1.1. - L’uso di imminozuccheri in terapia medica

1. Introduzione

1.1. - L’uso di imminozuccheri in terapia medica

Gli imminozuccheri sono mimici di carboidrati dove l’ossigeno dell’anello piranosico o furanosico viene sostituito da un atomo di azoto, per questo spesso vengono anche definiti rispettivamente come azapiranosi o azafuranosi. Queste strutture sono largamente diffuse in natura e conferiscono alle piante che le contengono attività terapeutica. Ne è un esempio il gelso bianco (Morus Alba, L.) che da secoli viene utilizzato nella medicina tradizionale cinese per le sue proprietà dimagranti, ipoglicemizzanti e antiossidanti. Studi su questa pianta hanno infatti evidenziato che il gelso oltre ad essere ricco di glicoproteine, antiossidanti e fitosteroli contiene numerosi alcaloidi zucchero-mimetici come l’1-desossinojirimicina (1, DNJ) e la Fagomina (2).

Figura 1

1: R= OH 1-desossinojirimicina (DNJ);

2: R= H Fagomina;

N H O H O

H O H

R

1: R= OH 1-desossinojirimicina (DNJ);

2: R= H Fagomina;

N H O H O

H O H

R

Pur non essendo a rigore dei veri mimici di carboidrati, sono classificati come imminozuccheri anche numerosi alcaloidi, come la castanospermina e la swainsonina, (Figura 2) a causa della loro struttura poliossidrilata e delle loro spiccate proprietà fisiologiche.

Figura 2

N-butil-1-deossigalactonojirimicina (NB-DNJ)

1-deossigalactonojirimicina (AT 1001 ^TM)

AMP-DNM

miglitol (glyset ^{T M}) N-octil-4epi-β-valienamine (NOEV)

castanospermina swainosamina N-butil-1-deossigalactonojirimicina

(NB-DNJ)

1-deossigalactonojirimicina (AT 1001 ^TM)

AMP-DNM

miglitol (glyset ^{T M}) N-octil-4epi-β-valienamine (NOEV)

castanospermina swainosamina

L’imminozucchero in assoluto più studiato per le sue molteplici attività terapeutiche è la

DNJ (1). Questo interesse inizialmente è stato rivolto alle sue spiccate attività antimicrobiche,

e, successivamente, all’attività inibitoria nei confronti delle -glucosidasi, che ne ha focalizzato l’interesse come antidiabetico.

Ad oggi, i numerosi studi condotti su questa molecola e suoi derivati, hanno permesso di individuare i diversi processi biologici attraverso i quali queste strutture zuccherino- mimetiche possono interferire con l’organismo. In seguito ai risultati degli studi biologici, sono stati sintetizzati un numero impressionante di derivati della DNJ che, nel complesso, costituiscono una classe di composti con notevoli potenzialità terapeutiche

come:

- Inibitori di glicosidasi, in grado di interferire su processi di glicoconiugazione nel reticolo endoplasmatico, su glicosilazioni e biosintesi di glicoproteine nell’apparato del Golgi e in altri comparti intracellulari. L’inibizione dell’attività di enzimi digestivi delle cellule intestinali dell’orletto a spazzola e degli enzimi coinvolti nella degradazione del glicogeno intracellulare, ha una potenziale applicazione nella regolazione del metabolismo dei carboidrati. In questo caso gli obiettivi terapeutici sarebbero principalmente coinvolti nell’assorbimento e metabolismo dei carboidrati alimentari con un impatto rilevante nella cura del diabete, una delle patologia che, nelle società maggiormente sviluppate, ha raggiunto dimensioni di malattia

“sociale”.

- Inibitori delle glicosiltransferasi, enzimi responsabili delle principali reazioni biosintetiche, nonché coinvolti nella formazione di glicoconiugati, inclusi i glicosfingolipidi. Per questo trovano applicazione nella glicosfingolipidosi, derivante dalla mancata degradazione di glicosfingolipidi nel compartimento lisosomiale di molti tessuti, tra cui quello cerebrale.

- Accompagnatori farmacologici, capaci di mantenere le glicosidasi e altre proteine nella loro conformazione attiva durante la biosintesi, legandosi al loro sito attivo.

Questo tipo di attività è stata individuata, ad esempio, per glicosidasi lisosomiali e proteine di membrana, come la proteina transmembrana mutata in caso di fibrosi cistica (proteina CFTR).

- Agenti interferenti con le “zattere lipidiche” (lipid rafts): alterando i numerosi domini in cui sono presenti glicani (es. recettore dell’insulina) e/o proteine di trasporto di membrana. Possono anche modificare la composizione delle “lipid rafts”

limitando la biosintesi dei glicosfingolipidi.

