LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Eglė Beatričė Grigonytė
MIKROORGANIZMŲ IŠSKYRIMAS IŠ ŠUNŲ ODOS IR ATSPARUMO
ATIMIKROBINĖMS MEDŽIAGOMS VERTINIMAS
ISOLATION OF MICROORGANISMS FROM CANINE SKIN AND
EVALUATION OF ANTIMICROBIAL RESISTANCE
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
2020.12.01 Eglė Kalinauskienė 2020.12.01 Eglė Beatričė Grigonytė
Prof. dr. Jūratė Šiugždaitė 2021.01.15
prof. Saulius Petkevičius
TURINYS SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Mikroorganizmai, aptinkami kliniškai sveikų šunų odoje ... 11
1.2 Mikroorganizmai, galintys sukelti infekcines odos ligas ... 12
1.3 Veiksniai, darantys įtaką odos mikrobiotai ... 13
1.4 Bakterinės odos ligos ... 15
1.5 Bakterinių ligų gydymas ir atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 16
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 18
2.1 Tyrimo organizavimas ... 18
2.2 Tiriamųjų skirstymas į grupes ... 18
2.3 Mėginių paėmimas ... 20
2.4 Bakterijų išskyrimas ir biocheminių savybių nustatymas ... 21
2.6 Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas ... 22
2.6 Statistinės analizės metodai ... 23
3. REZULTATAI ... 24
3.1 Mikroorganizmai, išskirti iš kliniškai sveikų šunų odos ... 24
3.2 Mikroorganizmai, išskirti iš pažeidimų turinčių šunų odos ... 25
3.4 Iš sergančių ir sveikų šunų odos išskirtų mikroorganizmų palyginimas ... 27
3.5 Dažniausiai iš šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 28
3.5.1 Dažniausiai iš sveikų šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 28
3.5.2 Dažniausiai iš sergančių šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 30
4. REZULTATŲ APTARIMAS... 33
5. IŠVADOS ... 36
REKOMENDACIJOS ... 37
SANTRUMPOS
°C – laipsniai pagal Celsijų angl. – angliškai
EUCAST – (angl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas
E. coli – Escherichia coli
IgE – imunoglobulinas E
MRSA – (angl. Methicilin – resistant Staphylococcus aureus) (Meticilinui atsparus
Staphylococcus aureus)
MRSP – (angl. Methicilin – resistant Staphylococcus pseudintermedius) Meticilinui atsparus
Staphylococcus pseudintermedius)
MSK (angl. MIC) – minimali slopinamoji koncentracija ml – mililitrai mm – milimetrai Pav. – paveikslas pH – vandenilio potencialas proc. – procentai Pvz. – pavyzdžiui
PYR – L – pirolidonil – β – naftilamidas
S. aureus – Staphylococcus aureus
S. pseudintermedius – Staphylococcus pseudintermedius S. schleiferi – Staphylococcus schleiferi
S. hyicus – Staphylococcus hyicus S. warneri – Staphylococcus warneri
sek. – sekundės spp. – rūšys
Th2 – T – helperių 2 tipo imuninės ląstelės val. – valandos
MIKROORGANIZMŲ IŠSKYRIMAS IŠ ŠUNŲ ODOS IR ATSPARUMO ANTIMIKROBINĖMS MEDŽIAGOMS ĮVERTINIMAS
Eglė Beatričė Grigonytė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Kiekvieno šuns oda turi savo natūralią mikrobiotą. Ant šunų kailio ir odoje yra randami įvairūs mikroorganizmai, kurie sudaro natūralią individo mikrobiotą, tačiau pažeidus odos barjero mechanizmus, sumažėjus imunitetui, natūrali mikrobiota gali tapti potencialiai patogeniška bei atverti kelią naujiems patogeniniams mikroorganizmams. Sveikų šunų odoje gyvenantys mikroorganizmai „treniruoja“ įgimtą ir įgytą imuninę sistemą. Dažnai įvairios alergijos ir kiti odos pažeidimai atsiranda dėl sutrikusio imuninės sistemos atsako į vyraujančius odos mikroorganizmus. Palaipsniui didėjant mikroorganizmų rezistentiškumui antimikrobinėms medžiagoms, gydant gyvūnus, sergančius bakterinėmis odos ligomis būtina atlikti atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimus, norint tikslingai skirti gydymą. Šio darbo tikslas: išskirti mikroorganizmus iš šunų odos ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Tyrimo metodai ir medžiagos: Tyrimas atliktas 2019 – 2020 m. klinikoje „X“ ir trejose gyvūnų prieglaudose. Ištirti 36 šunys. Pagal sveikatos būklę šunys buvo išskirti į dvi grupes: pirmajai grupei priklausė kliniškai sveiki, antimikrobinėmis medžiagomis negydyti šunys (n=18), antrajai – šunys, turintys odos pažeidimų (n=18). Mėginiai imti steriliu vatos tamponu ir dėti į transportinę terpę TRANSWAB („AMIES CHARCOAL“, Ispanija). Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms buvo tirtas Kirby – Bauer diskų difuzijos metodu. Mėginiai ištirti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarinės patobiologijos katedroje. Rezultatai: kliniškai sveikų šunų odoje buvo išskirta po vieną rūšį šių mikroorganizmų:
Staphylococcus warneri (33,3 proc.) ir Staphylococcus pseudintermedius (5,5 proc.), taip pat
išskirtos bakterijos iš Bacillus (27,7 proc.) ir Corynebacterium (5,5 proc.) genčių. Iš 16,6 proc. kliniškai sveikų šunų odos buvo išskirta Bacillus genties bakterijos kartu su
Staphylococcus warneri; iš 5,5 proc. buvo išskirta Actionomyces genties bakterijos kartu su Staphylococcus warneri. Iš sergančių odos ligomis šunų odos buvo išskirta Staphylococcus pseudintermedius (38,8 proc.); Staphylococcus aureus (27,7 proc.); bakterijos iš Bacillus
sulfametoksazolui ir norfloksacinui, o odos pažeidimų turinčių šunų grupėje – oksacilinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui.
ISOLATION OF MICROORGANISMS FROM CANINE SKIN AND EVALUATION OF ANTIMICROBIAL RESISTANCE
Eglė Beatričė Grigonytė Master‘s Thesis
SUMMARY
Every dog has individual skin microbiota. Various bacterial agents are found on canine skin and fur, which creates natural individual skin microbiota, but when skin barrier and immunity is conflicted, natural microbiota can become potentially pathogenic and make new pathways for new pathogenic microorganisms. Microbiota, which is present in individual canine skin “trains” innate and adaptive immune system. Frequently, various allergies and other skin diseases are triggered by conflicted immune system response to skin’s prevalent microbiota. Antimicrobial resistance is gradually increasing, so it is important to investigate antimicrobial resistance in cases of bacterial skin diseases to ensure targeted treatment. The aim of this study was to isolate microbiota from canine skin and determine antimicrobial resistance. Materials and methods: Research was performed in 2019 – 2020 in clinic “X” and three different animal shelters. 36 canines were tested. According to clinical symptoms, dogs were divided into two groups: clinically healthy dogs with no history of treatment with antimicrobial substances (n=18) and other group consisted of canines who had signs of dermatological infections (n=18). Isolates were taken with sterile cotton swab with transport media TRANSWAB („AMIES CHARCOAL“, Spain). Resistance to antimicrobial substances were evaluated using Kirby – Bauer disc diffusion method. All samples were evaluated at Lithuanian University of Health Sciences, department of Veterinary pathobiology.
Results: from clinically healthy canine skin we isolated solitary microorganism cultures:
Staphylococcus warneri (33.3 %), Bacillus spp. (27.7 %), Staphylococcus pseudinermedius
(5.5%), Corynebacterium spp. (5.5 %). In 16.6 % of isolates Staphylococcus warneri and
Bacillus spp. were determined, Actionomyces spp. and Staphylococcus warneri were
determined in 5.5 % of tested dogs. From infected skin sites we isolated: Staphylococcus
pseudintermedius (38,8 %), Staphylococcus aureus (27.7 %), Bacillus spp. (11.1 %); Enterococcus faecalis (5.5 %). Most of isolates from clinically healthy canine skin were
ĮVADAS
Oda yra organas, kuris palaiko nuolatinį kontaktą su aplinka ir turi savo mikroflorą. Odai nuolat keičiantis, pleiskanojant, bei gyvūnams šeriantis, laikui bėgant keičiasi ir jų odoje esanti mikroflora. Odoje dažniausiai randami gram teigiami mikroorganizmai, kurie yra laikomi rezidentine odos mikroflora ir veikia šeimininko organizmą teigiamai. Tokio tipo mikroorganizmai turi mutualistinį santykį su šeimininku, geba išlikti ant odos ilgą laiką, kai tuo tarpu pašalinė invazinė flora nėra tokia stabili (1, 2).
Manoma, kad mikrobinės populiacijos daro įtaką patofiziologinei gyvūno būklei, norint užkirsti kelią tiek infekcinėms, tiek neinfekcinėms ligoms (3). Nustatyta, kad rezidentinės individo mikrofloros bakterijos gali išskirti proteininius faktorius – bakteriokinus, kurie slopina patogeninių bakterijų augimą odoje. Su žmonėmis atlikti in vivo tyrimai parodė, kad komensalinės odos bakterijos išskiria antimikrobines molekules, kurios saugo šeimininko organizmą nuo patogeninių odos bakterijų augimo (2).
