OTTIMIZZAZIONE DEL LEAD

OTTIMIZZAZIONE DEL LEAD

Scoperta del “ LEAD COMPOUND”

SCREENING:

• Estensivo

• Random

• HTS

• Intermedi e

sottoprodotti di sintesi

VALORIZZAZIONE DI INFORMAZIONI

BIOLOGICHE:

• Studio medicine indigene

• Studio effetti biologici

• Studio effetti secondari dei farmaci

• Scoperta fortuita da prodotti industriali

APPROCCIO RAZIONALE:

• Conoscenza eziologia della malattia

• Conoscenza target

• “computer-aided drug design”

FASE “ HIT-TO-LEAD ”

LEAD : un composto che fa da prototipo per una data struttura chimica che mostra attività e

selettività in uno screening rilevante dal punto di

vista biochimico o farmacologico. Di solito costituisce

la base per un processo di ottimizzazione e sviluppo,

allo scopo di identificare un composto candidato per

l’impiego clinico.

elevata affinità per il target (< 1 µM) possibilità di modificazione chimica

libertà da vincoli di proprietà intellettuale

mancanza di interferenza con gli enzimi P450 o con le proteine di trasporto della famiglia ABC

mancanza di legame all’ albumina del siero solubilità in acqua (> 100 µM)

stabilità

“ druglikeness”

capacità di permeare attraverso le membrane cellulari attività biologica significativa in un saggio cellulare

mancanza di citotossicità

selettività verso altri bersagli correlati

GENERAZIONE DI “ LEADS ”

Regola di Lipinsky (regola del 5):

peso molecolare < 500 cLogP < 5

gruppi donatori di legami H < 5 gruppi accettori di legami H < 10 legami ruotabili <10

Log P = log₁₀ del coefficiente di

ripartizione (P) tra fase organica (o) e fase

acquosa (a)

P = [F]_o/[F]_a

DRUGLIKENESS

APPROCCIO RAZIONALE

Basato sulla conoscenza:

1. delle alterazioni biochimico-metaboliche caratteristiche di determinate condizioni patologiche e responsabili, in taluni casi, della malattia e più frequentemente dei suoi sintomi più fastidiosi;

2. delle caratteristiche strutturali e/o funzionali di determinati target macromolecolari (enzimi, recettori, canali ionici, proteine trasportatrici);

3. della struttura chimica e delle funzioni biologiche dei ligandi fisiologici dei target sopracitati: agonisti, antagonisti, agonisti parziali ed inversi nel caso dei recettori; substrati, prodotti, attivatori ed inibitori nel caso di enzimi.

Contributi essenziali da parte di:

Biochimica, fisiologia, genetica, biologia molecolare, metodiche chimico- fisiche (N.M.R., E.P.R., spettrometria di massa, raggi X, scattering di neutroni), informatica.

ESEMPI:

A. Terapia sintomatica ma razionale del morbo di Parkinson.

I sintomi compaiono quando il contenuto di DOPAMINA nel corpo striato diventa il 20-40 % dei valori normali.

DOPAMINA

(mediatore endogeno)

non attraversa BBB

3,4 – DIIDROSSIFENILALANINA (L- DOPA) (precursore fisiologico della dopamina)

attraversa BBB

HO

HO NH₂

HO

HO NH₂

COOH

DOPA-decarbossilasi (DDC)

L - DOPA

(barriera emato encefalica)BBB

1 %

CERVELLO

DDC

DOPAMINA

SANGUE E TESSUTI PERIFERICI TRATTO GI

MAODDC

90% 9 %

COMTDDC

HO

HO NHNH₂

COOH CH₃

CARBIDOPA

inibitori DOPA-decarbossilasi

non attraversano BBB

NH HN

O

NH₂

OH

OH HO OH

BENSERAZIDE

B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina.

B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE).

Dettagli biochimici del sistema renina-angiotensina noti dai primi anni ‘60.

angiotensinogeno renina --->

angiotensina I (10 AA)

(inattiva)

angiotensina II (8 AA)

(vasocostrittore 40 volte più potente di nor-adrenalina:

stimola il rilascio di aldosterone)

chininogeno

<--- callicreina bradichinina (9 AA)

(potente vasodilatatore)

eptapeptide inattivo

<--- ACE --->

TEPROTIDE (9 AA)

primo inibitore noto di ACE ad attività antiipertensiva (1965) non biodisponibile per via orale

pyro-Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro-OH

O O^-

O O^-

ac. benzilsuccinico

inibitore carbossipeptidasi A

N R

O O

O^- S^-

N R

O O

O^- O

O^-

ipotesi di design di inibitori ACE

N COOH

O

O

OH

N-succinilprolina

(330 M)

N COOH

O

O

OH

H₃C H

N COOH

O

O

OH

H CH₃

(22 M)1 2

(1480 M)

N COOH

O SH

(0.20 M)3

N COOH

O SH

H₃C H

CAPTOPRIL

(0.023 M)

C. Scoperta di antagonisti selettivi del recettore istaminergico H

.

Antistaminici classici (mepiramina) non antagonizzano la secrezione acida gastrica da IST = nuova sottoclasse recettoriale (Black et al., 1964)

HN N

NH₂

ISTAMINA

ligando endogeno agonista puro

HN N

NH

NH NH₂

sintesi di oltre 200

composti correlati N^-GUANILISTAMINA

1° lead compound agonista parziale

n = 2-4; X = S, NH; Y = SCH₃, CH₃, NH₂ Tutti agonisti parziali

Requisiti per attività antagonista:

•anello imidazolico

•catena alchilica n = 2-4

•gruppo finale protonabile (funzionalità amidinica)

per leg. H bidentato con ossiacido

HN N

X

( )_n

Y NH

HN N

X

( )_n

Y NH

HN N

HN

S

NHCH₃

BURIMAMIDE

1° antagonista puro non biodisponibile per os

HN N

S

HN

S

NHCH₃ H₃C

METIAMIDE

10 vv più potente biodisponibile per os

tossicità dovuta a residuo di tiourea

HN N

S

HN

N-CN

NHCH₃ H₃C

CIMETIDINA

1° anti-H₂ approvato contro l’ulcera peptica (1976)

