolazione neuronale serotoninergica localizzata a livello dell’ipotalamo ventrale, che si ipotizza essere specificata da meccanismi indipendenti da XPet-1. Questa osservazione mi permette di rafforzare ulteriormente la conclusione della specificità di XPet-1 come marcatore selettivo dei neuroni serotoninergici romboencefalici. Inoltre, questo mi permette di ipotizzare che il gene XPet-1 sia necessario per il mantenimento del fenotipo serotoninergico. Sarebbe interessante osservare che cosa succede eliminando l’espressione del gene XPet-1 dal cervello adulto.
4.3 Analisi funzionali
Gli esprimenti funzionali svolti sono stati eseguiti sovraesprimendo il gene XPet-1 all’interno di tutto il tubo neurale a partire dagli stadi più precoci dello sviluppo di Xenopus, tramite l’utilizzo della tecnica della microiniezione.
Esperimenti di sovraespressione sono già stati condotti recentemente in pollo, utilizzando la tecnica dell’elettroporazione, e hanno permesso di concludere che il gene Pet-1 da solo non è in grado di promuovere il differenziamento di neuroni serotoninergici ectopici (Cheng et al., 2003). La motivazione della mia scelta di eseguire esperimenti di guadagno di funzione in un altro modello sperimentale deriva da due limitazioni della tecnica dell’elettroporazione. La prima limitazione è dovuta allo stadio su cui si applica, ossia stadio E2 dello sviluppo di pollo quando la somitogenesi è già avanzata. Essendo questo uno stadio abbastanza tardivo, relativamente allo sviluppo del sistema nervoso
centrale, i neuroni presenti nel midollo spinale (dove viene applicata l’elettroporazione) potrebbero non essere più competenti a cambiare destino differenziativo avendo già ricevuto una serie di informazioni posizionali specifiche per la regione del sistema nervoso in cui sono situati. Inoltre, indipendentemente dallo stadio di sviluppo deve essere tenuto in considerazione che il midollo spinale non è un territorio competente allo sviluppo dei neuroni serotoninergici. Per questo motivo Pet-1 potrebbe non trovare in questo territorio cofattori necessari per la sua funzione di attivatore trascrizionale.
Gli esperimenti svolti in Xenopus possono superare questi limiti dal momento che la microiniezione dell’mRNA di XPet-1 viene effettuata allo stadio di quattro blastomeri in uno dei due blastomeri dorsali, territorio presuntivo da cui origina l’intero sistema nervoso centrale. In questo modo l’mRNA di XPet-1 viene tradotto già a partire da stadi precoci e in tutto il tubo neurale.
Il processamento degli embrioni iniettati è stato fatto eseguendo ibridazioni in situ con un marcatore specifico del sistema serotoninergico: il trasportatore della serotonina (X5HTT o XSert) che è anche un “target” trascrizionale diretto di XPet-1 (Gaspar et al., 2003). Da una prima analisi degli embrioni iniettati, fatti crescere fino a stadio 35 e successivamente ibridati, non è stata identificata produzione di neuroni serotoninergici ectopici e, anche nel romboencefalo ventrale, non si assiste a una sostanziale differenza fra lato iniettato e lato di controllo. Questi dati, sebbene preliminari, potrebbero costituire una conferma del fatto che Pet-1, nonostante sia un gene indispensabile per la produzione dei neuroni serotoninergici, come dimostrato dagli esperimenti di “knock-out” in topo (Hendricks et al.,2003), da solo non è in grado di imporre un destino differenziativo di tipo serotoninergico nei precursori neuronali del sistema nervoso centrale al di fuori del suo normale territorio di espressione.
E’ possibile interpretare questi risultati e quelli ottenuti da studi riportati in letteratura formulando alcune ipotesi. Si può, infatti,
considerare che XPet-1 contiene al suo interno un dominio ETS, che, come già illustrato nell’introduzione, è importante per il legame al DNA ed inoltre permette interazioni proteina-proteina. E’ quindi plausibile pensare che per esercitare la sua funzione, XPet-1 necessiti di cofattori cellula specifici e che quindi la semplice espressione ectopica di XPet-1 non sia efficace nell’indurre un differenziamento di tipo serotoninergico.
Come già descritto nell’introduzione, i neuroni serotoninergici si differenziano da precursori neurali del pavimento del romboencefalo successivamente alla specificazione dei motoneuroni a partire dallo stesso “pool” di precursori. L’espressione di Pet-1 viene quindi regolata nel tempo e mantenuta silenziata fino a quando il differenziamento dei motoneuroni romboencefalici non è completato. E’ quindi possibile pensare che, nonostante la sovraespressione di XPet-1 avvenga a partire da stadi molto precoci di sviluppo nei precursori neuronali dei territori meso-romboencefalici, l’attività di Pet-1 venga contrastata dalla funzione di geni endogeni che reprimono un differenziamento di tipo serotoninergico. E’ stato ad esempio dimostrato nel topo che il fattore di trascrizione Phox2b è indispensabile per la produzione dei motoneuroni romboencefalici e la sua attività mantiene silente il processo di differenziamento dei neuroni serotoninergici fino a quando la specificazione dei motoneuroni non è completata (Pattyn et al., 2004). A questo riguardo, potrebbe quindi essere interessante provare a sovraesprimere XPet-1,. bloccando contemporaneamente la traduzione dell’mRNA endogeno di XPhox2b, tramite l’uso di oligonucleotidi antisenso modificati, (morpholino), e verificare se in questo caso XPet-1 possa essere in grado di promuovere il differenziamento di neuroni serotoninergici ectopici nelle regioni del meso-romboencefalo ventrale.