Tačiau skirtingose šalyse atlikti tyrimai demonstruoja skirtingus rezultatus – Amerikoje iš sveikų šunų odos dažniausiai išskiriamos mikroorganizmų gentys yra Ralstonia spp., Bacillus spp., Propionibacterium spp., tuo tarpu Ispanijoje – Bacillus spp., Actinobacteria spp. (4, 5). Vertinant odos susirgimus tiksliai nėra žinoma, kas juos sukelia: ar pokyčiai odos mikrofloroje, ar pati oda sukelia mikrofloros disbalansą (5, 6). Dažnai iš turinčių įvairių odos pažeidimų šunų odos išskiriamos rūšys yra Staphylococcus pseudinermedius ir
Staphylococcus aureus (7). Laikoma, kad Staphylococcus pseudinermedius yra dažniausias
piodermų sukelėjas, nes yra dažnai randamas sergančių atopiniu dermatitu šunų odoje, tačiau šeimininko organizme gali būti randamas kaip nepatogeninė rezidentinės floros dalis (7). S.
aureus dažniau siejamas su plauko šaknies uždegimais, pustulėmis, šlapiuojančiomis
žaizdomis (9). Apie 10 proc. odos ligų gali sukelti ir kitų rūšių stafilokokai – Staphylococcus
schleiferi, Staphylococcus hyicus (10).
Per pastaruosius 20 metų stafilokokų atsparumas padidėjo, iš šunų odos vis dažniau išskiriami meticilinui ir kitoms antimikrobinėms medžiagoms atsparios stafilokokų rūšys. Jungtinėje Karalystėje nustatyta, kad atsparumas įvairioms antimikrobinių vaistų klasėms palaipsniui auga (Beever et al., 2015). Taip pat matoma tendencija, kad atsparumas antimikrobinėms medžiagoms didės (Ludwig et al., 2016). Norint tikslingai gydyti tiek giliuosius, tiek paviršinius bakterinius odos pažeidimus, svarbu reguliariai atlikinėti antimikrobinio atsparumo tyrimus. Taip pat svarbu surasti tikslią diagnozę – giliai pažeistų
galima gydyti naudojant šampūnus su chlorheksidinu, benzoilo peroksidu (Mueller et al., 2012). Taip pat nustayta, kad įvairių tepalų su antimikrobinėmis medžiagomis vartojimas tiesiogiai ant odos yra veiksminga gydymo priemonė (Valentine et al., 2012; Clark et al., 2015). Svarbu nepamiršti, kad gydymo alternatyvoms galima naudoti tokius pagalbinius preparatus kaip Manukos medaus tepalus, antibiofilminius produktus; antibakterinius ne antibiotinės kilmės tirpalus (Walker et al., 2016).
Didėjant antimikrobinių medžiagų panaudai ir kylančio rezistentiškumo rizikai, odos ligų diagnostika yra vienas svarbiausių uždavinių veterinarijos gydytojo darbe. Norint taikyti tikslingą gydymą svarbi teisinga diferencinė diagnostika, sukėlėjo identifikavimas, tinkamiausio vaisto parinkimas konkrečiam individui bei pirminės ligos priežasties suradimas (L. Beco., 2015).
Darbo tikslas: išskirti mikroorganizmus iš šunų odos ir nustatyti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Uždaviniai:
1. Išskirti mikroorganizmus iš sveikų šunų odos.
2. Išskirti mikroorganizmus iš šunų, sergančių odos ligomis.
3. Palyginti išskirtus mikroorganizmus tarp sergančių odos ligomis ir sveikų šunų grupių. 4. Nustatyti išskirtų mikroorganizmų padermių atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Mikroorganizmai, aptinkami kliniškai sveikų šunų odoje
Epidermis nuolatos kontaktuoja su išore ir funkcionuoja kaip terpė įvairių rezidentinių mikroorganizmų augimui (1).
Oda yra vienas iš pagrindinių su aplinka kontaktuojančių organų ir yra visuomet veikiama išorės mikroorganizmų, kurie yra potencialiai patogeniški. Oda yra lyg “gyvas barjeras” bei odos mikroorganizmai prisideda prie odos imuniteto raidos trimis pagrindiniais būdais: tiesiogiai stabdo patogenų augimą; pastiprina šeimininko įgimtą imunitetą; vysto ir ugdo įgytą imunitetą (2).
Gyvūno odos terpė yra įvairi ir joje gausu mikroorganizmų, tačiau ne visada adekvačiai ištiriama. Manoma, kad mikroorganizmų populiacijos turi didelę įtaką tiek patofiziologinei gyvūno būklei, tiek ligų prevencijai. Nustatyta, kad odoje gyvenantys bakterinės kilmės mikroorganizmai turi svarbų vaidmenį infekcinių ir neinfekcinių ligų plitime ir organizmo atsake į ligas (3).
Gram teigiami mikroorganizmai dominuoja rezidentinėje odos mikrofloroje. Tarp gram teigiamų, koaguliazei neigiamų mikroorganizmų, Staphylococcus spp. sudaro didžiausią dalį. Tam tikros koaguliazei teigiamų stafilokokų atmainos taip pat yra laikomos rezidentine mikroflora. Fakultatyviniai anaerobiniai difteroidai (Corynebacterium spp. ir
Propionibacterium spp.) yra nuolatos vyraujanti mikroflora, taip pat ir Micrococcus spp. bei
kiti veridiniai streptokokai (Streptococcus viridans). Iš gram neigiamų bakterijų didžiausią dalį sudaro Actinobacter genties bakterijos. Taip pat odoje randama įvairi nerezidentinė mikrobiota (1).
2017 m. Amerikiečių atliktas tyrimas parodė, kad dažniausiai kliniškai sveikų šunų odoje buvo aptiktos šios bakterijų gentys: Proteobacteria spp., Firmicutes spp., Flavobacteria spp.,
Actinobacteria spp., Cyanobacteria spp., Fusobacteria spp. priklausomai nuo mėginio
ėmimo vietos. Proteobacteria spp. buvo dažniausiai išskirti mikroorganizmai, paplitę visose odos vietose, o Fusobacteria spp. – perianalinėje srityje. Iš šunų smakro paimtuose mėginiuose vyravo gamaproteobakterijos, iš kurių labiausiai paplitusi buvo
Pseudomonadaceae šeima. Nugaros ir pažasčių srityje dažniausiai randamos bakterijos taip
pat priklausė gamaproteobakterijų klasei, iš kurių daugiausiai paplitę buvo Moraxellaceae,
Staphylococcaceae bakterijų šeimos mikroorganizmai. Taip pat šis tyrimas parodė, kad įtaką
odos mikrobiotai gali daryti tiek sezoniškumas, tiek vieta, iš kurios buvo imti mėginiai (4).
1.2 Mikroorganizmai, galintys sukelti infekcines odos ligas
Didžioji dalis mikroorganizmų, natūraliai gyvenančių ant odos, nėra žalingi organizmui ir yra laikomi naudingais. Mikrobiota “treniruoja” įgimtą ir įgytą imuninę sistemą. Alerginės odos reakcijos atsiranda dėl sutrikusio imuninės sistemos atsako į natūraliai vyraujančius odos mikroorganizmus. Alergijomis sergančių šunų odoje aptinkamas didesnis kiekis koaguliazei teigiamų stafilokokų, nei sveikų šunų odoje (5).
Bakterinės odos infekcijos yra klasifikuojamos į paviršines piodermas (impetigo, paviršinis bakterinis folikulitas) arba giliąsias piodermas (folikulitas, furunkuliuozė, celiulitas ir poodiniai abscesai). Koaguliazei teigiami stafilokokai (S. aureus, S. pseudintermedius, S.
hyicus) yra pirminiai paviršinių piodermų uždegimo sukelėjai. Dėl kastinių žaizdų ir traumų
dažnai atsiranda giliosios piodermos, kurių atveju dažnai vyrauja koaguliazei teigiami stafilokokai. Beta hemoliziniai streptokokai ant šuns ar katės odos paprastai yra asocijuojami su patologinėmis būklėmis. Enterobacteriaceae šeimos, ypač Escherichia coli ir
Morganellaceae bakterijų šeima bei enterokokai yra dažnai sutinkami nerezidentiniai
mikroorganizmai (1).
Bakterinė disbiozė, susijusi su atopiniu dermatitu ir psoriaze, yra charakterizuojama kaip bakterinės įvairovės sumažėjimas, kai odoje paplinta didesnės tam tikrų bakterijų populiacijos (Kong et al. 2012; Alekseyenko et al. 2013).
Veterinarijos gydytojai dažnai susiduria su antrinėmis infekcijomis gydydami šunis, sergančius atopiniu dermatitu. Anksčiau buvo manoma, kad didelė stafilokokų populiacija odoje yra susilpnėjusio imuninio atsako pasekmė, tačiau dabar pradėta manyti, kad stafilokokai gali būti pirminė priežastis (5, 6).
S. pseudintermedius yra dažniausiai sutinkamas oportunistinis patogenas odoje, ypač
paviršinės piodermos atveju. Šios rūšies bakterijos yra normali odos mikrofloros dalis, tačiau sumažėjus individo imuniniam atsparumui, kai gyvūno apsaugos barjerai nusilpsta, ar oda yra neigiamai paveikiama kitų faktorių, pavyzdžiui, atopinio dermatito atveju, medicininių procedūrų metu, imunosupresinių vaistų vartojimo metu, jos gali veikti patogeniškai (Beck, 2012). Tačiau S. pseudintermedius buvimas odoje nėra ligos indikatorius, nes jis yra laikomas komensaline bakterija šuns odos mikrobiotoje (7, 8, 9). Laikoma, kad padidėjęs S.
tiksliai iki galo ištirta, bet yra manoma, kad S. pseudintermedius prisijungia prie atopiniu dermatitu sergančių šunų keratinocitų geriau nei prie sveikų šunų. Panašiai į S. aureus infekcijas, randamas žmonėse, padidėjęs kolonizacijos lygis gali būti laikomas rizikos veiksniu ir yra manoma, kad šuns odai patogeninį poveikį turės būtent tos bakterijų padermės, kurias pats šuo jau nešiojosi ant savo odos kaip nepatogeninę mikrofloros dalį (Beck, 2012). Kitos stafilokokų rūšys – S. aureus, S. schleiferi ir S. hyicus sutinkamos apie 10 proc. atvejų (10).
