LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Gabrielė Marcikonytė
IŠ ŠUNŲ IŠSKIRTŲ ENTEROKOKŲ RŪŠINĖ SUDĖTIS, ATSPARUMAS ANTIBAKTERINĖMS MEDŽIAGOMS, KODUOJANČIŲ GENŲ PAPLITIMAS IDENTIFICATION OF ENTEROCOCCUS SPECIES ISOLATED FROM DOGS, RESISTANCE TO ANTIMICROBIAL AGENTS AND SPREAD OF RESISTANCE GENES
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Marius Virgailis
DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Iš šunų išskirtų enterokokų rūšinė sudėtis, atsparumas antibakterinėms medžiagoms, koduojančių genų paplitimas“
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Enterokokų charakteristika, struktūra, biocheminės savybės ... 10
1.2. Enterokokų virulentiškumas ... 10
1.3. Enterokokų paplitimas ... 12
1.4. Enterokokų patogeniškumas ir sukeliamos ligos ... 12
1.5. Bakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms ... 13
1.6. Atsparumą antibiotikams lemiantys genetiniai elementai. Įgimtas įgytas atsparumas ... 15
1.6.1. Atsparumas β-laktaminiams antibiotikams ... 16
1.6.2. Atsparumas aminoglikozidams ... 17 1.6.3. Atsparumas glikopeptidams ... 17 1.6.4. Atsparumas streptograminams ... 18 1.6.5. Atsparumas fluorochinolonams ... 18 1.6.6. Atsparumas linezolidams ... 19 1.6.7. Atsparumas daptomicinui ... 19 1.6.8. Atsparumas tigeciklinui ... 20 1.6.9. Atsparumas tetraciklinui ... 20
1.7. Enterokokų dauginis atsparumas antibakterinėms medžiagoms ... 21
1.8. Veiksniai lemiantys enterokokų atsparumą antibakterinėms medžiagoms ... 21
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 23
2.1. Enterokokų rūšies identifikavimas ... 23
2.2. Enterokokų jautrumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas ... 24
2.3. Molekuliniai tyrimai ... 25
2.4. DNR fragmentų frakcionavimas agarozės gelyje ... 27
2.5. Statistinė analizė ... 27
3. TYRIMO REZULTATAI ... 28
3.1. Išskirtos enterokokų rūšys ir jų atsparumas antibakterinėms medžiagoms ... 28
3.3. Atsparumo antibakterinėms medžiagoms genų pasireiškimo dažnumas ... 33
3.4. Atsparumo genų sąsaja su antibakterinėmis medžiagomis ... 33
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
IŠVADOS ... 38
PADĖKA ... 39
SANTRAUKA
Iš šunų išskirtų enterokokų rūšinė sudėtis, atsparumas antibakterinėms medžiagoms, koduojančių genų paplitimas
Gabrielė Marcikonytė Magistro baigiamasis darbas
Antibakterinis atsparumas kasmet vis didėjanti globalinė problema žmonių ir veterinarinėje medicinoje. Yra žinoma, kad daugelis antibakterinių medžiagų naudojamų veterinarinėje medicinoje yra tokios pačios kaip ir naudojamos žmonių medicinoje. Enterokokai sudaro normalią žmogaus ir gyvūnų virškinamojo trakto mikroflorą. Enterokokinės infekcijos gyvūnų tarpe yra retos, tačiau žmonių tarpe jos gana plačiai paplitusios ir sunkiai gydomos, kadangi pasižymi dideliu atsparumu įvairioms antibakterinėms medžiagoms. Jis siejamas ir su genais koduojančiais atsparumą antibakterinėms medžiagoms.
Tyrimo tikslas buvo išskirti enterokokus iš šunų organizmo, nustatyti jų jautrumą antibakterinėms medžiagoms ir įvertinti atsparumą koduojančių genų paplitimą įvairiose enterokų rūšyse. Mėginiai rinkti dviejose smulkiųjų gyvūnų klinikose, esančiose Kauno mieste ir šunų prieglaudoje. Enterokokų rūšys nustatytos atsižvelgiant į jų biochemines savybes ir patvirtintos DNR amplifikacija (PGR). Viso ištirti 103 šunų enterokokų izoliatai. Atlikus mikrobiologinius ir molekulinius enterokokų identifikavimo iki rūšies tyrimus identifikuotos 6 enterokokų rūšys: E. faecalis (48,6 proc.), E. faecium (22,3 proc.), E. hirae (9,7 proc.), E. durans (8,7 proc.), E. casseliflavus (7,8 proc.), E. gallinarum (2,9 proc.). Įvertintas enterokokų rūšių atsparumas skitingoms antibakterinėms medžiagoms Kirby Bauer metodu. Didžiausias atsparumas nustatytas: streptomicinui – 36,9 proc., β - laktaminiams antibiotikams – imipenemui – 30,1 proc. ir ampicilinui – 34 proc. Rezistentiškumo genams nustatyti taikyta polimerazės grandininė reakcija (PGR). Daugiausia aptikta aph(3) –10 proc. ir blaZ – 18 proc. atsparumo genų E. faecalis rūšyje. E. faecium padermėse tetL (17,4 proc), ermB (13 proc.) ir ermA (13 proc.), E. hirae rūšyje ant(6) (20 proc.) ir blaZ (10 proc.) atsparumo genai.
Daugiaatspariose E. faecalis padermėse labiausiai paplitę buvo tetK, tetM, aph(3) ir blaZ atsparumo genai.
SUMMARY
Identification of enterococcus species isolated from dogs, resistance to antimicrobial agents and spread of resistance genes
Gabriele Marcikonyte Master‘s Thesis
Antimicrobial resistance is the growing global problem all over the world in the human and veterinary medicine. It is well known that many antimicrobials used in veterinary medicine are the same as in human medicine. Enterococcus are the part of normal gastrointestinal flora in humans and animals. Enteroccal infections among animals are rare, however in humans it is usualy diagnosed and difficulty treated, because of the resistance to many antibiotics. Resistance to antibiotics in enterococcus is associated with the resistance genes in plasmids which are responsible for many antibiotic inactivation.
The aim of this study was to isolate enterococcus species from dogs rectum (feaces), determine resistance to antibiotics and estimate prevalence of resistance genes in different Enterococcus spp..
Dogs feaces samples were colleted in one animal shelter and two small animall clinics, both located in Kaunas. A 103 samples collected, one sample per dog. Enterococcus species were determined by biochemical activity and confirmed by PCR. A 6 enterococcus species were detected: E. faecalis (48,6 %), E. faecium (22,3 %), E. hirae (9,7 %), E. durans (8,7 %), E. caselliflavus (7,8 %), E. gallinarum (2,9 %). Antimicrobial resistance were detected by Cirby-Bauer method and antmicrobial resistance genes were detected by PCR. The highest resistance were detected to : streptomycin - 36,9 %, β – lactams: imipenem (30,1 %), and ampicillin- 34 % of all isolates. Most prevalence resistance genes were aph(3) – 10% and blaZ – 18% founded in E. faecalis. In E. faecium most prevalence genes were tetL (17,4 %), ermB (13 %) and ermA (13 %), in E. hirae ant(6) (20 %) and blaZ (10 %).
Antimicrobial resistance genes tetK, tetM, aph(3) and blaZ were most prevalent among multidrug resistant E. faecalis, tetL, ermB ir ermA – among multidrug resistance E. faecium, and ant(6) and blaZ – in E. hirae.
SANTRUMPOS
ESP- ekstraceliuliozinis paviršinis baltymas AAEF- ampicilinui atsparūs Enterococcus faecium PSB- peniciliną surišantys baltymai
GAE- gentamicinui atsparūs enterokokai VAE- vankomicinui atsparūs enterokokai
ARE- antibakterinėms medžiagoms atsparūs enterokokai PGR- polimerazės grandininė reakcija
DAA- dauginis atsparumas antibiotikams AMP – ampicilinas IMI – imipenemas S – streptomicinas SXT – sulfametoksazolas QDA – kvinupristinas-dalfopristinas E – eritromicinas TET – tetraciklinas CN – gentamicinas VA – vankomicinas %, proc. – procentai m. – metai 0C – Celsijaus laipsnis
ĮVADAS
Naminiai gyvūnai, o ypatingai šunys yra kompanijos gyvūnai ir neatsiejami šeimos nariai. Dabartiniu metu šunys laikomi ne tik atskiruose aptvaruose, voljeruose, bet ir daugiabučiuose. Tai labai padidina šunų kontaktą su žmogumi, tuo pačiu didinama šuns mikrobiotos patekimo į žmogaus organizmą tikimybė. Šuo užksikrėtęs patogeniškais mikroorganizmais, gali užkrėsti ir žmogų. (1) Tačiau kontakto metu gali būti perduodami ne tik patogeniški mikroorganizmai. Enterokokai – natūrali daugelio žinduolių ir paukščių mikroflora, taip pat dirvožemio ir vandens mikrobiotos dalis. Daugelį metų manyta, kad enterokokų rūšys nėra patogeniškos žmonėms ir laikytos nesvarbiomis medicinine prasme. Dabartiniu metu enterokokai laikomi svarbiais ligoninėse sutinkamais sąlyginai patogeniškais mikroorganizmais, kurie buvo laikomi didelio mirtingumo priežastimi. Mirtingumas siekdavo iki 61 proc. (2) Enterokokai taip pat laikomi vandens užteršumo fekalijomis bei žarnyno mikrobiotos atsparumo antibakterinėms medžiagoms indikatoriniais organizmais. (3)
Pastaraisias metais auga ne tik enterokokų patogeniškumas bet vis didesnę reikšmę įgyja jų didėjantis atsparumas antibakterinėms medžiagoms. Enterokokai įgyja atsparumą vartojant geriamąsias antibakterinių preparatų formas ir įgiję atsparumą bei atsparumą koduojančius genus perduoda juos kitoms bakterijoms. Todėl labai svarbu išsiaiškinti enterokokų rūšių ekologiją, epidemiologiją ir virulentiškumą norint sumažinti šlapimo takų infekcijų, endokarditų, chirurginių žaizdų infekcijų, bakteriemijų ir kitų enterokokų sukeltų infekcijų skaičių. (1).
