LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Konstantin Spiridonov
Atsparumą ir toksiškumą koduojančių determinančių paplitimas iš šunų
išskirtose Pseudomonas aeruginosa
Prevalence of toxicity and antimicrobial resistance genes in Pseudomonas
aeruginosa isolated from dogs
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Dr. Marius Virgailis
2
DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Atsparumą ir toksiškumą koduojančių
determinančių paplitimas iš šunų išskirtuose Pseudomonos aeruginosa “:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas)
vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINIS
Turinis ... 3 SUTRUMPINIMAI ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 Įvadas ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Taksonomija ir klasifikacija ... 10 1.2. Morfologija ir struktūra ... 10 1.3. Virulentiškumas ... 11 1.4. Piocianinas ... 11 1.5. Fermentai ... 111.6. Trečio tipo sekrecijos sistema ... 12
1.7. Šunų ausų uždegimas ... 12
1.8. P. aeruginosa atsparumas antibiotikams ... 13
1.8.1 Atsparumas penicilinams ir plataus spektro betalaktamazių sintezė ... 15
1.8.2 Atsparumas aminoglikozidams ... 16
1.8.3. Atsparumas fluorochinolonams ... 16
1.9. Pseudomonų sukeliamų infekcijų pavojus visuomenės sveikatai ... 17
2. Metodika... 17
2.1. Medžiagos paėmimas ir pristatymas į laboratoriją ... 17
2.2. Bakterijų išskyrimas ... 18
2.3. Pseudomonos spp. identifikavimas... 18
2.3.1. Oksidazės testas... 18
2.4. Jautrumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas... 18
2.5. Molekuliniai tyrimai ... 19
2.5. Fenotipinio atsparumo antibiotikui įgijimo greičio nustatymas ... 21
2.6. Statistinių duomenų analizė ... 22
3. rezultatai ... 22
3.1. Pseudomonų identifikavimas pagal biochemines savybes ... 22
4
3.3. Atsparumą β-laktaminiams antibiotikams koduojantys genai ... 23
3.3.1.Tem ... 23
3.3.2. Oxa ... 23
3.3.3. Shv ... 23
3.4. Atsparumas ciproflaksocinui: gyrA gyrB genai ... 23
3.5. Atsparumas karbopenamams: Pse, Oxa5 genai ... 24
3.6. Atsparumas sulfonamidui/trimetoprimui ... 24
3.6.1. Atsparumas sulfonamidui: sul1 sul2 ... 24
3.6.2. Atsparuma trimetoprimui: dfr1 dfr5 ... 24
3.7. Atsparumas cefalosparinui: ctxM cmy2 ... 24
3.8. Atsparumas gentamicinui: aadA, aac(3)ir aadB genai ... 24
3.9. Toksiškumą koduojantys genai ... 25
3.9.1. ExoS/ExoU genai ... 25
3.10. Atsparumo geno nustatymas, veikiant kultūrą gentamicinu ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
5. IŠVADOS... 34
5
SUTRUMPINIMAI
HI − hospitalines infekcijas
ITS −intensyviosios terapijos skyriuose Gram− − gramneigiamos bakterijos Gram+ − gramteigiamos bakterijos OE − Otitis externa
OXA − oksacilinazių PSBL − betalaktazmazių
PGR − grandininės reakcijos metodą LPS – liposacharidai
O antigenas – somatinis antigenas p – tikimybė
P. aeruginosa – Pseudomonos aeruginosa
mm − milimetras
iRNR – informacinė RNR liet. − lietuviškai
MIK − minimali slopinanti koncentracija pav. − paveikslas
RNR − ribonukleino rūgštis rRNR – ribosominė RNR spp. – rūšys
6
SANTRAUKA
Darbo autorius – Konstantin Spiridonov. Darbo vadovas − Dr. Marius Virgailis.
Pseudomonos gerai adaptuojasi įvairiose aplinkose, todėl skirtingai nei kitos bakterijos, geba
užimti įvairias ekologines nišas. Gebėjimas pasisavinti įvairius organinius junginius leidžia joms išgyventi kitiems organizmams nepalankioje aplinkoje. Pseudomonos gali būti natūralios mikrofloros dalimi, kaip saprofitinis organizmas, sutinkamas ant sveikų gyvūnų odos, gleivinių, kvėpavimo takuose ar virškinamajame trakte. Nusilpus imunitetui, Pseudomonos gali tapti pneumonijų, mastitų, abortų, septicemijos, otitų priežastimi. Kaip vienas iš adaptacinių veiksnių, Pseudomonos atsparumas antibakterinėms medžiagoms mechanizmas, leidžia joms išvengti antibakterinių medžiagų poveikio. Šunų otitas – dažnai pasitaikantis susirgimas, sukeliamas Pseudomonos aeruginosa bakterijų, kurio klinikinę eigą gali sunkinti ir kiti mikroorganizmai. Atsparios vaistams hospitalinės pseudomonų padermės tampa pavojingos ir žmonėms.
Tyrimo tikslas – išskirti Pseudomonos iš šunų ausies ar odos, identifikuoti rūšį, nustatyti išskirtų
P. aeruginosa jautrumą antibakterinėms medžiagoms bei nustatyti atsparumą koduojančius genus.
Jautrumas antibiotikams nustatytas Kirby-bauer metodu, atsparumą koduojantys genai – PGR metodu. Kartu nustatytas atsparumo gentamicinui įgijimo greitis. Tirti 76 mėginiai, paimti iš šunų ausies ar odos. Mėginiai rinkti Kauno ir Vilniaus smulkių gyvūnų klinikose. Virš 70 proc. izoliatų buvo atsparios trims ir daugiau antibiotikams. Dažniausia buvo koduojamas atsparumas penicilinams:
oxa genas nustatytas 15 proc. atvejų. Atsparumą kitiems antibiotikams koduojantys genai išskirti ne
daugiau nei 4 proc. atvejų. Exo S toksiškumą koduojančių determinačių aptikta 58,8 proc., o exo U – 23 proc. padermių. Nustatyta, kad P. aeruginosa atsparumas išsivysto po 3 kartų kontaktavus su antibakterine medžiaga.
Raktiniai žodžiai: šunys, Pseudomonos aeruginosa, jautrumas antibiotikams, toksiškumas, genai.
7
SUMMARY
The author of the work – Konstantin Spiridonov Scientific adviser − Dr. Marius Virgailis
Pseudomonos adapts well to various environments, which makes it different from the ability of
other bacteria to occupy various ecological niches. The ability to absorb various organic compounds allows them to survive in other hosts in a disadvantaged environment. Pseudomonos may be part of a natural microflora as a saprophytic organism found on a healthy animal in the skin, mucous membranes, respiratory tract, or gastrointestinal tract. With the loss of immunity, Pseudomonos could become a cause of pneumonia, mastitis, abortion, septicemia, and otitis. As one of the adaptive factors
Pseudomonos developed antimicrobial resistance mechanisms that allow them to avoid exposure of
antimicrobial agents. A common infection with dog otitis is caused by Pseudomonos aeruginosa bacteria, which may be aggravated by other microorganisms in the clinical case. Resistant to medicines, hospital Pseudomonos strains also become dangerous for humans.
Purpose of the study: isolation Pseudomonos from dog ear or skin, identifying species, determination P. aeruginosa resistance to antimicrobials and resistance encoding genes. Antibiotic susceptibility was determined by the Kirby-Bauer method, resistance-encoding genes - by PCR method. Meanwhile, the rate of gentamicin resistance has been determined. 78 samples were taken from dogs ear or skin. All samples collected in Kaunas and Vilnius small animal clinics. Over 60 proc. Isolates were resistant to three or more antibiotics. The resistance to penicillins was moust often encoded: the oxa gene was found to be 15 percent cases, Tem genes 7.8 percent. cases. The genes encoding resistance to other antibiotics are not more than 4% cases. Exo S toxicity coding determinants were detected 58.8%, exo U - 23%. Strains. P. aeruginosa has been shown resistance developing after 3 times contact with the antibacterial agent.
8
ĮVADAS
Pseudomonos aeruginosa − gramneigiama lazdelė, pakankamai svarbus patogenas žmonių
ir gyvūnų užkrečiamųjų ligų etiologijoje. Literatūroje nurodoma nemažai atvejų, kuomet ji gali būti atspari visoms antimikrobinių medžiagų klasėms. Dėl jų sunkiai gydomi pacientai, ypač turintys sumažėjusį imuninį atsparumą (1). Šunims P. aeruginosa yra dažna piodermos, otito priežastis, galinti sukelti išorinę ir šlapimo takų infekciją (2). Todėl, kad yra efektyvios vaistų pašalinimo sistemos (pompos) ir porinai. P. aeruginosa gali įgyti atsparumą įvairiems antimikrobiniams preparatams, įskaitant benzilpenicilinus, aminobenzilpenicilinus, karboksipenicilinus, pirmosios ir antrosios kartos cefalosporinus, chloramfenikolį ir tetracikliną (3). Ji taip pat formuoja biofilmus, kurie yra nepralaidūs antimikrobinėms medžiagoms, todėl gydymas tampa sudėtingesnis (4). Pagrindinės antimikrobinių medžiagų klasės, naudojamos sisteminių infekcijų gydymui, apima antipseudomonalinius penicilinus, trečią ir ketvirtą kartos cefalosporinus, karbapenemus, aminoglikozidus, ir fluorhinolonus. Deja, atsparumas šiems vaistams dažnas klinikinėje praktikoje. Dėl labai kintamo atsparumo modelių, empirinis gydymas gali vesti prie netinkamo gydymo. Taigi, antimikrobinio jautrumo tyrimai turėtų būti labai svarbūs parenkant antibakterinį gydymą. Didėjantis atsparumas fluorokvinolonų naudojimas tiek žmonių, tiek veterinarijos medicinoje kelia didelį susirūpinimą. (5). Atsparumas fluorokvinolonams iššaukiamas dėl taškinių mutacijų DNR girazėje (gyrA ir gyrB) ir topoizomerazės IV (parC ir parE) genuose. Plazmidžių ir efliukso sistema naudojama kaip alternatyvus atsparumo mechanizmas. 1 klasės 1 integronai yra svarbūs atsparumo sklaidai gramneigiamosiose bakterijose (7).
