Esami di laboratorio effettuati

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Animali

Sono stati presi in esame 50 cani naturalmente infetti da Leishmania infantum provenienti da diverse province della regione Toscana e con almeno un segno clinico riferibile alla infezione. Si è trattato di soggetti con età e sesso differente e appartenenti a diverse razze (tab. 4.1). I soggetti sono stati distribuiti in 3 gruppi omegenei, in base al trattamento effettuato:

Gruppo A: Miltefosine –allopurinolo

Gruppo B: Difloxacin- metronidazolo

Gruppo C: AnM-allopurinolo

Criteri di inclusione:

• IFAT: ≥1:80

• 1 o più sintomi dell’ infezione (alopecia,linfonodi ingrossati,forfora, onicogrifosi… in base ad una scala di gravità)

• Pcr sul sangue/Ln/congiuntiva

Criteri di esclusione:

• senza consenso informato del proprietario

• in gravidanza

• in lattazione

• in terapia di emergenza

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Parametri Gr. A (n=18) Gr. B (n=14) Gr. C (n=18) p*

Età (anni, m±std) 6±3.44 5.8±3.02 6.3±3.56 0.79 Peso (Kg, m±std) 18.3±9.33 19.6±8.76 17.99±7.95 0.45 Maschio N (%) 12 (66.7) 10 (71.4) 11 (61.1) 0.88 Femmina N (%) 6 (33.6) 4 (28.6) 7 (38.9) 0.84

Tab.4.1.Soggetti esaminati. I valori indicano una popolazione omogenea a Giorno 0.

* t-test: comparazione tra i tre gruppi. Differenze non statisticamente significative (P>0.05)

Stadiazione e punteggio clinico

I cani sono stati osservati per un periodo di 24 mesi. Durante la visita a giorno 0 i casi sospetti di lesihmaniosi sono stati selezionati e stadiati secondo le linee guida (G.S.L.C., 2008) (Tab 4.2). Inoltre è stato assegnato ad ognuno di loro un punteggio per ogni sintomo (Tab. 4.3) utile per dare in seguito un valore oggettivo del miglioramento clinico del soggetto (Tab 4.4).

Stadio Gr. A (n=18) Gr. B (n=14) Gr. C (n=18)

A (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) B (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) C (%) 15 (83.3) 11(78.6) 14 (77.8) D (%) 3 (16.7) 3 (21.4) 4 (22.2) E (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Totale 18 14 18

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Tab. 4.2. Stadiazione clinica dei soggetti esaminati. Legenda: Stadio A: esposto; Stadio B:

infetto; Stadio C: malato; Stadio D: malato con quadro clinico grave; Stadio E: refrattario, recidivo.

Punteggio Parametri clinici

0, 1, 2, 3 DIM, CUT, LN, MUC, ONG EP, ATM, DIS

Tab. 4.3: Segni clinici Legenda: DIM: dimagrimento; CUT: lesioni cutanee; LN: linfoadenopatia;

MUC:pallore delle mucose; ONG: onicogrifosi; EP:epistassi; ATM: atrofia muscolare, DIS:

disidratazione.

Gr. A (n=18) Gr. B (n=14) Gr. C (n=18) P*

Punteggio

Clinico (Kg, m±std) 10.7±3.93 9.07±4.34 11.3±4.95 0.98

Tab. 4.4 Medie del Punteggio clinico a giorno 0. * t-test: comparazione tra i tre gruppi. Differenze non statisticamente significative (P>0.05)

Durante il periodo estivo coincidente con la stagione del plebotomo, vettore principale di L. infantum nella nostra zona, i soggetti reclutati hanno seguito delle misure di profilassi contro il vettore, rappresentate principalmente da collari a base di deltametrina (Scalibor®) o spot on con imidaclopride e permetrina (Advantix®), oltre al fatto di far dormire gli animali in luoghi chiusi o provvisti di zanzariere a maglia stretta visto l’attività notturna del vettore. In questo modo si è cercato di evitare o perlomeno ridurre la possibilità di reinfezioni.