D. Computer-aided drug design

Si utilizza un modello 3D sperimentale o ipotetico del sito di binding del target molecolare sviluppando nuovi ligandi mediante:

- Ottimizzazione di ligando già noto

- Ricerca nei database di strutture 3D di composti con caratteristiche stereoelettroniche ottimali per l’interazione

- Progettazione “de novo” di ligandi specifici A. PROGETTAZIONE

DIRETTA DI LIGANDO BASATA SU

STRUTTURA 3D NOTA DEL SITO DI BINDING

B. PROGETTAZIONE INDIRETTA DI LIGANDO BASATA SU UN MODELLO 3D DEL SITO DI BINDING DEDOTTO DA ALTRI LIGANDI

A STRUTTURA 3D NOTA (AGONISTI O ANTAGONISTI)

LIGAND-BASED DRUG DESIGN STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN

STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN

• Isolamento e produzione su vasta scala di target (tecnologia: DNA ricombinante)

• Determinazione della sua struttura 3D attraverso:

cristallografia a raggi X tecniche NMR

scattering di neutroni

• Identificazione e caratterizzazione sito di binding sterica (DOCK)

elettrostatica (GRID)

• Determinazione della conformazione di binding di ligando noto

(AUTODOCK, MACROMODEL)

• Ricerca o design di nuovi ligandi

• Calcolo di energie di affinità (G) e costanti di

inibizione (Ki)

LIGAND-BASED DRUG DESIGN

•Impossibile isolare e/o produrre il target in quantità adeguate per risoluzione struttura 3D

•Unici dati disponibili = dati di serie più o meno ampie di agonisti e antagonisti

•Identificazione del farmacoforo o modello farmacoforico

•Mappatura del sito di binding, cioè deduzione del modello 3D dello stesso

•Ricerca e design di nuovi ligandi

•3D-QSAR (CoMFA)

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

E’ un fatto piuttosto raro che un lead,

qualunque sia la sua origine e una volta

determinata la sua struttura, non venga

ottimizzato, sia che lo scopo finale sia quello

di ottenere un farmaco che di perfezionare

un mezzo di indagine farmacologica.

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

Le principali ragioni per cui un lead viene modificato strutturalmente sono:

 Ottenere prodotti con proprietà farmacologiche migliori in termini di affinità, efficacia, specificità e ridurre, se

necessario, la tossicità e gli effetti secondari.

Variare le caratteristiche chimico-fisiche quali solubilità e stabilità chimica.

Ottimizzare le caratteristiche farmacocinetiche quali

biodisponibilità, stabilità metabolica, distribuzione, durata d’azione.

Rendere un prodotto brevettabile.

Rendere disponibile per sintesi un farmaco di origine naturale con struttura complessa.

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

L’insieme delle informazioni che si raccolgono durante gli studi di modificazione strutturale determina per ogni gruppo omogeneo di prodotti le cosiddette relazioni struttura-attività (SAR) che

permettono l’identificazione del farmacoforo e sono alla base di ulteriori manipolazioni molecolari.

Farmacoforo: minima unità strutturale di una molecola che, per la combinazione degli atomi e la disposizione spaziale dei gruppi funzionali che interagiscono con il recettore, è in grado di

produrre l’effetto biologico osservato.

I chimici hanno cercato nel corso dello sviluppo della Chimica Farmaceutica di ridurre al minimo le manipolazioni casuali della struttura (trial and error), individuando metologie e

procedimenti empirici che, anche se di affidabilità limitata, si sono dimostrati utili nello sviluppo di nuovi farmaci.

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

1. Principio di Isosteria e Bioisosteria 2. Semplificazione Molecolare

3. Complicazione Molecolare

4. Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

5. Modificazioni Molecolari di Peptidi

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

E’ una delle metodolgie più utilizzate nella modulazione molecolare. Si tratta di introdurre nella molecola di riferimento modificazioni tali che, pur variandone alcune caratteristiche strutturali e chimico-fisiche, rimanga intatta la capacità di riconoscere lo stesso oggetto biologico. Due molecole isosteriche devono avere, entro certi limiti, la stessa forma e lo stesso volume. La conseguenza è che spesso, malgrado le premesse che sono alla base dell’isosteria, le somiglianze di tipo biologico tra due isosteri sono più grandi rispetto a quelle di tipo elettronico e, in generale, chimico-fisico.

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

Ovviamente l'interazione può avvenire con conseguenze diverse da quelle del prodotto diriferimento: ad esempio non è infrequente il caso che in seguito ad una trasformazione isosterica un agonista si trasformi in antagonista e viceversa. E' questo il caso delle modificazioni isosteriche apportate alla molecola del baclofen, un agonista del recettore GABA-B, che hanno condotto sia ad agonisti che ad antagonisti dello stesso recettore.

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

Va subito detto che, per le caratteristiche empiriche del metodo, anche semplici modificazioni possono determinare una variazione nel tipo di bersaglio biologico individuato dalla molecola originale; per questo è sempre necessaria una verifica del meccanismo di azione qualora si osservino anomalie nell'attività biologica attesa. Inoltre, la sostituzione isosterica può determinare delle notevoli variazioni in altre proprietà quali la distribuzione elettronica, le distanze e gli angoli di legame (con conseguenze sulla affinità dell'isostere), la solubilità, il metabolismo, la farmacocinetica in generale. Il risultato di questo metodo può essere qualche volta imprevedibile come nel caso della sostituzione isosterica di un -O- con il gruppo -NH- nell'anestetico locale procaina. Si ottiene infatti un prodotto (procainamide) con azione anestetica locale irrilevante ma con una importante azione antiaritmica. Questo fatto è stato attribuito al netto calo di lipofilia che si ha passando dall'estere all'ammide che rende difficoltoso il raggiungimento del sito di azione (canale del sodio neuronale).

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

Tuttavia proprio le informazioni che si possono trarre dalle variazioni di attività biologica e di farmacocinetica in seguito a variazioni isosteriche possono essere essenziali per caratterizzare il modo di azione di un farmaco, particolarmente se si tratta di recettori.