9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: identifikuoti iš šunų išskiriamų pseudomonų rūšį, nustatyti jų jautrumą
antibakterinėms medžiagoms bei atsparumą ir toksiškumą koduojančius genus.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti Pseudomonos iš šunų, identifikuoti išskirtas preudomonus iki rūšies, 2. Nustatyti išskirtų pseudomonų jautrumą antibakterinėms medžiagoms. 3. Nustatyti atsparumą ir toksiškumą koduojančias genetines determinantes. 4. Nustatyti fenotipinio atsparumo igijimo greitį pasirinktam antibiotikui.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Taksonomija ir klasifikacija
Pseudomonos priklauso Pseudomonadaceae šeimai, kurioje yra Pseudomonos, Burkholderia, Comamonas, Acidovarax, Brevundimonas, Stenotrophomonas, Xanthomonas gentys. Bakterijų rūšys,
priklausančios šioms gentims, vadinamos pseudomonomis. Jos klasifikuojamos remiantis augimo mitybinėse terpėse kolonijų morfologija, biocheminėmis savybėmis ir remiantis rRNR/DNR homologija. Jos skirstomos į penkias grupes. Tipinė rūšis yra Pseudomonos aeruginosa. Ji, atsižvelgiant į ląstelės sienelės LPS antigenus, dar skirstoma į serologinius variantus. Šiuo metu žinoma 30 P. aeruginosa serovarų. Tam tikras P. aeruginosa padermes, sukeliančias ligos protrūkius, galima skirstyti remiantis DNR hibridizacijos reakcija, gali būti tipuojamos ir remiantis jų jautrumu bakteriocinams (piocinams). (1)
1.2. Morfologija ir struktūra
Pseudomonos aeruginosa – vidutinio dydžio 0,5-1,0 x 1,5-4,0 µm tiesios ar truputį lenktos
lazdelės. Šios bakterijos priskiriamos griežtiems aerobams, tačiau dėl savo prisitaikymo gyventi ir daugintis, esant ribotam deguonies kiekiui arba visiškomis anaerobinėmis sąlygomis, laikomos fakultatyviniais anaerobais. P. aeruginosa gerai auga esant 25 ° C − 37 ° C temperatūrai ir jos gebėjimas augti 42 ° C temperatūroje, padeda ją atskirti nuo daugelio kitų Pseudomonos rūšių. (2)
Pseudomonos neformuoja sporų teigiamos oksidazės ir katalazės testams. Pseudomonos turi poliškai
išsidėsčiusį vieną ar kelis žiuželius pilių ir gali sudaryti polisacharidinę kapsulę, ypač plaučiuose, esant cistinei fibrozei. (6) Pseudomonos turi grupinio specifiškumo O ir variantinio specifiškumo H antigenų. Antigeninės savybės būdingos ir pseudomonų polisachandinei kapsulei adhezijos veiksniams, pilėms, išskiriamiems fermentams, kurie aktyviai dalyvauja, sukeliamų infekcijų patogenezėje. (1) P. auruginoza tepinėliuose gali išsidėstyti po vieną, poromis, retai – trumpomis grandinėlėmis. Dauguma P. aeruginosa padermių gamina vieną ar daugiau pigmentų, įskaitant piocyaniną (mėlyna-žalia), pioverdiną (fluorescuojantį mėlynos spalvos) ir piorubiną (raudonai ruda). Ankstesni tyrimai parodė, kad piocyaninas ne tik prisideda prie P. aeruginosa patvarumo, bet taip pat trukdo daugeliui žinduolių ląstelių funkcionuoti, įskaitant ląstelių kvėpavimą, epidermio ląstelių augimą, kalcio homeostazę ir prostaciklino išsiskyrimą iš plaučių endotelio ląstelių. (2) Piocyaninas (mėlyna žalia) unikalus šiam organizmui, jis pagamina daugiausiai padermių ir šis būdingas požymis leidžia identifikuoti P. aeruginosa. (3)
11
1.3. Virulentiškumas
P.aeruginosa virulentiškumo mechanizmai yra kompleksiški ir nepilnai ištirti. Pseudomonos. aeruginosa turi daug virulentiškumo faktorių, įskaitant piles, kapsulę, žiuželius, endotoksiną, piociną,
hemolyziną, fermentus, toksinus ir atsparumo antibakterinėms medžiagoms faktorius. (2) Šie faktoriai atsakingi už audinių pažeidimus bakterijos patekimo vietoje, šeimininko ląstelių membranų suardymą ir imuniteto faktorių slopinimą. Šiandien dar nėra tyrimais pagrįsto metodo kaip įvertinti kiekvieno faktoriaus atskirai įtaką P. aeruginosa virulentiškumui, tačiau manoma, kad visų faktorių visuma lemia šio mikroorganizmo virulentiškumą. (13) Kadangi Pseudomonos yra oportunistiniai mikroorganizmai, infekcija prasideda atsiradus makro pažeidimams, tokiems kaip odos traumos ar ligos, natūralios mikrofloros pokyčiai dėl antibakterinių medžiagų naudojimo ir kitų aplinkybių. Toliau seka P. aeruginosa ląstelių adhezija ant šeimininko epitelio ląstelių pilių ir kapsulinio polisacharido dėka.(36) Kapsulė vėlesnėse užkrėtimo stadijose saugo nuo imuninių ląstelių fagocitozės. Proteazės daug prisidėda prie pseudomonų paplitimo šeimininko audiniuose. Elastazė, ardydama ląstelių membranas, pašalina ląstelinį barjerą, kuris, esant sveikoms ląstelėms, stabdo infekcijos plitimą. Elastinas yra vienas pagrindinių plaučių audinių ir kraujagyslių komponentas. Manoma, kad elastazė vaidina svarbų vaidmenį audinių hemoraginės pneumonijos patologijoje, pažeidžiant plaučių parenchimą ir kraujagysles. (17) Toksinai ir proteazės sukelia edemą, hemoraginius pažeidimus ir nekrozės židinius odos žaizdose. Pilės ir kiti adhezinai svarbūs P.
aeruginosa kolonizuojant gleivinių ląstelių membranas ir kitus paviršius. Mukoidinis išorinis
sluoksnis (lipopolisacharido, LPS) supa ląstelę, leidžia joms prisitvirtinti vienai prie kitos ir sudaro bioplevelę, kuri saugo bakterijas ne tik nuo šeimininko imonokompetentinių ląstelių poveikio, bet ir silpnina antibakterinių medžiagų poveikį P. aeruginosa ląstelėms. (20)
1.4. Piocianinas
Šis pigmentas, manoma, priklauso virulentiškumo faktoriams. P. aeruginosa-vienintelis gram neigiamas mikroorganizmas, galintis sintetinti tokio pobūdžio medžiagą. Jis veikia kaip mitochondrijų fermentų slopintojas žinduolių audiniuose, todėl nosies gleivinės epitelis negali jo pašalinti P. aeruginosa, taip pat gali būti silpnai veikiama oksidacinių redukcinių reakcijų. Piocianinas aktyviausiai sintetinamas bakterijoms esant ramybės fazėje ir suteikiantis terpei spalvą. Piocianino sintezė vyksta veikiant phnA-Bgenams. (3)
1.5. Fermentai
Patogenezėje taip pat dalyvauja keletas išorinių ląstelinių patogenų, kurios išskiria P.
12
P. aeruginosa gamina keletą proteolitinių fermentų, kurie skaido daugybę substratų, įskaitant
kazeiną, elastiną, želatiną, kolageną ir fibriną. Mažiausiai trys skirtingi proteazės būdingos vadinamai bendrai proteazei, šarminėms proteazėms ir elastasei (9). Kiti faktoriai, tokie kaip hemolizinas, veikia makroorganizmo eritrocitus. Sintetinami egzotoksinai slopina baltymų sintezę ir sukelia šeimininko ląstelių žūtį. Sintetinami toksinai atsakini už vietinių ląstelių audinių pažeidimus, pagreitinana P.
aeruginosa invaziją į organizmą ir padedančiais slopinti organizmo imuninės sistemos poveikį.(8)
1.6. Trečio tipo sekrecijos sistema
Ši sistema aptinkama daugelio patogeniškų Gram neigiamų bakterijų tarpe. Tai sistema, tiesiogiai „sušvirkščianti“ toksinus į šeimininko ląstelę. P. aeruginosa tai vienas pagrindinių virulentiškumo faktorių, siejamas su ūmiomis infekcijos formomis ar net letaline baigtimi. (24) Žiuželio formą primenantis ląstelės darinys padaro poras šeimininkų ląstelių membranose, pro kurias sušvirkščiami baltymai. Kol kas identifikuoti keturi efektoriniai baltymai, exoY, exoS, exoU ir exoT.
