Immunolocalizzazione di HB-EGF in placche aterosclerotiche umane
R. Scuderi1, S. Travali2, P. Castrogiovanni2, R.M. Imbesi2, V. Mazzone3, G. Failla4, A. Failla1
1Dipartimento di Medicina Interna e Patologie Sistemiche Policlinico; 2Dipartimento di Scienze Biomediche: 3Dipartimento di Anato- mia, Patologia diagnostica, Medicina Legale, Igiene e Sanità Pubblica; 4U.O.C. di Chirurgia Vascolare e Centro Trapianti Policlini- co, Università di Catania, Italia
Articolo originale
Clin Ter 2009; 160 (6):435-439Corrispondenza: Prof. Scuderi Rosario, Via Municipio, 156 Misterbianco (CT) 95045, Italia. Tel. +39.095/462026; +39.3471944827, +39.0953782731; +39.0953782725. E-mail: rosarioscuderi@virgilio.it
Introduzione
Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) è stato identifi cato come un potente fattore mitogeno per cellule muscolari lisce di origine macrofagica.
Esso è espresso in cellule di endotelio vascolare e cellule muscolari lisce, indicando un ruolo potenzialmente impor- tante per aterosclerosi.
L’HB-EGF è stato inizialmente identifi cato nel 1990 da Klagsbrun et al. come una glicoproteina 20-22 KD secreta
Riassunto
Obiettivi. Heparin-binding epidermal growth factor(HB-EGF) è un membro della famiglia EGF, è un potente mitogeno per cellule muscolari lisce ed è stato implicato in aterosclerosi e angiogenesi.
Nell’aterosclerosi HB-EGF è stato dimostrato nella media in cellule muscolari lisce e nei macrofagi. In questo lavoro noi abbiamo valu- tato con metodo immunoistochimico la localizzazione di HB-EGF in placche ateromasiche.
Materiali e Metodi. Sono stati esaminati tre casi di uomo affetti da aterosclerosi. Abbiamo raccolto ed esaminato le placche atero- masiche con procedura immunoistochimica in microscopia ottica,.
i campioni sono stati incubati con AC Primario (IgG di capra anti HB-EGF umano).
Risultati. Nei tre casi esaminati i risultati sono in parte sovrappo- nibili, ma con qualche differenza sulla localizzazione della positività per HB-EGF. Solo in un caso,la colorazione è piuttosto debole e si trova appena al di sotto dell’endotelio dove è addensato uno spazio di tessuto ricco di fi bre e poche cellule, In un altro caso, la positività di HB-EGF è presente in una zona di tessuto connettivo dell’intima.
Nell’ultimo caso, la positività di HB-EGF è evidente nel contesto di una presunto tessuto elastico con cellule fusiformi che potrebbero essere fi broblasti o cellule della muscolatura liscia.
Conclusioni. Questi risultati indicano che HB-EGF è implicato nella formazione della placca ateromasica, e che potrebbe essere un possibile bersaglio terapeutico. Clin Ter 2009; 160(6):435-439
Parole chiave: HB-EGF, placche aterosclerotiche
Abstract
Immunolocalization of HB-EGF in human atherosclerotic plaques
Aims. Heparin-binding epidermal growth factor is a member of the EGF family, it is a potent mitogen for smooth muscle cells and has been implicated in atherosclerosis, angiogenesis. In athererogenesis, HB-EGF has been detected in medial smooth cells and foamy mac- rofages. In this work, we have investigate about immunohistocemical localization of HB-EGF in atherosclerotic plaques.
Materials and Methods. Three cases of man affected by athero- sclerosis have been examined. We have collected and examined atherosclerotic plaques by immunohistochemical procedure in optical microscopy. Samples have been incubated with primary Ac (anti-hu- man HB-EGF- goat IgG).
Results. In the three examined cases, results are partly overlap- ping, but with some difference in relation to location of positivity to HB-EGF. Only in one case, HB-EGF staining is rather weak and located just below endothelium where is a thickened area of tissue rich in fi bres and few cells, In another case, positivity to HB-EGF is present in an area of connective tissue of the intima. In the last case, positivity to HB-EGF is evident in the context of a presumed elastic tissue with fusiform cells following fi bres orientation, and that could be fi broblasts or smooth muscle cells.
Conclusions. These results indicate that HB-EGF is involved in the development of atherosclerotic plaques and that HB-EGF is a possible target for atherosclerosis therapy. Clin Ter 2009; 160(6):435-439 Key words: HB-EGF, atherosclerotic plaques
da linee cellulari macrofagiche U-937(1). Il gene di HB-EGF è stato individuato nel 1993 e localizzato sul cromosoma 5 (2) nel tratto 5q21 e su tale cromosoma è stata identifi cata la sensibilità per la tossina difterica (3). L’mRNA dell’HB- EGF è ampiamente espresso da diversi tessuti adulti di mammifero (4).
