INTRODUZIONE
Forse niente è importante, in termini di efficacia delle indagini microbiologiche in generale e viro-logiche in particolare, quanto la scelta corretta del tipo di campione da analizzare, del momento e del modo in cui viene raccolto, trasportato ed even-tualmente conservato. Il successo delle procedure diagnostiche è legato indissolubilmente alla qua-lità del materiale ottenuto e alla consapevolezza che tale qualità deve essere manenuta il più possi-bile invariata durante le varie fasi del lavoro suc-cessivo al prelievo (1, 2, 7, 8, 10).
A proposito di qualità del campione ricordiamo cosa indica, tra l’altro, il termine stesso: una o più parti prelevate da un sistema progettate per dare informazioni sull’intero sistema stesso. Quindi un buon campione per definizione dovrebbe essere scelto in modo da rappresentare il fenomeno che intendo studiare. Scendendo nel caso della virolo-gia un campione adeguato dovrebbe essere tale da fornire indicazioni più esaurienti possibile sull’in-fezione e sul processo patologico in atto.
Il buon esito della diagnosi di laboratorio perciò dipende da un prelievo che non può essere casua-le e richiede da un lato un background di cono-scenze sulle malattie virali e loro patogenesi, sui possibili agenti eziologici in gioco e sulla modali-tà ottimali per la loro ricerca, e dall’altro l’acqui-sizione volta per volta di informazioni specifiche sul quadro clinico e sullo stadio di infezione, sul-l’età, sulle altre caratteristiche del paziente (pro-venienza, viaggi, abitudini particolari ecc... tra le quali non ultima l’immunocompetenza) (7, 8). Due perciò sono le colonne portanti per poter impostare adeguatamente le ricerche virali: cultu-ra ed esperenza acquisite nel tempo e informazio-ni ottenute caso per caso dalla collaborazione con il Curante (2, 5 ,7, 8, 10).
Prima di affrontare in modo più specifico l’argo-mento vale la pena sottolineare due aspetti impor-tanti e peculiari:
Primo: i virus sono microrganismi intracellulari che richiedono cellule metabolicamente attive per una replicazione efficiente. Non appena prelevati questa cessa e il contenuto virale del campione rischia di impoverirsi e scendere in tempi brevi al di sotto dei limiti di evidenziazione. Maggiore saranno qualità del prelievo (=carica virale) e
accuratezza dei successivi passaggi, maggiore sarà la probabilità di persistenza di livelli virali evidenziabili(1, 2, 7).
Secondo: esistono sistemi diagnostici diversi. Oltre alle tecniche di biologia molecolare, tre infatti sono gli approcci fondamentali: 1) isola-mento in colture cellulare, poco frequentemente in animali e in uova; 2) ricerca dirette di particel-le virali, con microscopia eparticel-lettronica, o di antige-ni virali; 3) indagine sierologia per evidenziare la risposta immune specifica. Molte volte uno solo di essi non soddisfa la necessità del laboratorio di un referto più esaustivo possibile e si può rendere necessario utilizzarne più di uno e bisogna preve-dere questa possibilità. Ogni laboratorio deve quindi adattare i metodi di raccolta e preparazio-ne dei campioni per ottimizzare la resa virale in relazione alle diverse strategie diagnostiche in uso (1, 2, 7, 8, 10).
Elementi fondamentali nello stabilire i corretti protocolli, che dovranno essere poi chiaramente comunicati anche ai responsabili dei prelievi, sono: 1) il momento in cui ottenere il materiale biologico (tempi); 2) il tipo di materiale e il sito anatomico da cui prelevare; 3) la modalità corret-ta per compiere quescorret-ta operazione; 4) gli stru-menti necessari; 5) i contenitori adeguati; 6) il tra-sporto e la conservazione idonei. Questi elementi sono strettamente correlati fra di loro e si condi-zionano a vicenda e, soprattutto, sono correlati all’agente patogeno ricercato e alle procedure dia-gnostiche previste (2, 5, 10, 12).