P. aeruginosa padermėse šie 3 tipo sekrecijos sistema koduojama 36 genų. (10) Reikia pažymėti, kad
šie efektoriniai baltymai sintetinami nevienodai. Beveik visos pseudomonų padermės sintetina egzotoksiną exoU ar exoS, tačiau tik retais atvejais sintetinami abu. Tuo tarpu exoY ir exoS turinčių mažesnę reikšmę sintetinami daugumos P. aeruginosa padermių. exoU 100 kartų toksiškesnis ląstelei už exoS toksiną ir gali sukelti šeimininko ląstelių žūtį dėl nekrotinio poveikio ląstelių membranoms. (24,35)) Kol kas nėra išaiškintas kiekvieno toksino vaidmuo infekciniame procese, bet žinoma, kad 3 tipo sekrecijos sistema įgalina Pseudomonos sudaryti „plyšius“ epitelinių ląstelių lygmenyje ir trukdyti žaizdų gijimo procesui, veikiant ląsteles tiesiogiai (exoU toksinas) arba netiesiogiai (aktyvuojant neutrofilus). (25)
1.7. Šunų ausų uždegimas
Ausies uždegimas gali išsivystyti nuo išorinės ausies uždegimo, arba iš nosiaryklės pro eustachiaus vamzdį. Dažniausiai sutinkamas išorinės ausies uždegimas. Šio uždegimo priežastimi dažniausiai nurodomi mikroorganizmai, nes jie būna dažnai išskiriami uždegimo metu. Dažnai išskiriama P. aeruginosa. Žmonėms ir gyvūnams būdingas oportunistinis patogenas retai dalyvauja pirminėje ligoje (18). Tyrimais įrodyta, kad P. aeruginosa yra skirtinga infekcijų priežastis, pvz., lėtinė piodermija, lėtinis ausies uždegimas, dermatitas, cistitas ir šlapimo takų infekcinės ligos. Otitis externa (OE) yra apibrėžiamas kaip ūminis ar lėtinis išorinio klausos kanalo epitelio uždegimas, paprastai laikomas labiausiai paplitusia liga. Bakterinė OE yra dažna šunų liga. Nors OE nėra pavojinga gyvybei liga, ji gali būti nemaloni tiek pacientui, tiek savininkui. Organizmo atsakas prieš infekciją sukėlusią P. aeruginosa yra opsonizuojantys antikūnai ir makrofagų vykdoma fagocitozė. (11, 20). Šunų OE etiologija yra sudėtinga ir apima daugelį aspektų, kurie gali būti klasifikuojami kaip predisponuojantys, pirminiai ir antriniai. Mikroorganizmai yra laikomi nuolatiniais veiksniais,
13 nes jie yra atsakingi dėl ligos eigos pablogėjimo. Paprasti organizmai, išskirti iš šunų su OE, apima
Staphylococcus spp., Pseudomonos spp., Proteus spp., Streptococcus spp. Escherichia coli, Klebsiella spp. ir Pasteurella spp. (12). P. aeruginosa yra gramneigiama gliukzę fermentuojanti
aerobinė bakterija ir viena arba kartu su kitais mikroorganizmais, tokiais kaip Proteus mirabilis, yra dominuojanti lėtinė „obstrukcinė“ OE rūšis.(2) Tyrimais nustatyta, kad P. aeruginosa išskirta iš 9,64% šunų, sergančių OE. Mokslininkai savo tyrimuose nustatė, kad P. aeruginosa (27proc.),
Staphylococcus aureus, (18 proc.) S. intermedius, (18%) P. mirabilis, (12%) Escherichia coli, (9%) Corynebacterium pyogenes, 6% Streptococcus pyogenes, 3% Citrobacter spp. 3% buvo išskirti iš
šunų, kuriems diagnozuota OE. Uchida ir kt. (37, 38) savo tyrimuose nurodo, kad įvairūs mikroorganizmai (S. intermedius, S. hyucus, S. haemolyticus, Pseudomonos spp., Bacillus spp., S.
aureus, Corynebacterium spp. Ir Candida spp.) gali dalyvauti šunų OE etiologijoje. Otitis externa yra
daugiafaktorinės etiologijos liga, kurios pagrindines priežastys apima ektoparazitus, alergines ligas, dermatologinės problemas, endokrininius sutrikimus ir svetimkūnius (15). Tai dažniausiai būdinga šunų veislėms su nukabusiomis ausimis. Lėtinis ausies uždegimas apibrėžiamas kaip pasikartojanti ar nuolatinė išorinės kanalo ausies infekcija, trunkanti 6 mėnesius ar ilgiau (18). Mikroorganizmai, dažniausiai išskiriami iš šunų OE atveju, yra mielės Malassezia pachydermatis ir bakterijos
Staphylococcus intermedius (20). Dažnumas yra nuo 11 iki 13% dėl Pseudomonos spp. Pseudomonos
aeruginosa yra pagrindinė infekciją sukelianti rūšis. Be to, ligos paplitimas ir etiologinės priežastys gali skirtis priklausomai nuo geografinio regiono. (28)
1.8. P. aeruginosa atsparumas antibiotikams
Mikroorganizmai, atsižvelgiant į jautrumą tam tikrai antibakteriniei medžiagai, skiriami į jautriuosius ir atsparius (nejautriuosius).(27) Jautrumas antibakterinei medžiagai yra genetiškai determinuota mikroorganizmų rūšies savybė, pasireiškianti tuo, kad tos rūšies mikroorganizmai natūraliai sintetina „taikinius“, kuriuos veikdamas tam tikras antimikrobinis vaistas sustabdo tos mikroorganizmų rūšies ląstelių augimą ir dauginimąsi (mikrobostatiškas poveikis) ar/ ir juos užmuša (mikrobocidiškas poveikis).(14)
P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymas yra sudėtingas dėl šio mikroorganizmo didelio
pirminio (įgimto) atsparumo antibiotikams. Įgimtas sukėlėjo atsparumas susijęs su P. aeruginosa gebėjimu apsisaugoti nuo antibiotiko skverbimosi per išorinę membraną dėl sumažėjusio išorinės membranos laidumo, beta laktamazių sintezės ir dauginių aktyvaus antibiotikų pašalinimo iš ląstelės mechanizmų (10). Dėl prigimtinių P. aeruginosa atsparumo antibiotikams savybių kuriami nauji antibiotikai, veikiantys šį sukėlėją, tačiau P. aeruginosa gebėjimas įgyti atsparumą prieš jas veikiančius antibiotikus dar blogina ligos baigtis daugelyje šalių, taip pat ir Lietuvoje (42). Didėjant
14 gydymą netgi plataus veikimo antibiotikais. Atsparumui daro įtaką ir antibiotikų išmetimo iš ląstelės sistema – siurbliai („efflux“). Siurblių sistema sudaryta iš trijų baltymų: energiją taupantis siurblys, esantis citoplazmo membrana; išorinės membranos porinas ir Linkerio baltymas, kuris jungia du membraninius komponentus kartu. Taip susiformoja efektyvi šalinimo sistema, toksiškoms molekulėms pašalinti iš ląstelės citoplazmos. Keturios skirtingos siurblių („effluks“) sistemos buvo aprašytos P. aeruginosa padermėse: MexAB-oprM, MexXY-oprM, MexCD-oprJ ir MexEF. Visos antibiotikų klasės, išskyrus Polimiksinus, gali būti šalinamos vieno arba kelių iš šių siurblių.(30)
Pseudomonos pasižymi trijų tipų atsparumu. Natūralus mikroorganizmų nejautrumas
antibakterinėms medžiagoms yra koduojamas chromosomoje. Pseudomonos natūralus atsparumas siejamas su mažai pralaidžia išorine ląstelės membrana, antibiotikų pašalinimo pro ląstelės membrana mechanizmu-siurbliais ir sintetinamomis beta-laktamazėmis, AmpC. (15) Išorinė pusiau pralaidi membrana neleidžia sąlyginai mažoms hidrofilinėms molekulėms, tokioms kaip beta-laktamai antibiotikai, prisitvirtinti prie ląstelės membranos porinų baltymų. Pažymėtina, kad pseudomonų ląstelės išorinė membrana 10-100 kartų mažiau laidesnė Escherichia coli. „Siurbliai“ gali išstumti iš ląstelės platų antibakterinių medžiagų spektrą.(50) MexAB ir MexXY siurbliai kartu gali pašalinti beta-laktamus, chloramfenikolį, fluorochinolonus, makrolidus, novobiociną, sulfonamidus, tetraciklinus ir trimetoprimą ir aminoglikozidus. Periplazmoje esanti beta-laktamazė AmpC gali hidrolizuoti keletą beta-laktaminių antibiotikų, tokių kaip penicilinas ir cefalosporinai. Ši hidrolizė nėra intensyvi ir gali būti sužadinama esant nepakankamoms penicilinų terapinėmis koncentracijoms. (30) Siurblių ir beta-laktamazių suteikiamas atsparumas yra susijęs su mažu išorinės membranos pralaidumu. Didesnė beta-laktaminių antibiotikų koncentracija periplazmoje lemia greitesnį antibiotikų patekimą pro ląstelės membraną.(52)
Įgytas atsparumas pasireiškia kuomet į bakterijos genomą patenka atsparumą antibakterinėms medžiagoms koduojantys genai arba įvyksta mutacijos genuose, kurie koduoja atsparumo mechanizmus, anksčiau nebūdingus vienai ar kitai bakterijai. DNR elementai, tokie kaip plazmidės ir transpozonai, gali būti perduodami tarp bakterijų konjugacijos, transformacijos ar transdukcijos metu. Vienu metu gali būti perduodamas atsparumas kelioms antibiotikų klasėms. (29)
Naujai įgyti elementai taip pat gali sustiprinti natūralų P. aeruginosa atsparumą, pvz., įgytosios beta-laktamazės gali sustiprinti atsparumą tam tikriems beta-laktaminiams antibiotikams arba padidinti beta-laktaminių antibiotikų rūšių skaičių, kuriems pseudomona yra atspari. Įgyti genai taip pat gali sukelti mutacijas atsparumo mechanizmus reguliuojančiuose genuose ir didinti jau egzistuojantį atsparumą.(40) Pvz., mutacijos mexZ, kuris normalioje būsenoje slopina MexXY siurblio veikimą, gali skatinti šio siurblio aktyvesnį veikimą. (30). Adaptacinis atsparumas gali pasireikšti P. aeruginosa bakterijoms paveiktoms įvairių aplinkos faktorių, pvz., nepakankama terapinė antibiotikų koncentracija, bioplėvelių formavimas, ar įvairūs nepalankūs augimo faktoriai.