Il gene codifi ca per il precursore transmembrana di HB-EGF, una struttura costituita da 208 amino acidi con un dominio esterno, un dominio che attraversa la membrana ed un dominio citoplasmatico: peptide segnale (ORF 1-23),
pro-peptide (ORF 24-62), HB-EGF maturo (ORF 63-149), dominio juxtamembrana (ORF 150-160), dominio tran- smembrana (ORF161-184) e dominio citoplasmatico (ORF 185-208); all’interno di HB-EGF maturo c’è anche un sito che lega la tossina difterica DT(ORF63-149) (5). Il precurso- re ancorato alla membrana di HB-EGF (proHB-EGF) viene scisso mediante “ectodomain shedding” ad opera di metallo- proteinasi e forma HB-EGF solubile (sHB-EGF), il quale sembra avere un ruolo chiave in processi proliferativi (6).
L’HB-EGF è un fattore di crescita, appartenente alla famiglia EGF. Tale famiglia recettoriale comprende quattro gruppi:
– I gruppo: EGF, TGF-α, amfi reguline, che legano speci- fi catamente erbB1
– II gruppo: HB-EGF, betacelluline, neureguline che le- gano erbB1 ed erbB4
– III gruppo NRG1 ed NRG2 che legano erbB3 ed erbB4
– IV gruppo NRG3 ed NRG4 che legano erbB4.
Tutte le molecole EGF possiedono sei residui di cisteina che formano ponti disolfuro essenziali per la loro attività biologica.
Il fattore di crescita esaminato in questo studio “HB- EGF” per adempiere alle sue funzioni si lega a specifi ci recettori di tipo tirosin-chinasico (erbB1, erbB4) con conseguente attivazione della via MAP-chinasi e Fosfoino- sitolo-3-chinasi. Le MAP-Kinasi regolano la cascata delle chinasi ERK, P38MAPK, PI3K, la cui attivazione induce migrazione e proliferazione di SMC, attivazione di cellule quiescenti ad entrare nel ciclo cellulare, attivazione di altre chinasi che infl uenzano la sopravvivenza , la migrazione e la proliferazione cellulare (7, 8).
Con il presente lavoro, abbiamo valutato su vivente la positività immunoistochimica di HB-EGF in placche ateromasiche.
Materiali e Metodi
Sono state esaminate tre placche umane ateromasiche e valutato mediante metodica immunoistochimica la positività per HB-EGF
Il paziente N° 1 aveva 62 anni, era di sesso maschile, dislipidemico in trattamento farmacologico e fumatore (circa 20 sigarette/die).
Il paziente N° 2 aveva 77anni, era di sesso maschile, non fumatore, diabetico non insulino dipendente, iperteso in trattamento farmacologico.
Il paziente N° 3 aveva 64 anni, di sesso maschile, iperteso, fumatore e dislipidemico in trattamento farmacologico.
I tre campioni di placche aterosclerotiche sono stati raccolti ed esaminati con procedura immunoistochimica in microscopia ottica. I campioni sono stati fi ssati con for- maldeide 10%, inclusi in paraffi na e sezionati. Il protocollo immunoistochimico prevedeva il trattamento delle sezioni ottenute al microtomo con H2O2 3% e successiva incubazione con: siero normale animale per 15’ a temperatura ambiente;
NaN3 0,1%; Ac primario (IgG di capra anti-HB-EGF uma- no) overnight a 4°C, utilizzandone due diverse concentrazio- ni: 12,5 µg/ml e 8,33 µg/ml; anticorpo secondario anti-capra per 45’ a temperatura ambiente; streptavidina coniugata a
perossidasi di rafano (HRP); 3,3’ diaminobenzidina (DAB).
Quindi, le sezioni sono state ulteriormente controcolorate con ematossilina, montate e visionate al microscopio ottico.
Il controllo negativo è stato ottenuto sostituendo al passaggio con Ac primario una incubazione con il solo diluente.
Risultati
Nei tre casi esaminati, i risultati sono in parte coincidenti, ma con qualche differenza in relazione alla localizzazione della positività all’HB-EGF. Solo in un caso, la colorazione è piuttosto debole e appena al di sotto dell’endotelio dove è presente una spessa area di tessuto ricco di fi bre ma con poche cellule nonostante la loro abbondanza nel contiguo tessuto connettivo denso (Fig. 1).