Negli ultimi anni due derivati della DNJ sono stati approvati e commercializzati come

farmaci.

Il primo è il miglitolo (1-desossi-N-etanol-DNJ) costituente della specialità Glyset

,

utilizzata in terapia per il diabete mellito di tipo II, capace di inibire l’attività delle -

glucosidasi intestinali, impedendo così la digestione dei carboidrati e il loro conseguente assorbimento. Il secondo è l’N-butil-1-desossinojirimicina (NB-DNJ, 3), noto anche come miglustat (Zavesca

), un farmaco ad oggi utilizzato come agente terapeutico per la malattia di Gaucher. Questa molecola è entrata in terapia solo dopo un lungo viaggio fallimentare che la proponeva prima come agente antidiabetico, poi come promettente antivirale. Più di recente, la scoperta della capacità di superare la barriera ematoencefalica da parte di NB-DNJ, ha aperto nuovi orizzonti per quanto riguarda il trattamento di malattie di tipo neurodegenerativo, che ancora oggi sono prive di terapia farmacologica.

Figura 3

N OH O

H HO

OH 3

A partire dal 1995, inoltre, è stata massa in evidenza anche un’apprezzabile attività immunoregolatoria

degli imminozuccheri, e più precisamente è stata rilevata la loro natura di tipo inibitorio sulla produzione di alcune citochine che giocano un ruolo importante nella risposta infiammatoria e immunitaria, come la IL-4, una citochina glicoproteica secreta principalmente dalle cellule Th2 attivate, dai mastociti e dalle cellule Natural Killer (NK).

I meccanismi di interazione tra questi composti ed il sistema immunitario non sono, tuttavia, conosciuti, tanto più che studi recenti hanno dimostrato l’esistenza di imminozuccheri strutturalmente analoghi tra loro che presentano un’attività sia immunosopprimente che immunostimolante nei confronti di alcuni mediatori della risposta immunitaria.

E’ questo il caso della produzione dell’interferone-γ (IFN-γ),

un’importante citochina secreta da linfociti, promotrice della risposta immunitaria e della produzione di cellule del sistema immunitario acquisito. IFN-γ svolge un ruolo importantissimo nella difesa dell’organismo da infezioni batteriche e mostra anche una spiccata attività antitumorale.

Nei confronti di questa citochina gli imminozuccheri 4 e 5 (Figura 4), hanno mostrato un’importante attività di tipo soppressorio, tanto che la minor tossicità rispetto alla ciclosporina A, li rendeva terapeuticamente interessanti come molecole immunosoppressive migliori di quelle finora conosciute.

Studi molto recenti da parte dello stesso Gruppo di ricerca

hanno portato alla sintesi dei

composti 6 e 7 (Figura 4), da cui, per semplice condensazione del gruppo amminico terminale

con acidi carbossilici di diversa natura, è stata ottenuta una libreria di ammidi a struttura

imminosaccaridica, tra cui, in maniera del tutto inattesa, quelle corrispondenti alle strutture 8

e 9 hanno mostrato una marcata attività immunostimolante, tanto da essere state proposte e testate come potenziali agenti antibatterici.

Figura 4

R1 NH

R2 OH

O H

OH OH

R1 NH

R2 OH

O H

OH NH₂

O O

N H NH

O H

OH

O H

OH NO₂

O N H NH

O H

OH

O H

OH

OH 4: R₁=H, R₂= CH₂OH

5: R₁=CH₂OH, R₂=H

6: R₁=H, R₂= CH₂OH 7: R₁=CH₂OH, R₂=H

8 9

1.2 . - Le cellule Natural Killer (NK) e loro attivatori carboidratici

Le cellule Natural Killer (NK) sono grossi linfociti granulari, con caratteristica morfologia, a cui sono state attribuite molteplici funzioni effettrici del sistema immunitario, tra cui la produzione di citochine, la regolazione dell’ematopoiesi e la lisi di cellule virali e tumorali (Figura 5).

Nonostante molti meccanismi citolitici di queste cellule siano analoghi a quelli dei linfociti T-citotossici, la natura dei recettori responsabili della loro attivazione e della promozione della cascata di eventi che porta alla lisi degli agenti patogeni, resta ancora oggi un argomento controverso. Negli anni sono stati evidenziati siti recettoriali capaci di attivare le cellule NK, come il CD2 e il CD16, la cui presenza però non è risultata essenziale, in quanto questi linfociti anche in assenza dei suddetti recettori si sono mostrati sempre capaci di esplicare la loro citotossicità spontaneamente.