15 Auginant Pseudomonos terpėje, kurioje yra Mg2+ jonų trūkumas, ir esant peptidų, polimiksinų ir epitelinių ląstelių sąveikai, mažėja išorinės membranos lipopolisacharidų neigiamas krūvis, o tai mažina antibiotikų peptidų sąveiką su išorine membrana. (8, 9)
1.8.1 Atsparumas penicilinams ir plataus spektro betalaktamazių sintezė
Penicilinai yra organinės rūgštys. Jų cheminės struktūros pagrindą sudaro 6-aminopenicilano rugštis, kuri susideda iš betalaktamo ir tiazolidino tarpusavyje sujungtų žiedų, su atvira šonine grandine, prijungta prie beta laktamo žiedo.(41) Tiazolidino žiedas, prijungtas prie beta laktaminio žiedo, kuris turi antrinę amino grupę (RNH-). 6-aminopenicilo rūgšties branduolio struktūros vientisumas būtinas šių junginių biologiniam veiklumui, kuri yra svarbi antibakteriniam aktyvumui.(23) P. aeruginosa atsparumą betalaktaminiams antibiotikams gali sukelti keli mechanizmai: 1) genetinės mutacijos, kurias sąlygoja AmpC fermentai su chromosomų koduojama cefalosporinaze; 2) perkeliamų genų, koduojančių įvairius genus, įgijimas, pvz., beta-laktamazės; 3) „siurblių“ (efflux) sistemų perprodukcija; ir 4) sumažėjęs ląstelės sienelės pralaidumas. (24) Klinikinėse P. aeruginosa padermėse aptinkamas vis didesnis skaičius Ambler klasės plataus spektro betalaktazmazių (PSBL), karbapenemazių ir plataus spektro oksacilinazių (OXA). PSBL yra sparčiai auganti betalaktamazių grupė, kuri hidrolizuoja platų spektrą cefalosporinų, taip pat ir aztreonamą, taigi PSBL lemia atsparumą ne tik penicilinams, bet ir siauro veikimo spektro cefalosporinams. PSBL yra slopinama betalaktamazės inhibitoriais, tokiais kaip klavulano rūgštis. (21, 23) Nuo 2009 m. Gram neigiamose bakterijose nustatyta daugiau kaip 200 skirtingų PSBL. P. aeruginosa buvo aptikta 32 PSBL iš jų, kurios gali būti suskirstytos į dvi molekulines A ir D klases ir toliau suskirstytos į aštuonis pogrupius: TEM-, SHV-, CTX-M-, PER-, VEB-, GES-, BEL- ir OXA tipo beta-laktamazės. Enterobakterijose dažniausiai aptinkamos TEM ir SHV tipo ESBL fermentai, tuo tarpu OXA ir PSE tipo fermentai dažniausiai aptinkami P. aeruginosa bakterijose. (16, 33) AmpC beta-laktamazės priklauso C klasės cefalosporinazėms ir buvo identifikuotos Enterobacteriaceae šeimoje ir P.
aeruginosa rūšyje. C klasės molekulės prisideda prie įgimto Enterobakterijų ir P. aeruginosa
atsparumo penicilinams ir cefalosporinams, taip pat kaip ir jų kombinacijai su beta-laktamų ir b-laktamazių inhibitoriais. P. aeruginosa atsparumas ceftazidimui dažniausiai atsiranda dėl natūralios AmpC tipo cefalosporinazės fermento veiklos. Atsparumas įvairiems A, B ir C klasės beta-laktamazams enterobakterijų tarpe buvo nustatytas Taivane, ir tik viename tyrime nustatyta P.
aeruginosa OXA tipo PSBL. (32) Trys PSBLs, priklausantys OXA tipai buvo nustatyti 1294 P. aeruginosa izoliatuose, tarp jų OXA-14 (0,2%), OXA-17 (2,8%) ir OXA-10 (0,6%). PSBL fenotipui
aptikti Klinikinių laboratorijų standartų institutas (angl., CLSI) yra rekomendavęs dvigubą disko sinergijos testą Escherichia coli ir Klebsiella pneumoniae padermėms. (34) Fenotipinis pseudomonų PSBL nustatymas gali būti neįmanomas dėl chromosomos AmpC cefalosporinazė, nes AmpC nėra
16 slopinamas beta-laktamazių inhibitoriais (pvz., klavulano rūgštis). PSBL aptikimas P. aeruginosa padermėse galimas pridedant kloksacilino, nes tuo būdu slopinamas AmpC fermento aktyvumas.(22)
1.8.2 Atsparumas aminoglikozidams
Aminoglikozidai jungiasi prie 30S ribosominio subvieneto ir trukdo baltymų sintezei, proteinų sintezei, o tai sukelia DNR transliacijos sutrikimus ir bakterinės ląstelės žūtį be ląstelės lizavimo. AphA geno koduojama aminoglikozidų fosforiltransferazė atsakinga už bendrą atsparumą kanamicinui ir tai matoma klinikinėse P.aeruginosa padermėse. (31, 32) Tačiau pseudomonų infekcijų gydymui naudojami aminoglikozidai (amikacinas, gentamicinas, tabromycinas) gali būti naudojami šios infekcijos gydymui.(19) Aminoglikozidų patekimas ir vėlesnė sąveika su bakterine ląstele yra kompleksas veiksnių, kuriame vyksta lipopolisacharidų (LPS) prisijungimas ir patekimas į ląstelę pro išorinę membraną, ribosomų pažeidimą, kuris veda prie jų sintezuojamų baltymų sintezės nutraukimo ar transliacijos proceso sutrikimo. (20, 29) Įgimtas ar adaptacinis klinikinių pseudomonų atsparumas aminoglikozidams siejamas su MexXY siurblių sistema. Ši sistema dažnai sužadinama kuomet klinikinėje praktikoje naudojamų aminoglikozidų ar kitų ribosomas slopinančių antibiotikų (chloramfenikolis arba tetraciklinai) koncentracija organizme nepasiekia rekomenduojamos terapinės koncentracijos organizme. Nepakankama koncentracija taip pat skatina P.aeruginosa bioplėvelių formavimą, o tai didina pseudomonų atsparumą antibakterinėms medžiagoms. (16, 33)
1.8.3. Atsparumas fluorochinolonams
Fluochinolonai, ypač ciprofloksacinas, yra dažnai naudojamas antibiotikas P.aeruginosa sukeltoms infekcinėms ligoms gydyti. Šis antibiotikas, patekęs į ląstelę, saveikauja su DNR kompleksais ir dviem fermentais DNR giraze ir topoizomeraze.(39) Natūralus P.aeruginosa laikinių kamienų atsparumas siejamas su antibakterinių medžiagų išstūmimo mechanizmu – siurbliais MexAB ir MexXY. Tačiau klinikinėse padermėse ir laboratorinėse šis atsparumas dažniau siejamas su keturiais siurbliais – (Mex) AB, CD, EF, ir XY. (31, 33) Kiti autoriai nurodo, kad atsparumas chinolonams gali būti siejamas ir su mexHi siurbliu. Kaip ir kitais atvejais, atsparumą antibiotikams gali didinti bioplėvelių formavimas, ypač tai pastebėta inkubuojant P.aeruginosa su nedidelėmis (nesiekiančiomis gydomojo klinikinio efekto) ciprofloksacino tobramycino, ir tetraciklino koncentracijomis. (26) Tačiau inkubuojant analogiškomis sąlygomis su karbenicilinu, chloramfenikoliu, ar polymiksinu toks atsparumo padidėjimas nebuvo užfiksuotas. Inkubuojant su ciprofloksacinu (bet ne su tetraciklinu ir tobramycinu) buvo matomas P.aeruginosa judrumo sumažėjimas, o tai rodo antibiotiko poveikį bakterijų judėjimui.(17, 41)
17
1.9. Pseudomonų sukeliamų infekcijų pavojus visuomenės sveikatai
Pseudomona aeruginosa – gramneigiamos aplinkoje paplitusios bakterijos, dažnai ligoninėse sukeliančios su plaučių ventiliavimo įrangos naudojimu susijusias infekcijas ir kraujo bei šlapimo takų infekcijas. P aeruginosa – vieni pagrindinių hospitalinių infekcijų sukėlėjų, sukelia apie 10-20 % visų hospitalinių infekcijų, apie 20 % visų hospitalinių plaučių uždegimų. Infekcijos šaltinis dažniausiai būna užteršti medicininiai instrumentai ir preparatai. Mikroorganizmai dažniausiai plinta lytėjimo būdu. Viena svarbiausių ligos atsiradimo sąlygų yra traumos, žaizdos, cukrinis diabetas, nusilpusi imuninė sistema ir kt. (14) Pseudomonų sukeltų ligų gydymas sudėtingas, nes dažnai šie mikroorganizmai atsparūs antibiotikams (polirezistentiškieji hospitaliniai ekovarai). Infekcijas, sukeltas P. aeruginosa, reikia gydyti ne vienu antimikrobiniu vaistu, nes greitai susidaro atsparumas. Antibiotikai vartojami remiantis antibiograma. Gydoma penicilinais, pvz., mezlocilinu ar piperacilinu kartu su aminoglikozidais, dažniausiai gentamicinu, tobramicinu ar amikacinu. (15)Pseudomonų sukeltų ligų gydymas sudėtingas, nes dažnai šie mikroorganizmai atsparūs antibiotikams (polirezistentiškieji hospitaliniai ekovarai). Infekcijas, sukeltas P. aeruginosa, reikia gydyti ne vienu antimikrobiniu vaistu, nes greitai susidaro jam atsparumas. Antibiotikai vartojami remiantis antibiograma. Kontroliuoti P. aeruginosa infekcijas sveikatos priežiūros įstaigose sunku dėl šių bakterijų paplitimo ir atsparumo daugeliui ligoninėse vartojamų detergentų, dezinfekcinių ir antimikrobinių medžiagų. Didelė P. aeruginosa bakterijų dalis atspari antimikrobiniams vaistams daugelyje šalių, ypač Pietų ir Rytų Europoje. Dauginiu (ne mažiau kaip trims antibiotikų klasėms) atsparumu pasižymi 15 proc. išskirtų P. aeruginosa bakterijų, o 5 proc. – visoms vartojamų antibiotikų grupėms (16). Atsparūs piperacilinui P. aeruginosa sudaro nuo 1,1 proc. (Švedijoje) iki 62,5 proc. (Rumunijoje) visų invazinių sukėlėjų. 2007–2010 m. atsparumas piperacilinui gerokai padidėjo Prancūzijoje ir atsparios bakterijos sudarė 20,3 proc. visų invazinių bakterijų. Atsparūs fluorochinolonams P. aeruginosa sudaro nuo 4,3 proc. (Olandijoje) iki 55,6 proc. (Rumunijoje). 2010 m. 28 Europos šalyse užregistruota vidutiniškai 17,9 proc. atsparių karbapenemams P. aeruginosa ir jų paplitimas varijavo nuo 0 proc. (Islandijoje) iki 70 proc. (Rumunijoje). 2005 m. Europos šalyse atsparūs karbapenemams P. aeruginosa sudarė 22 proc. visų invazinių sukėlėjų, 2008 m. ši dalis išaugo iki 24 proc., o 2010 m. sumažėjo iki 22 proc. (43).