In un altro caso, la positività all’HB-EGF è presente in un’area di tessuto connettivo dell’intima. Questa zona è ricca di fi bre con relativamente poche cellule connettivali. La colorazione sembra più diffusa tra le fi bre, piuttosto che in posizione intracitoplasmatica (in contrasto con la letteratura) (Figg. 2, 3, 4) (1-13 ). Sembra che l’HB-EGF venga secreto da cellule connettivali quali i macrofagi (attività paracrina dell’HB-EGF); quindi l’HB-EGF dovrebbe agire su cellule muscolari lisce isolate presenti nell’intima, stimolandone la proliferazione (attività mitogena dell’HB-EGF). Inoltre, la positività all’HB-EGF è presente nel contesto di un tessuto elastico con evidenti fi bre ondulanti (lamina elastica interna).
Anche qui, la positività sembra più estesa in posizione extra- cellulare (tra le fi bre), piuttosto che intracitoplasmatica.
Nell’ultimo caso, la positività all’HB-EGF è evidente nel contesto di un presunto tessuto elastico con cellule fusiformi che potrebbero essere fi broblasti o cellule della muscolatura liscia (Fig. 5). Positività all’HB-EGF è anche presente in una
Fig.1 (caso1). Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’ HB- EGF in M.O. (x 40): Al di sotto dell’endotelio è addensato uno spazio di tessuto ricco di fi bre in cui vi è una lieve positività all’ HB-EGF. In questa zona ci sono poche cellule, nonostante la loro abbondanza nel contiguo tessuto connettivo denso.
zona piuttosto amorfa con fi bre intrecciate miste a formazio- ni aghiformi che potrebbero essere cristalli di colesterolo, tipiche formazioni degenerative dell’aterosclerosi (Fig. 6).
Inoltre, è possibile evidenziare una forte colorazione in posizione intracitoplasmatica e pericellulare intorno ad un aggregato di probabili macrofagi (Fig. 7).
Sebbene sia evidente una colorazione diffusa tra fi bre (extracellulare),sono anche presenti zone circoscritte di intensa colorazione che indicano una positività intracito- plasmatica; tali zone potrebbero essere aggregati di cellule anche se nascoste dalla stessa colorazione.
Nessuno dei controlli negativi presenta la positività all’HB-EGF.
Fig. 2 (caso 2). Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x10)
La positività di HB-EGF è presente in una zona di tessuto connettivo di pertinenza della tonaca intima. Questa zona è ricca di fi bre con relativamente poche cellule connettivali. La colorazione sembra più sparsa tra le fi bre piuttosto che in posizione intracitoplasmatica . In fondo, quasi in posizione centrale vi è un accumulo di cellule ricche di depositi di lipidi, e in cui non vi è alcuna positività per HB-EGF.
Fig 3 (caso.2) Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x 20): ingrandimento più elevato della fi gura n.3.
che mette ancora più in evidenza come la colorazione sia presente in mezzo alle fi bre collagene intrecciate, con un leggero maggiore accumulo in alcune zone.
Fig. 4 (caso n.2). Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x 40): positività all’HB-EGF evidente tra le fi bre connettivali.
Fig. 5 (caso n.3). Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x 10): La positività all’ HB-EGF è presente nel contesto di un tessuto elastico frammisto a connettivo denso.
Fig. 6 (caso n.3). Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x 20):
La positività per HB-EGF è presente in una zona amorfa con fi bre intrecciate frammiste a spazi aghiformi che potrebbero corrispondere a cristalli di colesterolo, tipiche formazioni dell’arteriosclerosi.
Discussione
Molteplici fattori di crescita intervengono nella patoge- nesi dell’aterosclerosi. Recentemente l’attenzione dei vari ricercatori è stata rivolta all’HB-EGF potente mitogeno e fattore di crescita prodotto dai macrofagi, dalle cellule endoteliali e VSMC. È stato visto che HB-EGF secreto da cellule endoteliali, macrofagi, linfociti T e cellule muscolari lisce in seguito a legame col suo recettore guida processi di fosforilazione e stimola la proliferazione e migrazione di cellule muscolari lisce dalla media all’intima della parete vasale contribuendo alla formazione della placca (9-11).
Inoltre, è stata evidenziata una correlazione tra remnants di lipoproteine (RLP) ed espressione di HB-EGF solubile in placche ateromasiche. Infatti è stato dimostrato che alti livelli di RLP attivano metalloproteinasi che guidano il clivaggio di proHB-EGF e quindi aumentano l’espressione di HB-EGF solubile essenziale per la proliferazione di SMC (12).