Figura 5

Studi successivi hanno portato alla scoperta di una serie di proteine integrali di membrana di tipo II, espresse prevalentemente nelle cellule NK, che contengono ciascuna una porzione lectino-simile di tipo C (Calcio dipendenti), identificate inizialmente nei recettori NKR-P1, in cellule di ratto, e successivamente nei recettori CD69 linfocitari umani.

Successive osservazioni hanno evidenziato, nelle cellule NK, che: a) l’introduzione del recettore CD69 determina la comparsa della loro capacità litica, b) la stimolazione delle proteine NKR-P1 svolge un ruolo fondamentale nei processi di degradazione di cellule tumorali, c) entrambe le specie recettoriali vengono attivate da carboidrati.

Questi risultati hanno suscitato un grande interesse nella ricerca di possibili agonisti a struttura carboidratica che potessero andare a stimolare selettivamente l’attività immunologica di questi elementi chiave nel sistema immunitario.

1.3. - Le N-acetil esosammine come agonisti delle cellule NK

La ricerca glicobiologica molto spesso è indirizzata verso la progettazione e la sintesi di molecole a struttura saccaridica non naturali in grado di influenzare le numerose funzioni cellulari così da modulare i processi biologici, allo scopo di chiarire anche i meccanismi d’azione dei complessi sistemi di regolazione biologica.

La correlazione delle conoscenze di biochimica, di chimica organica e di immunologia ha spinto i ricercatori verso la progettazione di nuovi composti di natura saccaridica a potenziale attività terapeutica come vaccini antibatterici, antivirali o immunostimolanti per i trattamenti antitumorali e per ottenere protocolli terapeutici che usino dosaggi molto bassi tali da ridurre al minimo gli effetti tossici collaterali.

Recenti studi condotti dal Prof. V. Křen

dell’Accademia Ceca delle Scienze (Praga)

hanno evidenziato che tra i ligandi capaci di attivare le NK attraverso interazioni specifiche

con il recettore proteico NKR-P1, un ruolo importante è ricoperto dai derivati delle quattro

più comuni N-acetil-

-esosammine (10-13). Tali amminozuccheri sono in genere componenti

di oligosaccaridi naturali coinvolti in molti processi biologici, come reazioni di sorveglianza

cellulare (identificazione ed eliminazione delle cellule infette e degenerate) e trasformazioni

di cellule tumorali. Ad esempio, ManNAc (13) è presente nelle capsule batteriche che

determinano la virulenza di alcuni ceppi di Streptococcus Pneumoniae, mentre GlcNAc (12),

oltre ad essere il costituente esclusivo del polisaccaride chitina, è presente sui glicoconiugati

di superfici e di matrici cellulari e, per questo, viene considerata un ipotetico ligando

fisiologico di recettori lectino-simili.

3,4

2,0 2,0 6,7

7,2 8,0

5,7 6,7

7,5 8,2

4,0 5,2

7,3 6,5

7,0 8,0 8,1

9,6

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

Glc Man

GlcN GlcNAc

GalNac ManNAc

TalNAc Me-b-TalNac

pNP-b-GlcNAc pNP-b-GalNAc

pN P-a-GlcNAc

pNP-a-GalNAc ManNAc-b-(1->4)Glc

TalNAc-b-(1->4)Glc GlcNAc-b-(1->4)GlcNAc

GalNAc-b-(1->4)GlcNAc GlcNAc-b-(1->4)ManNAc

GalNAc-b-(1->4)ManNAc

Figura 6

OH O O

H

OH OH

NHAc

OH O O

H

OH OHNHAc

O H

O O

H

OH OH

NHAc

O

H O

O H

OH OH

NHAc D-Galattosamina (GalNAc) D-Talosamina (TalNAc)

D-Glucosamina (GlcNAc) D-Mannosamina (ManNAc)

10 11

12 13

La ricerca di potenziali attivatori delle cellule NK è stata condotta da Křen e coll.

in esperimenti effettuati con cellule NK di ratti, sintetizzando e testando diversi glicidi mono-, di- e oligosaccaridici, glicosidi portanti agliconi aromatici, glicoconiugati polivalenti e dendroni marcati con sostanze fluorescenti che espongono sulle loro superfici le strutture saccaridiche più attive. I risultati ottenuti, raccolti nella Figura 7 dove è riportato il –logIC

dei mono- e disaccaridi saggiati, hanno permesso di effettuare delle valutazioni sia sul rapporto struttura-attività che sui meccanismi d’azione a livello cellulare e sub-cellulare.