2. METODIKA
2.1. Medžiagos paėmimas ir pristatymas į laboratoriją
Tyrimai atlikti 2016 – 2017 metais Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Medžiaga tyrimams rinkta Kauno L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje, veterinarijos klinikoje „Pas Pumą“, Vilniaus Jakovo veterinarijos centre ir gyvūnų prieglobstyje „Tautmilės globa“. Tiriamoji
18 medžiaga rinkta steriliais vienkartiniais tamponėliais, iš karto po paėmimo patalpinta į transportinę terpę (TRANSWAB, Jungtinė karalystė). Medžiaga pristatyta į laboratoriją tą pačią dieną. Medžiaga imta iš pažeistų organų – odos ir ausų.
2.2. Bakterijų išskyrimas
Į laboratoriją pristatyta medžiaga tą pačią dieną buvo sėta į mitybines terpes. Naudotos bendro naudojimo terpės bei selektyvios ir diferencinės terpės: Sojos agaras (Oxoid, Jungtinė karalystė), Citrimido agaras (Oxoid, Jungtinė karalystė), McConkey agaras (Liofilchem, Italija) ir Kolumbijos su 5 proc. avies krauju agaras (S&O Laboratories Ltd., Škotija). Užsėtos lėkštelės inkubuotos +35C temperatūroje, 24-48 val. aerobinėse sąlygose.
2.3. Pseudomonos spp. identifikavimas
Aerobinės gramneigiamos citochromoksidazę (oksidazės reagentas, Becton Dicenson, Jungtinė Karalystė) gaminančios lazdelės identifikuotos pagal vandenyje tirpių pigmentų piocianino, pioverdino, piorubino ir piomelanino, gamybą ir kolonijų augimo standžiose terpėse morfologiją. Vertintas kolonijų augimas +42ºC ir +5ºC temperatūroje, judrumas, hemolizės buvimas kraujo agare, gebėjimas augti McConkey agare. Išskirtų bakterijų biocheminis aktyvumas tirtas naudojant „Microgen ID Systems“, GnA+B-ID (Jungtinė Karalystė) identifikavimo sistemas. Gauti rezultatai vertinti kompiuterine programa „Microgen ID“, versija 1.2.5.26. (Jungtinė Karalystė).
2.3.1. Oksidazės testas
P. aeruginosa identifikuoti naudojamas oksidazės testas. Ant filtrinio popieriaus kultūra
maišoma su oksidazės reagentu (Becton Dickinson, JAV). P. aeruginosa gamina fermentą oksidazę, išryškėja purpurinė spalva – reakcija teigiama. Enterobacter spp. negamina oksidazės, purpurinė spalva nesusidaro − reakcija neigiama. Testas daromas identifikuoti P. aeruginosa nuo
Enterobacter spp. naudojamas oksidazės testas.
2.4. Jautrumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas
Išskirtų ir identifikuotų pseudomonų jautrumas antibakterinėms medžiagoms tirtas diskų difuzijos agare (modifikuotas Kirby Bauer) metodu, naudojant Miueller-Hinton (Liofilchem, Italija) agarą ir žinomos koncentracijos antibiotikų diskus (Liofilchem, Italija). Antibiotikų rūšys parinktos pagal Europos atsparumo antibiotikams komiteto (EUCAST) rekomendacijas t.y. parinktos tyrimui tos medžiagos, kurios gali būti naudojamos klinikinėje praktikoje prieš atitinkamų rūšių ligų sukėlėjus (skirtingų antimikrobinių medžiagų klasių atstovai, kurie turi nustatytą klinikinį lūžio tašką (clinical break-point). Nesant reikšmių EUCAST sistemoje, naudota JAV klinikinių laboratorijų standartų instituto (CLSI) rekomenduojamos atsparumo reikšmės. Pagal šios organizacijos
19 reikalavimus atlikta ir rezultatų interpretacija, rezultatus vertinant kaip „jautri padermė“ ir „atspari padermė“. Naudotų antibakterinių medžiagų sąrašas ir koncentracijos pateiktos lentelėje.
Lentelė Nr 1. Tyrimams naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir
Pseudomonos aeruginosa atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm)
Antimikrobinė medžiaga
Koncentracija diske, μg
(arba IU
Klinikinė reikšmė (EUCAST/CLSI),
sterili zona Jautri, ≥ mm Atspari, mm Ciprofloksacinas 5 26 26 Gentamicinas 10 12 12 Sulfametoksazolis/trimetoprimas 25 16 10 Aztreonamas 30 50 16 Imipenemas 30 20 17 Ceftazidimas 25 17 17 Piperacilinas/tazobaktamas 110 18 18
2.5. Molekuliniai tyrimai
Pseudomonos areuginosa padermės pasižymėjusios atsparumu bent vienai antibakterinei
medžiagai tirtos siekiant išsiaiškinti, ar šis atsparumas yra koduojamas genų. Tuo tikslu Pseudomonos užsėtos ant sojos peptono agaro (Liofilchem, Italija) ir auginamos aerobinėse sąlygose +35ºC, 24 valandas. Bakterijų DNR išskyrimui keletas bakterijų kolonijų paimtų nuo standžios terpės resuspenduojama 200μl dejonizuoto vandens. Suspensija virinama 5 minutes vandens vonioje, o po to centrifuguojama 10 000 g. suspensijos nusiurbiama ir laikoma -18C temperatūroje.
Toksiškumą ir atsparumą atskirų klasių antibiotikams koduojančių genų paieška vykdyta naudojant polimerazės grandininės reakcijos metodą (PGR). PGR atlikti naudoti šiai reakcijai būtini komponentai: polimerazės, magnio jonų tirpalas, deoksinukleotidų mišiniai, atitinkami pradmenys, tiriamųjų bakterijų genominė DNR. Reakcija atlikta (BOECO, Vokietija) termocikleryje. DNR sintezė vykdoma 30-čia ciklų, kuriuos sudaro: DNR denatūracija (94°C, 30s), pradmenų prilipinimas (temperatūra parenkama pagal pradmenų Tm,Tm=4x(G+C)+2x(A+T), 1 min), DNRsintezė (72°C, laikas parenkamas pagal sintetinamo DNR fragmento ilgį. Polimerazės DNR sintezės greitis yra 2-4 kb/min, - 1 min sintezės laikas yra optimalus DNR fragmentų iki 2 kb sintezei. Jei fragmentai ilgesni, kiekvienai 1 kb pridedama 1 min.). Oligonukleotidiniai pradmenys buvo sukonstruoti atsparumą lemiančių genų koduojamų baltymų N galinės srities amplifikavimui, padauginant optimalaus ilgio
20 (300 – 1000 bp) DNR fragmentus. Taip pat panaudotos mokslinėse publikacijose pateiktos pradmenų sekos atskiriems genams tirti. Pradmenys pagal užsakymą buvo susintetinti Metabion International AG (Vokietija). Tirti genai pateikti lentelėje Nr. 1. Kiekvieno geno tyrimams atidirbtas protokolas, pagal galimybes, ekonominiam efektui pasiekti naudotos „Multiplex“ tipo PGR reakcijos, o laiko taupymui ir tikslumui pasiekti naudoti Fusion Flash High Fidelity (Thermo Fisher) ar Fast Mix (KAPA Biosystems, PAR) PGR reakcijų mišiniai. Atlikus PGR reakciją DNR fragmentai buvo frakcionuojami elektroforezės būdu 0,7 – 2% agarozės gelyje. Gelis ruošiamas: iš 1,6 ml TAE buferio supilta į matuoklį, iki 80ml įpilta vandens ir įdėta į 1,6 g agarozę su 9,4 ml 1,3% etidžio bromidu. Į gelio šulinėlius pipete kas kartą keičiant antgalius buvo įvedama po 10 μl gauto PGR produkto, o į pirmuosius šulinėlius įvesta 4,5 μl žymeklio „GeneRuler TM 1500 bp DNA Ladder”. DNR fragmentų gelyje frakcionavimui naudotas elektroforezės aparatas Cleaver, (Jungtinė Karalystė), o jiems išryškinti gelių dokumentavimo sistema GelDoc (Ultraviolet Products, Vokietija).
Lentelė Nr 2 P. aeruginosa atsparumą koduojantys genai, pradmenys, hibridizacijos
temperatūra.