Nell'esempio che segue la sostituzione isosterica dell'ossigeno etereo della muscarina (il prototipo degli agonisti muscarinici) con un atomo di zolfo e con un metilene ha permesso di valutare l'importanza sull'azione muscarinica del legame idrogeno coinvolto nell'interazione con il recettore, in funzione sia della distribuzione elettronica che del volume dell'atomo o gruppo di atomi inseriti.

Principio di Isosteria

Concetto base: introdurre nel lead compound modificazioni chimiche tali che, pur variandone alcune caratteristiche strutturali e chimico-fisiche, ne mantengano intatta la capacità di interagire con il target biologico.

Nuovo composto = profilo farmacologico complessivo migliore

1918, Langmuir:

isosteri due molecole che contengono lo stesso numero e disposizione di elettroni:

O^2-, F^-, Ne, Na⁺, Mg⁺², Al⁺³ MOLECOLE MONOATOMICHE

CO, N₂ MOLECOLE BIATOMICHE

CO₂, N₂O MOLECOLE TRIATOMICHE

ClO₄^-, SO₄^-2, PO₄^-3 MOLECOLE POLIATOMICHE

Principio di Isosteria

Un caso tipico è quello di CO₂ e N₂O, molecole che contengono entrambe tre atomi e 22 elettroni. Come appare dalla tabella, le loro proprietà chimico-fisiche sono sorprendentemente simili. Un aspetto interessante per lo sviluppo futuro del principio di isosteria fu che questi prodotti hanno anche lo stesso comportamento biologico su microrganismi come il Mixomiceta Physarum Policefalum.

Principio di Isosteria

Comunque, in questi termini, il concetto è molto poco utile al chimico farmaceutico, soprattutto per la sua rigidità. Da questo punto di vista la successiva elaborazione di Grimm (1925) rappresenta un notevole miglioramento in quanto mette a disposizione del chimico dei gruppi sostituenti, isosteri tra di loro, normalmente utilizzati nella manipolazione dei farmaci. Grimm ipotizzò che l'aggiunta di un atomo di idrogeno ad un atomo della riga precedente (per formare quello che egli chiamò uno pseudoatomo) non alterasse la isoelettronicità dell'atomo che segue. In tal modo egli costruì una tabella, detta dello spiazzamento degli idruri (hydride displacement) che qui è limitata agli elementi biologicamente interessanti, nella quale tutti i gruppi di una colonna sono considerati isosteri.

1925, Grimm (legge dello spostamento dell’idruro):

l’aggiunta di un idrogeno ad un atomo conferisce al’aggregato la proprietà dell’atomo successivo nella tavola periodica:

n° elettroni gruppi isosteri isoelettronici

7 N CH

8 O NH CH₂

9 F OH NH₂ CH₃

14 CH=CH N=N C=O

16 CH₂-CH₂ NH-NH S

36 42 44

O N

H

N NH

N O

N O

N N

N

N N

N N

S

N

S

N N

S

N S

1932, Erlemmeyer (ampliamento del concetto di isosteria):

Isosteri = atomi, ioni, gruppi funzionali o molecole che presentano la stessa configurazione elettronica ESTERNA

O S Se VI GRUPPO (6 elettroni nel guscio più esterno)

N P V GRUPPO (5 elettroni nel guscio più esterno)

C Si IV GRUPPO (4 elettroni nel guscio più esterno)

Inclusi anche gruppi funzionali con marcate analogie chimico-fisiche:

Cl, CN, SCN

Hinsberg (Equivalenti di anello):

Hinsberg dal canto suo, osservando la stretta somiglianza delle proprietà di benzene e tiofene propose l'equivalenza dei gruppi

-CH=CH- -S-

 introducendo il concetto di equivalenti di anello. In tal modo integrando tra di loro le diverse definizioni proposte, diventava possibile ammettere la isosteria di tutta una serie di eterocicli, una piccola selezione dei quali è mostrata di seguito.

Principio di Isosteria: Esempi

Un esempio illustrativo dell'uso del concetto di isosteria è nella modificazione apportata alla molecola della aminopirina, un efficace analgesico, che però produce un aumento dei casi di tumore per la sua trasformazione nel N-nitrosoderivato a livello intestinale. La sostituzione isosterica del gruppo dimetilamminico con il gruppo isopropilico, che non può subire tale trasformazione ma che evidentemente non altera la interazione con il bersaglio biologico, per dare il propifenazone ha condotto ad un farmaco di uso più sicuro.

Principio di Isosteria: Esempi

La sostituzione isosterica del carbonio con il silicio effettuata su di una serie di antagonisti muscarinici è stata motivata dalla intenzione di aumentare l'acidità del protone legato all'ossigeno, sulla base della ipotesi che il gruppo ossidrilico abbia un ruolo importante nella interazione con il recettore muscarinico.

Effettivamente i prodotti ottenuti sono dei potenti antagonisti, dotati anche di una certa selettività a livello dei recettori M₁, M₃. Purtroppo il prezzo pagato con questa sostituzione è stato quello di una ridotta stabilità sterica per cui i silicio-derivati non sono in genere stabili come singoli enantiomeri e racemizzano rapidamente.

Le variazioni isosteriche sono spesso utilizzate per modificare la selettività o la farmacocinetica di un farmaco. Nell'esempio che segue la sostituzione di un gruppo amminico con un metile ha permesso di eliminare la residua azione antibatterica di arilsulfaniluree ipoglicemizzanti, mentre la successiva sostituzione con un atomo di cloro ha reso più lungo il tempo di emivita di un prodotto altrimenti facilmente metabolizzato.

Principio di Isosteria: Esempi

Al contrario, la sostituzione isosterica di due gruppi etilenici nel decametonio con due gruppi O-C=O, facilmente e rapidamente idrolizzabili dalle acetilcolinesterasi ematiche, ha avuto lo scopo di rendere più breve la durata d’azione del farmaco originale, rendendone così più flessibile l’uso.

Principio di Isosteria: Esempi

La sostituzione isosterica di atomi o gruppi di atomi può essere estremamente utile per rendere chimicamente stabili prodotti biologici che hanno legami facilmente scindibili. Nell'esempio che segue la uridina si trasforma in un prodotto chimicamente più stabile per sostituzione isosterica dell'azoto in 5 dell'anello pirimidinico. Se la sostituzione isosterica si effettua sull'ossigeno dello zucchero si ottiene naturalmente lo stesso risultato come nel caso dell'isostere carbociclico della adenosina.

