della ruggine e dotati di attività antiproliferativa : i cladosporoli.

(1)

so di Biotecnologie Industriali-Modulo Processi

Microrganismi di interesse biotecnologico

Un esempio di metaboliti secondari, prodotti da un iperparassita (Cladosporium tenuissimum) dei funghi della ruggine e dotati di attività antiproliferativa :

i cladosporoli.

(2)

Corso di Biotecnologie Industriali-Modulo Processi

Microrganismi di interesse biotecnologico

(3)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(4)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(5)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(6)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(7)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(8)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(9)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(10)

A

D E

C B

The cladosporols

Microrganismi di interesse biotecnologico

(11)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(12)

I metaboliti secondari generati dal Cladosporium tenuissimum possono essere considerati dei veri e propri farmaci ?

Possono essere usati, per esempio nel controllo delle malattie degenerative (cancro) nell’uomo ?

Microrganismi di interesse biotecnologico

(13)

Microrganismi di interesse biotecnologico

Le fasi della sperimentazione di un farmaco nuovo

(14)

Microrganismi di interesse biotecnologico

Le fasi della sperimentazione di un farmaco nuovo

(15)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(16)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(17)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(18)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(19)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(20)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(21)

Microrganismi di interesse biotecnologico

Esempio di high throughput screening assay

(22)

Microrganismi di interesse biotecnologico

Esempio di high throughput screening assay

(23)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(24)

Microrganismi di interesse biotecnologico

Virtual high throughput screening assay

(25)

O

OH

O OH O

H OH

1

O

OH

O OH O

H O

2

3 4

OH

O OH O

H

OH OH

O OH O

H OH

OH

O OH O

H OH

HO

Cladosporol A

Microrganismi di interesse biotecnologico

(26)

Culture cellulari

Microrganismi di interesse biotecnologico

(27)

Untreated 5 M

Morphological changes of untreated and cladosporol A-treated HT-29 cells

Microrganismi di interesse biotecnologico

(28)

Microrganismi di interesse biotecnologico

(29)

Conta cellulare

Microrganismi di interesse biotecnologico

Il quadrato al cui interno si contano le cellule ha un lato di 1 mm, lo spessore tra vetrino portaoggetto e coprioggetto è di 0,1 mm,

perciò il volume è di 0,1 μl. Il

fattore per riportare la conta a 1 μl è 10, infatti 0,1 μl x 10 = 1 μl.

(30)

Conta cellulare

(31)

* p < 0,05

** p < 0,01

***p < 0,005

* p < 0,05

Cladosporol A (M)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0 4 8 24 48

Number of Cells (x10^4)

C 5 10 20 C 5 M 10 M 20 M 0

1 2 3 4 5 6

C 5 10 20

Number of Cells (x10^4)

HT29 CaCo2 SW480

* **

***

* ***

*

* * * *

* *

*

* * * * *

Cladosporol A inhibits HT-29 cell growth in a dose and time-response manner

(32)

RISULTATO N.1

Cladosporol A inhibits HT-29 cell growth in a dose and time-response manner

Microrganismi di interesse biotecnologico

(33)

Alcune Questioni

L’attività antiproliferativa del cladosporolo A da quali molecole è mediata ? Quali meccanismi molecolari sono coinvolti in questi effetti antiproliferativi ?

Quali sono i controllori di questi meccanismi ?

Quali sono le vie di trasduzione che portano all’attivazione o all’inibizione della proliferazione cellulare ?

E’ possibile pensare a più vie di regolazione che sono stimolate dal cladosporolo A ?

Microrganismi di interesse biotecnologico

(34)

• La cellula si divide preparandosi inizialmente durante alcune fasi di maturazione e quindi entrando in divisione.

• Dividiamo questi due processi in:

• Interfase

• Divisione cellulare

Ciclo cellulare

Microrganismi di interesse biotecnologico

(35)

• La divisione cellulare può essere di due tipi:

• 1. Mitosi (diploidi)

• 2. Meiosi (aploidi)

meiosi

Divisione cellulare

Microrganismi di interesse biotecnologico

(36)

• L’interfase si divide in 4 processi:

• Fase G1 (gap1)

• Fase S (sintesi)

• Fase G2 (gap2)

• Fase 0

Interfase

Microrganismi di interesse biotecnologico

(37)

Cellule in coltura

In genere le cellule che sono

utilizzate in esperimenti in vitro…

… sono popolazioni cellulari asincrone !!!