Antimikrobinė medžiaga
Atsparumo
genas Pradmenų sekos
PGR produkto ilgis (kbp) Hibridizacijo s T 0C Penicilinai TEM-F 5' GAGTATTCAACATTTTCGT 3' 857 50 TEM-R 5' ACCAATGCTTAATCAGTGA 3' OXA-F 5' TCAACAAATCGCCAGAGAAG 3' 276 55 OXA-R 5' TCCCACACCAGAAAAACCAG 3' SHV-F 5' TCGCCTGTGTATTATCTCCC 3' 768 52 SHV-R 5' CGCAGATAAATCACCACAATG 3' ctxM-F 5' ATGTGCAGYACCAGTAARGT 3' 876 56 ctxM-R 5' TGGGTRAARTARGTSACCAGA 3' cmy2-F 5' GCACTTAGCCACCTATTACGG 3' 758 56 cmy2-R 5' GCTTTTCAAGAATGCGCCACC 3' Aminoglikozidų grupė aadA-F 5' GTGGATGGCGGCCTGAAC 3' 487 61 aadA-R 5' AATGCCCAGTCGGCAGCG 3' aadB-F 5' ATGGACACAACGCAGGTCGC 3' 534 64 aadB-R 5' TTAGGCCGCATATCGCGACC 3'
aac(3) I-F 5' TGAAACGCTGACGGAGCCTC 3'
369 61
aac(3) I-R 5' GTCGAACAGGTAGCACTGAG 3'
Sulfonilamidai
sul 1-F 5' TTCGGCATTCTGAATCTCAC 3'
547 55
sul 1-R 5' ATGATCTAACCCTCGGTCTC 3'
21 sul 2-R 5' GTGTGCGGATGAAGTCAG 3' 543 51 Trimetoprimas dfr1-F 5'ACGGATCCTGGCTGTTGGTTGGACGC 3' 254 58 dfr1-R 5'CGGAATTCACCTTACGGCTCGATGTC 3' dfr5-F 5' GCBAAAGGDGARCAGCT 3' 394 58 dfr5-R 5' TTTMCCATATTTGATAGC 3' Karbopenemai pse-F 5' ACTGTATTGAGCCTTATTTA 3' 321 60 pse-R 5' ATCGAAGCCTGTGTGTGAGC 3' oxa5-R 5' AGCCGCATATCTAGTTCTAG 3' 664 50 oxa5-F 5' ACCTCAGTTCTTTTCTCTAC 3' Ciproflaksocinai gyrA-F 5' CGGGATGAACGAATTGGGTGTGA 3' 250 60 gyrA-R 5' AATTTTACTCATACGTGCTTCGG 3' gyrB-F 5' TGAAATTCTTGCTGGAAAAC 3' 370 gyrB-R 5' CAACAATAGGACGCATGTAAC 3' 60
Lentelė Nr 3 P. aeruginosa toksiškumą koduojantys genai, pradmenys, hibridizacijos
temperatūra
Toksiškumo
genas Pradmenų sekos
PGR produkto ilgis (kbp)
Hibridizacijo s T 0C
exoS-F ATC CTC AGG CGT ACA TCC
328 63
exoS-R ACG ACG GCT ATC TCT CCA C
exoU-F AGT GCT TAC ATT CCC CAG ATT AAG
271 63
exoU-R TGT CAA AAT TCT TGT CGA TCA TCT
2.5. Fenotipinio atsparumo antibiotikui įgijimo greičio nustatymas
Paruošti 10 vnt., 15 ml talpos mėgintuvėliai. Į kiekvieną mėgintuvėlį, įpylėme po 9 ml Muller-Hilton sultinio. Terpė autoklavuojama. Į pirmą megintuvėlį įpilame 1 ml 10% gentamicino (1ml yra 10mg gentamicino). Toliau atliekamas dešimtainins gentamicino serijinis praskiedimas. Sumaišoma panaudojant „Vortex“ maišytuvą.Sterilia kilpele paimama P. aeruginosa kultūra, nepasižyminti atsparumu antibiotikams, neturinti atsparumą ir toksiškumą koduojančių genų. Ji suspenduojama fiziologiniame tirpale iki 1,0 Mc Farland vieneto. Įpilama po 1 ml į kiekvieną mėgintuvėlį su serijiniu antibakterinės medžiagos skiedimu ir sumaišoma. Prieš kultivavimą kiekvieno mėgintuvėlio optinis tankis 0,24 McF vieneto. Kultivuojama 24h 35-37 oC temperatūroje. Po kultivavimo nustatoma minimali inhibuojanti koncentracija (MIK), kartu matuojant kultivuotos terpės optinį tankį (McFarland). Iš mėgintuvėlio,
22 kuriame yra didžiausia auginimo koncentracija gentamicino, paimama kultūra ir 24 val. +35 C temperatūroje auginama kraujo agare (Kolumbijos agaras su 5 proc. avies krauju). Vėliau kultūros atsparumas antibiotikui patikrinamas atliekant diskų difuzijos metodą. Ši kultūra naudojama tyrimo pakartojimui anksčiau aprašyta tvarka. Tyrimas kartojamas 10 kartų. Patikrinti fenotipinį atsparumą atliekama atsparumą koduojančio geno amplifikacija (PGR).
2.6. Statistinių duomenų analizė
Skaičiavimai atlikti naudojantis Excel 2010 programa. Naudotas Student's t-test. Apskaičiuotas koreliacijos koeficientai ir paklaidos. Rezultatai statistiškai patikimi laikomi tuomet, kai p<0,05, p<0,01, p<0,001, nepatikimi, kai p>0,05.
3. REZULTATAI
3.1. Pseudomonų identifikavimas pagal biochemines savybes
Iš viso tirti 100 mėginių, paimti iš šunų ausų ir nuo šunų odos. Pagal oksidazes testą, pigmentų gamybą, augimo morfologiją, gebėjimą augti McConkey agare, hemolizę kraujo agare ir kitus požymius P. aeruginoza nustatyta 76 mėginiuose (76 proc.). Išskirtų bakterijų biocheminis aktyvumas tirtas naudojant „Microgen ID Systems“, GnA+B-ID (Jungtinė Karalystė) identifikavimo sistemas.
3.2. Kirby – Bauer diskų difuzijos atsparumo antibiotikams tyrimas
Kirby – Bauer diskų difuzijos metodu ištirtas atsparumas septyniems antibiotikams. Ciproflaksocinui buvo jautrūs 46 izoliatai (60,5 proc.) ir 30 (39,4 proc.) atsparūs. Piperacilinui/ tazobaktamui buvo jautrūs 58 izoliatai (76,3 proc.) ir 20 (26,3 proc.) atsparūs. Gentamicinui buvo jautrūs 30 izuoliatai (39,4 proc.) ir 40 izoliatų atsparūs (52,6 proc.), o 6 izoliatai neįeina į atsparumo ar jautrumo kriterijus. Sulfametazolui/tazobaktamui buvo jautrūs 8 izoliatai (10,5 proc.), atsparūs - 66 izoliatai (86,8 proc.), o 4 izoliatai atitinka vidutiniškai atsparių pseudomonų kriterijus. Imipinemui buvo jautrūs 47 izoliatai (61,8 proc.), atsparūs – 17 izoliatų (22,3 proc.), o 4 izoliatai (5,2 proc.) neįeina į atsparumo arba jautrumo kriterijus. Ceftazidimui buvo jautrus 71 izoliatas (93,4 proc.), atsparūs 5 izoliatai (7.8 proc.). Aztreonamui buvo atspari viena kultūra (1,3 proc.). Visi Duomenys Kirby – Bauer diskų difuzijos atsparumo antibiotikams duomenis statistiškai patikimi (p<0,05).Kai kuriems izoliatams būdingas daugybinis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms, rezultatai pateikiami 1 paveiksle.
23
1 pav. Daugybinis atsparumas antibiotikams, (n = 76)
3.3. Atsparumą β-laktaminiams antibiotikams koduojantys genai
β-lactaminių antibiotikų grupei priklauso piperacilinas/tazobaktamas ir aztreonamas.3.3.1 Tem
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma Tem 857 bp pradmens amplifikacija. Šeši izoliatai turėjo geną Tem (7,89 proc). Trys izoliatai buvo jautrūs piperacilinui/tazobaktamui ir visi turintis geną atsparūs aztreonamui.
3.3.2. Oxa
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma Oxa 276 bp pradmens amplifikacija. Dvylika izoliatų turėjo geną Oxa (15,78 proc). Keturi izoliatai buvo jautrūs piperacilinui/tazobaktamui ir visi turintis geną atsparūs aztreonamui.
3.3.3.Shv
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma Shv 768 bp pradmens amplifikacija. Trys izoliatai turėjo geną Shv (3,94 proc). Visi izoliatai atsparūs piperacilinui/tazobaktamui ir aztreonamui.
3.4. Atsparumas ciproflaksocinui: gyrA gyrB genai
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma gyrA 250 bp ir gyrB 370 bp pradmens amplifikacija. Keturi izoliatai turėjo gyrA geną (5,26 proc.) ir keturi izoliatai turėjo gyrB geną (5,26 proc.). Visi
24 izoliatai su gyrA genu buvo atsparūs ciproflaksocinui. Vienas pradmuo su gyrB buvo jautrus ciproflaksocinui, kiti – atsparūs. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
3.5. Atsparumas karbopenamams: Pse, Oxa5 genai
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma Pse 321 bp ir Oxa5 664 bp pradmenų amplifikacija. Vienas izoliatas turėjo Pse geną (1,31 proc.) ir trys izoliatai turėjo Oxa5 geną (3,94 proc.). Visi izoliatai buvo atsparūs imipinemui. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
3.6. Atsparumas sulfonamidui/trimetoprimui
3.6.1. Atsparumas sulfonamidui: sul1 sul2
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma sul1 547 bp ir sul2 543 pradmenų amplifikacija. Trys izoliatai turėjo sul1 geną (3,94 proc.) ir du izoliatai turėjo sul2 geną (2,63 proc.). Visi izoliatai turintis geną buvo atsparūs sulfonamidui/trimetoprimui. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
3.6.2. Atsparuma trimetoprimui: dfr1 dfr5
Naudojant PGR metodiką buvo vykdoma dfr1 254 bp ir dfr5 394 pradmenų amplifikacija. Vienas izoliatas turėjo dfr1 geną (1,31 proc.) ir keturi izoliatai turėjo dfr5 geną (5,26 proc.). Visi izoliatai buvo atsparūs sulfonamidui/trimetoprimui. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
3.7. Atsparumas cefalosparinui: ctxM cmy2
Naudojant PGR metodiką buvo vykdoma ctxM 876 bp ir cmy2 758 bp pradmenų amplifikacija. Du izoliatai turėjo ctxM geną (2,63 proc.) ir du izoliatai turėjo cmy2 geną (2,63 proc.). Visi izoliatai buvo jautrūs ceftazidimui. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05).