Kovojant su užkrečiamosiomis ligomis ir vertinant bakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms tradiciškai kreipiamas didžiausias dėmesys į žemės ūkio gyvūnus kurių produkcija naudojama žmonių maistui. Ypatingai didelis dėmesys kreipiamas į zoonozinių ligų bei bendrų žmogui ir gyvūnui patogeniškų mikroorganizmų paplitimą bei jautrumą antibiotikams. Europos Sąjunga yra priėmusi direktyvas dėl zoonozių ligų sukėlėjų ir antimikrobinio atsparumo gyvūnų tarpe stebėsenos. Stebėseną vykdo institucijos atsakingos už visuomenės sveikatą ir jos tapo įprastos žmonių ir produkcijos gyvūnų tarpe.
Tačiau žymiai mažiau dėmesio buvo skiriama kompanijos gyvūnams, jų perduodamiems patogeniniams mikroorganizmams ir perduodamų mikroorganizmų atsparumui antibakterinėms medžiagoms. (4) Atsparūs, dažniausiai naudojamiems, ligoninėse antibiotikams enterokokai tapo pakankamai svarbia hospitalinių infekcijų priežastimi kaip ir kitos bakterijos. 2005 m. buvo pranešti 7066 bakteriemijos atvejai sukelti enterokokų Jungtinėje Karalystėje, 28 proc. šių sukeltų atvejų, enterokokai pasižymėjo atsparumu antibiotikams. Išaugęs plataus veikimo spektro antibiotikų tokių kaip fluorochinolonai, cefalosporinai, beta laktaminiai ir klavulano rūgštis vartojimas, skatina atsparių enterokokų padermių tolesnį plitimą. (5)
Tyrimo tikslas: identifikuoti enterokokų rūšis, išskirtas iš šunų išmatų, nustatyti jų jautrumą antibakterinėms medžiagoms, atsparumą antibakterinėms medžiagoms koduojančius genus, ir įverinti dauginio atsparumo pasireiškimą įvairiose enterokokų rūšyse.
Darbo uždaviniai:
1. Identifikuoti enterokokų rūšis, išskirtas iš šunų išmatų.
2. Nustatyti enterokokų padermių atsparumą antibakterinėms medžiagoms.
3. Įvertinti atsparumo antibakterinėms medžiagoms genų paplitimą atspariose enterokokų padermėse.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Enterokokų charakteristika, struktūra, biocheminės savybės
Enterokokai anksčiau klasifikuoti kaip D grupės streptokokai, tačiau 1984 m. jie buvo išskirti kaip atskira bakterijų gentis, nes ištyrus jų genominę DNR jie skyrėsi nuo streptokokų. (6) Enterokokai – įvairi ir daugialypė bakterijų grupė, turinti keletą savybių, kurios leidžia jiems augti ir išgyventi įvairiomis sąlygomis. Jie pasižymi didelėmis adaptacinėmis savybėmis, kurios jiems leidžia užimti komensalinių ir patogeninių bakterijų nišą. (7) Enterokokai yra Gram teigiami, katalazei neigiami sporų neformuojantys fakultatyviniai anaerobai, esantys žmonių ir gyvūnų virškinamajame trakte kaip normali žarnyno miroflora. (8) Enterokokai pakankamai plati bakterijų grupė, aprašytos daugiau nei 40 rūšių. (9) Enterokokai organizme ir terpėje formuoja įvairaus ilgio grandinėles, sunkiai suardoma ląstelės sienele ir gebantys išlaikyti savo struktūrą netgi esant ekstremalioms sąlygoms, pvz.: esant didelei druskos koncentracijai. (10) Enterokokai priskiriami pieno rūgšties bakterijoms, kurios gamina bakteriocinus.(8) Jie gali išgyventi įvairiose aplinkos sąlygose - varijuojant temperatūrai ( 5 - 65 0C), esant skirtingai pH nuo 4,5 iki 10,0, esant didelei NaCl koncentracijai, šios
savybės leidžia jiems plisti ir daugintis. Enterokokų atsparumas rūgštims ir šarmams priklauso nuo jų membranų patvarumo ir nepralaidumo šiems junginiams. Atsparumas skirtingai temperatūrai taip pat siejamas su enterokokų membranos struktūra, lipidų bei riebalų rūgščių kiekiu. Buvo įrodyta, kad enterokokų membrana yra stabilesnė esant minimaliai augimo temperatūrai, šis veiksnys yra specifinis mechanizmas būdingas tik enterokokams. Aukštesnėje temperatūroje enterokokai yra mažiau elastingi – membranų riebalų rūgščių kiekis padidėja, o sočiųjų riebalų rūgščių kiekis sumažėja. Enterokokų atsparumas priklauso ne tik nuo temperatūros, bet ir nuo augimo fazės.(8)
1.2. Enterokokų virulentiškumas
Išskiriami keli virulentiškumo veiksniai enterokokų rūšyse: agregacinė medžiaga, želatinazė, citolizinas, paviršinis baltymas (ESP) ir hialuronidazė. Agregacinė medžiaga yra prisitvirtinusi ant enterokoko plazmidės paviršiaus ir leidžia pernešti genus iš vieno enterokoko į kitą. (8) Agregacinę medžiagą koduoja asa1 genas, kuris įsiterpęs į plazmidę. (11) Agregacinė medžiaga padeda enterokokams specifiškai prisitvirtinti prie žarnyno, inkstų epitelio ląstelių, makrofagų ir neutrofilų. (12). Želatinazės fermentas didina enterokokų patogeniškumą tiekdamas enterokokams maistines medžiagas, tuo pačiu metu ardydamas šeiminko audinį. Taip pat šis fermentas turi įtakos formuojant bioplėveles. (8)
Želatinazė yra užkoduota chromosomos gelE, tai ekstraląstelinė cinko endopeptidazė, kuri ūmina endokarditą. (13) Citolizinas – toksinas, kurį dažniausiai gamina E. faecalis rūšys, jis padidina enterokokų virulentiškumą, lizuoja žmogaus, arklių ir triušių eritrocitus, o kartais ir žmonių leukocitus. (10) Ekstraceliuliozinis paviršinis baltymas yra susijęs su ląstelės sienelės baltymais. Jis skatina enterokokų sukibimą ir kolonizaciją, imuninės sistemos slopinimą ir atsparumo antibiotikams pasireiškimą. Tyrimais įrodyta, kad espgeno sutrikdymas neleidžia E. faecalis formuoti bioplėvelių, o E. faecium pademės turinčios espgeną, turi didesnę galimybę susijungti nei tos padermės, kurios neturi šio geno. Turintys šį geną enterokokai yra atsparesni antibiotikams: ampicilinui, ciprofloksacinui. (8) ESP koduojančios chromosomos yra susijusios su padidėjusiu enterokokų virulentiškumu, atsparumu šlapimo takuose ir bioplėvelių formavimu. (14) Hialurodinazė veikia hialurono rūgštį ir yra audinius pažeidžiantis fermentas. Hialurodinazė depolimerizuoja jungiamojo audinio mukopolisacharidą taip palengvindama enterokokų ir jų toksinų paplitimą per audinius. (8) Hialuronidazę koduoja hyl genas Hialuronidazė yra atsakinga už rinofaringitą ir pneumokokinę pneumoniją. (15) Tyrimais įrodyta, kad iš 26 vankomicinui atsparių E faecium izoliatų 7 turėjo hyl geną. (8)
Enterokokai gamina antibakterinus peptidus (bakteriocinus), bendrai vadinamus enterocinais. (16) Enterocinai skirstomi į 4 klases: 1) lantibiotiniai enterocinai, vienintelis šiuo metu žinomas yra citolizinas cylL; 2) pediocinų šeimos enterocinai ir enterocinai sintetinami be pirminio peptido; 3) enterocinai: cikliniai antibakteriniai peptidai; 4) Enterolizinas A. Enterokokų gaminami enterocinai gali padėti enterokokams kolonizuoti maisto produktus, ypatingai pieno ir mėsos, enterocinai atlieka svarbų vaidmenį genetinės medžiagos perdavime ir padeda enterokokams išgyventi įvairiose aplinkos sąlygose. (17)
Dar vienas svarbus veiksnys padidinantis enterokokų virulentiškumą yra gebėjimas formuoti bioplėveles. Bioplėvelė – tai ląstelių (bakterijų) populiacija, kuri negrįžtamai prisijungia prie biotinių ir abiotinių paviršių ir yra apsupta matrikso, sudaryto iš polimerinių medžiagų, baltymų, polisacharidų ir nukleino rūgščių. Bioplėvelių susidarymas yra sudėtingas procesas, apimantis: prisirišimą ir prisitvirtinimą ant paviršiaus, ląstelių tarpusavio sąveiką, mikrokolonijų susidarymą ir trimatės bioplėvelės struktūros kūrimą. Bioplėvelės su bakterijų kolonijomis gali kolonizuoti medicininius prietaisus (kateterius, širdies stimuliatorius, ortopedinius prietaisus). Enterokokai apsupti bioplėvelių yra labiau atsparūs antibiotikams. E. faecalis bioplėveles gamina dažniau nei E faecium. (18)
Enterokokų gebėjimas formuoti bioplėveles yra pagrindinis veiksnys skatinantis atsirasti endodontinėms ir šlapimo takų infekcijoms taip pat ir endokarditui. Enterokokams suformuoti bioplėvelę, pirmiausia būtina suformuoti pilę. (8) Mokslininkų nustatyta, kad enterokokai sudarantys normalią žarnyno mikroflorą gamina žymiai daugiau bioplėvelių, nei tie, kurie sukelia infekcijas
(pvz., infekcinį endokarditą). (19) FsrB genas yra fsr geno dalis, kuris koduoja želatinazės feromoną, reguliuojantį bioplėvelių formavimąsi E. faecalis rūšyse ir prisideda prie jų virulentiškumo. (13)
1.3. Enterokokų paplitimas
Enterokokai yra mikroorganizmai, kurie labai paplitę aplinkoje ir įvairiuose maisto produktuose. (20) Enterokokai dažnai randami gyvūninės kilmės maisto produktuose (pvz.: mėsoje, piene, sūriuose) ar daržovių paviršiuje. (21) Enterokokai - oportunistiniai ligos sukėlėjai ir sudaro dalį normalios virškinamojo trakto mikrofloros žmonių ir gyvūnų organizmuose. E faecium ir E. faecalis dažniausiai aptinkama žmonių žarnyne. E faecium produkcijos gyvūnų organizme, E. mundtii ir E. casseliflavus augaluose. E. faecalis kiekis žmonių išmatose vyrauja nuo 105 iki 107 bakterijų 1 grame, o E. faecium nuo 104 iki 106 vienetų 1 grame. (8) Enterokokai taip pat plačiai paplitę žmonių ligoninėse. Jų aptinkama ant medicininės įrangos, įvairių paviršių bei prietaisų. (22)