Microrganismi di interesse biotecnologico

(38)

Cellule in coltura

Microrganismi di interesse biotecnologico

(39)

Cellule in coltura

Microrganismi di interesse biotecnologico

(40)

Ciclo cellulare

Microrganismi di interesse biotecnologico

(41)

Citofluorimetria a flusso

(42)

Citofluorimetria a flusso

(43)

Citofluorimetria a flusso

(44)

Citofluorimetria a flusso

(45)

Citofluorimetria a flusso

(46)

Citofluorimetria a flusso

(47)

Citofluorimetria a flusso

(48)

0 10 20 30 40 50 60 70

0 4 8 12 24 48

Number of Cells (%)

G1 S G2/M

Untreated 5 M

10 M 20 M

0 10 20 30 40 50 60 70 80

4 8 12 24 48

Number of Cells (%)

G1 S G2/M

0 10 20 30 40 50 60 70

4 8 12 24 48

Number of Cells (%)

G1 S G2/M

0 10 20 30 40 50 60 70

4 8 12 24 48

Number of Cells (%)

G1 S G2/M

A

Time (hours)

Cladosporol A suppresses HT-29 cells growth via G1/S phase arrest

Zurlo et al. Mol Carcinog 2013; 52: 1-17.

(49)

RISULTATO N.2

Cladosporol A suppresses HT-29 cells growth via G1/S phase arrest

(50)

Marcatori del ciclo cellulare

(51)

Marcatori del ciclo cellulare

(52)

Marcatori del ciclo cellulare

Esperimento di Western Blotting

(53)

Marcatori del ciclo cellulare

Esperimento di Western Blotting

(54)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

C 4 6 8

Pixel levels

p21

21 KDa-

55 KDa-

CyclinB1 CyclinD1

36 KDa-

A B C

34 KDa-

Cdc2-p34 PCNA

36 KDa-

D E

Time (hours)

Time (hours) Time (hours)

C 4 6 8 C 4 6 8

Time (hours)

C 4 6 8

Time (hours)

C 4 6 8 C 4 6 8

Quantitative evaluation of cladosporol A-induced expression of cell cycle regulators in HT-29 cells

CyclinE

55 KDa-

Time (hours)

0 0.2 0.4 0.6 0.8

1 2 3 4

C 4 6 8

F

(55)

Ciclo cellulare

(56)

Marcatori del ciclo cellulare

(57)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C 4 6 8

Pixel levels

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

C 4 6 8

Pixel levels

p21

21 KDa-

55 KDa-

CyclinB1 CyclinD1

36 KDa-

A B C

34 KDa-

Cdc2-p34 PCNA

36 KDa-

D E

Time (hours)

Time (hours) Time (hours)

C 4 6 8 C 4 6 8

Time (hours)

C 4 6 8

Time (hours)

C 4 6 8 C 4 6 8

CyclinE

55 KDa-

Time (hours)

0 0.2 0.4 0.6 0.8

1 2 3 4

C 4 6 8

F

(58)

Marcatori del ciclo cellulare

(59)

CDK2

Time (hours) 34 KDa-

0 0.2 0.4 0.6 0.8

1 2 3 4

C 4 6 8

G

CDK4

34 KDa-

0 0.4 0.8 1.2

1 2 3 4

Time (hours)

C 4 6 8

H

pRB

Time (hours)

C 4 6 8

0 0.2 0.4 0.6

1 2 3 4

ppRB -

pRB - ^{- 116kDa}- 110kDa

0 200 400 600 800

1 2 3

Pixel Levels

IP: anti-CDK2 Histone H1

20 M Cladosporol A (hours of treatment)

L I

(60)

Reduction of cladosporol A-induced expression of cell cycle regulators in HT-29 cells (p21, cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4)

RISULTATO N.3

(61)

O

OH

O OH O

H OH

1

O

OH

O OH O

H O

2

3 4

5 OH

O OH O

H

OH OH

O OH O

H OH

OH

O OH O

H OH

HO

cladosporol A

cytosol

nucleus

p53 Sp1

p21^WAF1/CIP1

G2 S G1

Cell cycle arrest

PPARg

PPARg Sp1

cyclin D1/CDK4 cyclin E/CDK2

PPARg b-catenin

b-catenin b-catenin

b-catenin

PPARg b-catenin

PPARg

E-cadherin

Proteosomal degradation

TCF

c-myc cyclin D1

1

2

4

5

N AF1 DBD Hinge LBD AF2 C b-catenin

Cosa abbiamo imparato fino ad oggi dalla lezione sui cladosporoli ?

(62)

I recettori nucleari

(63)

I recettori PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor )

(64)

Meccanismo di attivazione trascrizionale del recettore PPARgamma

(65)

Meccanismo di attivazione trascrizionale del recettore PPARgamma

(66)

Le funzioni del recettore PPARgamma

(67)

PPARg

55 KDa -

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

C 4h 6h 8h

PPAR

55 KDa -

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

C 4h 6h 8h

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

C 4h 6h 8h

RXR

50 KDa -

C 4 6 8

Pixel LevelsPixel LevelsPixel Levels

Cladosporol A modulates PPARgamma expression in HT-29 cells

(68)

C N C N C N C N

0 2 4 8

- 55 KDa

PPARg -

Time (hours)