Figura 7

- logIC

Requisito strutturale essenziale per l’attività di stimolazione delle NK è la presenza di

un gruppo acetammidico in posizione 2 del carboidrato: tutte le N-acetil-

-esosammine sono

più attive sia degli analoghi ossigenati, come il

-glucosio (Glc) ed il

-mannosio (Man), sia delle ammine libere, come la

-glucosammina (GlcN). Tutte le N-acetilesosammine deprotette al C-1 (10-13) mostrano una buona affinità con il recettore proteico NKR-P1, con un livello di attività influenzato dalla serie stereochimica, che varia nell’ordine:

ManNAc>GalNAc>GlcNAc>>TalNAc. La bassa affinità della N-acetil-

-talosamina (11) è attribuita al fatto che essa è presente, in H

O, prevalentemente in forma furanosica a differenza delle altre, per le quali prevale largamente quella piranosica. Questa ipotesi è stata più recentemente confermata dal valore di attività del corrispondente metil β-glicopiranoside (Me-β-TalNAc), appositamente sintetizzato nel nostro Laboratorio di Pisa,

che risulta paragonabile a quella di GlcNAc (12). L’insieme di questi risultati indica quindi, che sia la struttura esopiranosica sia la stereochimica al C-2 e al C-4 sono importanti nell’attività di ligando per il recettore NKR-P1. Anche la natura del legame glicosidico e il tipo di aglicone influiscono in maniera sensibile sulle capacità agoniste verso i recettori delle cellule NK. Nel caso dei p-nitrofenil glicosidi, tutti più attivi degli analoghi metilici, gli anomeri più attivi sono quelli a configurazione β (14β β β β e 15β β β) (Figura 8) che hanno un’attività superiore di ben β tre ordini di grandezza rispetto agli α-anomeri (14α α α α e 15α α α) e di circa un ordine di grandezza α rispetto alle corrispondenti esosamine libere (10 e 12).

Figura 8

OH O OH

NHAcX O

H HO

O OH

NHAc X O

H

O NO₂

14αααα: e 14 βββ β

X=

15ααα: e 15 βα βββ

Sulla base di queste valutazioni è stato ipotizzato che il p-nitrofenil β-

-ManNAc (pNP- ManNAc), epimero al C-2 di 15β β β β, fosse il monosaccaride più attivo come agonista del recettore NKR-P1 delle NK di ratto, ed è stata dimostrata la validità di questa ipotesi verificandone l’azione immunostimolante, che è risultata in grado di ridurre le masse tumorali in alcuni tipi di tumori maligni indotti sperimentalmente in ratti, quali il carcinoma del colon e i melanomi.

Altra caratteristica strutturale indispensabile per manifestare una buona attività

agonistica è la presenza in posizione 6 di gruppi in grado dare legami ad idrogeno (OH,

COOH, ecc.), mentre gli analoghi desossigenati al C-6 risultano essere inattivi. Passando alle

strutture di- e oligosaccaridiche, è stato dimostrato che il tipo di giunzione necessario per

esprimere l’attività agonistica è quello β-1→4 glicosidico. Lo studio del dimero (Figura 9) e

degli oligomeri di GlcNAc a giunzione β-1→4, che sono gli unici accessibili sinteticamente senza difficoltà insormontabili, ha messo in luce un andamento inaspettato. Passando da GlcNAc (12) al dimero, il chitobiosio (16), si ha un aumento dell’attività sul recettore NKR- P1 con variazione del –logIC

da 6.7 a 7.0. Testando, invece, gli oligomeri dal trimero al nonamero [β-(1→4)-GlcNAc]

(n=3/9), si osserva un incremento dell’attività fino al tetrasaccaride (n=4) oltre il quale l’IC

diminuisce, dimostrando che per l’attivazione del recettore NKR-P1 è importante anche il numero delle unità monosaccaridiche.

Figura 9

O

H O

O

H O

O O H

OH

OH OH

NHAc AcHN

O H

O OH

NH S

NH CH₂ NH N

O H OH

O H

O

H S

O H

NHAc

(GlcNAc-ββββ-(1->4)GlcNAc) NHAc 16

17

( )₈

Un risultato molto interessante

è stato ottenuto dallo studio dei cosiddetti glicodendrimeri, strutture oligosaccaridiche di recente introduzione, in cui le singole unità monosaccaridiche, dotate di un gruppo funzionale generalmente locato sull’aglicone anomerico, sono legate ad una matrice polifunzionale mediante legami covalenti, ad esempio di tipo tioureidico, come in 17 (Figura 9).

L’inserzione di una catena tra le unità monosaccaridiche induce una maggiore flessibilità strutturale, che determina un sensibile aumento dell’affinità recettoriale. Nel caso di 17 il valore di -logIC

risulta di 8.5, un valore decisamente superiore a quello del dimero 16, in cui le stesse due unità di GlcNAc sono direttamente connesse. Questo importante effetto, definito genericamente come effetto “multivalenza”, ha aperto la strada ad un capitolo nuovo della glicobiologia ed è oggetto di studio anche nel Laboratorio dove è stata svolta questa Tesi.