Enterokokų rūšių pasiskirstymas Europoje nevienodas: Ispanijoje ir Jungtinėje Karalystėje dažniausiai išskiriami E. faecalis ir E. faecium izoliatai iš aplinkos ir klinikinių šaltinių, tuo tarpu Švedijoje mažiau paplitusi E. faecium rūšis, bet dažniau aptinkama E. hirae. Danijoje E. hirae yra dominuojanti rūšis skerdžiamų gyvūnų tarpe. (8)
1.4. Enterokokų patogeniškumas ir sukeliamos ligos
Kad sukeltų ligą enterokokai turi įveikti nemažai apsauginių organizmo barjerų. Vienas jų - gebėjimas kolonizuoti virškinamąjį traktą, jame įsitvirtinti ir konkuruoti su kitais mikrooganizmais dėl maistinių medžiagų. (6) Manyta, kad enterokokų patogeniškumas susijęs su selektyvia padermių atranka vykstančia naudojant antibakterines medžiagas, tačiau tyrimai rodo, kad ir patys virulentiškumo veiksniai turi įtakos šios rūšies mikroorganizmų paplitimui. (10) Enterokokai tapo svarbiais patogenais, sukeliančiais daugybę enterokokinių infekcijų žmonėms, kurias dažniausiai sukelia dvi rūšys E. faecalis ir E. faecium. (9) Enterokokų infekcijos kelia grėsmę žmonių sveikatai dėl to, jog sunku joms pritaikyti antibiotinį gydymo metodą. (23) Enterokokų patogeniškumas susijęs su daugelio vaistinių preparatų naudojimų E. faecium sukeltoms infekcijomis gydyti. Manoma, kad dėl to galėjo atsirasti atskira su ligonine susijusių ampicilinui atsparių E. faecium (AREF) padermė, šiuo metu žymimo kaip klonų kompleksas 17 (CC17) (33). CC17 izoliatai pasižymi atsparumu ampicilinui ir fluorochinolonams, taip pat daugumoje izoliatų egzistuojančių įtariamų virulentiškumo genų, koduojančių enterokokinį paviršinį baltymą (ESP) ir hialuronidazę (hyl). Daugelį metų manyta, jog enterokokai nėra kenksmingi žmogui, tačiau neseniai nustatyta, kad jie yra pagrindiniai ligoninių
infekcijų sukėlėjai, ypač tos enterokokų rūšys, kurios turi atsparumą kelioms antibakterinėms medžiagoms. (22) Enterokokai – tipiniai oportunistiniai mikroorganizmai, kurie nekenksmingi sveikiems žmonėms, tačiau sukelia infekcines ligas žmonėms slaugomiems intensyviosios terapijos skyriuose, sergantiems sunkiomis lėtinėmis neinfekcinėmis ligomis arba tiems, kurių imuninė sistema yra nusilpusi. (24) Enterokokų sukeliamos infekcijos žmonėms dažnai pasireiškiančios ir jų eiga sunki, tuo tarpu gyvūnuose jos rečiau pasitaikančios. Enterokokines žmonių infekcijas sukelia endogeninės kilmės enterokokai. (25) Per pastaruosius du dešimtmečius atsirado enterokokų sukeltos hospitalinės infekcijos, o jų paplitimas sparčiai didėjo, pirma Jungtinėse Amerikos Valstijose ir neseniai Europoje (26) Naujausi tyrimų duomenys įrodo, kad enterokokai yra tretieji pagal dažnumą infekcijas sukeliančių mikroorganizmų ligoninėse (12 proc. visų ligoninių infekcijų), juos lenkia tik Staphylococcus aureus ir koaguliazei neigiami stafilokokai.(27) Infekcijas gali sukelti šios enterokokų pademės: E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, and E. solitarius. Dažniausiai sutinkamos yra E. faecalis ir E. faecium. E faecalis išskiriama 80 – 90 proc. infekcinių žmonių ligų pasireiškimo atveju, o E. faecium 5 – 15 proc. atvejų. (28) Antrąją vietą pagal dažnumą infekcinių ligų tarpe, kurią sukelia enterokokai užima vidiniai pilvo ir dubens abscesai bei pooperacinės žaizdų infekcijos. Trečia dažniausiai diagnozuojama infekcija, kurią sukelia šie mikroorganizmai yra kraujo užkrėtimas (sepsis). Kitos rečiau pasireiškiančios infekcijos žmonių tarpe, sukeltos enterokokų- CNS pažeidimai. (28) Vertinant infekcinio endokardito sukėlėjus enterokokai antra dažniausiai išskiriama mikroorganizmų grupė. VA E. faecalis sukeltas endokarditas susijęs su kepenų transplantacija, centrine vena ir mitralinio vožtuvo infekcijomis, o VA E. faecium endokarditas susijęs su triburio vožtuvo infekcija. (29)
Šlapimo takų infekcija yra dažnai sutinkama liga šunų tarpe, 14 proc. šunų gydomų klinikose bent kartą susiduria su šia liga. Labiausiai ji paplitusi vyresnių kalių tarpe, vienas iš veiksnių lemiančių užsikrėtimą šia liga yra enterokokai. (30) Iš 27 tirtų šunų Airijoje ir Jungtinėje Karalystėje, kurie sirgo cholangitu ir cholecititu 6 atvejais išskirti enterokokai. (31)
1.5. Bakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Antibiotikai viena iš sėkmingiausių chemoterapijos formų medicinos istorijoje, jie padėjo išsaugoti milijonų žmonių gyvybes ir padėjo kovojant su infekcinėmis ligomis, kurios daugelį metų buvo nekontroliuojamos. 1940 m. antibiotikai buvo ypač veiksmingi kovojant su patogeniniais mikroorganizmais ir jau buvo manoma, kad infekcinių ligų problema išspręsta visiems laikams, tačiau mikroorganizmai įgijo įvairius atsparumo mechanizmus. (32) Tobulėjant veterinarinei medicinai daugelis infekcinėmis ligomis užsikrėtusių gyvūnų buvo išgydyti, dėl to padidėjo antibakterinių
medžiagų vartojimas, ko pasekoje padidėjo ir atsparumas antibakterinėms medžiagoms. Šis atsparumo didėjimas buvo stebimas visose šalyse, naudojančiose antibakterinius preparatus. (33) Antibakterinės medžiagos naudojamos gydant bakterines infekcijas nuo XXa. vidurio. Šios medžiagos buvo sėkmingai ir plačiai naudojamos gydant įvairias ligas tiek žmonių, tiek veterinarinėje medicinoje. (34) Bakterijų atsparumas antibiotikams tiek individo, tiek bendruomenės lygmeniu yra neišvengiamas. Atsparumas antibiotikams riboja galimus gydymo būdus ir padidina sergamumą bei mirtingumą. Išskyrus antibakterinėms medžiagoms atsparias bakterijas, nebuvo gilinamasi į atsparumo mechanizmus, o gydymui naudojami nauji antibakterinių medžiagų junginiai arba didinamos vaisto dozės. (35)
Nustatyta, kad antibakteriniu požiūriu atspari bakterinė infekcija padidina sergamumą ir mirtingumą žmonėms bei gyvūnams. Pradėjus profilaktiškai naudoti antibakterines medžiagas gyvūnams gydyti ir augimui skatinti antibakterinių medžiagų atsparumas dar labiau išaugo, todėl imti taikyti apribojimai ir draudimai šioms sritims. Nors atsparių bakterijų santykis svyruodavo, tačiau bendras atsparių bakterijų procentas nenustoja didėjęs taip pat kaip ir daugeliui antibiotikų atsparių bakterijų skaičius, nes patogenas gali būti atsparus visiems atibiotikams naudojamiems infekcijai gydyti. (34) Per pastaruosius du dešimtmečius atsparumas antibiotikams tapo pagrindine visuomenės sveikatos problema, kuriai daug įtakos turėjo atsparių bakterijų genų paplitimas nacionaliniu ir tarptautiniu mastu bei mažėjantis farmacijos pramonės interesas atlikti naujus antibakterinių vaistų tyrimus. (35) Infekcijų gydymą apsunkina ir tai, jog dėl šiuolaikinės logistikos, atsparios padermės šiandien gali plisti pasauliniu mastu, greičiau nei pasireiškia infekcinių ligų simptomai. (36) Bakterinės infekcijos vis dar išlieka viena pagrindinių žmogaus mirties priežasčių ypatingai besivystančiose šalyse. (37)
Išspręsti šią problemą padėtų naujų antibiotikų kūrimas. Mokslininkai pateikia 6 galimus būdus, kurie padėtų sumažinti atsparumo antibiotikams plitimą. Pirmasis, tai daugiapakopiai inhibitoriai, kuriuose vienas komponentas slopintų daugiau nei vieną taikinį. Antrasis – sinergijos būdu slopinti tuos pačius taikinius. Trečiasis – tikslinių inhibitorių atradimas būtų įmanomas naudojant nuosekliąją virtualiąją atranką. Ketvirtasis pritaikius jau esamus vaistus, galima taikyti daugiapakopį gydymą. Penktasis – taikiniai neturi būti baltyminės kilmės. Šeštasis – slopinti virulentiškumo faktoriau formavimąsi ir skatinti įgimtą imunitetą. (38)
Bakterijų atsparumo didėjimą parodo vis didėjantis sunaudojamų antibakterinių medžiagų kiekis įvairiose valstybėse. Apie 1100 kilogramų antibakterinių medžiagų buvo sunaudota Danijoje gydant kompanijos gyvūnus 2005 m. Apie 80 proc. sunaudotų medžiagų buvo skirtos gydyti šunis. (39) Pasaulyje jau yra sukurtos nacionalinės ir tarptautinės atsparumui su antimikrobinėmis medžiagomis kovoti programos, tokios kaip: SENTRY, SCOPE, SVARM FAO, DANMAP IR NARMS. Šios programos skirtos kontroliuoti antimikrobinių medžiagų vartojimą produkcijos
gyvūnams ir žmonėms, stebėti antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų izoliatų išskirtų iš gyvūnų, gyvūninės kilmės maisto produktų ar žmonių. Stebėti kaip susijęs antibakterinių medžiagų vartojimas su atsparumu antibakterinėms medžiagoms 2016 m. ECDC duomenimis ES daugiau nei pusė E. coli (58,6 proc.) ir Acinetobacter spp. (55,4 proc.), trečdalis (34,5 proc.) K. pneumoniae ir (33,9 proc.) P. aeruginosa izoliatų buvo atsparios bent vienai antibakterinei medžiagai. (40)
1.6. Atsparumą antibiotikams lemiantys genetiniai elementai. Įgimtas ir
įgytas atsparumas
Skirtingi genai gali būti atsakingi už atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Šių genų identifikavimas yra svarbus norint suprasti antibiotikams atsparių bakterijų epidemiologiją ir atsparių padermių identifikavimą.