- 21 KDa

p21-

0 0.2 0.4 0.6 0.8

1 2 3 4 5 6 7 8

Pixel Levels

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 C 0 2h 0 4h 0 8h

Pixel Levels

b-Actin

- 50 KDa

(69)

Cladosporol A (20M) GW9662 (10M)

- + + + + + + - - + - + - + Time (hours) - 1 1 2 2 3 3

p21

- _{- 21kDa}

PPARg -

_{- 55kDa}

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1 2 3 4 5 6 7

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1 2 3 4 5 6 7

(70)

RISULTATO N.4

PPARg is the molecular target cladosporol A

(71)

RISULTATO N.4

Reduction of cladosporol A-induced expression of cell cycle regulators in HT-29 cells (p21, cyclin D1, cyclin E, CDK2 and CDK4)

RISULTATO N.3 RISULTATO N.2

Cladosporol A suppresses HT-29 cells growth via G1/S phase arrest RISULTATO N.1

Cladosporol A inhibits HT-29 cell growth in a dose and

time-response manner

(72)

O

OH

O OH O

H OH

1

O

OH

O OH O

H O

2

3 4

5 OH

O OH O

H

OH OH

O OH O

H OH

OH

O OH O

H OH

HO

cladosporol A

cytosol

nucleus

p53 Sp1

p21^WAF1/CIP1

M

G2 S G1

PPARg

PPARg Sp1

PPARg b-catenin

b-catenin b-catenin

b-catenin

PPARg b-catenin

PPARg E-cadherin

PPARg

E-cadherin

TCF

1

2 4 3

5

(73)

Via di attivazione del pathway di Wnt/beta-catenin

WNT (Wingless-Type MMTV Integration Site Family)

(74)

Via di attivazione del pathway di Wnt/beta-catenin

(75)

(76)

Il pathway di Wnt/beta-catenin nel tumore del colonretto

(77)

Il pathway di Wnt/beta-catenin nel tumore del colonretto

(78)

Il pathway di Wnt/beta-catenin nel tumore del colonretto

(79)

C N C N C N C N

0 2 4 8

- 92 KDa

b-catenin -

Time (hours)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

1 2 3 4 5 6 7 8

Pixel Levels

A

- 55 KDa

PPARg -

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 C 0 2h 0 4h 0 8h

Pixel Levels

b-Actin

- 50 KDa

Cladosporol A interferes with the beta-catenin /TCF pathway and HT-29 cell proliferation

(80)

c- m yc/ GAPDH

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 1 2 4 8

Tim e ( hours)

RelativemRNAlevel (RTqPCR:a.u.)

B

(81)

Cy clin D 1 / GAPD H

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 1 2 4 8

Tim e ( h ou r s) Relative mRNA level (RTqPCR: a.u.)

C

(82)

0 2 4 6 8 10 12 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

C N C N C N C N

0 4 2 4 8

- 55 KDa PPARg

Time (hours)

C N C N C N C N

b-catenin

MG132 10M - - + + - - + + - - + + - - + + Cladosporol A 20M - - - - + + + + + + + + + + + +

- 92 KDa

b-actin ^{- 43 KDa}

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

15.0 12.5 10.0 7,5 5.0 2.5 0.0

0 2 4 6 8 10 12 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

15.0 12.5 10.0 7,5 5.0 2.5 0.0

D

Regulation of PPARgamma and beta-catenin expression in HT-29 cells

(83)

Traditional procedure of co-immunoprecipitation of a protein

(84)

Untreated 3 hours 6 hours

- 92 kDa b-catenin -

- 55 kDa PPARg -

E

Untreated 6 hours

anti-HA - anti-FLAG -

F

- 92 kDa - 55 kDa

PPARgamma and beta-catenin interaction in HT-29 cells

(85)

HT-29

0 4 6 8

E-cad

_{- 120 kDa}

0 0.5 1 1.5 2 2.5

1 2 3 4

P i x e l L e v e l s

Time (hours)

E-cadherin gene expression in HT-29 cells after cladosporol A treatment

(86)

E-cad -

HCT116 HCT116p53-/-

0 4 6 8 0 4 6 8

- 120 kDa

0.2 0 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

1 2 3 4 5 6 7 8

Pixel levels

Time (hours)

E-cadherin gene expression in HT-116 cells after cladosporol A treatment

(87)

RISULTATO N.5

Cladosporol A interferes with the beta-catenin /TCF pathway and

HT-29 cell proliferation

(88)

O

OH

O OH O

H OH

1

O

OH

O OH O

H O

2

3 4

5 OH

O OH O

H

OH OH

O OH O

H OH

OH

O OH O

H OH

HO

cladosporol A

cytosol

nucleus

p53 Sp1

p21^WAF1/CIP1

M

G2 S G1

PPARg

PPARg Sp1

PPARg b-catenin

b-catenin b-catenin

b-catenin

PPARg b-catenin

PPARg E-cadherin

PPARg

E-cadherin

TCF

1

2 4 3

5

(89)