Principio di Isosteria: Esempi

Principio di Isosteria: Esempi

Analogamente la sostituzione di un legame ammidico con un doppio legame ha permesso di passare dalla indometacina al sulindac. In questo caso inoltre, la possibilità di separare i due isomeri geometrici ha contribuito a chiarire le modalità di interazione di questa serie di antinfiammatori con la cicloossigenasi.

La sostituzione isosterica di un legame peptidico è un caso particolare molto importante dal punto di vista pratico, vista la instabilità metabolica e gli altri problemi farmacocinetici di proteine e peptidi. Tale problema verrà trattato in seguito.

Principio di Isosteria: Esempi

Principio di Bioisosteria

Dalle ricerche degli anni successivi alla definizione del concetto di isosteria classico, si è potuto constatare che il numero degli elettroni periferici non costituiva una caratteristica essenziale e che il tipo di ibridazione condizionava molto di più la capacità di un gruppo di sostituirne opportunamente un altro. Si sono così identificati una serie di gruppi che non rientrano nella definizione originale, ma che per le caratteristiche steriche ed elettroniche possono essere definiti isosteri tra di loro.

Principio di Bioisosteria

Questi gruppi, alcuni dei quali sono indicati nella figura, sono stati chiamati isosteri non classici.

Principio di Bioisosteria

 Un esempio di questo tipo di isosteria è quello tra l'ossidrile della fenilefrina e il gruppo metansolfonarnmidico di un analogo che ha una azione del tutto equivalente. In questo caso la isosteria viene attribuita al fatto che i due idrogeni dei gruppi sostituenti in meta hanno acidità equivalenti.

Principio di Bioisosteria

1951, Friedman (da isosteria a bioisosteria):

bioisosteri = gruppi o molecole aventi almeno una analogia chimica o fisica, che producono effetti biologici spiccatamente simili

Il moltiplicarsi di queste situazioni ha infine spinto alla formulazione di un concetto più ampio di isosteria. Così Friedman (1951) ha proposto il termine di bioisosteri per quei gruppi che sostituiti al gruppo originale in una data molecola ne mantengono il tipo di attività; in altri termini mantengono intatta nella molecola la capacità di essere riconosciuta dallo stesso bersaglio biologico.

Principio di Bioisosteria

Un classico esempio di bioisosteria è quello tra estradiolo, un ormone estrogeno,e il dietilstilbestrolo, un ormonoide in grado di interagire con lo stesso recettore degli estrogeni. È chiaro in questo caso che la struttura dell'estrano è bioisosterica con quella del trans-stilbene. Questa bioisosteria è stata attribuita alla identica capacità dei due supporti lipofili di tenere i due ossidrili alla distanza necessaria per interagire con il recettore.

Questo esempio offre immediatamente la possibilità di mettere in evidenza alcuni inconvenienti del concetto di bioisosteria.

Principio di Bioisosteria

Innanzi tutto questa, almeno fino a qualche tempo fa, veniva verificata il più delle volte a posteriori. Ora, con l'utilizzazione di metodi teorici computerizzati, è spesso possibile prevedere la bioisosteria di gruppi che non sono isosteri classici. Inoltre, una volta determinata la bioisosteria di un gruppo, non è detto che essa valga in una situazione diversa. Per esempio non è detto che l'ingombro sterico e la lipofilia del gruppo stilbenico siano compatibili con un altro tipo di recettore, anche se la distanza richiesta tra i due gruppi interagenti dovesse essere la stessa. La inversione di un gruppo estereo produce in alcuni casi come quello di meperidina e trimeperidina, due analgesici narcotici, prodotti bioisosteri. Tuttavia analoghe inversioni su altri tipi di substrati non danno lo stesso risultato.

Principio di Bioisosteria

Nonostante queste limitazioni, il concetto di isosteria si è rivelato utilissimo ed è ampiamente utilizzato. L'uso di metodi teorici computerizzati spesso è in grado di rivelare le ragioni steriche ed elettroniche che rendono due gruppi bioisosteri.

Recentemente si sono cercati dei bioisosteri non idrolizzabili della funzione esterea della arecolina, un prodotto con interessanti proprietà muscariniche ma troppo labile per poter essere utilizzato come farmaco anti-Alzheimer. Si è visto che ossadiazoli e derivati ossimminici quali quelli mostrati in figura erano alcuni possibili bioisosteri con lo stesso effetto farmacologico e maggiore resistenza metabolica.

Principio di Bioisosteria

Lo studio delle mappe di potenziale elettrostatico molecolare di prodotti modello ha in effetti dimostrato che la distribuzione elettronica dei vari derivati è molto simile, come si può vedere dall'esempio riportato nella figura nella quale sono mostrate le mappe di potenziale dell'acetato di metile e del suo bioisostere 3,5-dimetil-l,2,4-ossadiazolo.

Principio di Bioisosteria

Nel corso di questi ultimi anni si sono identificati numerosi bioisosteri di gruppi importanti nell'interazione con i recettori che, con le cautele già menzionate, possono essere utilmente usati nella manipolazione isosterica di molti lead. Alcuni di questi bioisosteri sono riportati nella figura.

Semplificazione Molecolare

Soprattutto nel caso di lead di origine naturale che sono spesso di natura molto complessa, è frequentemente usato il metodo di dividere la molecola in frammenti più piccoli, considerando che la sua struttura è molto più complessa di quella necessaria per avere l’ azione biologica. In altre parole, con questo approccio si tenta di identificare il farmacoforo, cioè la porzione di molecola che è responsabile dell’ attività.

Semplificazione Molecolare

I motivi che inducono ad usare tale approccio sono:

Individuare una struttura chimica più semplice e più facilmente accessibile dal punto di vista sintetico che possa essere modificata con metodi sintetici non troppo complessi, per ottimizzarne l’attività.

Eliminare parti strutturali non necessarie che possono essere responsabili ad esempio di effetti collaterali o proprietà farmacologiche o farmacocinetiche non desiderate.

Semplificare la stereoisomeria per ridurre il numero degli isomeri prevedibili e di conseguenza semplificare sintesi, farmacocinetica e farmacologia del prodotto iniziale.