I tempi
In generale dovrebbero essere quanto più tempe-stivi possibile rispetto all’esordio dei sintomi, sia che siano previste colture o metodi non colturali sia nel caso del prelievo ematico per anticorpi della fase acuta, importanti per poter stabilire il background immunologico del paziente.
I fattori che condizionano i tempi sono l’agente sospettato, il materiale che posso o intendo prele-vare e il metodo diagnostico previsto. Ad esempio il virus della parotite può essere rinvenuto nella saliva parecchi giorni prima e fino a cinque dopo l’esordio, quattordici giorni e oltre dopo l’esordio se utilizzo l’urina (14). Il virus della varicella
Il campione per esame virologico:
raccolta, trasporto e conservazione
Paola Martelli
zoster (VZV) è isolabile al massimo per 3-4 gior-ni nel liquido di bolla, anche successivamente se ricorro a microscopia elettronica o PCR (3). L’importanza di un campionamento precoce non solo è dovuta al fatto che quanto più si è tempe-stivi tanto più è alta la probabilità di successo per la maggiore carica virale, ma anche alla possibili-tà il tempo condizina la corretta interpretazione del risultato. Esempio tipico è la viruria da ese-guirsi nei primi quindici-ventuno giorni dopo la nascita per poter differenziare fra infezione con-genita e perinatale da CMV (4).
Per semplificare comunque indicazioni ottimali e generali possono essere: tre, quattro giorni dall’e-sordio e massimo 24 ore per i materiali post mor-tem. Una delle eccezioni che merita menzione per l’attualità dell’infezione è la SARS nel corso della quale è stato chiaramente dimostrato che l’escre-zione del Coronavirus aumenta nel tempo fino a raggiungere il massimo nel corso della seconda settimana di malattia (6, 11).
Per quanto riguarda la ricerca degli anticorpi è consigliabile sempre un secondo prelievo per verificare la dinamica della risposta immune in genere dopo una–due settimane, anche se talvolta la presenza di IgM può già indirizzare la diagnosi al primo campionamento. Se viene richiesta l’in-dagine su liquor deve essere sempre associata a quella su siero (7, 8, 13).
Sito di prelievo e tipo di materiale biologico, modalità e contenitori
A riconoscere l’organo bersaglio e a capire cosa e come raccogliere ci guidano i sintomi e i segni come pure ci aiutano la conoscenza della patoge-nesi,la storia naturale dell’infezione. Se infatti è chiaro per esempio che in caso di meningoencefa-lite il liquido cefalo rachidiano potrebbe rappre-sentare il materiale idoneo come in caso di gastroenteriti lo possono essere le feci, meno immediato è l’utilizzo del campione di urine in caso di parotite o di infezione da CMV.
Modalità e contenitori specifici sono diretta con-seguenza di sito, materiale e sistemi diagnostici (tabelle dalla 1 alla 3). Dal punto di vista pratico è utile distinguere materiali contaminati (esempio feci) e no (esempio liquido cefalorachidiano) da un lato e suscettibilità all’essicamento (esempio tampone faringeo) e no (esempio urine).
Premessa importante alla raccolta è che una volta deciso che il prelievo deve essere fatto si deve procedere in modo deciso, anche se la procedura risulta fastidiosa, chiarendo magari in precedenza al paziente e ai parenti cosa sarà fatto (7). Nelle tabelle dal numero 1 al 2 sono schematizza-ti il campione e modalità di raccolta per la coltu-ra. Le stesse informazioni sono indicate nelle
tabella 3 per i metodi non colturali.
In generale, per quanto riguarda gli strumenti per il prelievo ambulatoriale è necessario disporre in ambulatori di bisturi, speculum, siringhe da insu-lina, cateteri per prelievo rinofarigeo, set per pre-lievo ematici,tamponi adeguati. Materiali per rachicentesi o pompe per prelievo dalle vie respi-ratorie sono invece più comunemente dotazione dei reparti specializzati.