Figura 10

OH O O

H O

O O

H OH

OH OH

NHAc

NHAc OH

O O

H O

O O H

OH

OH OH

NHAc NHAc O

H O

O

H O

O O H

OH

OH OH

NHAc NHAc

O

H O

O

H O

O O H

O

H OH

OH OH

NHAc OH

O O

H O

O O H

O

H OH

OH OH

NHAc (GalNAc-βββ-(1->4)GlcNAc)β

19

(GalNAc-βββ-(1->4)ManNAc)β 20

(GlcNAc-ββββ-(1->4)ManNAc) 18

(ManNAc-ββββ-(1->4)-Glc) 21

(TalNAc-ββββ-(1->4)-Glc) 22

Altri studi su disaccaridi derivanti dalla combinazione di GlcNAc, GalNAc e

ManNAc, come i tre disaccaridi 18-20 (Figura 10) hanno evidenziato in tutti i casi forti

attività agonistiche delle NK, con il valore più alto (-logIC

di 9.6) per la sequenza GalNAc-

β-(1→4)ManNAc (20). Un elevata attività agonistica, anche se di circa un ordine di

grandezza inferiore a quella di 20, è stata trovata anche nel caso dei disaccaridi 21 e 22,

sintetizzati nel nostro Laboratorio, che presentano il

-glucosio come unità riducente.

E’ da

notare che 21 è il primo esempio di un disaccaride in cui l’unità dell’esosammina più attiva

sulle NK (ManNAc) si trova in posizione non riducente, suggerendo ulteriori ricerche per

accedere a disaccaridi in cui l’unità ManNAc sia legata con giunzione β-(1→4) ad un’altra

unità esosamminica.

1.4. - Azadisaccaridi, potenziali agonisti del recettore NKR-P1

Dai dati ottenuti sugli studi di relazione fra la struttura di mono-, di-, e oligosaccaridi e la loro attività come agonisti dei recettori delle cellule NK, un ruolo determinante è attribuito alla presenza di esosammine, eventualmente in forma di β-glicosidi con agliconi semplici o di di- e oligosaccaridi a giunzione β-(1→4).

A queste linee guida si sono aggiunte due ulteriori aspetti riguardanti gli imminozuccheri.

La prima è quella descritta nella Sezione 1.1 a proposito della recente attribuzione di proprietà immunomodulanti a derivati della DNJ, la seconda, di tipo puramente strutturale, è in relazione al fatto che gli imminozuccheri, come ad esempio la nojirimicina (NJ, 23), in realtà altro non sono che una particolare tipologia di esosammine, in cui il gruppo amminico è in posizione 5 anzichè 2, come nella quasi totalità delle esosammine naturali. La diversa posizione del gruppo amminico è, quindi, la ragione per cui esso interagisce intramolecolarmente con il gruppo aldeidico determinando così la struttura azapiranosica (Figura 11).

Figura 11

NH O

H

OH O H

OH OH OH

O H

OH NH₂ CH₂OH CHO

23 (NJ)

Sulla base di queste considerazioni nel Laboratorio ove è stata svolta la Tesi, è stato avviato negli ultimi due anni un progetto in collaborazione con il Gruppo di ricerca del Prof.

Křen di Praga, avente come scopo la sintesi e la valutazione come agonisti dei recettori delle cellule NK dei mimici disaccaridici 24-27 in cui un’unità di DNJ risulta glicosilata in 4 attraverso un legame β glicosilico con le 4 più comuni esosammine.

Figura 12

NH O

O OHOH

O H

OH O H

O H NHAc

NH O

O OH O H

O H

OH O H

O H

NHAc O NH

O OH OH

O H

OH O H

O H

NHAc O NH O OH O H

O H

OH O H

O NHAc H

24 β−

β−

β−

β−TalNAc-(1 >4)-DNJ

25 β−

β−β−

β−ManNAc-(1 >4)-DNJ

26 β−β−β−

β−GlcNAc-(1 >4)-DNJ

27 β−β−

β−β−GalNAc-(1 >4)-DNJ

Oggetto della presente Tesi è stata la sintesi dei due azadisaccaridi 25 e 26, a struttura rispettivamente β-

-ManNAc-(1→4)-DNJ e β-

-GlcNAc-(1→4)-DNJ. Con il lavoro svolto nella Tesi è stata completata la sintesi di 25 e portata ad uno stadio molto avanzato quella di 26. Dal punto di vista della valutazione sulle cellule NK, è stato possibile raccogliere i risultati dell’attività di 25 e dell’analogo

-TalNAc-(1→4)-DNJ (24), di cui molto recentemente è stata messa a punto la sintesi.