Questo è particolarmente importante nel caso degli enantiomeri, in quanto l’ottenimento di enantiomeri puri può essere un processo laborioso e costoso.

Semplificazione Molecolare

Il metodo però può presentare degli svantaggi:

Perdita di specificità d’azione. La semplificazione strutturale ha spesso come conseguenza un aumento della flessibilità molecolare che può permettere l’adattamento del farmacoforo ad un differente sito di interazione. Ad esempio, nel caso dei recettori, si può perdere per il sottotipo o per il tipo di recettore.

Alterazione profonda delle proprietà farmacocinetiche del prodotto originale, in particolare stabilità metabolica e distribuzione corporea.

Semplificazione Molecolare

L’influenza della strereoisomeria è in ogni caso critica e qualsiasi modificazione a questo livello va valutata con attenzione.

L’apertura di cicli è uno dei mezzi più usati per la semplificazione molecolare, ma la molecola può essere modificata in modo che i cicli vengano simulati da catene laterali mantenendo il,più possibile la somiglianza con il prodotto di riferimento (es. estradiolo-dietilstilbestrolo).

Semplificazione Molecolare (esempi)

Morfina: la spinta ad apportare modificazioni e semplificare la molecola è stata in questo caso la necessità di eliminare o di attenuare il fenomeno della tossicodipendenza legato all’uso di questo analgesico. Tale obiettivo non è stato però raggiunto anche se la molecola della morfina è stata semplificata enormemente ottenendo composti con elevata attività analgesica.

Semplificazione Molecolare (esempi)

La molecola della d-tubocurarina è invece servita come modello per progettare e sintetizzare numerosi derivati alifatici nei quali fossero presenti due atomi di azoto quaternario.Tra questi vi è il decametonio, che presenta i due gruppi cariche positivamente alla stessa distanza della d-tubocurarina (notare che in quest’ultima uno è un gruppo ammonico quaternario, l’altro un’ammina terziaria protonata a pH fisiologico). Tuttavia si è presto constatato che i due farmaci operano sulla placca muscolare motrice con due meccanismi diversi, probabilmente a causa della maggiore flessibilità della molecola del decametonio. Esso infatti agisce anche depolarizzando la membrana, mentre la d-tubocurarina agisce unicamente bloccando i recettori nicotinici di placca. Questo influenza i loro effetti tossici e il loro uso clinico.

Semplificazione Molecolare (esempi)

Un esempio di eliminazione di un centro chirale è riportato in una ricerca volta ad esaltare l’azione agonista muscarinica M₁ della minaprina (1). La modulazione molecolare del lead (minaprina) aveva condotto ad un prodotto potente (2), ma contenente uno stereocentro. Eliminando il centro chirale con la sintesi dell’analogo (3) non si ha perdita di attività agonista e si elimina il problema della preparazione dell’enantiomero puro (in questo caso la stereochimica non influenza l’attività biologica).

Semplificazione Molecolare (esempi)

Un esempio più recente di applicazione di questo metodo riguarda la semplificazione molecolare dell’asperlicina, un prodotto naturale, che ha portato alla sintesi di un inibitore della colecistochinina più potente e selettivo e con una struttura molto più semplice.

Semplificazione Molecolare (esempi)

La semplificazione molecolare è particolarmente utile quando il lead sia di natura polipeptidica, in quanto per questo tipo di molecole è molto frequente che l’azione farmacologica sia legata ad una particolare sequenza all’interno della struttura originaria. Ad esempio, è stato dimostrato che l’attività della bombesina, peptide di 14 aminoacidi isolato dalla pelle di una rana europea e dotato di molteplici azioni biologiche, è dovuta interamente alla sequenza terminale di 8 aminoacidi e che ciò si verifica per molti peptidi della stessa famiglia.

Complicazione Molecolare

Le complicazioni molecolari apportate alla molecola del lead sono di varia natura e possono essere estremamente semplici, come nel caso della omologazione, o molto complesse, come nel caso della ibridazione molecolare. Gli approcci di complicazione molecolare possono essere così suddivisi:

Omologazione

Omologazione Arilica Vinilogia

Ciclizzazione

Raddoppiamento Molecolare Ibridazione Molecolare

Modificazioni Stereoisomeriche Derivatizzazione

Complicazione Molecolare (Omologazione)

Questa semplice strategia risulta essere particolarmente utile nel caso di prodotti che interagiscono con i recettori in quanto la specificità di interazione con il sito attivo rende la molecola molto suscettibile a variazioni strutturali anche di piccola entità. Ad esempio, da prometazina a clorpromazina.

Analoghi della NOR-ADRENALINA

OH

N H

R

HO

OH

R recett. Eff.

ipertensivo

Eff.

ipotensivo

H  ++ -

Me  ++ -

Et  + +

n-Prop  - +

iso-Prop  - ++

n-But  - ++

iso-But  - ++

Esempio di inversione

di attività farmacologica in serie omologa

Complicazione Molecolare (Omologazione)

L’esempio più recente di questo tipo di variazioni è costituito dal salmeterolo, un farmaco broncodilatatore che per effetto della lunga e lipofila catena presente sull’azoto è un agonista adrenergico di lunga durata. L’azione agonista viene mantenuta a dispetto della presenza della voluminosa sostituzione sull’azoto, che di solito converte l’attività da agonista in antagonista. Tale azione risulta inoltre essere di lunga durata. Ciò si spiega con l’ancoraggio della molecola , grazie al sostituente lipofilo, ad un sito accessorio (esosito) che è sufficientemente lontano da permettere la normale formazione e rottura del complesso farmaco-recettore e talmente forte da mantenere il farmaco nell’intorno del sito attivo. In altre parole, la molecola è libera di associarsi e dissociarsi dal recettore per dar corso all’azione agonista, ma non è libera di diffondere lontano dal recettore stesso.

Complicazione Molecolare (Omologazione)

Inoltre l’allungamento progressivo di catene alifatiche può alterare la geometria della molecola, determinando variazioni nei meccanismi d’azione. Un classico esempio è rappresentato dall’esametonio, bloccante del recettore nicotinico gangliare, rispetto al decametonio, bloccante dello stesso recettore di placca.