Kai kurios bakterijos turi įgimtus (natūralius) atsparumo antibakterinėms medžiagoms mechanizmus. (24, 39) Enterokokų atsparumas antibiotikams gali būti įgimtas ir įgytas. (29) Įgimtas atsparumas yra tas, kuris koduojamas visų rūšių genome arba savybė, pasireiškianti atsparumu atskirų klasių antibakterinėms medžiagoms. (2) Pavyzdžiui, bakterija neturi taikinio, į kurį galėtų būti nukreipta antibakterinė medžiaga. Kai kurių padermių atsparumą makrolidams koduoja ermB genas. Atsparumas tetraciklinui koduojamas tet (K, L, M O ir S) genų. Tet(L) genas paprastai yra aptinkamas enterokokų plazmidėse, tetO gali būti plazmidėse arba chromosomoje, tetS aptinkamas tik chromosomoje. (25) Manoma kad didelė atsparumo antibakterinėms medžiagoms mechanizmų įgaunama dėl horizontaliosios genų pernašos. Dabartiniu metu išskiriami trys horizontaliosios genų pernašos mechanizmai – transdukcija, tansformacija ir konjugacija. (32) Konjugacijos būdu horizontalioji pernaša vyksta pasitelkiant bakterijų judriuosius genetinius elementus. Judrieji genetiniai elementai gali būti suskirstyti į dvi grupes: elementai, kurie pernešami iš vienos bakterijos į kitą (pvz., konjugacinės atsparumo plazmidės ir konjugaciniai atsparumo transpozonai) ir elementai, kurie gali keisti savo padėtį toje pačioje ląstelėje (pvz., insercinės sekos). (42)
Atsparių enterokokų paplitimas tampa vis aktualesnis, ne tik Šiaurės Amerikoje, bet ir Europos Sąjungos šalyse. Vankomicinas pirmą kartą medicinoje buvo panaudotas 1972 m. ir tik prieš 15 metų buvo nustatyta, kad egzistuoja enterokokai atsparūs vankomicinui (VAE). (8) Šių enterokokų infekcijos buvo retos, tačiau 2003 m. Paryžiaus ligoninėje buvo užfiksuotas VAE protrūkis ir buvo prognozuota, kad protrūkių skaičius tik didės. (43) Enterokokų atsparumas antibiotikams išsivystė dėl to, jog antibiotikai buvo plačiai naudojami gydant žmonių infekcijas, maisto gamybos pramonėje, žemės ūkyje, produkcijos gyvūnų augimo skatinimui, neracionaliame gyvūnų ligų gydyme. (23). Kiekvieną kartą gyvūną gydant antibiotikais enterokokai bando išgyventi natūralioje organizmo
mikrofloroje ir antibiotikams vykdant vadinamąjį selektyvų spaudimą, vystosi antibiotikams atsparūs enterokokai, jie perduodami žmogui tiesioginio kontakto būdu su gyvūnu arba per gyvūninės kilmės produktus, kuriuos žmogus vartoja maistui. Pavyzdžiui, VAE iš žemės ūkio gyvulių ar jų mėsos gali perduoti jų DNR esančius atsparumą koduojančius genus žmonių enterokokams. (23) Enterokokai pasižymi dideliu genomo plastiškumu ir polinkiu išlikti ligoninių aplinkoje, kas leidžia padidinti atsparumo genų paplitimą. (29) Atsparumą antibiotikams enterokokai gali perduoti horizontaliuoju genų perdavimo būdu. (44) Šiuo atveju matomas jeu ne įgimtas, o įgytas atsparumas. Tai atsparumas antibakterinėms medžiagoms, kuris nėra būdingas rūšiai ir gali būti įgytas per atsitiktines genų mutacijas arba įgyjant genus, koduojančius atsparumo mechanizmus iš išorės, horizontaliuoju būdu, įgyjant atsparumą iš kitų bakterijų padermių. Horizontalus genų pasikeitimas tarp enterokokų įvyksta perduodant feromonui (chromosomų užkoduoti lipoproteinų fragmentai) plazmides ar transpozonus. Šie elementai gali sąveikauti tarpusavyje ir su bakterijų chromosoma, kad sudarytų sudėtinius mobiliuosius elementus. Transpozonai bakterijose dažnai turi antibiotikų atsparumo genus. Jie gali nukeliauti į plazmides, kurios dalyvauja horizontaliame genų perdavime, taip transpozonai padeda plisti antibiotikų atsparumui bakterijose. Didelis atsparumas β-laktaminiams antibiotikams E. faecium rūšyje yra susijęs su taškinėmis mutacijomis PPB5 geno srityse, E. faecalis rūšyje susijęs su PPB4 geno mutacijomis. (27)
1.6.1. Atsparumas β – laktaminiams antibiotikams
Enterokokai turi įgimtą atsparumą β – laktaminiams antibiotikams. β – laktaminiai antibiotikai veikia slopindami bakterijų augimą. (2) β – laktaminiams antibiotikams priskiriami visi antibiotikai savo molekulinėje struktūroje turintys β – laktaminį žiedą (penicilinai, cefalosporinai, karbapenemai, monobaktamai). (45) Enterokokai atsparūs cefalosporinams dėl produkuojamo mažo afiniteto PPB. E faecium atsparus ampicilinui dėl per didelės ekspresijos ar geno koduojančio mažo afiniteto PPB5 mutacijų. β – laktaminiai antibiotikai prsitvirtinę prie PPB sutrikdo ląstelių sienelių sintezę ir daugeliu atvejų užprogramuoja ląstelių žūtį, sukuriant reaktyvų deguonį. Enterokokai pasižymi mažo aktyvumo PPB, kurie silpnai prisijungia prie β – laktaminių antibiotikų. Todėl, minimali penicilinų slopinamoji koncentracija 2-8 mg/ml E. faecalis ir 8-16 mg/ml E. faecium rūšiai slopinti, ji yra 7 kartus didesnė nei reikalinga slopinti streptokokus ir kitus Gram+ mikroorganizmus. Laikui bėgant minimalios slopinamosios koncentracijos enterokokų rūšims padidėjo. (27)
1.6.2. Atsparumas aminoglikozidams
Aminoglikozidai veikia bakterijų ribosomas prie jų prisitvirtindami ir slopindami baltymų sintezę. (46) E. faecium ir E. faecalis pasižymi įgimtu atsparumu aminoglikozidams. Tiek E. faecium, tiek E. faecalis yra atsparūs įprastai kitas bakterijas slopinančioms aminoglikozidų koncentracijoms. Atsparumas pasireiškia todėl, kad aminoglikozidai nesugeba patekti į enterokoko ląstelės vidų (jei patektų, slopintų ribosominę baltymų sintezę. (27). Padidėjęs atsparumas aminoglikozidams (pvz., gentamicinui) gali pasireikšti dėl enterokokuose koduojamo geno aac6-aph2. (25)
E. faecalis įgimtai atparus linkozamidams ir streptograminams, nes turi lsa geną. (27)
Atsparumas aminoglikozidams dažniausiai įgyjamas per geną, APH(2'')-Ia-AAC(6'). Šis genas inaktyvuoja aminoglikozidus (pvz.: gentamiciną) ir jie nebegali atlikti savo antibakterinio vaidmens. Enterokokai taip pat gali vykdyti ribosomines mutacijas, kurios sukelia pasipriešinimą aminoglikozidams (streptomicinui). (47)
1.6.3. Atsparumas glikopeptidams
Atsparumas glikopeptidams pastarųjų 25 metų epidemiologinė ir antimikrobinių medžiagų naudojimo dilema. 1988 m. pirmą kartą aprašyta glikopeptidams atsparių enterokokų priežastis dėl kurių atsirasdavo infekcijos. Daugumą glikopeptidams atsparių enterokokinių infekcijų sukelia E. faecium rūšis. (27) Enterokokų rūšyse buvo aprašyti devyni atsparumo glikopeptidams tipai. Kiekviena rūšis yra susieta su skirtingais genetiniais elementais, kai kuriuos iš jų, galima suskirstyti į potipius. VanA ir vanB yra laikomi labiausiai kliniškai reikšmingais genotipais ir paprastai yra susiję su E. faecium ir E. faecalis izoliatais, o VanC atsparumas būdingas E. gallinarum (vanC1 genotipas) ir E. casseliflavus (vanC2-- vanC4 genotipai). Papildomi atsparumo glikopeptidų tipai, koduojami vanD, vanE, vanG ir vanL-vanN genų, enterokokų rūšyse sutinkami rečiau. VAE pirmą kartą buvo užfiksuoti Vakarų Europoje ir JAV. Nuo to laiko nuolat pranešama apie VAE izoliatus, įvairiose geografinėse vietovėse. VAE padermės klasifikuojamos pagal fenotipines ir genotipines savybes, taip pat pagal molekulinius tyrimo metodus (pvz., PGR). (7) Glikopeptidas (vankomicinas) veikia prisirišdamas prie pentapeptidų galo D-Ala-D-Ala, tokiu būdu slopindamas ląstelės sienelės sintezę, tačiau enterokokai turi netgi tris genetinius mechanizmus sukurtus atsparumui nuo šių antibiotikų, tai antibiotiko acetilinimas, antibiotiko išplėtimas ir antibiotiko 23S rRNR vietos dimetilinimas. Daugeliu atveju už atsparumą vankomicinui enterokokuose yra atsakingas vanA genas. (7) Susirūpinimą kelia ir tai, kad vankomicinui atsparūs genai eneterokokuose, bus perduoti kitoms patogeniškoms bakterijoms, tokioms kaip Staphylococcus aureus. (16)
1.6.4. Atsparumas streptograminams
Atsparumas streptograminas. Streptograminų – kvinupristino – dalfopristino junginys yra vienas iš metodų siekiant sunaikinti vankomicinui atsparius enterokokus, jis patvirtintas FDA. 1-12 proc. E. faecium izoliatų yra atsparūs streptograminams. Išskiriami trys genetiniai mechanizmai dėl kurių išsivysto atsparumas streptograminams:
1. Antibakterinės medžiagos acetilinimas. 2. Antibiotiko pašalinimas iš ląstelės. 3. 23 rRNR dimetilinimas.
Iki šiol buvo aprašyti 12 genų, sukeliančių atsparumą streptograminui. Veterinarinėje medicinoje plačiai naudotas streptograminas A – virginamicinas, kuris vėliau sukėlė didelį enterokokų atsparumą žemės ūkio gyvūnams taip pat ir jų paplitimą gyvūnų srutose. Šių atsparių enterokokų atsiradimas naudojant virginamiciną siejamas su acetiltransferazės genais vatD, vatE ir vatH, kurie buvo įsiterpę į enterokokų plazmides.
Atsparumas kvinupristinui ir dalfopristinui gali pasireikšti dėl 1 ar kelių mechanizmų, tokių kaip: fermentų modifikacija, aktyviosios pernašos ar pašalinimo, kurį sukelia adenozino trifosfatą surišantis baltymas. (48) 23S RNR metilinimas yra labiausiai paplitęs atsparumo mechanizmas streptograminams. Dėl metilazės užkoduotų erm genų (ypač erm[B]), kryžminio atsparumo makrolidams – linkozamidams- streptograminams B (MLSB fenotipas). E faecalis – įgimtai atspari
rūšis linkozamidams ir steptograminams. A (LSA fenotipas) dėl ABC baltymų, susijusių su Lsa (A).
Enterokokų atsparumas makrolidams. Pirmasis makrolidas panaudotas klinikinėje praktikoje 1950 m. buvo eritromicinas A, kurio struktūros pagrindinė sudedamoji dalis – didelis laktono žiedas prie kurio glikozidiniais ryšiais prisijungę amino ar neutraliųjų cukrų molekulės. Makrolidų veikimo mechanizmas pasireiškia slopinant baltymo sintezę per ribosominį enterokoko 50S subvienetą. Makrolidai veikia slopindami baltymų sintezę surišant 50S ribosominį subvientą. (42) Vienas iš svarbiausių mechanizmų lemiančių atsparumą makrolidams yra 23 S rRNR metilazinių ribosomų modifikavimas, kurį sąlygoja erm genai. Kiti du mechanizmai yra išpūtimo siurbliai ir antibiotiką inaktyvuojantys genai: msr ir ere.
1.6.5. Atsparumas fluorochinolonams
Fluorochinolonai veikia slopidami bakterijų augimą, trukdydami DNR replikacijai. (2) Aukšto lygio įgytas atsparumas dėl taškinių mutacijų gyrA ir parC genuose, koduojančių subvieneto A DNR girazę ir topoizomerazę IV, atitinkamai. Aukšto lygio fluorochinolonų atparumas būdingas hospitaliniams E. faecium klinikiniams izoliatams, ypač tiems, kurie priklauso kloninei linijai CC17.
Atlikta tyrimų, kurie įrodo, jog NorA išsiurbimo pompa egzistuoja E. faecium rūšyje ir gali būti įtraukta į atsparumo hidrofiliniams fluorochinolonams mechanizmą. Mutacijos neleidžia veiksmingai prijungti antibiotiko į fermentą, todėl DNR replikacija gali tęstis, nepaisant antibiotiko buvimo. (2)
1.6.6. Atsparumas linezolidams
Iki FDA pranešimo 2000m. buvo užfiksuoti keli enterokokų atsparumo atvejai linezolidams. Linezolidas pirmasis oksazolidonų klasės antibiotikas, priklausantis sintetiniams antibiotikams. Jo veikimo mechanizmas yra pagrįstas prisijungimu prie iniciacijos komplekso ir taip yra slopinama baltymų sintezė. Jis veikia bakteriostatiškai. Enterokokų atsparumas linezolidams susijęs su taškinėmis mutacijomis (G2576T) centrinės linijos domene V 23S rRNR. E faecalis turi 4 kopijas 95 geno, o E. faecium 6 kopijas 96 geno. Teoriškai didelis kiekis genų kopijų, mažina tikimybę įvykti atsitiktinėms mutacijoms, nes nepažeista geno kopija atstatys mutavusį geną. Tačiau rekombinacija tarp jautrių ir atsparių kopijų “pagamins” padermes su daug mutavusių kopijų.
Atsparumas sulfonamidams. Seniausias sintetinis antibiotikas- sulfonamidai pirmą kartą panaudotas 1932 m. Dažniausiai naudojamas sulfametoksazolas ir sulfametoksazolo junginys su trimetorpimu. Bakterijos įgijo atsparumą sulfonamidams, bakterijose išsivystė genai sul1, sul2, ir sul3 koduojantys atsparumą šios antibakterinių medžiagų klasės junginiams. (42) Dauguma bakterijų negali įsisavinti folio rūgšties iš aplinkos, todėl vykdo folio rūgšties sintezę, siekiant gauti nukleino rūgščių. Antibiotikų derinys trimetoprimas ir sulfametaksazolas slopina du nuoseklius etapus: tetrahidrofoliato sintezę, tokiu būdu slopindamas folio rūgšties sintezę ir sinergiškai naikindamas plataus spektro bakterijų rūšis. Enterokokai yra neįprasti, nes jie gali absorbuoti folio rūgštį iš aplinkos ir išvengti trimetoprimo ir sulfametaksazolo derinio poveikio. Todėl trimetoprimas sulfametoksazolas yra visiškai neveiksmingas gydant sunkias enterokokines infekcijas. (27)
1.6.7. Atsparumas daptomicinui
Daptomicinas yra cikliškas lipopeptidinis antibiotikas, baktericidiškai veikiantis enterokokus. E. faecium yra labiau atsparus daptomicinui nei E. faecalis. Atsparumas išsivystė dėl plautaus jo vartojimo ir jis labiausiai pasireiškia Europoje ir Azijoje. Jo veikimas pagrįstas tuo, kad patekdamas į Gramteigiamų organizmų, šiuo atveju enterokokų, ląstelių membraną esant normaliai Ca2= jonų koncentracijai ir skatina K+ jonų patekimą į ekstraląstelinę erdvę, taip sukeldamas ląstelių žūtį. (27)
1.6.8. Atsparumas tigeciklinui
Tigeciklinas yra bakteriostatinis antibiotikas veikia prisijungdamas prie bakterinės 30S ribosomos subvieneto ir blokuodamas priėjimą prie amino acilo tRNR A ribsomos vietos, todėl slopinama baltymų biosintezė. Atsparumas susijęs su padidėjusia efliukso siurblių ekspresija stafilokokų rūšyse. FDA patvirtino tigeciklino naudojimą esant sunkioms pilvo, odos, plaučių bei minkštųjų audinių infekcijoms sukeltoms enterokokų. Enterokokai labai retai būna atsparūs tigeciklinui, o jų atsparumo mechanizmai vis dar neišaiškinti. (27)
1.6.9. Atsparumas tetraciklinui
Tetraciklinai buvo pirmoji antibakterinių medžiagų grupė, kuri buvo apibūdinama kaip plataus veikimo spektro antibiotikai. Jie buvo plačiai vartojami ne tik dėl plataus veikimo, bet ir dėl žemos kainos bei santykinio saugumo, jie buvo antrieji pagal dažnumą vartojami antibiotikai po penicilino. Buvo manoma, kad jų veikimo mechanizmas pagrįstas bakterijų augimo slopinimu, patekę į bakterijos ląstelę, sąveikauja su ribozėmis ir blokuoja baltymų sintezę. (49) Tetraciklino veiksmingumas klinikinėje praktikoje ėmė mažėti, kai buvo pastebėti atsparumo mechanizmai. Išskiriami trys mechanizmai sukeliantys atsparumą tetraciklinams:
1. tetraciklino išstūmimas iš bakterijos ląstelės, efliukso siurblių pagalba; 2. bakterijos išskiria ribosominius apsauginius baltymus;
3. fermentų inaktyvacija;
Enterokokai turi genus koduojančius atsparumą tetraciklinui. Šiuo metu yra išskiriami daugiau nei 40 rūšių genų tet, koduojančių atsparumą. (42)
Kilus enterokokinei infekcijai pirmojo pasirinkimo antibiotikai yra β – laktaminiai antibiotikai ir aminoglikozidai, antrojo pasirinkimo antibiotikai yra glikopeptidai ir linezolidas prieš kuriuos enterokokai turi didelį atsparumo lygį. Taip pat enterokokai yra natūraliai atsparūs cefalosporinams, žemo lygio aminoglikozidams, polimiksinams, linkomicinams, klidamicinams, chinolonams, taip pat jie gali įgyti atsaprumą makrolidams, tetraciklinams, trimetoprimui/sulfametakzoliui, cloramfenikoliui ir ampicilinui. Per pastaruosius keletą dešimtmečių ypatingai išaugo enterokokų atsparumas β – laktaminiams antibiotikams, glikopeptidams aminoglikozidams ir linezolidams. Vankomicinas yra vienas iš nedaugelio antibiotikų, kuris vis dar veiksmingas kovojant su enterokokinėmis hospitalinėmis infekcijomis, tačiau 1980 m. buvo nustatyti VAE. (50) Siekiant sumažinti VAE paplitimą, antibiotikai naudojami paukščiams buvo uždrausti visose Europos Sąjungos šalyse nuo 1995 m., jau yra pastebimi pokyčiai, kad mažėja VAE kai kuriose Europos Sąjungos šalyse. (EFSA, 2011 m.). (20) Daugybė tyrimų buvo atlikta, kuriais nustatyta, jog atsparūs