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Le seguenti tabelle riassumono i soggetti arruolati nei 3 gruppi:

GRUPPO A

Cane Razza Età

(anni)

Sesso Segni clinici Stadio

1 Meticcio 3 f DIM, CUT, LN, PM, CR C

2 Segugio italiano 9 f DIM, ATM, CR C

3 Meticcio 6 m DIM,CUT,LN,PM, ATM, DIS D

4 Meticcio 5 m DIM, CUT, LN, DART, PM D

5 Boxer 5 m CUT, LN, EP C

6 Boxer 2,5 m CUT, LN C

7 Briquet griffon 3 m LN, PM C

8 Meticcio 5,5 m DIM, CUT,LN, ATM,

EP,DART,PM,ONG

D

9 Meticcio 2,5 f LN, DART C

10 Meticcio 13 m DIM, CUT C

11 Welsh corgi 8 m LN C

12 Carlino 7 m CUT, LN,PM C

13 Bracco Tedesco 12 m DIM, LN C

14 Meticcio 3 f LN C

15 Corso 2 m DIM,LN,CUT C

16 Dalmata 8 f DIM, CUT C

17 Meticcio 6 m LN C

18 Meticcio 4 f DIM, PM C

Legenda: DIM dimagrimento, CUT: lesioni cutanee; LN: linfadenomegalia; PM: pallore delle mucose; ONG: onicogrifosi, EP: epistassi; ATM: atrofia muscolare; DART: dolorabilità articolare;

DIS: disidratazione, CR: calo di rendimento a caccia.

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Gruppo B

(anni)

1 Meticcio 3 m DIM, CUT, LN, C

2 Pitt Bull 5 m DIM, CUT, LN C

3 Meticcio 10 m DIM, CUT,PM C

4 Meticcio 4 f DIM, LN, C

5 Meticcio 4 f DIM, CONG, LN C

6 Meticcio 10 m DIM, CUT, LN, DIS, ATM D

7 Meticcio 5 m DIM, LN, CUT C

8 Segugio 5 m DIM, CUT,LN C

9 Meticcio 1 f DIM, PM C

10 P. Maremmano 1 m DIM, LN, CUT, PM, CONG, ONG

D

11 Meticcio 4 m DIM, LN, CUT C

12 Shnauzer Gigante

10 m DIM, LN, DIS C

13 Meticcio 7 f DIM, LN C

14 Setter Inglese 13 m DIM, LN, CUT, CONG, ONG D

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Gruppo C

(di controllo)

(anni)

1 Petit Gascon 5 f DIM, LN C

2 Setter inglese 4 f DIM, LN, CUT C

3 Lagotto 7 f DIM, CUT, LN C

4 Segugio Italiano 4 m DIM, DIS; CUT, LN, PM;CR

D

5 Espagneul Breton 5 m CUT, LN C

6 Meticcio 2,5 m CUT, LN, DIM, ATM D

7 Segugio Italiano 8 f LN, PM C

8 Meticcio 5,5 m DIM, CUT, LN, ATM,

DART,PM

D

9 Meticcio 2,5 f LN, DART C

10 Meticcio 13 m DIM, CUT C

12 Segugio Italiano 7 m CUT, LN,PM C

13 Bracco Tedesco 12 m DIM, LN C

15 Corso 2 m DIM,LN,CUT C

16 Pointer 5 m DIM, CUT, CR C

17 Setter Inglese 8 f LN, DIS, PM, CR C

18 Border Collie 8 f DIM, CUT, PM C

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Esami di laboratorio effettuati

Gli animali sono stati sottoposti a :

• emogramma e formula leucocitaria su un campione di sangue raccolto in EDTA (Contaglobuli Hemacomp, SEAC, FI)

• funzionalità epatica (got, gpt, γgt, proteine tot.), (metodo cinetico ottimizzato secondo l’IFCC con LDH, SEAC, FI)

• funzionalità renale (urea e creatinina), (metodo cinetico colorimetrico di Jaffé modificato, SEAC, FI)

• esame delle urine

• sieroelettroforesi effettuata su siero mediante Microtech 648 R (INTERLAB, Roma)

• IFAT

• Pcr /ln/sangue/congiuntiva

• Real time Pcr su linfonodo e sangue a giorno 0, 180, 720.

L’IFAT è stata eseguita come precedentemente descritto (Mancianti & Meciani, 1988), con titolo-soglia pari a 1/80.