Per quanto riguarda i tamponi in particolare è conveniente escludere l’alginato di calcio, che può diminuire l’infettività di HSV, virus con cap-side e Chlamydiae e il legno che può risultare tos-sico per colture cellulari per la possibile presenza di tossine e formaldeide (5, 7). Lo stelo può esse-re in materiale plastico o alluminio, rigido o fles-sibile e di diametro diverso a secondo degli usi. La punta può essere di dacron, rayon, poliestere e cotone (2, 5, 7, 9, 10).
È necessario di riporre di vetrini puliti (trattati in acetone/etanolo) con adeguato contenitore per il trasporto (a libro, vaschetta o almeno piastra di Petri in materiale plastico sigillata con scotch). Sono utilizzabili anche vetrini ricoperti di teflon con pozzetto centrale già pronti all’uso.
Per quanto riguarda i contenitori devono essere adeguati al prelievo e consentire una raccolta age-vole quindi è meglio prevedere una rosa di possi-bilità: esempio provette da 15 ml e provettoni da 50 ml con tappo a vite, ma anche provette più pic-cole (1-2 ml circa), contenitori per urino - colture con tappo a vite. I contenitori devono essere pre-feribilmente sterili, inerti, non rilasciare sostanze tossiche o comunque interferenti, resistenti al congelamento ≤70°C anche rapido. A prova di spandimento e di rottura. In caso di sistemi non colturali commerciali, vanno usati i materiali for-niti o indicati dalla ditta. Nel caso i materiali (esempio prelievi con tamponi) siano suscettibili di disidratazione i contenitori devono contenere un adeguato medium di trasporto (VTM), la cui funzione o oltre a prevenire appunto l’essicamen-to è quello di stabilizzare i virus e mantenerne il più possibile la vitalità e ritardare, in caso di materiale contaminato, la crescita di batteri (2, 5, 7, 9, 10).
volumi maggiori in genere posso non essere necessari solo per tessuti (5-7 ml). In condizioni particolari può essere usata soluzione fisiologica meglio TSB. Non dovrebbero essere usati i tam-poni con terreno di trasporto per batteri (Stuart, Amies), il materiale può comunque essere recu-perato ma la resa è di solito inferiore in particola-re se pparticola-resente charcoal per la possibile inattiva-zione virale. I liquidi non devono essere posti in VTM che oltre a essere superfluo (molti sono ste-rile e hanno un contenuto proteico sufficiente a stabilizzare i virus) ha un effetto di diluizione (2, 5, 7, 9, 10).
Il prelievo per indagini sierologiche va eseguito in provette senza anticoagulanti e senza conservan-te, anche se per alcuni sistemi è consentito l’uti-lizzo di plasma. In genere conviene comunque seguire le indicazioni fornite dalla Ditta produttri-ce dei kit usati.
Trasporto e conservazione
Sistemi colturali: l’invio al Laboratorio deve essere quanto più tempestivo possibile, alcuni materiali come il liquor non dovrebbero essere trattenuti assolutamente in reparto Se non è immediato l’invio, i campioni vanno refrigerati a 4°C, con eccezione del sangue fluido che va refri-gerato o meno a seconda del sistema di separazio-ne delle cellule (2, 5, 7, 9).
Il trasporto deve essere fatto in contenitori refri-gerati, (thermos con ghiaccio, scatole di polistiro-lo con siberini non a diretto contatto con i cam-pioni) in caso di virus labili (es RSV) se è indi-spensabile un tragitto molto lungo il campione dovrebbe essere inviato in ghiaccio secco. Una volta in laboratorio, gran parte dei virus resi-stono 1-3 giorni a temperature fra 2 e 8°C, tutta-via è meglio seminare subito e conservare a-70°C il residuo. Virus labili (RSV) dovrebbero essere congelati rapidamente in ghiaccio secco e aceto-ne. L’utilizzo di 2SP con il 10% di sieroalbumina fetale e 10% di dimetil sulfossido può aiutare ulteriormente la stabilità. Il congelamento a -20°C non deve mai essere fatto in quanto risulta estre-mamente dannoso (2, 5, 7, 9, 10).