Uno studio molto importante eseguito su cadavere ha valutato con metodo immunoistochimico HB-EGF su 31 biopsie di aorta addominale e toracica di individui di età compresa tra 2 mesi e 80 anni, alcuni dei quali erano affetti da aterosclerosi (13). Esso ha dimostrato che l’HB-EGF era iperespresso in tenera età poi subiva un decremento e in seguito si presentava elevato nelle SMC dell’intima e della media del paziente anziano con patologia aterosclerotiche.
Un altro trial clinico è stato effettuato su tre anziani pazienti con placche aterosclerotiche in diverso stadio ; questi pazienti venivano trattati per un periodo di circa 5 anni con CRM197, analogo non tossico della tossina difterica con la quale condivide lo stesso sito recettoriale in HB- EGF,dimostrando una signifi cativa riduzione delle placche e quindi del grado di stenosi carotidea (14).
L’HB-EGF è una proteina O-glicosilata di 22 kDA;
mitogenica per fi broblasti, cellule della muscolatura liscia e cellule epiteliali. L’HB-EGF deriva da un prodotto primario successivamente clivato per la produzione della proteina matura (5).
Fig. 7 (caso n.3) Tessuto ateromasico. Immunolocalizzazione dell’
HB-EGF in M.O. (x 40): (X 40).è evidente un tessuto connettivo ricco di cellule, con poche fi bre ed una evidente colorazione per HB-EGF. Solo in una zona, a sinistra è possibile evidenziare una forte colorazione intracitoplasmatica e pericellulare, intorno ad un aggregato di macrofagi.
La scoperta di molteplici forme di HB-EGF in cellule U-937 ha portato ad una più dettagliata analisi strutturale dell’HB-EGF umano. Questi studi hanno rivelato ulteriori informazioni sui processamenti relativi alla produzione di un fattore di crescita maturo successivamente secreto. Espe- rimenti di digestione enzimatica hanno rivelato che forme native e ricombinanti di HB-EGF sono ampiamente modi- fi cate dalla O-glicosilazione. L’HB-EGF esiste sia come proteina transmembrana che come prodotto di secrezione.
La O-glicosilazione non sembra essere necessaria per la secrezione o il processamento dell’HB-EGF; ulteriori studi sono comunque necessari per stabilire se la mancanza di O-glicosilazione si ripercuote sul tasso di HB-EGF secreto (15). L’enzima responsabile della trasformazione dell’HB- EGF potrebbe essere una metalloproteinasi. Esperimenti con Northern blotting hanno evidenziato la presenza di più pro- dotti di trascrizione di HB-EGF in diversi tessuti compresi polmoni, muscoli scheletrici, cervello e cuore. In particolare questi risultati indicano che l’HB-EGF m-RNA è presente in una vasta gamma di tessuti corporei, e che esistono diversi trascritti a partire da un unico m-RNA.
Questo fattore di crescita non è solo importante per i normali processi di sviluppo, ma può avere un ruolo rilevante anche per la progressione di molte malattie. Nell’ateroscle- rosi, l’iperplasia delle cellule muscolari lisce è collegata a fattori di crescita macrofagici e delle stesse cellule musco- lari lisce; l’HB-EGF è prodotto da entrambi tipi cellulari.
Inoltre, diversi fattori di crescita sintetizzati dalle cellule muscolari lisce sono importanti per l’avvio della migrazione e proliferazione delle stesse a seguito di un danno vasale.
Espressione di HB-EGF mRNA è stata indotta in arterie carotidi di ratto danneggiate con palloncino, suggerendo che l’HB- EGF può favorire il rimodellamento vascolare in risposta a lesioni arteriose attraverso un meccanismo autocrino o paracrino (16).
Per studiare il ruolo dell’HB-EGF nella patogenesi della aterosclerosi, è stata quantizzata l’HB-EGF nelle cellule muscolari lisce e nei macrofagi di pareti arteriose umane normali e con arteriosclerosi in differenti fasi, dimostrando livelli di proteina signifi cativamente più elevati in queste ultime. Placche aterosclerotiche di arterie coronarie con eccentrico ispessimento intimale mostravano una alta espres- sione di HB-EGF nei macrofagi e nelle cellule muscolari lisce (17, 18).
Tutti questi dati suggeriscono che l’HB-EGF può essere coinvolta nella proliferazione e migrazione delle cellule muscolari lisce e di altri tipi cellulari che si verifi cano sia durante il normale sviluppo delle pareti arteriose e di altri tes- suti, che nella formazione delle placche aterosclerotiche.
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