Complicazione Molecolare (Omologazione)

Anche l’ampliamento dei cicli può essere considerato un caso speciale di omologazione ed anche in questo caso i risultati ottenuti possono essere differenti in relazione alle variazioni, soprattutto conformazionali, che questa modifica comporta. In alcuni casi la variazione non è tale da alterare l’interazione con il recettore, quindi il prodotto omologo mostra la stessa azione di quello da cui deriva; un esempio è rappresentato dal caso della meperidina e della etoeptazina, entrambi analgesici oppioidi.

Complicazione Molecolare (Omologazione)

Complicazione Molecolare (Omologazione)

Nel caso invece del passaggio dal clorprotissene alla dotiepina la omologazione ha introdotto una flessibilità nella struttura che viene considerata la causa della comparsa dell’azione antidepressiva accanto alla azione neurolettica del clorprotissene.

Infatti, mentre questo viene usato come neurolettico, la dotiepina è utilizzata per la sua azione antidepressiva.

Complicazione Molecolare (Omologazione Arilica)

Un caso particolare di omologazione può essere considerato la introduzione sulla molecola di gruppi aromatici (e grazie al concetto di isosteria, eteroaromatici). Usualmente si tratta di grupi lipofili che il più delle volte servono per aumentare la affinità attraverso interazioni lipofile ed elettrostatiche. Tali gruppi possono essere presenti come sostituenti o condensati a cicli preesistenti. Nel caso di ligandi recettoriali si è visto che l’introduzione di tali gruppi trasforma spesso gli agonisti in antagonisti. L’esempio riporta la struttura dell’acetilcolina (agonista) e quella dell’adifenina (antagonista competitivo). E’ chiaro che la presenza dei gruppi fenilici comporta il legame con siti di interazione accessori, un’elevata affinità del farmaco e la comparsa dell’azione antagonista.

Lo stesso effetto si ottiene con la condensazione di gruppi arilici. Nell’esempio riportato la sostituzione dei gruppi ossidrilici dell’anello catecolico con un anello benzenico condensato in 3,4 trasforma la molecola dell’isoproterenolo (agonista - adrenergico) nel pronetanolo (antagonista -adrenergico).

Complicazione Molecolare (Omologazione Arilica)

Complicazione Molecolare (Omologazione Arilica)

E’ ovvio che il risultato finale dipenda dalla tipologia del sito attivo e dalla capacità di accogliere gruppi lipofili e voluminosi sia da parte del sito stesso che da parte di siti accessori contigui.

La condensazione di anelli aromatici è anche utilizzata al fine di sondare lo spazio disponibile in zone particolari di del sito di legame di un ligando o di una classe di ligandi. Cook JM e collaboratori hanno utilizzato questo approccio per disegnare una serie di benzoanaloghi del flunitrazepam che sono serviti come sonde molecolari (molecular yardsticks) per determinare le disponibiltà spaziali di del sito di legame delle benzodiazepine intorno all’anello benzenico fuso con quello 1,4-diazepinico.

Si è visto che solo la fusione con l’anello B dà composti dotati di elevata affinità per il recettore. Si è inoltre evidenziato che i diversi sottotipi recettoriali presentano caratteristiche steriche differenti in quella zona dello spazio.

Complicazione Molecolare (Vinilogia)

Nei casi in cui l'effetto elettronico è importante nell'azione di una molecola, l'interposizione di un gruppo vinilico o di un gruppo aromatico tra i due gruppi responsabili di tale effetto può condurre a prodotti che mantengono l'attività, purchè naturalmente ciò non interferisca con altre caratteristiche essenziali per l'interazione, come la forma e il volume della molecola. Una applicazione di questo principio è rappresentata

Complicazione Molecolare (Vinilogia)

Naturalmente un anello benzenico ha la stessa capacità di trasmettere effetti mesomeri e quindi può essere utilizzato allo stesso scopo.

Il principio di vinilogia è stato solo

saltuariamente applicato nella

modificazione di lead, con risultati non

molto incisivi. Attualmente il suo uso si è

fatto ancora più raro.

Complicazione Molecolare (Ciclizzazione)

Metodologia inversa alla apertura dei cicli. Consiste nell’introdurre nuovi cicli o nel ciclizzare catene laterali preesistenti. Tali modifiche servono a ridurre la flessibilità molecolare del lead e quindi ad individuare possibili conformazioni più attive e selettive

L’isoapomormina (-rotamero della dopamina) risulta meno potente come agonista rispetto alla apomorfina. Al contrario nei sistemi tetraidronaftalenici il derivato A-6,7-DTN, risulta più attivo come agonista. Tali dati sembrano indicare che sono accettabili entrambi I conformeri trans  o . Ma è anche possibile ipotizzare una diversa collocazione nella tasca recettoriale.

Complicazione Molecolare (Raddoppiamento Molecolare)

Il metodo consiste nella duplicazione di un farmacoforo sia direttamente (testa-testa, testa-coda, coda-coda) che per mezzo di uno spaziatore (spacer o linker). Si ottiene così una nuova molecola che, a livello metabolico, subisce una scissione per liberare due molecole identiche a quella di partenza (acido salicilsalicilico) ed in tal caso non sarà altro che un profarmaco con migliori caratteristiche farmacocinetiche. Più frequentemente però la molecola raddoppiata può risultare attiva come tale (dicumarolo, eseclorofene): questo risultato si ottiene in genere quando lo spaziatore è una catena polimerica di lunghezza opportuna.

Complicazione Molecolare (Raddoppiamento Molecolare)

La razionalizzazione di questo approccio è piuttosto incerta. Non è chiaro infatti se il raddoppiamento molecolare abbia un suo ruolo specifico sull’attività o debba essere considerato come una delle tante modificazioni che hanno un effetto positivo su farmacocinetica e farmacodinamica della molecola originale.

 Infatti, il secondo farmacoforo ha l’effetto farmacodinamico di contribuire al legame con il bersaglio biologico, attraverso la interazione con siti accessori a quelli riconosciuti dalla prima porzione del farmacoforo stesso. Dal punto di vista farmacocinetico il secondo gruppo può indurre un miglioramento delle proprietà chimico-fisiche quali la lipofilia che giocano in questa fase un ruolo fondamentale.