In breve: i promastigoti di coltura sono stati posti su appositi vetrini, lasciati asciugare e fissati in acetone puro per 10’, quindi passati per 5’ in soluzione tampone PBS a pH 7,2. I sieri sono stati diluiti per raddoppio in base 10, con soglia di positività a 1/40, posti sui vetrini, incubati in camera umida per 30’ a 37 °C. Dopo lavaggio con PBS a pH 7,2, è stata aggiunta l’antiglobulina marcata con isotiocianato di fluorescina. Dopo un’ulteriore incubazione a 37 °C ed altri lavaggi, i vetrini sono stati montati con copri-oggetto in glicerina tamponata a pH 7,2 ed osservati al microscopio a fluorescenza.

La PCR è stata effettuata su sangue, linfonodo e congiuntiva. Il DNA è stato estratto con un kit commerciale (Winzard Genomic, DNA purification kit, Promega).

E’ stata quindi allestita una PCR usando primers specifici per leishmania (13A e 13B). I primers disegnati amplificano una porzione di 116 pb che codifica per una

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regione costante del kintetoplasto in tutte le specie di leishmania (Rodgers et al.

,1990).

• Primer 13A: 5’GTGGGGGAGGGGCGTTCT3’

• Primer 13B: 5’ATTTTACACCAACCCCCAGTT3’

La miscela per ciascuna reazione era costituita da:

Master Mix Vol (µl) Master mix (Gotaq®, green master mix Promega) 12,5 H2O 9,5

Primer 13 A 1

Primer 13 B 1

DNA 1

Tot 25

Allo scopo di verificare l’attendibilità del campione in esame, è stato parallelamente allestito un sistema di controllo interno con un campione positivo e un bianco.

E’ stato allestito un controllo interno utilizzando primers specifici per il gene codificante la proteina GAPDH.

Determinazione del campione standard di riferimento

Promastigoti di Leishmania infantum (zymodema MON 1 isolato da un cane) sono stati coltivati su EMTM (Evan’s modified Tobie’s medium). La crescita è stata valutata tramite osservazione al microscopio. Il risultato è stato estrapolato facendo la media geometrica su tutti i campi microscopici osservati. I Parassiti sono stati lavati due volte PBS and portati in un volume finale di 1 ml. Lo standard è stato quindi preparato aggiungendo i promastigoti vivi a sangue di cane al fine di ottenere una concentrazione di 1,5 milioni (1,5M) di promastigoti in 1 ml sangue.

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La miscela per ciascuna reazione era costituita da:

Buffer (50 mM KCl + 50 mM NaCl) dNTP (200 mM ognuno)

MgCl2

(3.5 mM) Forward primer(13A) (10 pm) Reverse primer(13B) (10 pm) GAPDHf Mod (DNA cane) (1 pm) GAPDHr Mod (DNA cane) (1 pm) Taq (1 U) DNA (1 µl) H2O (13.75 µl)

Successivamente i campioni sono stati sottoposti all’azione di un termociclatore (Bio-Rad, Hercules, Calif.) utilizzando il seguente protocollo termico che consta essenzialmente di tre fasi che si susseguono in sequenza sempre uguale con una denaturazione iniziale a 94°C per 10 minuti (hot start). Seguono quindi 40 cicli uguali: 94°C per 30'' di denaturazione 64°C per 30''di annealing, 72°C per 30'' di estensione e 94°C denaturazione. Estensione finale di 5 minuti a 72°C). Aliquote di 22µl di DNA amplificato vengono infine caricate su gel di agarosio al 2,5%, contenente 15µl di Bromuro di etidio in buffer TAE 50X (Tris-EDTA-Acido Acetico) e sottoposte a migrazione elettroforetica (tensione 80 V, amperaggio variabile tra 100 e 200 mA, 30 min). La lettura dei campioni è stata eseguita tramite transilluminatore per confronto con le bande del controllo positivo (costituito da un campione di DNA proveniente dal sangue di un cane naturalmente infetto) , del controllo negativo (DNA estratto dal sangue di un cucciolo sano proveniente da zona indenne) e del marcatore di peso molecolare, (Ladder 100 bp), dopo aggiunta in ogni campione di 2µl di colorante (Blu di bromofenolo).

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La real time PCR (qPCR) è stata eseguita per poter quantificare la carica parassitaria dei soggetti trattati prima dell’inizio della terapia (G0) e dopo sei mesi e due anni di follow up.