E’ stato, inoltre, possibile stabilire il confronto delle proprietà agonistiche di 25 e del suo diastereoisomero 24 sui recettori NKR-P1 (ratto) e CD69 (umane) con quelle dei due disaccaridi 21 e 22 che, al posto della DNJ, avevano un’unità di

-glucosio.

Prima di affrontare la discussione dei risultati ottenuti nel lavoro di Tesi, verrà

presentata una breve rassegna dei metodi di sintesi della 1-desossinojirimicina.

2. - Approcci sintetici alla DNJ e suoi derivati

In questa Sezione verranno descritti prima i principali metodi riportati in letteratura per la sintesi di DNJ a partire da carboidrati comuni, e, di seguito, le più significative vie di accesso a mimici disaccaridici costituiti da DNJ glicosilata con diversi tipi di monosaccaridi.

2.1. - Sintesi della DNJ

La prima sintesi della 1-desossinojirimicina (DNJ, 1) a partire da un monosaccaride è stata descritta nel 1967 da Paulsen,

e da allora sono state pubblicate diverse metodiche che portano alla preparazione di tale composto.

Molte di queste si basano sulla correlazione strutturale che la

-nojirimicina (23) ha con il

-glucosio (28) e l’

-sorbosio (29), i quali presentano nella corretta configurazione tre dei quattro centri stereogenici di 23 (rispettivamente il C-2, C-3, C-4 per 28 e il C-3, C-4 e C-5 per 29, Schema 1).

Questo aspetto è di fondamentale importanza perchè, rispetto ad altri precursori monosaccaridici, 28 e 29 permettono di ridurre sensibilmente il numero di manipolazioni chimiche necessarie per la trasformazione dei prodotti di partenza nel target voluto. Partendo dal

-glucosio 28, i procedimenti chimici formalmente necessari, infatti, sarebbero riconducibili solamente ad una amminazione con formale ritenzione di configurazione al C-4 ad ottenere 28a, forma aperta della NJ, che per disidratazione e riduzione dell’immina intermedia porta a 1. Partendo, invece dall’

-sorbosio, basterebbe un’amminazione in posizione 6, seguita dallo step di amminazione riducente, che, in questo caso, sarebbe, però, lo step stereodeterminante.

E’, comunque, ovvio che questi approcci retrosintetici non possono essere effettuati sui monosaccaridi deprotetti, ma che parte rilevante del processo deve essere legata alla scelta di metodi capaci di selezionare e differenziare i gruppi su cui operare le manipolazioni.

Nel caso della sintesi proposta da Paulsen (Schema 2), l’intermedio 30, ottenibile dall’

-

sorbosio mediante acetonazione e tosilazione sugli ossidrili primari 1 e 6 dell’intermedio 2,3-

O-isopropiliden-α-furanosico, è sottoposto a sostituzione selettiva del gruppo tosilico sul C-6

con NaN

, attraverso una semplice reazione S

2.

Schema 1

OH N H OH O

H HO

OH O

H

OH O H

N H₂

CHO CH₂OH

O H

OH O H

O CH₂OH

CH₂NH₂

O H

OH O H

O H

CHO CH₂OH

O H

OH O H

O CH₂OH

CH₂OH N H

OH O

H HO

OH

28a 29a

23

D-glucosio (28) L-sorbosio (29)

1

Dopo riduzione dell’azide 31a e completa deprotezione si ottiene il 6-ammino-

-sorbosio (29a) come miscela di anomeri furanosici 31c, che sottoposti ad amminazione riducente portano alla DNJ (1) in resa complessiva del 13%.

Schema 2

O O O

OH TsO

OTs

O O O

OH N₃

OTs

O

N H₂

O O

OH OH

O

N H₂

OH

OH OH

OH N H

OH O

H HO

OH

NaN₃ 1) Pt, H₂ 2) Na/Hg

30 31a 31b

31c HCl

H₂

1

Nel 1968 Inouye e coll.

hanno proposto una via sintetica che prevede la preparazione

di 1 a partire da 32, ottenuto per semplice benzilazione dell’1,2:5,6-di-O-isopropilidene-

-

glucosio commerciale. Attraverso manipolazione dei gruppi protettivi, seguita da una

sequenza ossidazione-ossimazione-riduzione al C-5 si ottiene selettivamente l’ammina

protetta 32c (Schema 3). La rimozione dei gruppi protettivi di 32c, con conseguente

esposizione della funzione aldeidica, porta alla formazione dell’azapiranosio 1 a

configurazione

-gluco, con resa complessiva del 22%.