antibiotikams enterokokai aptinkami mažmeninės prekybos maisto produktuose Prancūzijoje, pvz sūryje. (21) Kompanijos gyvūnai, tokie kaip šunys ar katės turintys vankomicinui atsparių enterokokų savo virškinamajame trakte, gali perduoti šias atsparias bakterijas žmogui. (16)
1.7. Enterokokų dauginis atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Dauginis atsparumas yra reiškinys, kai viena bakterijų padermė yra atspari keletui antibakterinių medžiagų. Jis siejamas su R plazmide, kurioje atsparumą koduojantys genai formuoja genų kasetę. DAA plinta per plazmides, transpozonus ir įsiterpimo elementus bakterijų konjugacijos dėka. (51) Didelis antibakterinių medžiagų naudojimas žmonių medicinoje, ūkinių ir kompanijos gyvūnų gydymui, akvakultūroje paskatino atsirasti patogenines bakterijas atsparias daugeliui antibakterinių medžiagų. Dauginio atsparumo atsiradimas yra pagrįstas diejų mechanizmų veikimo principu:
Bakterijos gali kaupti kelis atsparumą skirtingoms antibakterinėms medžiagoms koduojančius genus; Padidėjus genų ekspresijai, kurie koduoja DAA išsiurbimo siurblius. (52)
Enterokokai vieni dažniausių mikroorganizmų pasižymintys dauginiu atsparumu įvairioms antibakterinėms medžiagoms. (2) Enterokokai pasižymi daugiaatsparumu – jie gali “sukurti” pasipriešinimą beveik visoms antibakterinėms medžiagoms. Dėl šio pasipriešinimo daugiaatsparumo determinantai enterokokuose turi platų antibiotikų atsparumo mechanizmą: antibakterinių medžiagų viduląstelinių taikinių pakeitimą, antibiotikų kaupimosi ląstelėje efektyvumo sumažinimą. (53) Yra nustatyti du DAA pasireiškimo būdai: kryžmiškas ir ko-atsparumas. Bakterijų atsparumo determinantės gali būti pernešamos iš vienų bakterijų į kitas tokiu būdu atsparumas išplinta įvairiose ekologinės nišose. Įrodyti keli galimi pernašos būdai – transformacija, transdukcija ir konjugacija. (54) 2009 m. buvo aprašytas pirmasis atvejis Europoje, kai šuns žaizdoje buvo aptiktas dideliu atsparumu gentamicinui ir vankomicinui pasižyminti E. faecium rūšis. (55)
1.8. Veiksniai lemiantys enterokokų atsparumą antibakterinėms medžiagoms
Enterokokai gali būti atsparūs beveik visiems kliniškai naudojamiems antibiotikams. Veiksniai, kuriais grindžiamas enterokokų atsparumas gali būti jau būdingi tai rūšiai (įgimti), arba įgyti per tam tikras genų mutacijas. (27) Yra gerai žinoma, kad enerokokai yra komensalinės žarnyno bakterijos taip pat jos laikomos atsparių antibiotikams genų rezervuaru ir gali būti horizontaliai perkelti į kitas bakterijas per maisto grandinę. (20) Antimikrobinio atsparumo genų sklaida yra pagrindinė visuomenės sveikatos problema visame pasaulyje. (21) Vienas iš svarbių veiksnių lemiantis
enterokokų atsparumą antibakterinėms medžiagoms yra, tai, kad enterokokai geba kolonizuoti virškinamąjį traktą, antrasis veiksnys- gebėjimas prisitvirtinti prie įvairių ekstraląstelinių baltymų matricų (pvz.: trmbosponidino, laktoferino ar vitronektino), trečiasis veiksnys gebėjimas išgyventi burnos epitelyje, šlapimo takų epitelyje.
Per kelerius metus enterokai įrodė, kad gali perduoti atsparumo genus, todėl jie tapo svarbiu klinikiniu patogenu. Būtina geriau suprasti daptomicinui ir tigeciklinui enterokokų rezistentiškumo mechanizmus, kurie padėtų prognozuoti epidemiologinį paplitimą ir jo išvengti. Buvo įrodyta, kad ceftarolis yra efektyvesnis gydant gyvūnus nei linozolidas ir ateityje gali užimti svarbų vaidmenį. Šiuo metu tiriamas naujas gklikopeptidas oritavancinas, kuriuo būtų galimą gydyti VAE sukeltas infekcijas. (27)
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS
Tyrimai buvo atliekami nuo 2016 m. rugsėjo mėn. iki 2017 m. birželio mėn. Tyrimas buvo atliekamas Mikrobiologijos ir virusologijos institute, Mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje.
Iš viso ištirti 103 skirtingų veislių, amžiaus ir lyties šunys, 54 patina ir 49 patelės. Gyvūnų amžius varijavo nuo 1 iki 10 metų. Mėginiai buvo imti Kauno mieste iš X klinikos, (47 mėginiai), Y (32 mėginiai) bei šunų prieglaudos (24 mėginiai) smulkiųjų gyvūnų klinikų. Mėginiai buvo imami iš šunų tiesiosios žarnos naudojant sterilius vatos tamponėlius ir transportines Transwab® (Amies, Lioflchem, Italija) terpes. Surinkti mėginiai tą pačią dieną buvo pristatomi į laboratoriją ir pasėjami į Petri lėkšteles su mitybinėmis terpėmis. Enterokokams išskirti buvo naudotas Slanetz-Bartley agaras, Pfizer selektyvinis enterokokų agaras bei tulžies azido eskulino agaras. Užsėtos Petri lėkštelės kultivuotos 24-48h termostate, 37 0C temperatūroje.
2.1. Enterokokų rūšies identifikavimas
Enterokokų rūšiai nustatyti naudotos selektyvios terpės, o taip pat tirta bakterijų ir jų kolonijų morfologija, atliktas katalazės testas, gebėjimas hidrolizuoti eskuliną, augimas esant natrio azidui terpėje ir kiti bendrai priimti bakteriologiniai testai. Išskirtų bakterijų biocheminis aktyvumas tirtas naudojant „Microgen ID Systems”, GnA+B-ID (Jungtinė Karalystė) identifikavimo sistemas. Gauti rezultatai vertinti, kompiuterine programa “Microgen ID”, versija 1.2.5.26. (Jungtinė Karalystė). Skirtingų enterokokų rūšių biocheminės savybės pateiktos 1 lentelėje.
Lentelė Nr. 1 Pagrindinės skirtingų enterokokų rūšių biocheminės savybės Testas ar
savybė Enterokokų rūšis
L-arabinozė Manitolis Ribozė Ramnozė Sorbitolis Sacharozė Geltonas pigmentas
faecalis faecium hirae duran s aviu m casseliflav us flavesce ns - + + v + + - + + + - - + - - - + - - + - - - + - - d - + + + + + (+) - + + + (+) d + + + + - + - + +
+ - teigiama reakcija,- - neigiama reakcija, (+) 75-89 proc. padermių reaguoja teigiamai, v – 26-74 proc. padermių reaguoja teigiamai, d – galimos variacijos.
2.2. Enterokokų jautrumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas
Kokybinio bakterijų jautrumo/atsparumo antibiotikams tyrimo esmė – nustatyti ar konkretus antibiotikas (ar atskira antibiotikų klasė) būtų efektyvus kliniškai gydant gyvūną/žmogų. Šio metodo privalumas yra nedidelė kaina ir konkreti išvada apie antibiotiko numatomą efektyvumą in vivo. Šis metodas naudotas visais atvejais tam, kad gauti pirminius skriningo duomenis apie bakterijų jautrumo situaciją gyvūnuose-kompanionuose. Antibiotikų rūšys parinktos pagal EUCAST rekomendacijas t.y. parinktos tyrimui tos medžiagos, kurios gali būti naudojamos klinikinėje praktikoje prieš atitinkamų rūšių ligų sukėlėjus (kitaip sakant, skirtingų antimikrobinių medžiagų klasių atstovai, kurie turi nustatytą klinikinį lūžio tašką (clinical break-point). Pagal šios organizacijos reikalavimus atlikta ir rezultatų interpretacija, rezultatus vertinant kaip „jautri padermė“ ir „atspari padermė“.