L’estrazione da sangue, linfonodo ha seguito la solita procedura della pcr qualitativa, utilizzando però un kit di estrazione diverso (DNeasy Blood and Tissue kit, Qiagen^®, USA), poiché valutato come più sensibile, dopo aver effettuato delle prove in doppio su campioni di riferimento.

Una coppia di primer specifici (13A, 13B) è stata presa dalla regione costante del KDna di leishmania, con la formazione di un amplicone di 120bp.

Si è proceduto con una real time PCR con SYBR Green in quanto valutata rapida sensibile e facilmente riproducibile nel controllo delle infezioni da Leishmania infantum (Cavalcanti et al., 2009).

Il SYBR Green I è un composto organico aromatico (formula molecolare C₃₂H₃₇N₄S) facente parte del gruppo delle cianine asimmetriche, molecole dotate di attività fluorofora ed è utilizzato in biologia molecolare quale colorante di acidi nucleici.

Il complesso DNA-colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d'onda λmax = 488 nm ed emette luce verde λmax = 522 nm.

Questa molecola si lega al solco minore del DNA. La doppia elica è infatti una spirale destrorsa. Con l'avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi tra i diversi gruppi fosfato. Il solco maggiore è largo 22 Å, mentre il solco minore è largo 12 Å (Wing et al.,1990).

Dopo l’annealing dei primers si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza proporzionale all’aumento del numero di copie dell’amplicone (dsDNA).

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La reazione era così composta:

Master Mix Vol (µl) MESA GREEN (SYBR®, Eurogentec) 12,5 H2O 5 Primer 13 A 2.5 Primer 13 B 2.5 Templato 2.5 Tot 25

Il campione standard contenente 1,5 milioni promastigoti/ml è stato utilizzato per ottimizzare la reazione di real-time PCR. La soluzione di DNA ottenuta è stata diluita con una diluizione fattore 10 corrispondente a 1.5x10^-2 parassiti/ml.

Dopo alcune prove è stata trovata la miglior temperatura di annealing che riducesse al minimo la formazione di dimeri di primer.

Il profilo termico includeva un incubazione iniziale di 10 minuti a 95°C per denaturare il DNA e attivare la hot start Taq polimerasi. Susseguono 40 cicli di amplificazione (95°C per 15 secondi e 60°C per 1 minuto per singolo ciclo). Al termine dei 40 cicli è stata calcolata una curva di Melt che permette di valutar la specificità del prodotto amplificato per ogni singolo campione.

Al fine di effettuare una quantificazione assoluta del DNA si è proceduto alla costruzione di una retta di taratura impiegando campioni standard di L. infantum sopracitati a concentrazione nota (Grafico 4.1)

Il calcolo di DNA in campioni sconosciuti, si ottiene misurando la fluorescenza emessa al ciclo soglia (Ct) con l’ausilio dell’algoritmo descritto da Higuchi et al (1992). Il Ct rappresenta il ciclo o la frazione di ciclo a cui il segnale di fluorescenza raggiunge un arbitrario ma definito valore soglia nell’ambito della fase esponenziale precoce della reazione. I valori di Ct sono proporzionali al logaritmo i numero di copie del target iniziale

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Grafico 4.1: Curva di calibrazione

Trattamento

Gli animali hanno effettuato un trattamenti continuati per 30 giorni con le seguenti posologie:

Gruppo Farmaco utilizzato Dosaggio (mg/Kg) A Miltefosine (Milteforan^®)

Allopurinolo (Zyloric^®)

2 10 BID B Difloxacin (Dicural^®)

Metronidazolo (Flagyl^®)

5 25

C Antimoniato di N-

metilglucamina (Glucantime^®) Allopurinolo (Zyloric^®)

100 oppure 50 BID

10 BID

Dopo 1 anno di follow- up, tutti i soggetti del gruppo A e C hanno ripetuto un ciclo della stessa terapia, mentre solo 6/14 hanno potuto ripetere la terapia nel gruppo B in quanto non è stato più possibile reperire il farmaco in commercio.

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Follow up:

Al giorno 30-90-180-360-720 è stato effettuato un controllo dei seguenti parametri:

• EOG

• emogramma e formula leucocitaria

• funzionalità renale e funzionalità epatica

• sieroelettroforesi

• titolo anticorpale specifico (IFAT)

• Pcr su sangue puntato linfonodale e congiuntiva

• Real time pcr su puntato linfonodale e sangue al giorno 180 e 720