Sistemi non colturali: durata del trasporto e T di conservazione non sono così stringenti come per le procedure colturali, ma vanno comunque osser-vate alcune regole: per i trasporti brevi in genere non serve refrigerazione, una volta in laboratorio gli antigeni generalmente resistono almeno 24-48h a 2-8°C, per tempi più lunghi possono essere con-servati a temperature ≤20°C. Nel caso di utilizzo di sistemi commerciali si devono seguire le indi-cazioni fornite dalla ditta produttrice (2, 5, 7, 9). Prelievo ematico per indagini sierologiche: le pro-vette vanno tenute a temperatura ambiente,
lascia-te coagulare. Mai congelalascia-te! In laboratorio vanno sierate al più presto e il siero va conservato per qualche giorno a temperatura fra 2 e 8°C per più di una settimana è conveniente congelare a-20°C, salvo indicazioni specifiche diverse delle Ditta produttrici dei sistemi diagnostici in uso.
Ricordare che non è indispensabile il trasporto refrigerato, se è previsto però un tragitto lungo è consigliabile spedire sieri piuttosto che sangue intero che potrebbe emolizzare. Gli anticorpi sono resisteneti ma bisogna fare attenzione per evitare la contaminazione batterica del sangue e l’emoli-si che l’emoli-si può verificare facilmente per motivi diversi (7).
I trasporti interni ed esterni all’Ospedale e la spe-dizione dei campioni vanno fatta negli adeguati contenitori e imballi nel rispetto delle norme di sicurezza.
Valutazione dell’appropriatezza e criteri di non accettabilità
È responsabilità del laboratorio stabilire i criteri di accettabilità dei campioni e le linee guida per rifiutarli. Queste devono essere chiaramente comunicate e spiegate ai responsabili dei prelievi. Non appena il campione perviene al laboratori deve essere verificato che quanto previsto sia rispettato pienamente. In particolare va controllato: 1) La corretta identificazione del campione (dati anagrafici, provenienza, data, tipo di campione ecc)
2) La scheda con dati anagrafici, clinici –anamne-stici e il medico richiedente (come preventiva-mente concordata).
3) Il contenitore: adeguatezza; integrità, tenuta, contaminazione esterna.
4) Il trasporto: contenitori, temperatura e tempi 5) Il campione e la sua congruenze e quantità
suffi-ciente per la ricerca virale richiesta, nonché la contaminazione batterica o con altri materiali (esempio liquor-sangue, urine-feci, sperma-urine ecc). In caso di siero l’emolisi, la torbidità. Una volta verificata una qualsiasi congruenza va annotata in appositi registri e notificata immedia-tamente al responsabile del prelievo.
Nel caso il campione non risponda ai requisiti richiesti preventivamente indicati ai prelevatori, comunicare e motivare il rifiuto del campione tempestivamente ai prelevatori preferibilmente in modo scritto.
È importante prevedere tre possibili percorsi 1) Inadeguatezza grave e irrimediabile: rifiuto. 2) Campione adeguato: accettazione.
partire accettando il campione con riserva, notificando immediatamente il problema rile-vato al Prelerile-vatore e prevedendo un’ulteriore nota in calce al referto definitivo (2, 5). Conclusioni
Il campione ben raccolto rappresenta uno scrigno ricco di preziose informazioni che noi abbiamo l’obbligo di conservare e sfruttare al meglio. Pur tenendo conto delle diverse caratteristiche di virus e sistemi diagnostici, sono necessarie dei proto-colli che pur prevedendo la massima parte delle
possibili richieste siano semplici e non complichi-no senza ragione precisa il lavoro. È consigliabile scegliere le condizioni ottimali inoltre che per-mettano in un secondo tempo, se necessario, di variare il percorso diagnostico: esempio passare da una indagine colturale a una di tecnica di amplificazione. Nelle tabelle 4, 5, 6 sono pertan-to riassunte regole estremamente semplificate che possono aiutare a raggiungere questo target e per trasporto e conservazione e per accettazione del campione.