Complicazione Molecolare (Ibridazione Molecolare)

Si parla di ibridazione molecolare quando:

Due molecole, con meccanismo d’azione diverso ma identico effetto farmacologico, vengono unite tramite un legame covalente in un’unica entità molecolare (farmaci gemelli non identici)

Le caratteristiche fondamentali (farmacoforo) di due molecole aventi lo stesso o diverso meccanismo d’azione, ma uguale effetto farmacologico, sono introdotte in una nuova entità molecolare che in genere corrisponde solo parzialmente alle molecole di partenza.

Complicazione Molecolare (Ibridazione Molecolare)

Nel primo caso, se il legame tra due molecole può essere facilmente degradato a livello metabolico, ognuno dei due farmaci produrrà il suo effetto tramite il proprio meccanismo d’azione. Il vantaggio dell’ibridazione molecolare sarà quindi di tipo farmacocinetico, in quanto si evitano in tal modo i problemi legati ad una differente farmacocinetica dei due farmaci originali.

Naturalmente affinchè questo tipo di ibridazione abbia senso è necessario che i dosaggi dei due farmaci siano compatibili con il rapporto stechiometrico presente nel farmaco ibrido. Un esempio è dato dall’ibridazione di ampicillina e sulbactam per dare la sultamicillina che viene scissa facilmente nei due prodotti originali dagli enzimi plasmatici.

Complicazione Molecolare (Ibridazione Molecolare)

Se invece il legame non viene degradato a livello metabolico, la molecola sarà in tutto e per tutto una nuova entità molecolare che può essere attiva con entrambi i meccanismi delle due molecole originali, può essere attiva con uno solo due due meccanismi o essere del tutto inattiva. Un esempio di successo dell’applicazione di questo principio è rappresentato dalla fenetillina, molecola che proviene dall’ibridazione della caffeina (aumenta l’AMP ciclico inibendo le fosfodiesterasi) e metanfetamina (simpaticomimetico) entambi utilizzati come psicostimolanti.

Complicazione Molecolare (Ibridazione Molecolare)

Il labetalolo, nel quale si sono ibridate le caratteristiche di - e

-bloccanti allo scopo di ottenere un’azione antiipertensiva con doppio meccanismo d’azione è uno di questi casi.

Complicazione Molecolare (Modificazioni Stereoisomeriche)

Tra le complicazioni molecolari che vengono introdotte più spesso in un lead ci sono quelle a carico della stereoisomeria della molecola. La stereoisomeria ha infatti un ruolo fondamentale nell

’interazione macromolecolare con i target biologici.

Variazioni della stereoisomeria di una molecola possono essere introdotte in vari modi: inserimento di doppi o tripli legami e ciclizzazioni sono approcci che abbiamo visto essere utili nell’ottenere analoghi rigidi o semirigidi e che implicano variazioni a carico della stereoisomeria della molecola.

In generale, l’effetto farmacodinamico di modificazioni steriche è quello di variare l’affinità della molecola originale per il suo partner biologico che ha, nella quasi totalità dei casi, una stereochimica ben definita. Conseguentemente si possono ottenere derivati con affinità selettiva verso recettori o sottogruppi di recettori ed acquisire così informazioni sulla stereochimica dei rispettivi siti di interazione. Il tutto può venire utilizzato per la progettazione e lo sviluppo di nuovi farmaci

Complicazione Molecolare (Modificazioni Stereoisomeriche)

L’introduzione nella molecola dell’acetilcolina di un centro stereogenico rende la molecola stessa metabolicamente più stabile conduce a due enantiomeri (R-(+) e S(-)-metacolina) con affinità molto diversa per il recettore muscarinico. L’enantiomero più potente risulta essere selettivo per questo tipo di recettore rispetto a quello nicotinico. La ciclizzazione della stessa molecola di acetilcolina a diossolano mantiene un’alta attività colinergica solo in uno dei quattro possibili stereoisomeri, il (+)-cis-diossolano.

Complicazione Molecolare (Modificazioni Stereoisomeriche)

L’introduzione di un doppio legame nell’anello A del cortisone per dare il prednisone non influisce sulla capacità di legame con il recettore, ma altera la struttura sterica dell’anello rendendolo molto più resistente alla degradazione metabolica e ne incrementa la attività antiinfiammatoria.

Complicazione Molecolare (Derivatizzazione)

Questa semplice procedura, che il più delle volte consiste nell’esterificare acidi ed alcooli o acilare amine ed altre simili reazioni, non presenta molto interesse dal punto di vista delle informazioni da trarre dalla manipolazione molecolare, ma ha al contrario un enorme impatto a livello pratico poiché può permettere lo sviluppo di molecole altrimenti inutilizzabili a causa di problemi farmacocinetici.

Ad essa è legato il campo vastissimo della

progettazione e sintesi dei profarmaci che hanno un

ruolo essenziale nello sviluppo di farmaci anche nel

campo dei recettori. Ugualmente importante è la

derivatizzazione per modulare la solubilità di una

molecola o la sua distribuzione nei i vari distretti

dell’organismo.

Complicazione Molecolare (Derivatizzazione)

Un esempio è rappresentato dell’esterificazione dell’ossidrile alcolico dell’ossazepam con anidride succinica per dare l’ossazepam emisuccinato; si introduce così una funzione acida salificabile che rende idrosolubile una molecola altrimenti insolubile in acqua.

Un secondo esempio è la esterificazione dell’adrenalina con acido pivalico per ottenere la dipinefina; ciò incrementa la lipofilia della molecola permettendone l’uso a livello oculare per il trattamento del glaucoma.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

Si tratta di modificazioni molecolari mirate a variare la distribuzione elettronica e la lipofilia della molecola o a introdurre funzioni e gruppi che possono aumentare le forze di legame tra il prodotto originale ed il suo bersaglio biologico allo scopo di ottimizzarne l’interazione.

Il primo approccio viene attuato con una strategia ragionata di sintesi ed una valutazione critica dei risultati biologici ottenuti.