Jautrumas antibakterinėms medžiagoms buvo nustatomas sudarant antibiogramą, naudojant Kirby Bauer modifikuotą metodą pagal CLSI (Clinical Laboratory Standarts Institute, JAV) rekomendacijas). Enterokokų antimikrobiniam atsparumui nustatyti naudotas „Mueller Hinton Agar II” (Liofilchem, Italija) mikroorganizmai suspenduoti fiziologiniame tirpale iki 0,5 Mac Farland vieneto optinio tankio. Sterilus vatos tamponėlis merktas į gautą suspensiją, tiriamos enterokokų kultūros pasėtos į Petri lėkštele su agaru ir ant jų paviršiaus sudėti indikatoriniai antimikrobinių medžiagų diskai, nustatyti antimikrobiniam rezistentiškumui. Buvo naudoti šie 9 antibakterinių
medžiagų diskai: ampicilinas (2 µg), vankomicinas (5 µg), imipenemas (10 µg), gentamicinas (30 µg), sulfametoksazolas (25µg), streptomicinas (300 µg), kvinupristinas- dalfopristinas (15 µg), eritromicinas (15 µg), tetraciklinas (30 µg). Petri lėkštelės su užsėtais enterokokais ir antibakterinių medžiagų diskais ant jų kultivuotos 24-48h termostate 370C temperatūroje. Atsparumas
antibakterinėms medžiagoms buvo nustatytas išmatuojant zonų skersmenį liniuote, kuriose slopinamas enterokokų augimas, įvertinamas jautrumas: jautrios ir atsparios zonos.
Lentelė Nr. 2Enterokokų atsparumas skirtingoms antibakterinėms medžiagoms remiantis EUCAST
Antibakterinė medžiaga (koncentracija)
Klinikinė reikšmė (EUCAST), sterili zona Jautru (mm) ³ Atsparu (mm) £ Ampicilinas (AMP 2µg ) 10 8 Vankomicinas (VA 5 µg) 12 12 Imipenemas (IMI 10 µg) 21 18 Gentamicinas (CN 30 µg) 22 25 Sulfametoksazolas (SXT 25µg) 30 34 Streptomicinas (S300 µg) 17 14
Kvinupristinas- dalfopristinas (QDA 15µg) 22 20
Eritromicinas (E 15 µg) 23 13
Tetraciklinas (TET30 µg) 19 14
Atsparios bent vienos klasės antibiotikui padermės buvo užšaldytos gilaus šaldymo šaldiklyje ir iš jų paruošta medžiaga molekuliniams tyrimams.
2.3. Molekuliniai tyrimai
Pradiniam tyrimo etapui, PGR atlikti, išskirta genominė DNR.Keletas bakterijų kolonijų augančių standžioje terpėje buvo resuspenduojamos 200 µl sterilaus dejonizuoto vandens. Suspensija buvo virinama 5 minutes verdančio vandens vonioje, o po to centrifuguojama 10 000 g 10 min kambario temperatūroje. Supernatantas buvo pepilamas į švarų, sterilų mėgintuvėlį ir laikomas šaldiklyje -20 0C temperatūroje. Rezistentiškumo genams aptikti taikyta polimerazės grandininė reakcija (PGR). PGR buvo vykdoma automatiniame termocikleryje (BOECO TC-PRO, Vokietija), laikantis 3 lentelėje aprašyto protokolo.
Lentelė Nr. 3 Polimerazės grandininės reakcijos parametrai
Temperatūra Laikas
Pirminė DNR Denatūracija 95°C 5 min
DNR Denatūracija 30 ciklų 95°C 30 s
Hibridizacija X°C 30 s
DNR sintezė 72°C 1 min
Baigiamoji DNR sintezė 72°C 10 min
X- temperatūra naudota nurodyta 3 lentelėje, kiekvienam genui atskirai – Hibridizacijos temperatūra
Tirti Enterococcus padermių atsparumo genai: tetraciklinui [tet(K), tet(M), tet(L)], makrolidams [erm(A), erm(B), msr(C)], aminoglikozidams [aph(3), aac(6)-aph2, ant(6)-I], B-laktamams (blaZ), sulfonamidams [dfr(K), dfr)G)]. PGR reakcijoje naudoti oligonukleotidų pradmenys, specifiški tiriamiems atsparumo genams. Nurodyti 4 lentelėje.
Lentelė Nr. 4 Enterokokų antibakterinio atsparumo genai ir pradmenų sekos, PGR produkto ilgis ir hibridizacijos temperatūra Antimikrobinė medžiaga Atsparumo genas Pradmenų sekos PGR produkto ilgis (kbp) Hibridiz acijos temperat ūra 0C Nuoroda Tetraciklinų grupė
tetK F 5' TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC 3' 718 55 Aerestrup et al
2000 DMID 37:127-137 tetK R 5' GCAAACTCATTCCAGAAGCA 3' tetM F 5' GTTAAATAGTGTTCTTGGAG 3' 656 45 tetM R 5' CTAAGATATGGCTCTAACAA 3' tetL-F 5'GTGTTGCGCGCTATATTCC3' 696 55 tetL-R 5'GTGAAMGRAGCCCACCTAA3' Makrolidų grupė
ermA-F 5'TCAAAGCCTGTCGGAATTGG3' 441 52 Sutcliffe et al.,
1996
ermA-R 5'AAGCGGTAAACCCCTCTGAG3'
ermB 5' GGAACATCTGTGGTATGGCG 3' 425 48 Jensen et al 2002
MDR 8: 369-74 ermB 5' CATTTAACGACGAAACTGGC 3' msrC-F 5'TATAACAAACCTGCAAGTTC3' 1040 55 Thumu et al 2012 msrC-R 5'CTTCAATTAGTCGATCCATA3' Aminoglikozid ų grupė
aph3-III-F 5' CCGCTGCGTAAAAGATAC 3' 609 57 Perreten et al
2005 JAC 43 2291-2302 aph3-III-R 5' GTCATACCACTTGTCCGC 3' aac6-aph2-F 5'CAGAGCCTTGGGAAGATGAAG 3' 348 61 aac6-aph2-R 5'CCTCGTGTAATTCATGTTCTGGC 3' ant6-I-F 5' AATTGTGACCCTTGAGGG 3' 814 61 ant6-I-R 5' GGCATATGTGCTATCCAG 3' Streptograminų grupė
vatD-F 5'GCTCAATAGGACCAGGTGTA3' 271 52 Robredo et al.,
2000 vatD-R 5'TCCAGCTAACATGTATGGCG3' vatE-F 5'ACTATACCTGACGCAAATGC3' 511 52 vatE-R 5'GGTTCAAATCTTGGTCCG3' B-laktamų grupė
blaZ-F 5'ACTTCAACACCTGCTGCTTTC3' 173 54 Aerestrup et al
2000 DMID 37:127-137 blaZ-R 5'TGACCACTTTTATCAGCAACC3' Sulfonamidų grupė dfrK_fw 5' GCTGCGATGGATAAGAACAG 3' 214 50 Kadlec et al 2010 AAC 54 3475-3477 FMV dfrK_rv 5'GGACGATTTCACAACCATTAAAGC3' dfrG-F 5' TTTCTTTGATTGCTGCGATG 3'
2.4. DNR fragmentų frakcionavimas agarozės gelyje
DNR fragmentai buvo frakcionuojami elektroforezės būdu 0,7 – 2 proc. agarozės gelyje. Gelis ruoštas: 1,6 ml TAE buferio supilta į matuoklį, iki 80ml įpilta vandens ir įdėta 1,6 g agarozės, 9,4 ml 1,3 proc. etidžio bromido. Į gelio šulinėlius pipete kas kartą keičiant antgalius buvo įvedama po 10 µl gauto PGR produkto
,
o į pirmuosius šulinėlius įvesta 4,5 µl žymeklio „GeneRuler TM 1500 bp DNA Ladder”. Elektroforezė vykdyta naudojant 5V/cm srovę elektroforezės aparate. PGR produktai buvo analizuojami ultravioletiniais spinduliais transiliuminatoriuje. Gavus rezultatus nustatyti rezintetiškumo genai, koduojantys atsparumą skirtingoms antimikrobinėms medžiagoms.2.5. Statistinė analizė
Tyrimo duomenys buvo kaupti Microsoft Excel 2010 programoje, statistiniai skaičiavimai atlikti naudojant Statistical Packages for Social Sciences (SPSS 23.0).
Duomenys analizuoti naudojant aprašomąją statistiką, neparametrinį Kruskall–Wallis testą, chi kvadrato (χ2) suderinamumo kriterijų. Duomenys laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Išskirtos enterokokų rūšys ir jų atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Į tyrimą buvo įtraukti 103 šunys ir analizuoti 103 šunų išmatų mėginiai. 54 (52,4 proc.) patinai ir 49 (47,6 proc.) patelės. Jauniausias šuo buvo 1 metų amžiaus, vyriausias 10 metų amžiaus, amžiaus vidurkis 4,2 ± 2,2 metai.
Išskirtos 6 enterokokų rūšys. Didžiausią dalį sudarė Enterococcus faecalis rūšis, kuri buvo išskirta 50 mėginių (48,6 proc.) Enterococcus faecium rūšis išskirta 23 mėginiuose (22,3 proc.), detaliau Enterococcus spp. pasiskirstymą žr. 1 pav.