Tabella 1. Sono schematizzati campioni ( non liquidi) dai tratti gastroenterici , genitourinari, da cute e mucose , modalità di raccolta
e virus più comunemente ricercati . I materiali prelevati con tampone devono essere immediatamente stemperati in adeguato VTM (2, 5, 7, 8, 9, 10).
Campione per coltura Modi di raccolta Virus Note
Gastrointestinali Tampone rettale: inserire 4-6 cm nel retto, ruotare , stemperare in VTM
Feci 2-3 g (2 –3 cucchiani da te) in conteni -tore steriles (VTM solo se trasporto non immediato e rischio di essiccamento)
Adeno, Entero, HSV
Adeno, Entero, Corona.
Proctite .
Per gastroenteriti non equivalente a feci in quanto a resa virale
Genitourinari T. Cervicali (inserire a 1 cm, ruotare 10 sec) T.Vulvare
T.Uretrale (2-4cm)
HSV, CMV, Adeno HSV
HSV, Adeno
Eliminare prima il muco Non far urinare per almeno 1 h prima
Lesioni delle mucose Tampone strofinato sulla lesione Orali: Coxsackie A., HSV Anogenitali: HSV
Lesioni cute Vescicola fresca: lavare con fisiologica, rompere, raccogliere liquido e cellule della base con tampone. Se non vescicole, inumidire tampone con fisiologica e strofinare o rompere la superficie della lesione e prelevare dalla base con tampone umido o eseguire uno scraping .
Coxsackie A, Echo, HSV, VZV
Per VZV meglio aspirare liquido con siringa da insulina e sciacquare l’aghetto in VTM
Tabella 1a e 1b. Sono schematizzati campioni dalle vie respiratorie, modalità di raccolta e virus più comunemente ricercati . I
materiali prelevati con tampone devono essere immediatamente stemperati in adeguato VTM. (2 ,5, 6, 8, 9, 10, 11)
Campione da vie respiratorie
Modo di raccolta Virus
Liquidi Gargarizzato con 10 ml di VTM (TSB) Lavaggio nasale Aspirato nasofaringeo Lavaggio broncoalveolare., Aspirato endotracheale (8–10 ml ) L.pleurico (2ml) In contenitore sterile Raccolta non conveniente
Instillare salina sterile nelle narici , raccolta facendo inclinare capo in avanti. Meglio dispostivi con catetere e pompa in particolare nei bambini per aspirato.
RESPIRATORI
Rinite : Rino, RSV, Influenza, Adeno , Entero, Reo, Corona Faringite: Parainfluenza, Influenza, HSV, CMV ,+ virus della rinite Laringotracheite : Parainfluenza ,Influenza , RSV
Bronchite, Bronchiolite : RSV, Parai, Inflienza
Polmonite: Influenza, RSV, Parainfluenza, Adeno, CMV, Morbillo, Varicella , Coronavirus
Altri virus reperibili in vie respiratorie (prelievo rinofaringeo): Parotite
Esantematici : Entero, Rosolia, Morbillo Sindromi posttrapianto :HSV,CMV Infezioni congenite : CMV, Rosolia, HSV, VZV Note
T.nasale indicato per Rhino
Tabella 1b.
CAMPIONE DA VIE RESPIRATORIE Modo di raccolta Virus
Tamponi (t) Nasale
Rinofaringeo
Orofarngeo
Non lasciare essiccare.
Inserire un t. sottile flessibile per narice lasciare per qualche secondo, stemperare nello stesso VTM per entrambi
T. sottile flessibile attraverso narice fino a rinofaringe. Ruotare e stemperare in VTM Tamponare vigorosamente tonsille e faringe posteriore. Usare abbassalingua per evitare di raccogliere saliva.