2018 metais atliktame tyrime, kuriame buvo lyginta sveikų ir sergančių odos ligomis šunų mikrobiota, gauti rezultatai rodo, kad odos pažeidimuose Staphylococcus genties bakterijos buvo dominuojanti gentis. Kaip ir sveiko šuns odoje, taip ir odoje su pažeidimais randama didelė bakterinė įvairovė, tačiau kitokiomis proporcijomis. Šalia Staphylococcus genties randamos kitos bakterijų gentys: Propionibacterium (šių bakterijų padidėjimas taip pat stebimas tiek epiderminiuose pažeidimuose, tiek folikulito atvejais), Fusobacterium gentis (daugiausiai rasta kontrolinėje - sveikų šunų grupėje) ir Bacteroides gentis (didžiausias paplitimas taip pat kontrolinėje grupėje). Šunyse, kurių oda yra sveika, dominuoja
Firmicutes bakterijų tipas (35 proc.), Polymorphonas, Bacteroides bakterijų gentys ir kitos Bacteroidetes tipo bakterijų rūšys sudaro po 9 proc., Actinobacteria bakterijų tipas sudaro 6
proc, Proteobacteria tipas sudaro 22 proc; kitos bakterijos – 10 proc. visų bakterijų, randamų ant odos. Mėginiuose, kurie buvo imti iš bakterinio folikulito pažeidimo vietos, stebimi padidėję Staphylococcus (15 proc.) ir Streptococcus genčių (4 proc.) kiekiai, Proteobacteria tipo (47 proc.), Actinobacteria tipo (22 proc.) ir sumažėjęs kitų Firmicutes tipo (7 proc.) bakterijų kiekis lyginant su kontroline grupe. Mėginiuose, kurie buvo imti iš epiderminio tipo pažeidimų, rastas ženkliai padidėjęs Staphylococcus genties bakterijų kiekis (41 proc.) lyginant su sveiko šuns oda, bei panašus kiekis proteobakterijų kaip ir šunų odoje, kurie serga bakteriniu folikulitu (10).
1.3 Veiksniai, darantys įtaką odos mikrobiotai
Veiksniai, lemiantys odos mikrobiotą gali būti skirtomi į endogeninius (šeimininko odos) ir egzogeninius (gyvenamoji aplinka) (11).
Individas ir aplinka, kurioje jis gyvena, yra laikomi pagrindiniais veiksniais, kurie sudaro sveikų šunų odos kompoziciją ir struktūrą. Vienas iš didžiausių veiksnių, lemiančių odos būklę, yra aplinka, nepaisant reto odos padengimo plaukais. Tam tikros odos ligos
demonstruoja skirtingą paplitimą priklausomai nuo odos vietos, veislės ir individualių veiksnių (4).
Šunys ne tik savo odoje „nešioja“ rezidentinę mikrobiotą, tačiau ir šerdamiesi pašalina laikinają (12). Tyrimai rodo, kad didelė šunų odos mikrobiotos dalis atsiranda iš išorinės aplinkos. Sezoniškumas taip pat gali paveikti odos mikrobiotą (13).
Gyvenamoji aplinka, lokacija, kur šuo yra vedžiojamas, gyvenimo būdas, pašaras, metų laikas, kiek šuo yra maudomas yra veiksniai, kurie sudaro mikrobinę visumą, darančią įtaką odos būklei. Įdomu tai, kad tyrimai parodė, jog šunų, kurie gyvena miesto aplinkoje be kitų naminių augintinių, mikrobiota skyrėsi nuo tų, kurių šeimininkai gyvena didelėse šeimose su kitais naminiais gyvūnais bei lankosi užmiestyje (14).
Viena iš pagrindinių problemų, norint ištirti odos mikrobiotą, yra galimai didelė aplinkos įtaka. Pagal atliktus ankstesnius tyrimus galime daryti prielaidą, kad individas (kartu su savo aplinka) buvo pagrindinė priežastis, kodėl tirtuose šunyse, kurie buvo trijų skirtingų veislių ir skirtingų kailio tipų, gauti skirtingi rezultatai (4). Du atlikti tyrimai parodė, kad šunys, kurie gyvena kartu vienoje aplinkoje, paveikia vienas kito mikrobiotą (12, 13). 2017 m. atliktas kohortinis tyrimas, kurio imtis buvo 40 šunų (jie buvo tirti pagal sezoniškumą, amžių, lytį, veislę, plauko tipą, odos vietą), parodė, kad sezoniškumas buvo vienintelis reikšmingas veiksnys odos mikrobiotos struktūros pokyčiams (13).
Gydant įvairias ligas odos mikrobiotos indvidualumas turi būti atidžiai apsvarstomas. Odos mikrobiota yra paveikiama sergant įvairiomis ligomis, pavyzdžiui atopiniu dermatitu (18). 2017 m. buvo vertintas sveikų šunų odos mikrobiotos individualumas. Šiame tyrime buvo rasta, kad odos individualumas buvo pagrindinis veiksnys, kuris darė įtaką odos mikrobiotos kompozicijai: ant individo odos rasti mikroorganizmai buvo panašūs tarpusavyje, nepaisant to, iš kokios kūno vietos mėginiai buvo paimti. Tyrimo metu nebuvo įmanoma tiksliai įrodyti, ar skirtumas buvo tik dėl odos individualumo, ar rezultatai susiję su unikalia aplinka, kurioje buvo laikomi šunys (visi tirti šunys buvo surinkti iš skirtingų aplinkų). Tačiau taip pat analogiškai atlikti tyrimai su didele tos pačios veislės šunų imtimi, kurie gyveno kartu, parodė, kad kiekvieno šuns odos individualumas buvo pagrindinis veiksnys, kuris darė įtaką odos mikrobiotai, nes rastos mikroorganizmų rūšys ir jų kiekis buvo panašūs (4).
Oda, kaip organas, taip pat daro įtaką mikroorganizmų populiacijoms. Odos sausumas, pleiskanojimas, sekrecija ir ekskrecija, imuninės sistemos atsakas į mikroorganizmus yra faktoriai, kurie formuoja individualią mikrobiotą (1). Daugeliu atvejų, oda gali būti laikoma nesvetinga mikroorganizmams. Kitaip tariant, ji yra vėsi, sausa, turi daug druskų, yra hidrofobiška ir rūgštinės pH, padengta antibakteriniais peptidais ir nuolatos keičianti
paviršinius sluoksnius (15). Nepaisant šių odos veiksnių, odoje gyvena didelė ir kompleksiška mikroorganizmų populiacija, kitaip vadinama mikrobiota, kuri turi stiprų ryšį su šeimininko organizmu ir daro didelę įtaką tiek apsauginei organizmo funkcijai, tiek ligų vystymuisi (3).
1.4 Bakterinės odos ligos
Pioderma apibūbuidinama kaip bakterinio tipo uždegiminė odos liga. Nors piodermos veterinarinėje medicinoje pasitaiko gan dažnai, tačiau lygiai taip pat dažnai ši liga yra klaidingai diagnozuojama ir taikomas gydymas dažnai būna neefektyvus (Gortel, 2013). Piodermos gali būti paviršinės ir giliosios. Nors pioderma yra retai grėsminga gyvybei liga, ji sukelia skausmą ir pavojingus uždegiminius pokyčius. Pioderma yra laikoma pirminės ligos pasėkme ir dažnai kartojasi, nebent yra visiškai išgydoma. Dažniausiai šunys serga paviršine piodermos forma, kai bakterijos kolonizuoja epidermio ląsteles ir bakterinis folikulitas išsiplėtoja į folikulo ertmę ir epidermį (10). Paviršinė šunų pioderma yra apibūdinama kaip bakterinė epidermio ir plauko folikulo infekcija (7). Šia piodermos forma sergantiems šunims matomi pažeidimai gali būti įvairių tipų: papulės, pustulės ir epiderminiai cirkuliariniai pažeidimai (dažniausiai ventralinėje pilvo dalyje, medialinėje šlaunų dalyje, kaklo srityje), egzemos, dažnai matoma alopecija ir stebimas skirtingas kasymosi lygis (Bloom, 2014; Beco et al., 2013a). Pirminės kilmės paviršinė bakterinė pioderma nėra dažnai pasitaikantis susirgimas. Dažniausiai pasikartojanti paviršinė pioderma yra siejama su alerginėmis ligomis (pvz. atopiniu dermatitu, odos reakcijomis į pašarą) (17).
Gilioji pioderma yra rečiau pasireiškianti liga, tačiau yra pavojingesnė dėl savo invazijos į dermą bei galimo kraujagyslių pažeidimo, dėl kurio gali būti sukelta bakteriemija (16, 17). Matomi pažeidimai, fistulės, abscesai, hemoragijos, mazgeliai, eritema, patinimas, skausmas. Mazginiuose pažeidimuose dažnai randami ne tik stafilokokai, bet ir kitų rūšių mikroorganizmai. Tokio tipo pažeidimai turi būti atskiriami nuo nebakterinės kilmės granuliomų, neoplazijų. Kalbant apie piodermai būdingus pažeidimų tipus - tiek folikulitą, tiek išplitusias pažeidimų formas, lyginant su sveikų individų oda, dažniausiai sutinkami mikroorganizmai yra Staphylococcus genties bakterijos (10).