3.8. Atsparumas gentamicinui: aadA, aac(3)ir aadB genai
Naudojant PGR metodiką, buvo vykdoma aadA 487 bp, aac(3) 369 bp ir aadB pradmenų amplifikacija. Trys izoliatai turėjo aadA geną (3,8 proc.), du izoliatai turėjo geną aac(3) (2,5 proc.) ir vienas turėjo aadB geną (1,31 proc.), duomenys statistiškai patikimi (p<0,05). Visi izoliatai buvo atsparūs gentamicinui. aadA geno pradmens amplifikacija pavaizduota 2 paveiksle.
25
N N N N N N N N N Tak. N N N N N N N N N N
N N N N N N N N N Tak. N N N T T N N T N N
2 pav. aadA geno amplifikacija.
Tak. – DNR molekulinės masės žymuo Gene Ruler 100bp (Thermo Scientific, Lietuva), T – genas yra, N –geno nerasta (n = 43)
3.9. Toksiškumą koduojantys genai
3.9.1. ExoS/ExoU genai
Naudojant PGR metodiką buvo vykdoma ExoU 250 bp ir ExoS 370 bp pradmenų amplifikacija (3 paveikslas). 46 izoliatai turėjo ExoS geną (58,9 proc.), ir 18 izoliatų turėjo ExoU geną (23 proc.), duomenys statistiškai patikimi (p<0,05). Du izoliatai turėjo abu genomus. ExoU ir ir ExoS genų amplifikacija pavaizduota 3 paveiksle.
200 100 300 400 500 400 500 1000 1000 100 200 300 534 bp
26 T T T N T N T T T T Tak. T T T N T T T T T
T T T N T T N N T T Tak. T T T T T T T T T
3 pav. ExoU ir ir ExoS genų amplifikacija.
Tak. – DNR molekulinės masės žymuo Gene Ruler 100bp (Thermo Scientific, Lietuva), T – genas yra, N –geno nerasta (n = 38)
3.10. Atsparumo geno nustatymas, veikiant kultūrą gentamicinu
1 bandymas. Buvo parinkta P. aeruginosa kultūra, neturinti atsparumo gentamicinui
kodojančių genų, aadA, aac(3)ir aadB. Kirby – Bauer diskų difuzijos metodu buvo patvirtintas jautrumas gentamicinui, jautrumo zona sudarė 20 mm (kultūra jautri). Po kultivavimo serijiniame praskiedime, nustatyta minimali slopinanti koncentracija (MIK)(mėg. Nr. 5), 4pav. Iš mėgintuvėlių Nr. 5 ir Nr. 6 paimta kultūra gaivinama kraujo agare Kultūros augimas mėgintuvėliuose pavaizduotas 4 paveiksle, o grafike Nr. 1 pavaizduotas McFarlendo optinio tankio pokytis dešimtainiame praskiedime. 200 100 300 400 500 400 500 1000 1000 100 200 300 250 bp 370 bp 250 bp 370 bp
27
4 pav. Kultūros augimas mėgintuvėliuose (Šaltinis: nuotrauka darbo autoriaus )
Iš penkto mėgintuvėlio pasėta kultūra neužaugo. Tai patvirtino MIK. Mėgintuvėlyje Nr. 6 (4pav.) kultivuota kultūra sudarė 18 mm. jautumo zoną (Kirby-Bauer metodas). Tai parodė kultūros jautrumą gentamicinui.
Grafikas Nr 2. P .aeruginosa kultūros augimas dešimtainiame antibiotiko praskiedime. Pirmas bandymas Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6 Nr. 7 Nr. 8 Nr. 9 Nr. 10 Drumstumas 0.21 0.25 0.24 0.19 0.26 0.55 0.76 0.77 0.85 0.83 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 McF arl an d Praskiedimai
28
2 bandymas. Iš kraujo agaro paimta 1 McFarkendo kultūros ir suspenduojama į tokį pat
serijinį antibiotiko praskiedimą.
Po antro kultivavimo, patikrinus atsparumą Kirby – Bauer diskų difuzijos metodu, jautrumo zona sumažėjo iki 17 mm, kultūra vis dar skaitoma kaip jautri gentamicinui. Iš šešto ir septinto mėgintuvėlio sterilia pipete paimtos kultūros buvo gaivinamos kraujo agare 24 val +37 C. Iš abiejų mėgintuvėlių užaugo kultūros, tačiau iš šešto mėgintuvėlio užaugo mažesnės, retesnės kolonijos. Kultūros augimą mėgintuvėliuose pavaizduoja grafikas Nr2.
Grafikas Nr 2. P .aeruginosa kultūros augimas dešimtainiame antibiotiko praskiedime. Antras bandymas
3 bandymas. Iš kraujo agaro iš šešto praskiedimo paimta 1 McFarkendo kultūros ir
suspendojama į tokį pat serijinį praskiedimą.
Po trečio kultivavimo, penktame mėgintuvėlyje grafike Nr. 3 akivaizdžiai matosi MIK, nes MacFarlend skaičius sumažėjo iki 0,16, o mėgintuvėlyje Nr.6 jis padidėjo. Paimtos kultūros iš penkto ir šešto mėgintuvėlių. Kultūros gaivinamos kraujo agare. Kultūra užaugo tik iš šešto mėgintuvėlio. Patikrinus atsparumą Kirby – Bauer diskų difuzijos metodu, jautrumo zona sumažėjo iki 12mm, kultūra tapo atspari gentamicinui.
0.15 0.24 0.22 0.2 0.19 0.25 0.54 0.64 0.7 0.64 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M cF arlan d Praskiedimas
29
Grafikas Nr 3. P .aeruginosa kultūros augimas dešimtainiame antibiotiko praskiedime. Trečias bandymas.
4 bandymas . Iš kraujo agaro iš šešto praskiedimo paimta 1 McFarkendo kultūros ir
suspendojama į tokį pat serijinį praskiedimą. Po ketvirto praskiedimo, McFarlendo skaičiaus padidėjimas pastebėtas taip pat kaip ir po trečio praskiedimo. Tačiau MIK pasislenke į kairę pusę. McFarlendo skaičiaus padidėjimas siejamas su Pseudomonu atsparumu (antibiotikas neslopina mikroorganizmo augimo). Tai patvirtina Kirby – Bauer diskų difuzijos metodas, jautrumo zona sumažėjo iki 8mm.
Pradedant nuo penkto bandymo jautrumo zonos visiškai nebuvo, tačiau bandymas tęsėsi dar penkis kartus. Taip pat pastebėtos kolonijos mutacijos gaivinimo metu – jos tapo retesnės ir tamsesnės. Po dešimto praskiedimo drumstumas pastebėtas mėgintuvėliuose Nr. 4,5,6,7,8,9,10. Paimtos kultūros iš trečio (MIK) ir ketvirto mėgintuvėlių ir gaivinamos kraujo agare. Kultūra užaugo tik iš ketvirto mėgintuvėlio. Grafike Nr. 4 pavaizduotas dešimto praskiedimo mietu McFarlendo skaičiaus pokeitis. 0.23 0.22 0.24 0.18 0.16 0.35 0.54 0.65 0.62 0.61 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 McF arl an d Praskiedimas
30
Grafikas Nr 4. P .aeruginosa kultūros augimas dešimtainiame antibiotiko praskiedime. 10 bandymo grafikas.
Visu praskiedimu metu matėsi McFarland skaičiaus, kuris parodo ląstelių kiekį, didėjimas didesnėje koncentracijoje gentamicino. Tai parodo mažiausios slopinančios koncentracijos didėjimas mėgintuveliuose ir atsparumą gentamicinui.
Pav. Nr4. MIK kitimas mėgintuvėliuose bandymo mietu. Molekulinis tytimas
Po kiekvieno gaivinimo, iš kultūros kuri toliau dalyvavo praskiedimose buvo išskiriama pseudomonų DNR kuri toliau buvo amplifikuojama, siekiant nustatyt atsparumo gentamicinui genus. Nė viename izoliate aadA, aac (3) ir aaB genai neaptikti. Tai parodo fenotipinį atsparumą gentamicinui (5 paveikslas). 0.18 0.21 0.21 0.55 0.65 0.75 0.66 0.73 0.75 0.74 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 McF arl an d Praskiedimas 5 6 6 5 4 5 4 3 4 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M ėg in tu vė liai su MIK . Bandymo Nr.
31
5 pav. aadA geno amplifikacija.
Taip pat gentamicino poveikyje pastebėtas pseudomonų kolonijų augančių Citrimido agare kolonijų morfologiniai pokyčiai. Pakito kolonijos išskiriamas pigmentas. Nustotas sintetinti geltonai žalios (pioverdinas) spalvos pigmentas ir pradėtas sintetinti tamsiai žalios (piocianinas) spalvos pigmentas. Taip pat pakito augančių pseudomonų kolonijų morfologija, kolonijos tapo mažiau išplitusios įgijo griežtesnius ir retesnius kontūrus.
6 pav. 9 (dešnė) 10 (kairė) sejimai 7 pav. 10 (kairė) pradinis (dešnė) siejimai 534 bp
32
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiame tyrime buvo panaudoti: biocheminis testas identifikuoti P. aeruginoza, atsparumo antibiotikams tyrimas, fenotipinio atsparumo antibiotikui įgijimo greičio nustatymas, PGR reakcija identifikuojant atsparumą ir toksiškumą koduojančias determinantes.
Vertinant tyrimo metu nustatytą P. aeruginoza atsparumą antibakterinėms medžiagoms, rezultatų duomenys leidžia daryti išvadą, jog ceftazidimas buvo efektyviausias antibiotikas, jam buvo jautrus 71 izoliatas (93,4 proc). Tendencija skiriasi negu kituose tyrimuose. Brazilijoje Rio de Žaneire buvo išskirti 528 izoliatu iš šunų ausų iš jų 52,8 proc. buvo jautrus ceftazidimui. (44) Taivane 34,8 proc. iš 66 izoliatu turėjo atsparumą ceftazidimui. (45) Daugiausiai atsparių izoloiatų buvo aztreonamui 75 izoliatai (98,6 proc.). Taip pat Brazilijoje padarytas tyrimas patvirtina didelį rezistiškumą aztreonamui 92,7 proc. (46) Žiūrint į daugybinį atsparumą, daugiausiai atsparių izoliatų buvo trims antibiotikams 30 proc. o mažiausiai septyniems antibiotikams 1 proc.