Vedi tabella 1a
Tabella 2a. Sono schematizzati i liquidi biologici più comunemente usati per la coltura virale (2, 5, 9, 10)
Campione per coltura : Liquidi Modo di raccolta Virus
CSF ( 2-5 ml) Disinfezione con.tintura iodio 2%.In spazi intervertebrali L3- L4 o 4-5 . In contenitore sterile vuoto
Entero, Mumps ; meno frequentemente isolati Arbo, HSV, LCML ( difficile VZV, Morbillo meglio PCR)
Urine (10-20 ml mitto dimezzo) In contenitore sterile (2-3 campioni sequenziali per CMV)
CMV (neonati), Adenovirus (uretriti, cistiti emorragiche), HSV(uretriti), Polyoma (BK cistite emorragica,) Rubella, Mumps
Liquido amniotico Amniocentesi in contenitore sterile CMV,Rubella
Liquido.pericardico (2 ml) In contenitore sterile Coxsackie B
Tabella 2b.
Campioni x coltura Modo di raccolta Virus
Mat.congiuntivale./corneale Tamponare con t. sottile flessibile umido (fisiologica) cong. inferiore in VTM (prima eliminare muco)/ spatolato per cornea.
Congiuntintivit :e. Adeno, Entero, Morbillo (Rosolia) Cheratocongiuntivite : Adeno , HSV,VZV
Coriorenite : CMV
Tessuti Biopsia in VTM
Tess.autoptici (1-2 g) in VTM 8-10 ml
Patologia d’organo
Tabella 2c. Modalità per sangue e midollo (2, 4, 5, 6, 9, 10)
Campione per coltura Modo di raccolta Virus
Sangue (4-7 ml) *^ ( 10 ml in leucopenici)
Midollo (2 ml)
Prelievo in provette con anticoagulante EDTA (citrato, eparina)**.In alcuni casi serve siero o coagulo ( previa disinfezione cute : ottimale alcol isopropilico 70 % + iodio 2%)
Da cresta iliaca anteriore (bambini), posteriore, sterno, tibia (per età <18 mesi)
Comuni : CMV, HSV, Entero nei neonati , Arbo
Arena., Retro., EBV
CMV
Note e commenti
• *Utile in infezioni persistenti e disseminate dei pazienti immunocompromessi
• **Anticoagulanti: EDTA, Eparina; Citrato . Meglio EDTA perchè 1) eparina da un lato è stato segnalato interferire con HSV e dall'altro non è indicata nel caso il campione si debba necessariamente utilizzare anche per biologia molecolare; 2) per CMV antigenemia sono indicate eparina e EDTA
Tabella 3. Indicazioni per metodi di virologia non colturale(2,7, 9).
Metodo Virus Campioni/modi di raccolta (vedi sempre eventuali
indicazioni Ditte) Evidenziazione
AG con IF/ IE
Adeno ,CMV, HSV , Influenza, Para influenza, RSV, VZV, Morbillo, Parotite, Corona, Entero
Tamponi ./scraping: in VTM o su vetrino (HSV e VZV)
Aspirati e fluidi / tessuti Raccolta come coltura EIA/Latex
Adeno, HSV , RSV, Astro Entero, Rota Fluidi e Aspirati come coltura
Feci in contenitore sterile o pulito asciutto Tamponi o scraping
.
EM Rota, e agenti non coltivabili, Norwalk, Calici,
Astro, Corona
Feci in contenitore sterile o pulito asciutto Altri materiali : vedicoltura
Tabella 4. Indicazioni di massima e semplificate per la raccolta, il trasporto e la conservazione dei prelievi percoltura.
Tabella 5. Indicazioni di massima e semplificate per la raccolta, il trasporto e la conservazione dei prelievi per metodi non colturali
Raccolta campione per metodi non colturali : tempestiva, contenitore adeguato, sicuro, ben identificato /bile (dati paziente, provenienza ,data, materiale ) scheda
paziente
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Tabella 6. Schema per la valutazione del campione , l'accettazione con o senza riserva il rifiuto