Schema 3

O O O

O O OBn

N H OH

O H

OH HO

O O H

O O OBn TrO

O

O O OBn TrO HON

O N H₂

O O OBn TrO 1) H⁺ 1) DMSO, Ac₂O

2) NH₂OH

32

LiAlH₄

1) Li, NH₃ 2) resina H⁺ 3) H^-

1

32a 2) TrCl

32b

32c

Più recentemente Baxter e Reitz

hanno proposto l’uso di monosi 1,5-dicarbonilici come precursori di azapiranosi, attraverso un passaggio chiave che prevede una doppia amminazione riducente (Schema 4).

La sintesi del derivato 33c, forma N-protetta di 1, prevede l’uso del derivato 1,5- dicarbonilico 33b, preparabile da 33 per ossidazione selettiva al C-5 seguita da idrolisi acida delle protezioni acetaliche sul C-1 e C-2. Uno studio sistematico

sull’uso di diversi agenti riducenti capaci di realizzare la reazione di doppia amminazione riducente sia per via catalitica che per via chimica ha dimostrato che il sodio cianoboroidruro (NaBH

CN), utilizzato con benzidrilamina in metanolo, ha portato ai migliori risultati in termini di stereoselettività e resa chimica fornendo direttamente la N-benzidril-DNJ (33c) in resa del 74% da 33b.

Schema 4

O O H

O H

O O OH

O O H

O

O O OH

OH

OH OH OH

O

CHO N

OH O

H O H

OH 1) (Bu₃Sn)₂O Resina H⁺

33 33a 33c

2) Br₂, CHCl₃

33b

H₂NCHPh₂ NaBH₃CN

Quest’ultimo approccio sintetico, coinvolgente aldosi 1,5-dicarbonilici come intermedi-

chiave, è quello cui è stato fatto riferimento per la preparazione dei derivati della DNJ

sintetizzati in questo lavoro di Tesi, per cui esso verrà descritto in modo dettagliato nella

Sezione 3.3.

2.2. - Preparazione di azadisaccaridi contenenti un’unità di DNJ

La scoperta di glucosidi naturali contenenti azazuccheri, come il glicoside della fagomina (34) isolato dai semi del legume Xanthocercis Zambesiaca (Figura 12),

ha spinto i ricercatori ad interessarsi alla preparazione di oligosaccaridi contenenti unità azapiranosiche come 1.

Figura 12

O OH

O

NH OH O H

OH O

H O H

34

In letteratura la preparazione di strutture azadisaccaridiche prevede reazioni di glicosidazione tra le due porzioni piranosiche, una saccaridica ed una azapiranosica.

Nell’esempio

riportato nello Schema 5, il glicosil accettore 36, che ha il gruppo OH-4 libero, va ad attaccare il carbonio anomerico opportunamente attivato del glicosil donatore 35.

Le reazioni di glicosidazione necessitano della protezione di tutte le funzioni ossidriliche sia di 35 che di 36, con l’ovvia eccezione del gruppo OH del glicosil accettore coinvolto nel coupling. Il procedimento complessivo comporta, perciò, sia una serie di manipolazioni di protezione e deprotezione dei gruppi ossidrilici sia di vari processi di purificazione che, accompagnati al basso stereocontrollo nella formazione del legame interglicosidico, portano spesso a basse rese.

Schema 5

O

Br AcO

AcO OAc

OAc

O H

N OBn

OTBDMS

BnO N

O H O H O O OH O H

O H

OH

OH

35 36 37 (resa 20%)

Reagenti: i: AgOTf, 4A, CH₂Cl₂, -78°C ii: Bu₄NF, THF; iii: MeONa-MeOH; iv: H₂, Pd/C al 10%.

i-iv

+

La sintesi enzimatica o chemo-enzimatica può spesso rappresentare un’interessante

alternativa alla sola sintesi chimica. Un azadisaccaride può essere ottenuto o per

condensazione enzimatica di un monosaccaride con un’unità azapiranosica, oppure per trans-

glicosidazione, operazioni che sono mediate da glicosidasi oppure da glicosiltransferasi,

enzimi a specificità di substrato e, talvolta, di tipo e stereochimica della giunzione.

Un esempio di letteratura è quello riportato nello Schema 6, dove la preparazione dell’azadisaccaride 40 si ottiene per trasferimento di un’unità di

-galattosio dal lattosio ad un’unità della 1-desossinojirimicina (1), ad opera di una β-galattosidasi.