1. pav. Išskirtų enterokokų rūšių pasiskirstymas procentais
2. pav. Išskirtų enterokokų padermių atsparumas antibakterinėms medžiagoms E.feacalis 48.6% E.faecium 22.3% E.hirae 9.7% E.durans 8.7% E. casseliflavus 7.8% E.gallinarum 2.9% 70% 30% Atsparu Jautru
Tyrimo metu buvo analizuotas atsparumas 9 antibakterinėms medžiagos: ampicilinui, vankomicinui, imipenemui, gentamicinui, sulfametoksazolui, streptomcinui, kvinupristinui-dalfopristinui, eritromincinui, tetraciklinui. 2 pav. pateiktas visų išskirtų enterokokų rūšių atsparumas 9 antibakterinėms medžiagoms.
Atsparumas ampicilinui nustatytas 35 tirtuose izoliatuose (34 proc.). Atspariausios ampicilinui buvo šios enterokokų rūšys: E. faecium – 43 proc., E. hirae – 40 proc. ir E. faecalis – 34 proc., detaliau žr. 3 pav.
3. pav. Enterokokų rūšių atsparumas ampicilinui
Atsparumas vakomicinui nebuvo nustatytas nei viename mėginyje. Atsparumas sulfametoksazolui buvo nustatytas tik 1 atveju (2 proc.) E. faecalis rūšyje. Atsparumas sulfametoksazolui nebuvo statistiškai reikšmingai susijęs su rūšimi (p=0,958). Atsparumas imipenemui buvo nustatytas 31 (30,1 proc.) mėginyje, detaliau žr. 3 pav.
4. pav. Enterokokų rūšių atsparumas imipenemui
34% 43% 40% 22% 25% 0% 66% 57% 60% 78% 75% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,642 28% 43% 30% 11% 38% 0% 72% 57% 70% 89% 63% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,405
Atsparumas gentamicinui nustatytas 22 tirtuose enterokokų izoliatuose (21,4 proc.). Atsparumas pagal rūšį dažniausiai pasireiškė E. gallinarum – 33 proc. ir E. faecalis – 30 proc. rūšyse. Detaliau žr. 5 pav.
5. pav. Enterokokų rūšių atsparumas gentamicinui
6. pav. Enterokokų rūšių atsparumas streptomicinui
Atsparumas streptomicinui nustatytas 38 tirtuose izoliatuose (36,9 proc.). Didžiausias atsparumas streptomicinui buvo nustatytas E. faecalis – 44 proc., E. hirae – 40 proc. ir E. casseliflavus – 38 proc. rūšyse. Detaliau žr. 6 pav.
30% 13% 20% 11% 0% 33% 70% 87% 80% 89% 100% 67% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,295 44% 30% 40% 11% 38% 33% 56% 70% 60% 89% 63% 67% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,537
Atsparumas kvinupristinui – dalfopristinui nustatytas 2,9 proc. tirtų izoliatų E. faecalis ir E. faecium rūšyse. Detaliau žr. 7 pav.
7. pav. Enterokokų rūšių atsparumas kvinupristinui – dalfopristinui
Eritromicinui atsparios buvo trys enterokokų rūšys: E. durans – 22 proc., E. faecium – 17 proc. ir E. faecalis – 6 proc. Atsparumas eritromicinui pavaizduotas žemiau esančiame 8 pav.
8. pav. Enterokokų rūšių atsparumas eritromicinui
Atsparumas tetraciklinui pavaizduotas 9 pav. Atsparios buvo trys enterokokų rūšys: E. faecium – 22 proc., E. faecalis – 20 proc. ir E. durans – 11 proc.
4% 4% 0% 0% 0% 0% 96% 96% 100% 100% 100% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,939 6% 17% 22% 0% 0% 94% 83% 100% 78% 100% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,250
9 pav. Enterokokų rūšių atsparumas tetraciklinui
Statistiškai reikšmingo ryšio tarp atsparumo antibakterinėms medžiagoms ir enterokokų rūšies nebuvo stebėta (p>0,05) (Kruskalo-Valiso ANOVA).
3.2. Dauginis enterokokų atsparumas antibakterinėms medžiagoms
30 padermių nustatytas dauginis atsparumas antibakterinėms medžiagoms (29,1 proc.). dauginio atsparumo nustatymas neturėjo statistiškai reikšmingo ryšio su šuns lytimi (p=0,065). Dauginis atsparumas buvo statistiškai reikšmingai susijęs su šuns amžiumi (p<0,001), detaliau žr. 5 lentelę.
Lentelė Nr. 5 Daugiaatsparumo pasireiškimas pagal šuns amžių. Šuns amžius Mėginių
skaičius
Daugiaatsparumas a/b Daugiaatsparumas, proc.
< 5 metai 57 6 10,53
≥ 5 metai 46 24 52,17
Dauginis atsparumas nebuvo statistiškai reikšmingai susijęs su enterokokų rūšimi (p=0,575). Dauginio atsparumo pasiskirstymas skirtingose enterokokų rūšyse pavaizduotas 6 lentelėje.
Daugiaatsparumas dažniausiai pasireiškė E. faecium – 39,1 proc. E. faecalis – 30 proc. ir E. hirae – 30 proc. rūšyse.
20% 22% 0% 11% 0% 0% 80% 78% 100% 89% 100% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Jautru p=0,371
Lentelė Nr. 6 Dauginio atsparumo pasiskirstymas pagal rūšį E.feacalis n=50 E.faecium n=23 E.hirae n=10 E.durans n=9 E.casselifl avus n=8 E.gallinar um n=3 Daugiaats parumas 15 (30,0 proc.) 9 (39,1 proc.) 3 (30 proc.) 1 (11,1 proc.) 2 (25 proc.) 0
3.3. Atsparumo antibakterinėms medžiagoms genų pasireiškimo dažnumas
Tyrime analizuotas 14 atsparumą koduojančių genų pasireiškimo dažnumas, šių genų pasireiškimas pavaizduotas 10 pav.
10 pav. Atpsarumą koduojančių genų pasireiškimo dažnumas.
3.4. Atsparumo genų sąsaja su antibakterinėmis medžiagomis
Enterokokų atsparumas tetraciklinui buvo statistiškai reikšmingas ir susijęs su atsparumą tetraciklinui koduojančiais genais tetK, tetM ir tetL.
• tetK p<0,023 • tetM p<0,001 • tetL p<0,001 1.9 6.8 4.9 3.9 5.8 0 10.7 5.8 4.9 12.6 0 0 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Pa sir eiš kim as , p ro c.
Atsparumas eritromicinui buvo susijęs su ermB, ermA ir msrc atsparumo genais. Atsparumas eritromicinui statistiškai reikšmingas ir susijęs su atsparumą koduojančiais genais ermB ir ermA. Nebuvo nustatyta padermė, kuri turėtų atsparumo geną msrC
• ermB p<0,001 • ermA p<0,001 • msrc 1
Atsparumas gentamicinui siejamas su aph(3), aac(6) ir ant(6) atsparumo genais. Atsparumas gentamicinui buvo statistiškai reikšmingai susijęs su atsparumo genu aac(6).
• aph3 p=0,430 • aac(6) p=0,002 • ant6 p=0,289
Atsparumą streptomicinui koduoja aph(3), aac(6) ir ant(6) genai. Atsparumas streptomicinui buvo statistiškai reikšmingai susijęs su atsparumo genais aph(3) ir aac(6).
• aph3 p=0,013 • aac6 p=0,002 • ant6 p=0,006
Atsparumo genai vatD vatE koduojantys atsparumą kvinupristinui-dalftopristinui nebuvo nustatyti nei vienoje enterokokų padermėje.
• vatD 1 • vatE 1
Atsparumas β-laktaminiams antibiotikams. Atsparumas ampicilinui ir imipenemui buvo statistiškai patikimas ir susijęs su atsparumą koduojančiu genu blaZ.
Ampicilinui blaZ p<0,001 Imipenemui blaZ p=0,002
Atsparumo genai dfrK ir dfrG sulfametoksazolui ir vankomicinui nebuvo nustatyti nei vienoje enterokokų padermėje
• dfrK 1 • DfrG 1
Statistiškai reikšmingo ryšio tarp genų pasireikšimo ir rūšies nebuvo stebėta (p>0,05), detaliau žr. 7 lentelę.
Lentelė Nr. 7 Atsparumo genų pasireiškimas enterokokų rūšyse Genas E. faecalis n=49 E. faecium n=23 E. hirae n=10 E. durans n=9 E. casseliflavus n=8 E. gallinarum n=3 p reikšmė tetK 2 (4 proc.) 0 0 0 0 0 0,829 tetM 7 (14 proc.) 0 0 0 0 0 0,163
tetL 1 (2 proc.) 4 (17,4 proc.) 0 0 0 0 0,071
ermB 1 (2 proc.) 3 (13 proc.) 0 0 0 0 0,237
ermA 2 (4 proc.) 3 (13 proc.) 0 1 (11,1 proc.)
0 0 0,520
aph3 10 (20 proc.) 1 (4,3 proc.) 0 0 0 0 0,108
aac6 3 (6 proc.) 2 (8,7 proc.) 0 0 0 1 (33,3 proc.) 0,297
ant6 3 (6 proc.) 0 2 (20 proc.) 0 0 0 0,204
msrC 0 0 0 0 0 0 1,000
vatD 0 0 0 0 0 0 1,000
vatE 0 0 0 0 0 0 1,000
blaZ 9 (18 proc.) 2 (8,7 proc.) 1 (10 proc.) 0 1 (12,5 proc.) 0 0,639
dfrK 0 0 0 0 0 0 1,000
dfrG 0 0 0 0 0 0 1,000
Daugiausiai buvo aptikta atsparumą β-laktaminiams antibiotikams koduojančių genų blaZ, šis genas aptiktas keturiose enterokokų rūšyse: E. faecalis, E. faecium, E. hirae ir E. casseliflavus. Atsparumo genai makrolidams ermA ir atsparumo genai aminoglikozidams aac6 aptikti 3 enterokokų rūšyse ErmA aptikti E. faecalis, E. faecium ir E. durans enterokokų rūšyse, o aac6 aptikti E. faecalis, E. faecium ir E. gallinarum enterokokų rūšyse.