Kita dažnai pasitaikanti odos liga yra atopinis dermatitas. Atopinis dermatitas yra plačiai paplitusi, heterogeniška, atsinaujinanti, chroniška, niežulį sukelianti odos liga, kylanti dėl epitelinio barjero sutrikimų, sutrikusio imuniteto, odos uždegimo, odos mikrobiotos balanso
aplinkos alergenų pakyla IgE kiekiai, sužadinama I tipo hiperjautrumo reakcija, kurios metu padidėja T – helperių 2 tipo (Th2) ląstelių kiekiai pažeistoje odos vietoje. Vėliau, lėtiniais atvejais, pasireiškia IV tipo hiperjautrumo reakcija (Miller et al. 2013b). Atopiniu dermatitu sergančių šunų odoje matoma sumažėjusi mikoorganizmų įvairovė bei padidėjęs
Staphylococcus genties bakterijos, ypač Staphylococcus pseudintermedius, bei Corynebacterium genties bakterijų kiekis (20).
1.5 Bakterinių ligų gydymas ir atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Šunų piodermos kontrolė yra paremta taikant sisteminį arba antimikrobinį gydymą (21). Nepaisant to, pastarieji metai rodo, kad mikroorganizmų atsparumas dažnai naudojamoms antimikrobinėms medžiagoms didėja visame pasaulyje (22, 23). Ypatingai svarbios yra meticilinui atsparios mikroorganizmų padermės, nes jos yra atsparios visiems beta laktaminiams antibiotikams, kurie skiriami piodermą gydyti oraliai (24, 25, 26). Piodermos nustatymo atvejais rekomenduojama atlikti citologinį odos tyrimą norint tikslingai išsirinkti antimikrobinę medžiagą. Paviršinės piodermos žaizdų citologinis tyrimas yra 93 proc. jautrus nustatant neutrofilų ir intraląstelinių kokų kiekį (27). Mikroorganizmų išskyrimo, naudojant bakterines kultūras, galimybės yra limituotos, nes tiriant stafilokokus, mėginyje jų būna tiek nuo pažeidimo vietos, tiek nuo sveikos odos, todėl kartais sunku nustatyti, ar sukelėjai yra iš sveikos odos, ar iš pažeidimo vietos (28). Nepaisant to, bakterijų išskyrimas terpėse ir antimikrobinio rezistentiškumo nustatymas yra svarbios priemonės, norint taikyti tinkamą sisteminį gydymą bei nustatyti tikslią diganozę. (10). Mėginių paėmimas dažnai būna sudėtingas, ypač giliosios piodermos atveju. Paviršinis odos tepinėlis, imamas iš giliosios piodermos pažeidimų, yra tik 30 proc. patikimas tyrimo metodas (Shumaker et al., 2008). Idealiausia, jei mėginiai imami švieži biopsijos metodu, nenaudojant nei natrio chlorido nei formalino (10).Daugelio kitų bakterijų, tokių kaip Proteus, Streptococcus, Burkholderia genčių,
Escherichia coli ir Pseudomonas aeruginosa rūšių bakterijų atskyrimas gali būti kliniškai
sudėtingas (Rantala et al., 2004; Hiller et al., 2006; Cain et al., 2011; Tham et al., 2016). Koaguliazei neigiamų bakterijų, tokių kaip Staphylococcus lugdunensis ir Macrococcus genties bakterijų izoliacija gali trukdyti išskirti koaguliazei teigiamas bakterijų kultūras (29, 30).
Piodermos gydymas reikalauja pakartotinio gydymo ir tyrimų, todėl sukelia daug keblumų. Ši liga yra viena iš dažnausiai antimikrobinių medžiagų panaudojimo reikalaujanti būklė (31).
2014 metais Didžiojoje Britanijoje atliktas tyrimas parodė, kad 92 proc. šunų (iš 683 tirtųjų), kurie sirgo, ar jiems buvo įtariama pioderma, buvo taikomas antimikrobinis gydymas (Summers et al., 2014). Metams bėgant, didėjant metilicinui atsparių stafilokokų populiacijoms, ypač Staphylococcus aureus (MRSA) bei Staphylococcus pseudintermedius (MRSP), didelę svarbą turi antimikrobinių medžiagų panaudojimo mažinimas (10).
Nors meticilinas nebėra naudojamas klinikose, jis vistiek išlieka plataus spektro beta laktamų žymuo. Nuo pirmo MRSA identifikavimo iš gyvūnų buvo įrodyta, kad genetiškai padermės yra identiškos, o tai įrodo, kad žmonės gali užsikrėsti ir nuo gyvūnų (McCarthy et al., 2012). Jungtinėje Karalystėje, kurioje MRSP pirmą kartą buvo identifikuotas 2009 metais, laboratorijose randamas apie 5 proc. S. pseudintermedius paplitimas (Maluping et al., 2014; Beever et al., 2015). Kontinentinėje Europos dalyje paplitimas skaičiuojamas apie 30 proc. (25, 32).
In vitro atliktų tyrimų rezultatai rodo, kad efektyvios antimikrobinės medžiagos stafilokokų
sukeltoms odos ligoms gydyti yra cefalosporinai, fluorochinolonai, amoksicilinas – klavulano rūgštis, gentamicinas ir rifampicinas (33, 34). 2011 metais atliktame tyrime nustatyta, kad didelė dalis sveikai atrodančių šunų odoje turėjo stafilokokų (69,5 proc.), didelė mikroorganizmų dalis buvo atspari ampicilinui (68,6 proc.), tetraciklinui (41 proc.), eritromicinui (35,2 proc.), klindamicinui (28,6 proc.). Kitų šalių rezultatai rodo, kad atsparumas antimikrobinėms medžiagoms varijuoja, tačiau minėti medikamentai yra vis tiek mažiau efektyvūs (21, 35, 36, 37). Apskritai, 78 proc. mikroorganizmų rūšių buvo atsparios bent vienai antimikrobinei medžiagai. Atsparumo skirtingoms antimikrobinėms medžiagoms dažnumas buvo pakilęs orgnizmuose gyvūnų, kurie sirgo pasikartojančia piodermos forma ir buvo gydomi ilgalaikiais antimikrobinių medžiagų kursais, ypač naudojant amoksiciliną – klavulano rūgštį, cefalosporinus, enrofloksaciną ir ciprofloksaciną. Buvo nustatyta, kad daugiau nei 30 proc. išskirtų mikoorganizmų buvo rezistententiški keliems antibiotikams. Tokie tyrimų rezultatai rodo, kad prieš taikant antimikrobinį gydymą verta atlikti in vitro tyrimus (40).
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS
2.1 Tyrimo organizavimas
Magistro baigiamasis darbas “Mikroorganizmų išskyrimas iš šunų odos ir atsparumo antimikrobinėms medžiagoms įvertinimas” atliktas 2019 – 2020 m. įvairiose vietose – veterinarinėje klinikoje “X” ir trejose gyvūnų prieglaudose. Tyrimas vykdytas pagal schemą, pavaizduotą 1 paveiksle:
1 pav. Magistro baigiamojo darbo tyrimo schema
2.2 Tiriamųjų skirstymas į grupes
Atliekant tyrimą, šunys buvo skirstomi į dvi pagrindines grupes: kliniškai sveikus bei turinčius vizualiai matomų odos ar plaukų pažeidimų (odos abscesų, plikimo, egzemos ir atopinio dermatito požymių). Dažnai šiuos požymius lydėjo skausmas, kasymasis, bendras diskomfortas. Šunys, kurie neturėjo odos ligų požymių, buvo laikomi kliniškai sveikais.
Tyrime dalyvavę pacientai (n=36) nebuvo gydyti antimikrobinėmis medžiagomis iki mėginio paėmimo.
Tyrimui buvo sudarytos tokios grupės:
1. Kliniškai sveiki, odos problemų neturintys šunys (n=18).
2. Šunys, turintys odos pažeidimų: sergantys atopiniu dermatitu, turintys abscesų, egzemą, plikimo židinių. (n=18).
Mėginiai iš sveikų ir sergančių šunų imti klinikinės apžiūros metu.
Daugiausiai tyrime dalyvavusių šunų buvo mišrūnai, vokiečių aviganiai ir pudeliai. Viso tyrime dalyvavo dvylika skirtingų šunų veislių (1 lentelė).
1 lentelė. Tiriamųjų pasiskirtymas pagal veisles
Veislė Ištirtų individų kiekis
procentais
Mišrūnas 55,5 proc.
Vokiečių aviganis 11,1 proc.
Pudelis 5,55 proc.
Vakarų sibiro laika 2,7 proc.
Bulmastifas 2,7 proc.
Prancūzų buldogas 2,7 proc.
Shiba – inu 2,7 proc.
Taksas 2,7 proc.
Jorkšyro terjeras 2,7 proc.
Mopsas 2,7 proc.
Cvergšnauceris 2,7 proc.
Rotveileris 2,7 proc.
Tarp tirtųjų šunų patinų buvo daugiau nei patelių. Kliniškai sveikų patelių buvo daugiau nei sergančių odos ligomis. Kliniškai sveikų patinų buvo mažiau nei sergančių odos ligomis tirtų patinų (2 lentelė).
2 lentelė. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal lytį
Sergantys Sveiki
Patinai Patelės Patinai Patelės
33,4 proc. 16,6 proc. 22,2 proc. 27,7 proc.
63,9 proc. tirtų šunų buvo laikomi vidaus sąlygomis, 36,1 proc. – lauke.
2.3 Mėginių paėmimas
Mėginiai buvo imti nuo sveikų ir turinčių odos pažeidimų šunų odos paviršiaus, naudojant sterilų vatos tamponėlį.