Tyrimo metu dažniausiai pasitaikantis genas atsakingas už P. aeruginoza toksiškumą: ExoS genas. Jį turėjo 46 izoliatai (58,9 proc.). ExoU geną (23 proc.) turėjo 18 izoliatų. Tai lemia P.
aeruginozą didelį toksiškumą. Panašus rezultatas buvo gauti iš tyrimo padaryto Jungtinėse Amerikos
Valstijojose kai iš 100 padermiu 72 proc. turėjo ExoU geną ir 28 proc. Exos geną (47).
Tiriant ciproflaksocinui atsparius genus, keturi izoliatai turėjo geną gyrA (5,1 proc.) ir keturi izoliatai turėjo geną gyrB (5,1 proc.). Visi keturi izoliatai su gyrA genu buvo atsparūs ciproflaksocinui. Vienas pradmuo su gyrB buvo jautrus ciproflaksocinui, kiti – atsparūs. P. aeruginosa atsparumas florochinolonui pirmiausia yra susijęs su tiksliniais fermentais gyrA i mutacijomis, nors yra duomenų apie gyrB mutacijas dėl kurių sumažėja jautrumas fluorochinolonams. Šių genų įtakotas atsparumas nustatytas Vokietijoje, Japonijoje, Jungtinėse valstijose. Čia iš 104 šunų izoliatų aptikta 34 padermės turinčios gyrA geną. Šis genas prisideda prie antibiotikų „išpompavimo“ iš ląstelės mechanizmo ir prisideda prie hospitalinių daugiaatsparių padermių atsiradimo. Kai kurie autoriai mano, kad minėti genai gali įtakoti atsparumą ir kitų klasių antibiotikams (49)
Tiriant pseudomonų atsparumą piperacilinui/tetraciklinams aptikus atsparumą koduojančius genus Oxa, Tem ir Shv, galima daryti prielaidą, jog Oxa genas dominuoja ir yra dažniau aptinkamas tiriant piperacilinui ir tetraciklinams atsparias P, aeruginoza padermes. Dvylika izoliatų turėjo geną
Oxa (15,7 proc) iš jų keturi izoliatai buvo jautrūs piperacilinui/tazobaktamui ir visi atsparūs
aztreonamui. Tyrime padarytame Anglijoje vertinant atsparumą penicilinams ir plataus spektro beta laktamazes koduojančių genų paplitimą dažniausiai nustatytas Tem genas, rečiau randamas oxa genas
33 Visi izoliatai su sul1, dfr5, sull2 dfr1 genais nepasižymėjo jautrumu prieš sulfanamidą/trimetoprimą. Tai parodo šių genų atsparumas prieš šį antibiotiką. Priešingas atvejis – su atsparumą kodojančiais genais cefalosparinui: ctxM, cmy2. Visi izoliatai buvo jautrūs antibiotikui. Jungtinėje karalystėje 190 P.aeruginosa padermių iš 250 turėjo sul1 geną ir buvo siejami su padidėjusiu atsparumu aminoglikozidams.(46) Vokietijoje 54 proc. iš smulkių gyvūnų išskirtų izoliatų turėjo sul1 tipo genus. Manoma, kad šie genai taip pat gali būti siejami su P. aeruginoza siurblių sistema. (47)
Remiantis gautais rezultatais aadA genas dominuoja aac(3) geno atžvilgiu, o aac(3) dominuoja
aac(3) tiriant aminoglikozidams atsparias padermes. Kadangi aminoglikozidai neretai vartojami P. aeruginosa sukeltų infekcijų gydymui, šio tipo genai aptinkami ir kitose valstybėse.
Aminoglikozidams atsparių padermių turinčių atsparumą šiems antibiotikams koduojančius genus aptinkama 31 proc. izoliatų. Šio tipo genų paplitimas matomas ne tik Europos Sajungos šalyse bet ir Azijos valstybese. (50)
Tiriant atsparumo atsiradimą rezultatai parodo, kad sierijnio praskiedimo metu, persėjant tą pačią kultūrą, po trečio persėjimo, ji įgauna atsparumą gentamicinui, o po penkto sėjimo jautrumo zona pradingsta. Taip pat pastebėta pačios kolonijos mutacija, kuri pasireiškia kolonijos deformavimu, retėjimu, pigmentų keitimų. Šitus pokyčius galima paaiškinti gentamicino poveikiu įvairioms ląstelių struktūroms, tokioms kaip efliuks pompos, peptidoglikaną surenkantys transpeptidazės, ląstelės sienelės pralaidumas, alginino rūgšties sintezė, pigmento sintezė. Persėjimo metu dėl gentamicino bakteriastatiško ir bakteriocidiško poveikio ne visos P. aeruginoza bakterijos žūdavo, o išlikusios įgaudavo atsparumo požymius ir perduodavo kitai kartai P. aeruginoza. Tai parodo penktas, dešimtas praskiedimai, kai įgavus atsparumo charakteristikas kultūra sugebėjo daugintis 10 kartų didesnėje koncentracijoje. Genų amplifikacijos metu genai neatsirado, manoma, kad tai fenotipinis, o ne genatipinis P. aeurginoza atsparumas gentamicinui.
34
5. IŠVADOS
1. Iš 100 mėginių buvo išskirti 76 kultūros kurios buvo identifikuotos kaip P. aeruginosa. 2. Išskirtos P. aeruginosa pasižymėjo daugiaatsparumu. 64 proc. išskirtų ir identifikuotų izoliatų buvo atsparūs trims ir daugiau antibiotikų. Labiausiai P. aeruginoza buvo atspari aztreonamui 98,6 proc. ir gentamicinui 52.6 proc. o efektyviausias buvo ceftazidimas 93,4 proc.
3. Tyrimo metu dažniausiai pasitaikantis genas atsakingas už P. aeruginosa toksiškumą: ExoS genas. Jį turėjo 46 izoliatai (58,9 proc.). ExoU geną (23 proc.) turėjo 18 izoliatų. Tai lemia P.
aeruginozą didelį toksiškumą. Iš atsparumą koduojančių genų dažniausias buvo Oxa genas (15,78
proc), atsakingas už atparumą piperacilinui/tazobaktamui.
4. Vystant atsparumą gentamicinui, daugybinio praskiedimo metu išsivystė fenotipinis, bet ne genotipinis atsparumas. Atsparumas atsirado po 3 persėjimų į serijinį praskiedimą, o po 5 persėjimų jautrumo zona visiškai dingo.
35
LITERATŪRA
1. Alvydas Pavilonis, Aldona Lasinskaiė-Čerkašina, Vytautas Vaičiuvėna. Diagnostinė mikrobiologija : vadovėlis. - 2-oji patais. ir papild. vadovėlio "Medicinos mikrobiologijos pagrindai" laida - 2007.Puslapiai: 165-169
2. Bryan Markey Finola Leonard Marie Archambault Ann Cullinane Dores Maguire. Clinical Veterinary Microbiology: second edition 2013. Volume 8, Issue 1, January 2015, Pages 36-48 3. M.Z.El-Foulya A.M.Sharafb A.A.M.ShahinaHeba A.El-Bialy Biosynthesis of pyocyanin pigment by Pseudomonas aeruginosa Journal of Radiation Research and Applied Sciences 2015, Pages 36-48
4. Fernandez L, Gooderham WJ, Bains M, McPhee JB, Wiegand I & Hancock RE Adaptive resistance to the ‘last hope’ antibiotics polymyxin B and colistin in Pseudomonos aeruginosa is mediated by the novel two-component regulatory system ParR– ParS. Antimicrob Agents Chemother 2010, 3372–3382.
5. Moore NM & Flaws ML Antimicrobial resistance mechanisms in Pseudomonos aeruginosa. Clinical Laboratory Science 24 2011, p 47–51.
6. Deep A, Chaudhary U & Gupta V Quorum sensing and bacterial pathogenicity: from molecules to disease. J Lab Physicians 3 2011p 4–11
7. Shih-Ping Lin, Meei-Fang Liu, Chin-Fu Lin, Zhi-Yuan Shi. Phenotypic detection and polymerase chain reaction screening of extended-spectrum b-lactamases produced by Pseudomonos aeruginosa isolates. Journal of Microbiology, Immunology and Infection 2012 p 200-207.
8. Klrissa Streeter, Mohammad Katouli. Pseudomonos aeruginosa: A review of their Pathogenesis and Prevalence in Clinical Settings and the Environment. Infect Epidemiol Med. 2016 Winter; Volume 2, Issue 1: 25-32.
9. Thilo Ko¨hler, Raphael Guanella, Jean Carlet, Christian van Delden Quorum sensing-dependent virulence during Pseudomonas aeruginosa colonisation and pneumonia in mechanically ventilated patients PubMed articles August 4, 2010
10. Azimi S, Kafil HS, Baghi HB, Shokrian S, Najaf K, Asgharzadeh M, Yousefi M, Shahrivar F, Aghazadeh M5. Presence of exoY, exoS, exoU and exoT genes, antibiotic resistance and biofilm production among Pseudomonas aeruginosa isolates in Northwest Iran GMS Hygiene and Infection Control 2016
11. J. Dégi, R.T. Cristina, A. Stancu. Otitis externa caused by bacteria of the genus Pseudomonos in dogs. LUCRĂRI Ştiinłifice MEDICINĂ VETERINARĂ VOL. XLIII (1), 2010 TIMIŞOARA. 12. S. Mekic´, K. Matanovic´, B. Sˇ eol. Antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa isolates from dogs with otitis externa Veterinary Record . 2011