Schema 6:

H N

OH O

H O H

OH OH

O OH

O

O OH

O OH H O H

OH O

H

OH O OH

O

N OH H

OH O

H

OH O

H

39 40 (resa 27%)

ββ

ββ-galattosidasi

L’utilizzo delle glicosidasi nella sintesi degli azadisaccaridi, seppur semplice perché basata su un singolo passaggio senza alcun processo preliminare di protezione o di attivazione del glicosil donatore, porta comunque a rese non elevate e bassa regio-selettività con la formazione di miscele di oligosaccaridi isomeri, dove il legame glicosidico coinvolge anche le posizioni 2, 3 e 6 di 1 con conseguente complicazione dei processi di purificazione e separazione dei vari prodotti non protetti.

Nel 2001 è stato proposto,

dal Gruppo pisano in cui è stata svolta questa Tesi, un innovativo approccio che elimina il problema della formazione del legame glicosidico partendo da un disaccaride naturale, in cui il legame interglicosidico risulta preformato nella giusta configurazione (Schema 7).

Schema 7

O

O O

(MeO)₂HC

O OBn

OBn

O O

O

O CMe₂ Me₂C

CMe₂

O O

N O H O H OBn

OBn OH

O H

OH Ph

O

O O

OH OBn

OBn

OH OH

O H

OH

OHC

43 i

Reagenti: i: Bn-NH₃⁺Cl^-, NaBH₃CN, MeOH, 60 °C, rese 55-65%

41 42

L’approccio al disaccaride

-Gal-(1→4)-DNJ (40) ha previsto l’utilizzo del lattosio (39)

come materiale di partenza. Un efficiente metodo di protezione per acetonazione seguita da

benzilazione porta, con resa elevata, dal lattosio al derivato completamente protetto 41, il

quale, per rimozione regioselettiva dei gruppi isopropilidenici in 5,6 e 3’,4’ seguita da

ossidazione con NBS mediata da acetali stannilidenici ed idrolisi acida finale, fornisce il

derivato

-xilo-aldoesos-5-ulosico β-galattosidato 42. La reazione di doppia amminazione

riducente intramolecolare porta, infine, al mimico disaccaridico parzialmente protetto 43, da

cui per debenzilazione catalitica si ottiene β-Gal-(1→4)-DNJ (40).

Questo tipo di approccio è stato, poi, applicato da Stutz e Steiner

alla sintesi di 44 e 45 (Figura 13), ottenuti rispettivamente a partire da cellobiosio e maltosio, i due disaccaridi semisintetici commerciali, accessibili in grandi quantità a partire da cellulosa e amido.

Figura 13

HN OH

OH O

H O O OH O H

O H

OH OHNH

OH O

H O O OH O H

O

H OH

44 45

La sintesi di 44 (Schema 8) prevede la conversione del cellobiosio nel corrispondente metil-β-cellobioside opportunamente protetto in 4΄,6΄ con un gruppo benzilidenico 46. Tale precursore viene poi trattato secondo le condizioni previste da Garegg così da ottenere il 6- desossi-6-iodio-

-cellobiosio 47, dal quale per-O-acetilazione e trattamento con AgF in piridina si ottiene il 6-desossi-es-5-enopiranoside 48. L’epossidazione in ambiente umido di 48 porta, attraverso un α-epossietere intermedio che spontaneamente subisce scissione con H

O, al derivato 1,5-dicarbonilico β-glucosidato in 4 49, come una miscela di tautomeri ciclici, che sottoposto ad amminociclizzazione e deprotezione completa, fornisce infine, il derivato β-Glc-(1→4)-DNJ (44).

Schema 8

O OH

OH O

H O O O

O O H

OH Ph

OMe O

I

OH O

H O O O

O O H

OH Ph

OMe

O O

O O O Ph

OMe OAc OAc AcO

O AcO H

OH O

OH O

O OH O

H O O

Ph O

46 47

48 44

49

Più recentemente, un approccio analogo è stato utilizzato per la sintesi di β-

-TalNAc-

(1→4)-DNJ,

esempio di azadisaccaridi in cui DNJ è glicosilata con un’esosammina che ha

costituito il primo obiettivo raggiunto nel progetto generale di sintesi della famiglia di

azadisaccaridi riportati in Figura 12 (pag 10) in cui questa Tesi è inserita.

1. Introduzione ... 1

1.1. - L’uso di imminozuccheri in terapia medica ... 1

1.2 . - Le cellule Natural Killer (NK) e loro attivatori carboidratici ... 4

1.3. - Le N-acetil esosammine come agonisti delle cellule NK ... 5

1.4. - Azadisaccaridi, potenziali agonisti del recettore NKR-P1 ... 10

2. - Approcci sintetici alla DNJ e suoi derivati ... 12

2.1. - Sintesi della DNJ ... 12

2.2. - Preparazione di azadisaccaridi contenenti un’unità di DNJ ... 15

1

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