Mėginių ėmimas iš odos pažeidimų turinčių šunų. Mėginį imantis asmuo dėvi vienkartines pirštines. Klinikinės apžiūros metu įvertinama paciento odos bendra būklė ir randama pažeidimo vieta. Mėginio ėmimo vieta parenkama taip, kad ji būtų kuo švaresnė (nebūtų purvo ar žemių). Mėginys imamas nuo pažeidimo krašto. Nuo šlapiuojančių pažeidimų sterilia vatos lazdele švelniai, sukamaisiais judesiais patrinama pažeidimo krašto vieta apie 20 – 30 sek. Esant sauso tipo odos pažeidimams (išplikimai, sausi šašai, pleiskanos) sterilus tamponėlis lengvai pašlapinamas natrio chlorido 9 proc. fiziologiniu tirpalu (“SODIUM CHLORIDE B. BRAUN”, Vokietija) ir sukamaisiais judesiais patrinama pažeidimo krašto vieta apie 20-30 sek. Sterilus vatos tamponas su tiriamąja medžiaga dedamas į transportinę terpę (“TRANSWAB AMIES CHARCOAL”, Ispanija).
Mėginių ėmimas iš kliniškai sveikų šunų odos. Imantysis mėginį dėvi pirštines, paciento plaukai yra praskiriami pirštais, kad matytųsi odos paviršius. Sterilus vatos tamponas yra lengvai pašlapinamas fiziologiniu tirpalu (“SODIUM CHLORIDE B. BRAUN”, Vokietija) ir sukamaisias judesiais patrinamas į odą 20-30 sek. Sterilus vatos tamponas su tiriamąja medžiaga dedamas į transportinę terpę (“TRANSWAB AMIES CHARCOAL”, Ispanija). Visi mėginiai pristatyti į laboratoriją per 24 – 48 val. nuo paėmimo. Mėginiai buvo pasėti ant Petri lėkštelėse esančių paprastų, selektyvių, diferencinių – diagnostinių, specialiųjų mitybinių terpių. Kultivuojama aerobinėmis sąlygomis 24 – 48 val. ir vertinama išaugusių mikroorganizmų kolonijų morfologija. Vėliau dažoma Gramo metodu („Diagnostica Merk“, Vokietija).
2.4 Bakterijų išskyrimas ir biocheminių savybių nustatymas
Norint identifikuoti E. coli, mėginiai buvo sėjami ant E.M.B (eozino-metileno mėlynojo) Levino agaro (“LIOFILCHEM”, Italija) ir kultivuojama 24 – 48 val, +37 °C temperatūroje.
E. coli būdinga laktozės fermentacija, o Levino agare kolonijoms būdingas metališkas
blizgesys. Taip pat mėginiai buvo sėti ant TBX agaro (“BIOLIFE”, Italija), nes E. coli išskiria fermentą β – D – gliukoronidazę. Kultivuojama 24 – 48 val, +37 °C temperatūroje. Išauga mėlynai žalios kolonijos. E. coli būdingas judrumas, jos išskiria indolą SIM terpėje (“LIOFILCHEM”, Italija), auga difuziškai nuo pasėjimo zonos. Drumstumas aplink bakterijų pasėjimo zoną rodo, kad judrumo testas – teigiamas. Užlašinus Kovačo reagentą, susidaro raudonos spalvos indolo žiedas, kuris parodo, kad bakterijoms būdinga triptofanazės gamyba.
E. coli negamina ureazės, todėl ureazės testas (“OXOID”, Italija), kultivuojant 24 val, +37 °C
temperatūroje – neigiamas.
Staphylococcus spp. išskyrimui šios gram teigiamos kokinės bakterijos buvo sėtos ant manito druskos agaro ir kultivuojamamos 48 val, +37 °C temperatūroje. Koaguliazei teigiami, manitolį fermentuojantys stafilokokai, pakeitė agaro spalvą nuo rožinės iki geltonos spalvos dėl pH pokyčio. Stafilokokų atskyrimui nuo streptokokų buvo atliekamas katalazės testas, panaudojus 3 proc. vandenilio peroksido tirpalą (UAB “VALENTIS”, Lietuva). Gram teigiami stafilokokai yra katalazei teigiami – sumaišius su vandenilio peroksidu buvo stebima putojimo reakcija, o neputojantys – oksidazei neigiami. Norint atskirti stafilokokus nuo mikrokokų buvo naudojamas greitasis oksidazės testas “Oxidase test stick” (“LIOFILCHEM”, Italija). Taip pat buvo nustatoma fermento β – galaktozidazės produkcija naudojant O.N.P.G. greitąjį testą (“LIOFILCHEM”, Italija), siekiant atskirti S. aureus ir S.
pseudintermedius bakterijų rūšis. Stafilokokų kultūra pasėjama į terpę su O.N.P.G.,
inkubuojama 24 val, +37 °C temperatūroje. Stafilokokai, kurie išskiria β – galaktozidazę, pakeičia terpę į geltoną spalvą dėl O.N.P.G hidrolizės. Jei mikroorganizmai neturi šio fermento, terpė išlieka be spalvos. S. aureus ir S. pseudintermedius išskiria α – ir β – hemolizinus, todėl kraujo agare šios rūšies bakterijoms būdinga „dviguba“ hemolizės zona.
S. pseudintermedius reakcija manito druskos agare (“LIOFILCHEM”, Italija) yra silpna, todėl
jai būdingas neryškus terpės spalvos pakitimas į gelsvą atspalvį. Tuo tarpu, S. aureus reakcija manito druskos agare yra teigiama. Agaras ryškiai pakeičia spalvą nuo rožinės iki geltonos.
S. aureus, priešingai nei S. pseudintermedius, neišskiria β – galaktozidazės, todėl
Bioproducts Ltd.”, Jungtinė Karalystė). Surištoji koaguliazė nustatyta paviršiaus “Staphytest” (“OXOID”, Anglija) koaguliazės testu, o laisvoji koaguliazė – mėgintuvėlyje naudojant “Coagulase Plasma EDTA” – liofilizuotą triušio plazmą (“Biolife”, Italija).
Streptokokai – katalazei neigiami mikroorganizmai. Taipogi šios bakterijos ant kraujo agaro
sukelia pilną arba dalinę hemolizę. Streptokokų nustatymui buvo naudojamas “Streptococcal grouping kit” (“LIOFILCHEM”, Italija). Taip pat buvo naudojamas Kanamicino eskulino agaras (“OXOID”, Anglija) – diferencinė – diagnostinė selektyvi terpė, kurioje D grupės streptokokai skaido eskuliną ir auga juodos spalvos kolonijomis. PYR (pirolidonilio aminopeptidazės) testas buvo atliktas norint identifikuoti D grupei priklausančią E. faecalis. (“LIOFILCHEM”, Italija). Šis greitasis testas parodo pirolidonilio aminopeptidazės aktyvumą. Teigiamu atveju matoma raudonos spalvos reakcija. Fenolio raudonojo sultinyje mėginys su E. faecalis pakeičia spalvą iš raudonos į geltoną, o mėginyje su E. faecium sultinio spalva nekinta, nes E. faecalis skaido sorbitolį, o E. faecium – ne.
Bacillus genties bakterijos formuoja endosporas, kurios yra matomos tepinėliuose, nudažytuose pagal gramą. Bacilos 5 proc. kraujo agare pasižymi plačia hemolizės zona. Tai yra katalazei teigiamos bakterijos.
Aktinomicetai yra prokariotiniai gram teigiami siūlai, sudarantys drūzas. Dauguma aktinomicetų yra katalazei neigiami (gali būti ir teigiamų), nejudrūs, neformuojantys sporų. Dažoma Gramo metodu – ataugėlės nusidažo gram teigiamai. Visi aktinomicetai auga paprastose terpėse, avies kraujo agare, geriau auga terpėse su 1 proc. gliukozės – Sabūro dekstrozės agare. Kultūros augintos aerobinėmis salygomis.
Corynebacterium spp. gali būti lazdelės ar kokoidinės formos, yra nejudrios, nusidažo gram teigiamai. Oksidazei neigiami. Gerai auga ant mielių – peptono – gliukozės agaro ir triptono sojos agaro bei kraujo agaro, tačiau neauga ant MacConkey agaro. Kultivuojama anaerobinėmis sąlygomis, +37 °C. Ant triptono sojos agaro matomos kremiškai baltos, nepermatomos, maždaug 0,5 mm. diametro kolonijos. Šarminei fosfatazei ir pirazinamidazei teigiami, b – gliukoronizadei, b – galaktosidazei, a – gliukozidazei, N – actetilgliukosaminidazei ir ureazei neigiami. Nitratų redukcijai, eskulino ir želatinos hidrolizei mikroorganizmai yra neigiami.