Il secondo approccio si basa essenzialmente sulle informazioni che si hanno sul sito attivo e sugli aminoacidi che lo costituiscono e lo circondano. Ciò si è rivelato molto utile nel caso degli enzimi, per i quali sempre più spesso è nota la struttura secondaria e terziaria; per ciò che riguarda i recettori e i canali ionici esso deve basarsi ancora su modelli approssimati ed è quindi molto legato all’intuito del ricercatore, anche se ultimamente sono note alcune strutture cristallografiche di recettori.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Legami covalenti, ionici ed elettrostatici)

E’ spesso utile inserire nella molecola gruppi funzionali quali carbossili, ammine, ossidrili, solfossidi, solfoni, amidi, gruppi insaturi per rendere possibili nuovi legami ionici o elettrostatici. E’ possibile inoltre, come già è stato descritto, introdurre gruppi lipofili per indurre o incrementare il legame idrofobico (vedi omologazione) .

Nel caso dei recettori si può indurre o migliorare la selettività verso diversi sottotipi se la funzione introdotta è in grado di interagire solo o preferenzialmente con uno di essi.

Tale approccio può modificare oltre alle caratteristiche farmacodinamiche anche quelle farmacocinetiche.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Legami covalenti, ionici ed elettrostatici)

Una classe di farmaci in cui è stato molto utilizzato è quella dei calcio antagonisti diidropiridinici derivati dalla nifedipina. Qui uno dei residui impegnati nella formazione di gruppi esterei è stato sostituito con gruppi contenenti una funzione aminoalcoolica, ottenendo una serie di sostanze con caratteristiche di potenza e selettività spesso migliori del lead. Tali prodotti sono esemplificati dalla nicardipina.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Legami covalenti, ionici ed elettrostatici)

I gruppi funzionali introdotti non devono necessariamente essere situati su catene laterali lunghe, anche se questo è un caso frequente. Per esempio, nel caso della nicotina, la semplice introduzione di un gruppo alchinilico, che è in grado di modulare l’interazione con uno dei numerosi sottotipi di recettori nicotinici a livello centrale introduce nella molecola un netto aumento della capacità di liberare dopamina. Ciò rende questa sostanza promettente per il trattamento del morbo di Parkinson.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Legami covalenti, ionici ed elettrostatici)

Per alcuni tipi di studi, soprattutto a livello dei recettori, può essere utile avere delle molecole in grado di stabilire legami covalenti con la molecola target. Si possono utilizzare tali molecole per:

marcare i recettori (affinity labeling) e rendere possibile lo studio di vari aspetti della loro biochimica;

bloccare i recettori rendendoli inattivi allo scopo di studiarne funzionamento e farmacologia

Ligandi di questo tipo si ottengono normalmente inserendo sulla molecola del lead funzioni alchilanti quali alochetoni, enoni, gruppi -cloroetilaminici, gruppi tiocianato e simili.

Particolarmente utili sono quei prodotti che alchilano dopo attivazione per irraggiamento (fotoalchilanti), ad esempio quelli contenennti un gruppo azido.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Legami covalenti, ionici ed elettrostatici)

La fenossibenzamina alchila selettivamente i recettori -adrenergici ed è largamente usata, fra l’altro, per inattivare tali recettori nel metodo di Furchgott per la determinazione delle costanti di affinità di agonisti. La bromoacetilicolina alchila i recettori nicotinici, mentre la -clornaltressamnina è un alchilante non selettivo dei recettori oppiodi. Infine l’(R)-2-azido-N⁶-p- idrossifenilisopropiladenosina (R-AHPIA) è un fotoalchilante del recettore adenosinico A₁

Il problema principale nella progettazione di questi composti è individuare la zona del lead in cui inserire la funzione alchilante senza alterare l’affinità per il recettore.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

La distribuzione elettronica e la lipofilia di una

molecola e di conseguenza la sua affinità per il

substrato biologico possono essere modulate

attraverso la sostituzione con gruppi che abbiano

diverse proprietà induttive e mesomere. Una tale

modulazione permette di ottenere da una parte

l’ottimizzazione del lead e dall’altra lo studio delle

forze che regolano l’interazione di un farmaco con il

proprio bersaglio biologico.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

Sostituenti più frequentemente usati a seconda del loro effetto induttivo e mesomero. I gruppi che attraggono gli elettroni più fortemente dell’idrogeno hanno effetto induttivo –I, quelli che li attraggono meno fortemente hanno un effetto induttivo +I. Effetti mesomeri risultano dalla delocalizzazione di elettroni  in composti che presentano doppi legami coniugati. Gruppi che aumentano la densità elettronica sul sistema coniugato hanno un effetto +R, mentre gruppi che la diminuiscono hanno un effetto –R.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

Ai fini di una valutazione quantitativa degli effetti elettronici, lipofili e sterici (inteso nel senso di ingombro sterico) di un dato sostituente si considerano le costanti ,  e E_s che sono le più largamente utilizzate per parametrizzare queste grandezze chimico- fisiche. Questi parametri, insieme ad altri, sono utilizzati per lo studio delle relazioni quantitative struttura-attività (QSAR) che sono un mezzo molto utile per valutare l’incidenza di effetti elettronici, lipofili e sterici sull’azione di un farmaco. Tali parametri sono definiti dalle equazioni:

rappresentano i contributi di un dato gruppo X rispetto all’idrogeno su lipofilia, distribuzione elettronica ed effetto sterico.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

 parametrizza sia l’effetto induttivo che l’effetto mesomero. Per il gruppo NO₂, ad esempio, il valore di  positivo (caratteristico di un gruppo elettronattrattore, è il risultato di un effetto induttivo –I e un effetto mesomero –R).

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

Per avere un’idea complessiva del comportamento di un gruppo in relazione agli effetti elettronici e lipofili Craig ha proposto di visualizzare graficamente i valori delle costanti  e . Tale grafico è bidimensionale e non include quindi il parametro sterico.

Normalmente questi dati si usano per selezionare gruppi che conferiscano alla nuova molecola le caratteristiche desiderate.

Modulazione Chimica e Chimico-Fisica

(Distribuzione elettrofila e lipofila)

Quando si vogliono esplorare tutte le possibilità di modulazione senza seguire un’ipotesi particolare si possono seguire strategie del tipo di quella proposta da Topliss. Lo schema riporta una formulazione semplificata dell’albero decisionale di Topliss per l’ottimizzazione di sostituenti aromatici.