2.6 Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas
Tyrimo metu buvo nustatomas atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Naudotas modifikuotas Kirby – Bauer diskų difuzijos metodas (1996 m.), remiantis EUCAST (The
European committee on antimicrobial susceptibility testing) rekomendacijomis. Nuo maitinamojo agaro sterilia kilpele imamos bakterijų kolonijos. Jos maišomos su steriliu 0,9 proc. NaCl tirpalu, kol suspensijos optinis tankis pasiekia 0,5 McFarland‘o vienetus. Optinis tankis nustatomas aparatu „DEN – 1“ („Biosan“, Latvija). Sėjimui naudojamos 90 mm. Petri lėkštelės su Mueller Hinton II agaru („Oxoid“, Anglija). Tiriamoji medžiaga sklaidoma agaro paviršiuje steriliu vatos tamponėliu. Ant Petri lėkštelės paviršiaus su praskiesta bakterijų kultūra dedami antimikrobinių medžiagų diskai. Kultivuojama termostate aerobinėmis sąlygomis, 35±1 °C, 16 – 20 val. Atsparumo zona buvo matuojama automatine liniuote. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms įvertintas pagal augimo zonas, laikantis EUCAST (versija 8.1, 2018–05–15) rekomendacijų. Šio tyrimo metu buvo naudojami tokie diskai: oksacilino (1µg, “Roseto”, Italija), amoksicilino su klavulano rūgštimi (20 µg + 10 µg, “Oxoid”, Anglija), cefovecino (30 µg, “Roseto”, Italija), norfloksacino (10 µg “Roseto” Italija), fuzidino rūgšties (10 µg, “Roseto”, Italija), sulfametaksazolio – trimetoprimo (25 µg, “Roseto”, Italija), amoksicilino (30 µg, “Roseto”, Italija) ir oksacilino epsilon testas (E – testas). Ant Petri lėkštelės su praskiesta bakterijų kultūra yra dedama juostelė su skirtingos koncentracijos oksacilinu. Inkubuojama 18 – 24 val, 35±1 °C. Rezultatas: matoma elipsoidinės formos slopinamoji sritis, einanti palei testo juostelę. MSK (mažiausioji slopinamoji koncentracija) matoma skalėje µg/mL kartu su elipsės kraštu. Vertinama pagal vietą, kurioje nebėra tiriamųjų mikroorganizmų dauginimosi.
2.6 Statistinės analizės metodai
Tyrimo duomenys sisteminti naudojant „Microsoft Excel 2016“ programą. Statistinė duomenų analizė atlikta taikant IBM SPSS Statistics 23.0 (angl. Statistical Package for Social
Sciences 23.0) programą. Tiriant statistines hipotezes pasirinkti 0,05, 0,01, 0,001 reikšmingumo
3. REZULTATAI
3.1 Mikroorganizmai, išskirti iš kliniškai sveikų šunų odos
1 pav. Kliniškai sveikų šunų odos mikrobiota
1 paveiskle matoma, kad iš kliniškai sveikų šunų odos dažniausiai buvo išskirtos Staphylococcus warneri ir Bacillus genties bakterijos. S. pseudintermedius, Corynebacterium, Actinomyces genčių bakterijos buvo išskirtos rečiausiai.
33.3 27.7 16.6 5.5 5.5 5.5 5.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Pro c.
3.2 Mikroorganizmai, išskirti iš pažeidimų turinčių šunų odos
2 pav. Šunų, turiunčių odos ligų požymių pasiskirstymas pagal pažeidimo tipą
Daugiausia tirtų šunų sergančiųjų grupėje turėjo paplikimų ir paraudimų ant odos. Panaši dalis tirtųjų šunų turėjo egzemą arba į egzemą panašius požymius. Mažesnė dalis tirtųjų turėjo atopinio dermatito požymius, o mažiausiai tirtų šunų turėjo odos abscesų (2 pav.).
33.3 proc. 27.8 proc. 22.2 proc. 16.7 proc. Plikimas Egzema Atopinis dermatitas Abscesas 66.7 11.1 5.6 16.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Pro c.
Tyrimo metu iš sergančių šunų odos dažniausiai išskirtos bakterijų gentys buvo
Staphylococcus spp. ir Bacillus spp., o Enterococcus spp. buvo išskirta rečiausiai (3 pav.).
4pav. Mikroorganizmų išskyrimas iš sergančių šunų odos pagal pažeidimo tipą
Lyginant mikroorganizmų išskyrimą priklausomai nuo pažeidimo tipo gauta, kad S.
pseudintermedius ir Staphylococcus aureus rūšys buvo išskirtos iš visų pažeidimų tipų odos.
Įvairiausia mikrobiota matoma plikančiųjų odoje – išskirtos keturios skirtingos mikroorganizmų rūšys, vyraujanti – Staphylococcus pseudintermedius, kita – Staphylococcus
aureus. Iš odos abscesų buvo išskirtos dvi mikroorganizmų rūšys, vyraujanti – Staphylococccus pseudintermedius. Iš atopiniu dermatitu sergančių šunų odos buvo išskirtos
dvi mikroorganizmų rūšys, iš kurių vyraujanti – Staphylococcus aureus. Egzemos atveju išskirtos trys mikroorganizmų rūšys, iš kurių vyraujanti yra Staphylococcus
pseudintermedius, tuo tarpu Staphylococcus aureus ir Bacillus genties bakterijos išskirtos
rečiau (4 pav.). Gauti rezultatai statistiškai skiriasi nereikšmingai (p > 0,001).
50 40 33.3 66.7 25 20 66.7 33.3 25 20 20 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Egzema Plikimas Atopinis dermatitas Abscesas
3
.
4 Iš sergančių ir sveikų šunų odos išskirtų mikroorganizmų palyginimas
5 pav. Kliniškai sveikų ir odos ligomis sergančių šunų mikrobiotos palyginimas 5 paveiksle matoma išauginta mikrobiota tiek iš sveikų, tiek iš sergančių šunų odos. Iš sveikų šunų odos buvo išskirtos dvi mikroorganizmų rūšys ir trys gentys, o iš sergančių šunų odos – trys mikroorganizmų rūšys ir viena gentis. Staphylococcus pseudintermedius yra labiausiai paplitęs sergančiųjų odos ligomis šunų grupėje mikroorganizmas, o tuo tarpu sveikų šunų grupėje išskirtas rečiausiai. Iš sveikų šunų odos dažniausiai išskirtas mikroorganizmas buvo
Staphylococcus warneri, o sergančių šunų odoje ši mikrooganizmų rūšis nebuvo aptikta. Tiek
sveikų, tiek sergančių odos ligomis šunų grupėje buvo rasta Bacillus spp. Sergančių šunų grupėje buvo išskirta Staphylococcus aureus, o sveikų grupėje – ne. Sergančiųjų grupėje taip pat rasta Enterococcus faecalis, sveikų šunų grupėje – neišskirta. Staphylococcus warneri buvo išskirta kartu su Bacillus genties bakterijomis tik sveikų šunų grupėje. Actinomyces genties bakterijos buvo išskirtos kartu su Staphylococcus warneri sveikų šunų grupėje.
Corynebacterium genties bakterijos buvo išskirtos tik sveikų šunų grupėje (5 pav.). Gauti
rezultatai statistiškai reikšmingi (p < 0,001). 38.8 5.5 27.7 33.3 11.1 27.7 16.6 5.5 5.5 5.5 16.6 5.5 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Sergantys Sveiki
Staphylococcus pseudintermedius Staphylococcus aureus
Staphylococcus warneri Bacillus spp.
Staphylococcus warneri ir Bacillus spp. Corynebacterium spp. Actinomyces spp. Ir Staphylococcus warneri Enterococus faecalis Neišskirta spp. spp. ir spp. spp. ir
3.5 Dažniausiai iš šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
3.5.1 Dažniausiai iš sveikų šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
6 pav. Iš sveikų šunų odos išskirtų Staphylococcus warneri padermių atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
6 paveiksle vaizduojamas Staphylococcus warneri atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Iš sveikų šunų odos išskirtas Staphylococcus warneri padermės yra atspariausios trimetorpimui – sulfametoksazolui, oksacilinui ir cefovecinui. Gauti rezultatai statistiškai reikšmingi (p < 0,01). Taikytas oksacilino E testas parodė, kad vienai iš padermių MSK gauta 0,25 µg/ml.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Trimetoprimas - sulfametoksazolas Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Norfloksacinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu
7 pav. Iš sveikų šunų odos išskirtų Bacillus genties bakterijų padermių atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
Iš sveikų šunų odos išskirtos Bacillus genties bakterijos buvo visiškai atsparios oksacilinui. Taip pat labiausiai atsparios norfloksacinui ir cefovecinui (7 pav.) Gauti rezultatai statistiškai reikšmingi (p < 0,01).
8 pav. Iš sveikų šunų odos išskirtų Staphylococcus pseudintermedius padermių atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Trimetoprimas - sulfametoksazolas Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Norfloksacinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Trimetoprimas - sulfametoksazolas
Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Norfloksacinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu
8 paveiskle matoma, kad iš sveikų šunų odos išskirtos Staphylococcus pseudintermedius padermės yra visiškai atsparios oksacilinui, norfloksacinui, amoksicilinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui. Gauti rezultatai statistiškai nereikšmingi (p > 0,01). Taikytas oksacilino E testas parodė, kad vienai iš padermių MSK gauta 0,75 µg/ml.
3.5.2 Dažniausiai iš sergančių šunų odos išskirtų mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
9 pav. Iš sergančių šunų odos išskirtų Staphylococcus aureus padermių atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
Iš sergančių šunų odos išskirtas Staphylococcus aureus yra visiškai atsparus oksacilinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui (9 pav.). Gauti rezultatai statistiškai nereikšmingi (p > 0,01).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Trimetoprimas - sulfametoksazolas Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu
10 pav. Iš sergančių šunų odos išskirtų Staphylococcus pseudintermedius padermių
atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Nustatyta, kad iš sergančių šunų odos išskirtos Staphylococcus pseudintermedius padermės yra visiškai atsparios oksacilinui ir fuzidino rūgščiai bei dauguma padermių atsparios cefovecinui (10 pav.) Gauti rezultatai statistiškai reikšmingi (p < 0,01).
11 pav. Iš sergančių šunų odos išskirtų Bacillus genties bakterijų padermių atsparumas
antimikrobinėms medžiagoms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Trimetoprimas - sulfametoksazolas Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Norfloksacinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Trimetoprimas - sulfametoksazolas Amoksicilinas su klavulano rūgštimi Amoksicilinas Cefovecinas Oksacillinas Fuzidino rūgštis Proc. Jautru Atsparu
Iš sergančių šunų odos išskirtos Bacillus genties bakterijos yra visiškai atsparios oksacilinui, cefovecinui, amoksicilinui bei trimetorpimui – sulfametoksazolui (11 pav.). Gauti rezultatai statistiškai nereikšmingi (p > 0,01).
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Atlikto tyrimo metu iš kliniškai sveikų (n=18) ir odos ligomis sergančių gyvūnų (n=18) buvo išskirtos mikroorganizmų kultūros. Šiame atliktame tyrime iš sveikų šunų odos buvo išskirta S. warneri mikroorganizmų rūšis ir Bacillus genties bakterijos. Tuo tarpu S.
pseudintermedius mikrorganizmų rūšis, Corynebacterium, Actinomyces genčių bakterijos
išskirtos mažai tiriamųjų daliai. Gauti duomenys panašūs su 2017 m. atliktu tyrimu – jame ištirta sveikų šunų odos mikrobiota, dažniausiai išskirtos bakterijų gentys – Staphylococcus spp. ir Corynebacterium spp. (4). Mūsų atliktame tyrime didžiausią išskirtų mikroorganizmų dalį iš šunų odos sudarė S. warneri, kuris yra laikomas įprastu komensaliniu oportunistiniu mikroorganizmu odos mikrobiotoje. Taip pat retais atvejais gali sukelti odos infekcijas, tačiau mūsų atliktame tyrime iš sergančių šunų odos nebuvo išskirtas. 2014 m. atliktame tyrime, kuriame buvo lyginta sveikų ir alergiškų šunų odos mikrobiota, iš kliniškai sveikų šunų dažniausiai išskirtos mikroorganizmų gentys, nepriklausomai nuo mėginio ėmimo vietos buvo Bacillus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Macrococcus spp. (Buna et al., 2007), (5). Lyginant literatūroje aprašomus tyrimų rezultatus su šio atlikto tyrimo rezultatais galima teigti, kad šio tyrimo metu iš sveikų šunų odos išskirti mikroorganizmai –
S. warneri, S. pseudintermedius, iš Corynebacterium, Bacillus, Actinomyces genčių išskirtos
bakterijos yra sveiko šuns rezidentinė odos mikrobiota. Indikacijų naudoti antimikrobines medžiagas šunims, kurių oda turi natūralią nepatogeninę mikroflorą, nėra, nes tokio tipo rezidentiniai mikroorganizmai „treniruoja“ ir stiprina epiderminį odos barjerą, daro teigiamą įtaką imuninio atsako ląstelėms. (Sanford et al., 2013), (5).
Tiriant odos ligomis sergančius ar odos ligų požymių turinčius šunis nustatyta, kad dažniausiai išskirtos mikroorganizmų rūšys buvo S. pseudintermedius ir S. aureus. Įvairūs tyrimai rodo, kad Staphylococcus spp. gentis yra bene dažniausias bakterinių ligų sukelėjas (Dreno et al., 2017) (Kong et al., 2012a). Kiti mūsų atliktame tyrime išskirti mikoorganizmai iš sergančių šunų odos buvo Bacillus genties bakterijos ir Enterococcus faecalis.
Enterococcus faecalis nėra laikomas patogenišku odos mikroorganizmu (Kataoka et al.,
2014). Nors Bacillus genties bakterijos gali būti laikomos natūralia šunų mikroorganizmų mikrobiotos sudedamąja dalimi, 2014 m. atliktame tyrime rasta, kad Bacillus genties mikroorganizmai sudarė vieną iš labiausiai dominuojančių mikroorganizmų genčių įvairiomis alergijomis sergančių šunų odoje, tačiau nenurodoma, ar Bacillus spp. gali būti pagrindiniu infekcijos sukėlėju (Hoffman et al. 2014). Tyrime iš odos ligomis sergančių šunų pagal
mikroorganizmas iš odos abscesų, plikimo ir egzemos atveju buvo S. pseudintermedius, o mažesniąją dalį sudarė S. aureus. Atopinio dermatito atveju S. aureus buvo dažniausiai aptinkamas mikroorganizmas. 2018 m. atliktame tyrime, kuriame buvo nagrinėjamas S.
pseudintermedius virulentiškumas, nustatyta, kad S. pseudintermedius, kaip jau minėta, gali
būti ir komensalinis odos mikrobiotos vienetas, tačiau tam tikros padermės gali būti labai virulentiškos ir sukelti didelius odos pažeidimus – abscesus, nekrotinius židinius, bėrimus, įvairias piodermų formas (38). Literatūroje teigiama, kad S. pseudintermedius yra panašaus veikimo principo kaip ir S. aureus ir abu šie mikroorganizmai turi panašius virulentiškumo faktorius (Garbacz et el., 2013). Todėl galima teigti, kad tiek S. aureus, tiek S.
pseudintermedius gali sukelti panašius ar to pačio tipo odos pažeidimus. 2012 m. atliktame
tyrime buvo analizuota įvairiomis odos ligomis (atopiniu dermatitu, pioderma, alopecija) sergančių šunų odos mikrobiota. Meticilinui atsparus S. pseudintermedius buvo dažniausiai išskirta mikroorganizmų kultūra, antra pagal dažnumą – S. aureus (39). Galime teigti, kad S.
pseudintermedius ir S. aureus turi didžiausią potencialą sukelti odos pažeidimus
nepriklausomai nuo pažeidimo tipo, nes kiekvieno šuns oda yra individuali.
Taip pat mūsų atliktame tyrime mikroorganizmų rūšys, išskirtos iš sveikų ir sergančių šunų, buvo palygintos. Mūsų atliktame tyrime matoma, kad iš sveikų šunų odos išskirtų mikroorganizmų įvairovė buvo didesnė nei iš sergančių odos ligomis šunų. Sveikų šunų odoje dominavo S. warneri ir Bacillus genties bakterijos, o tuo tarpu sergančių šunų – S.
pseudintermedius ir S. aureus. 2018 metais atliktame tyrime buvo lyginama odos ligomis
sergančių ir sveikų šunų odos mikrobiota. Rezultatai parodė, kad rastos mikroorganizmų rūšys tarpusavyje stipriai nesiskyrė. Dažniausiai sergančių šunų odoje aptiktos bakterijos ar jų gentys buvo S. pseudintermedius, Psychobacter spp., Trichococcus spp., Brachybacterium spp., Porphyromonas spp. (Chermprapai et al., 2018). Odos ligomis sergančių šunų mikrobiotoje dažnai dominuoja vienos rūšies mikroorganizmas – dažniausiai tai būna S.
pseudintermedius ar S. aureus, kaip ir mūsų atliktame tyrime (Rodrigues Hoffman et al.,
2014; Pierezan et al., 2016). Tiriant sveikų šunų odos mikrobiotą ji būna įvairesnė (Bradley et al., 2016a; Pierezan et al., 2016; Rodrigues Hoffman et al., 2014). Tai parodo ir mūsų atliktas tyrimas, kuriame Bacillus genties bakterijos buvo išskirtos kartu su S. warneri bei iš
Actinomyces genties išskirtos bakterijos kartu su S. warneri iš to paties individo. Galima
teigti, kad didžiausią įtaką susirgimui daro ne pati bakterijų rūšis, tačiau kiti individualūs veiksniai, tokie kaip sumažėjęs imuniteto rezistentiškumas (pvz. sergant atopiniu dermatitu), imunosupresinės būklės ir kt. (40).
Mūsų tyrime buvo tirtas mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Iš sveikų šunų odos išskirtos S. warneri padermės yra labiausiai atsparios oksacilinui (MSK 0,24 µg) ir trimetoprimui – sulfametoksazolui. Nustatyta, kad iš sveikų šunų išskirtos Bacillus genties bakterijų padermės buvo visiškai atsparios oksacilinui bei dauguma padermių atsparios norfloksacinui ir cefovecinui. Gauti panašūs rezultatai tiriant išskirtų Bacillus genties bakterijų atsparumą iš sergančių šunų odos – padermės taip pat visiškai atsparios oksacilinui ir visiškai atsparios tiek cefovecinui tiek trimetoprimui – sulfametoksazolui. Iš sveikų šunų odos išskirtos S. pseudintermedius padermės buvo visiškai atsparios oksacilinui (MSK 0,75µg), norfloksacinui, amoksicilinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui. Įdomu tai, kad iš sergančių šunų odos išskirtų S. pseudintermedius padermių atsparumas antimikrobinėms medžiagoms keliais aspektais skyrėsi. Visiškas atsparumas nustatytas fuzidino rūgščiai, oksacilinui bei nustatytas didelis atsparumas cefovecinui, tačiau matome, kad šiuo atveju padermės buvo jautrios norfloksacinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui, priešingai nei iš sveikų šunų odos išskirtos S. pseudintermedius padermės. 2019 m. atliktoje MRSP analizėje gauti rezultatai parodė, kad visos išskirtos S. pseudintermedius rūšys buvo atsparios daugeliui antimikrobinių medžiagų – 89,5 proc. išskirtų S. pseudintermedius rūšių buvo atsparios trimetoprimui – sulfametoksazolui, enrofloksacinui, ciprofloksacinui, 79 proc. atsparios gentamicinui. Tai aiškinama skirtingu rezistentiškumo genotipu (Menandro et al., 2019). Taip pat šiame darbe buvo nustatomas iš sergančių odos ligomis šunų išskirtų S. aureus padermių atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Padermės buvo 100 proc. atsparios tiek oksacilinui, tiek trimetoprimui – sulfametoksazolui. 2017 m. atliktame tyrime nustatyta, kad iš šunų išskirtos S. aureus padermės labiausiai atsparios fluorochinolonams (Schmidt, 2014). Iš gautų rezultatų galime teigti, kad amoksicilino ir klavulano rūgšties panauda norint gydyti bakterines odos ligas yra didžiausia, o oksacilinas, trimetoprimas – sulfametoksazolas yra mažiausiai tinkamos medžiagos šunų odos infekcinėms ligoms gydyti, tačiau individualiais atvejais gali būti pritaikomos. Tik atlikdami bakteriologinį mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimą galime užtikrinti, kad antimikrobinė medžiaga tikrai veiks, nes tyrime matome, kad vienos rūšies mikroorganizmų padermės pasižymi nevienodu atsparumu antimikrobinėms medžiagoms.
5. IŠVADOS
1. Tyrimo metu nustatyta, kad kliniškai sveikų šunų odoje dominuojanti mikroorganizmų rūšis yra Staphylococcus warneri (33,3 proc.).
2. Dažniausiai iš pažeidimų turinčių šunų odos buvo išskirtos tokios bakterijų rūšys:
Staphylococcus pseudintermedius (38,8 proc.) ir Staphylococcus aureus (27, 7 proc.).
Nustatyta, kad skirtingos mikroorganizmų rūšys gali sukelti tokio pačio tipo pažeidimus. 3. Nustatyta, kad sveikų ir sergančių šunų odos mikrobiota yra įvairi: Staphylococcus
warneri rūšies bakterijos dominuoja sveikų šunų odoje, tuo tarpu Staphylococus pseudintermedius ir Staphylococcus aureus rūšys dominuoja sergančių šunų odoje.
4. Vertinant atsparumą antimikrobinėms medžiagoms gauti rezultatai parodė, kad dauguma iš sveikų ir sergančių šunų odos išskirtų mikroorganizmų rūšių yra atsparios oksacilinui ir trimetoprimui – sulfametoksazolui. Iš sveikų šunų odos išskirti mikroorganizmai taip pat yra atsparūs norfloksacinui.
REKOMENDACIJOS
Šunis, turinčius odos pažeidimų, tikslinga tirti imant bakteriologinius odos mėginius, norint išsiaiškinti tikslią diagnozę bei sukelėją. Taip pat svarbu atlikti antimikrobinio atsparumo tyrimus, norint skirti racionalų ir individualų gydymą.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. McVey D, Kennedy M, Chengappa M. Veterinary Microbiology, 3rd Edition. John Wiley & Sons; 2013. p. 555 – 557.
2. Sanford J, Gallo R. Functions of the skin microbiota in health and disease. Seminars in Immunology. 2013; 25(5):370 – 377.
3. Weese J. The canine and feline skin microbiome in health and disease. Veterinary Dermatology. 2013; 24(1):137 – e31.
4. Cuscó A, Belanger J, Gershony L, Islas-Trejo A, Levy K, Medrano J et al. Individual signatures and environmental factors shape skin microbiota in healthy dogs. Microbiome. 2017; 5 (1).
5. Rodrigues Hoffmann A, Patterson A, Diesel A, Lawhon S, Ly H, Stephenson C et al. The Skin Microbiome in Healthy and Allergic Dogs. PLoS ONE. 2014; 9 (1):e83197. 6. Nakamura, Y.; Oscherwitz, J.; Cease, K.B.; Chan, S.M.; Muñoz-Planillo, R.; Hasegawa,
M.; Villaruz, A.E.; Cheung, G.Y.; McGavin, M.J.; Travers, J.B.; et al. Staphylococcus δ-toxin induces allergic skin disease by activating mast cells. Nature 2013, 503, (397– 401).
7. Bloom P. Canine superficial bacterial folliculitis: Current understanding of its etiology, diagnosis and treatment. The Veterinary Journal. 2014; 199 (2):217 – 222.
8. Fazakerley J, Nuttall T, Sales D, Schmidt V, Carter S, Hart C et al. Staphylococcal colonization of mucosal and lesional skin sites in atopic and healthy dogs. Veterinary Dermatology. 2009; 20 (3):179 – 184.
9. Bannoehr J, Guardabassi L. Staphylococcus pseudintermedius in the dog: taxonomy, diagnostics, ecology, epidemiology and pathogenicity. Veterinary Dermatology. 2012; 23 (4):253 – e52.
10. Loeffler A, Lloyd D. What has changed in canine pyoderma? A narrative review. The Veterinary Journal. 2018; 235: 73 – 82.
11. Grice E, Segre J. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 2011; 9(4):244 – 253.
12. Song S, Lauber C, Costello E, Lozupone C, Humphrey G, Berg – Lyons D et al. Cohabiting family members share microbiota with one another and with their dogs. eLife. 2013; 2.
13. Torres S, Clayton J, Danzeisen J, Ward T, Huang H, Knights D et al. Diverse bacterial communities exist on canine skin and are impacted by cohabitation and time. Peer J. 2017; 5: e3075.
14. Lehtimäki J., Sinkko H, Hielm-Björkman A., Salmela E., Tiira K., Laatikainen T. et al. Skin microbiota and allergic symptoms associate with exposure to environmental microbes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2018; 115(19): 4897 – 4902.
15. Percival S, Emanuel C, Cutting K, Williams D. Microbiology of the skin and the role of biofilms in infection. International Wound Journal. 2011; 9(1): 14 – 32.
16. Van den Broek A. Muller & Kirk's Small Animal Dermatology. William Miller Jr, Craig Griffin, Karen Campbell. Saunders – Elsevier, St Louis; 7th Edition, 2013, p. 938. 17. Kuznetsova E, Bettenay S, Nikolaeva L, Majzoub M, Mueller R. Influence of systemic
antibiotics on the treatment of dogs with generalized demodicosis. Veterinary Parasitology. 2012; 188(1 – 2):148 – 155.
18. Sala-Cunill A, Lazaro M, Herráez L, Quiñones M, Moro-Moro M, Sanchez I. Basic Skin Care and Topical Therapies for Atopic Dermatitis: Essential Approaches and Beyond. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 2018; 28(6):379 – 391.
19. Bjerre RD, Bandier J, Skov L, Engstrand L, Johansen JD. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis: a systematic review. Br J Dermatol. 2017; 177:1272 – 8
20. Bradley C, Morris D, Rankin S, Cain C, Misic A, Houser T et al. Longitudinal Evaluation of the Skin Microbiome and Association with Microenvironment and Treatment in Canine Atopic Dermatitis. Journal of Investigative Dermatology. 2016; 136(6):1182 - 1190.
21. Ganiere J, Medaille C, Mangion C. Antimicrobial Drug Susceptibility of Staphylococcus intermedius Clinical Isolates from Canine Pyoderma. Journal of Veterinary Medicine Series B. 2005; 52(1):25 – 31.
22. Petersen A, Walker R, Bowman M, Schott H, Rosser E. Frequency of Isolation and Antimicrobial Susceptibility Patterns of Staphylococcus intermedius and Pseudomonas
aeruginosa Isolates From Canine Skin and Ear Samples Over a 6 – Year Period (1992–
1997). Journal of the American Animal Hospital Association. 2002; 38(5):407 – 413. 23. Kadlec K, Weiß S, Wendlandt S, Schwarz S, Tonpitak W. Characterization of canine
and feline methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) from Thailand. Veterinary Microbiology. 2016; 194: 93 - 97.
24. Guardabassi L, Loeber M, Jacobson A. Transmission of multiple antimicrobial-resistant
Staphylococcus intermedius between dogs affected by deep pyoderma and their owners.
Veterinary Microbiology. 2004; 98(1):23 – 27.
25. Loeffler A, Linek M, Moodley A, Guardabassi L, Sung J, Winkler M et al. First report of multiresistant, mecA-positive Staphylococcus intermedius in Europe: 12 cases from a veterinary dermatology referral clinic in Germany. Veterinary Dermatology. 2007; 18(6):412 – 421.
26. Ross Fitzgerald J. The Staphylococcus intermedius group of bacterial pathogens: species re-classification, pathogenesis and the emergence of meticillin resistance. Veterinary Dermatology. 2009; 20(5-6):490 – 495.
27. Udenberg T, Griffin C, Rosenkrantz W, Ghubash R, Angus J, Polissar N et al. Reproducibility of a quantitative cutaneous cytological technique. Veterinary Dermatology. 2014; 25(5):435 – e67.
28. Doelle M, Linder K, Boche J, Jagannathan V, Leeb T, Linek M. Initial characterization of stiff skin-like syndrome in West Highland white terriers. Veterinary Dermatology. 2016; 27(3):210 – e53.
29. Cain C, Morris D, Rankin S. Clinical characterization of Staphylococcus schleiferi infections and identification of risk factors for acquisition of oxacillin-resistant strains in dogs: 225 cases (2003–2009). Journal of the American Veterinary Medical Association. 2011; 239(12):1566 – 1573.
30. Cotting K, Strauss C, Rodriguez-Campos S, Rostaher A, Fischer N, Roosje P et al.
Macrococcus canis and M. caseolyticus in dogs: occurrence, genetic diversity and
antibiotic resistance. Veterinary Dermatology. 2017; 28(6):559 – e133.
31. Hughes L, Williams N, Clegg P, Callaby R, Nuttall T, Coyne K et al. Cross-sectional survey of antimicrobial prescribing patterns in UK small animal veterinary practice. Preventive Veterinary Medicine. 2012; 104(3 – 4):309 – 316.
32. De Lucia M, Moodley A, Latronico F, Giordano A, Caldin M, Fondati A et al. Prevalence of canine methicillin resistant Staphylococcus pseudintermedius in a veterinary diagnostic laboratory in Italy. Research in Veterinary Science. 2011; 91(3):346 – 348. 33. Morris D, Rook K, Shofer F, Rankin S. Screening of Staphylococcus aureus,
Staphylococcus intermedius, and Staphylococcus schleiferi isolates obtained from small
companion animals for antimicrobial resistance: a retrospective review of 749 isolates (2003-04). Veterinary Dermatology. 2006; 17(5):332 – 337.
